專利名稱：一種抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物，特別是涉及一種以重組蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。
靶向毒素包括兩部分一部分是能夠殺傷細(xì)胞的毒素，另一部分為能夠介導(dǎo)毒素到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞的標(biāo)識(shí)載體。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多種用于殺傷癌細(xì)胞的靶向毒素，其中包括植物毒素(如篦麻毒素)、細(xì)菌毒素(如白喉毒素(DT)、綠膿桿菌外毒素(APE))和真菌毒素等，這些毒素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。標(biāo)識(shí)載體包括多種蛋白，如轉(zhuǎn)移生長因子(TGF)、表皮生長因子(EGF)、白細(xì)胞介素(IL-2、IL-4)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、EGF受體抗體、HER2受體抗體，轉(zhuǎn)鐵蛋白等等。毒素部分同載體的連接可以通過化學(xué)法偶聯(lián)或者通過基因工程的方法獲得融合蛋白。有報(bào)道表明，基因工程構(gòu)建的靶向毒素比化學(xué)偶聯(lián)法構(gòu)建的更有效。
研究證明，許多癌細(xì)胞的EGF受體基因被放大了，并在細(xì)胞表面過量表達(dá)EGF受體，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸結(jié)腸癌、子宮頸癌和腦瘤。目前已有數(shù)種靶向毒素被構(gòu)建來殺死過量表達(dá)EGF受體的癌細(xì)胞。如425.3-PE是利用EGF的單克隆抗體同毒素PE的化學(xué)聯(lián)結(jié)構(gòu)建的免疫毒素(Engebraaten et al，2002)。TP40是一種TGF和刪除變異的PE構(gòu)建的融合蛋白(Siegall et al，1989)。
一種治療腫瘤的藥物，它的活性成分是具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明序列表中序列2的蛋白質(zhì)由466個(gè)氨基酸殘基組成，具有抑制腫瘤的作用。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為每天100ug/kg體重。
編碼上述重組蛋白的是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
本發(fā)明序列表中序列1的DNA序列由1401個(gè)堿基組成。
本發(fā)明用于構(gòu)建重組融合蛋白的白喉毒素是一種含有兩個(gè)亞基的蛋白毒素，N末端亞基(1-388殘基)能夠通過催化elongation factor 2的ADP-ribosylation而致蛋白合成障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，C-末端亞基用于聯(lián)接受體。白喉毒素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有高細(xì)胞毒性，數(shù)分子的白喉毒素將足以殺死一個(gè)細(xì)胞。
本發(fā)明所構(gòu)建的重組蛋白是由刪除了受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的白喉毒素和人變異EGF重組表達(dá)形成的，它的特點(diǎn)是白喉毒素固有的毒性通過刪除受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而大大降低，所以毒素將只特異地殺傷具有載體受體的細(xì)胞，對(duì)其他正常人體組織細(xì)胞無傷害，本發(fā)明改造的變異的EGF提高了對(duì)受體EGFR和HER2的粘附親和力，同時(shí)也表現(xiàn)了對(duì)HER3和HER4的粘附親和力，擴(kuò)大了殺傷腫瘤細(xì)胞的范圍，可以有效殺傷過表達(dá)EGFR、HER2、HER3或HER4的細(xì)胞。
體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，本發(fā)明的重組白喉毒素人表皮生長因子融合蛋白對(duì)多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸結(jié)腸癌、子宮頸癌、和腦瘤具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞靶向殺傷作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
2、人表皮生長因子基因從人脾臟cDNA文庫經(jīng)PCR獲得，一對(duì)引物的序列如下1GGACTTCATATGTCTCACCTGGTTAAATGCCCGCTGTCCCACG2GGGCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGATCACGG該表皮生長因子的前五個(gè)氨基酸殘基突變成了SHLVK。
PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和XhoI按New England BioLabs所述方法消化。該嵌入物用T4連接酶連接入消化的28bDT388載體。生成的質(zhì)粒命名為28bDT388mEGF。
3、質(zhì)粒28bD T388mEGF轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種于含20μg/ml卡那霉素的10ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床生長12小時(shí)，取10ml上述LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種子1L含20μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基OD600值達(dá)0.6時(shí)，加入0.5ml 1M IPTG于1L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)3小時(shí)后收集細(xì)胞。
4、收獲于1L培養(yǎng)基中的大腸桿菌細(xì)胞離心沉淀并重懸于100ml 100mM Tris緩沖液中(pH7.9)；150mM NaCl。4℃超聲波裂解細(xì)胞，細(xì)胞碎片及不溶物用BeckmanJA20轉(zhuǎn)子于15000rpm條件下離心沉淀，因?yàn)楸磉_(dá)蛋白是組氨酸標(biāo)記的，因此可以比較容易地通過金屬螯合柱純化。
5、離心后的上清液泵入10ml樹脂的Ni柱，Ni柱用50mM Tris緩沖液(pH7.9)、0.5M NaCl和50mM imidazole充分沖洗柱子除去雜蛋白，被柱子結(jié)合的重組蛋白將被50mM Tris緩沖液(pH7.9)，0.5M NaCl和200mM imidazole洗脫。
6、洗脫的重組蛋白用2L PBS緩沖液透析，并用安裝于Pharmacia公司AKTA HPLC系統(tǒng)的Superdex 200凝膠過濾柱進(jìn)一步純化，得到成品。
實(shí)施例2、本發(fā)明重組蛋白對(duì)癌細(xì)胞的作用以DT388為對(duì)照，用本發(fā)明重組蛋白分別對(duì)乳腺癌(MCF-7)、肺癌(H125，H358)、直腸癌(SW480)、子宮頸癌(A431)和腦瘤(U251，U87，U373)八株腫瘤細(xì)胞做量效關(guān)系試驗(yàn)，融合蛋白與DT388的IC50(ng/ml)結(jié)果如表1所示表1.重組蛋白與DT388處理各種腫瘤細(xì)胞IC50(ng/ml)MCF-7 H125H358SW480 A431U251U87 U373重組蛋白 2.5 17.515.02.5 2 15 20 25.0對(duì)照 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000注IC50是所處理細(xì)胞半數(shù)死亡的蛋白濃度.
