專利名稱：用于可控釋放給藥的,含分子量降低的支鏈淀粉基純化淀粉的可生物降解微