從表中的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的重組蛋白對(duì)乳腺癌、肺癌、直腸癌、子宮頸癌、腦瘤等多種腫瘤細(xì)胞株均有明顯的殺傷作用。
序列表<160>2<210>1<211>1401<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atggctagcg gcgctgatga tgttgttgat tcttctaaat cttttgtgat ggaaaacttt 120tcttcgtacc acgggactaa acctggttat gtagattcca ttcaaaaagg tatacaaaag 180ccaaaatctg gtacacaagg aaattatgac gatgattgga aagggtttta tagtaccgac 240aataaatacg acgctgcggg atactctgta gataatgaaa acccgctctc tggaaaagct 300ggaggcgtgg tcaaagtgac gtatccagga ctgacgaagg ttctcgcact aaaagtggat 360aatgccgaaa ctattaagaa agagttaggt ttaagtctca ctgaaccgtt gatggagcaa 420gtcggaacgg aagagtttat caaaaggttc ggtgatggtg cttcgcgtgt agtgctcagc 480cttcccttcg ctgaggggag ttctagcgtt gaatatatta ataactggga acaggcgaaa 540gcgttaagcg tagaacttga gattaatttt gaaacccgtg gaaaacgtgg ccaagatgcg 600atgtatgagt atatggctca agcctgtgca ggaaatcgtg tcaggcgatc agtaggtagc 660tcattgtcat gcataaatct tgattgggat gtcataaggg ataaaactaa gacaaagata 720gagtctttga aagagcatgg ccctatcaaa aataaaatga gcgaaagtcc caataaaaca 780gtatctgagg aaaaagctaa acaataccta gaagaatttc atcaaacggc attagagcat 840cctgaattgt cagaacttaa aaccgttact gggaccaatc ctgtattcgc tggggctaac 900tatgcggcgt gggcagtaaa cgttgcgcaa gttatcgata gcgaaacagc tgataatttg 960gaaaagacaa ctgctgctct ttcgatactt cctggtatcg gtagcgtaat gggcattgca 1020gacggtgccg ttcaccacaa tacagaagag atagtggcac aatcaatagc tttatcgtct 1080ttaatggttg ctcaagctat tccattggta ggagagctag ttgatattgg tttcgctgca 1140tataattttg tagagagtat tatcaattta tttcaagtag ttcataattc gtataatcgt 1200cccgcgtatt ctccggggca taaaacgcaa ccacatatgt ctcacctggt taaatgcccg 1260ctgtcccacg acggttattg tctgcacgac ggtgtttgca tgtatatcga agctctggac 1320aaatacgctt gcaactgcgt agttggttac atcggtgaac gttgccagta ccgtgatctg 1380aaatggtggg aactgcgtta a 1401<210>2<211>466<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val1 5 10 15Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Gly Ala Asp Asp Val Val Asp20 25 30Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly35 40 45Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys50 55 60Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly65 70 75Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala G1y Tyr Ser Val80 85 90Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys95 100 105Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp110 115 120Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu125 130 135Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe140 145 150Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu155 160 165Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys170 175 180Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys185 190 195Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala200205 210Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile
215 220 225Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile230 235 240Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu245 250 255Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu260 265 270Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu275 280 285Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn290 295 300Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu305 310 315Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu320 325 330Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His335 340 345His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser350 355 360Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp365 370 375Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu380 385 390Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro395 400 405Gly His Lys Thr Gln Pro His Met Ser His Leu Val Lys Cys Pro410 415 420Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr425 430 435Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr440 445 450Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu455 460 465Arg46權(quán)利要求
1.一種治療腫瘤的藥物，它的活性成分是具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種治療腫瘤的藥物，其特征在于所述藥物中還含有人體可接受的藥用載體。
4.一種具有抑瘤作用融合蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述具有抑瘤作用融合蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.一種具有抑瘤作用的融合蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
8.權(quán)利要求3所述的融合蛋白在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4所述的融合蛋白在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤藥物。本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物，特別是涉及一種以重組蛋白為活性成分的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的目的是提供一種有效的治療腫瘤的藥物。一種治療腫瘤的藥物，它的活性成分是具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的藥物對(duì)多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸結(jié)腸癌、子宮頸癌、和腦瘤具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞靶向殺傷作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1465396SQ02123448
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者朱冰, 朱 冰 申請(qǐng)人:朱冰, 朱 冰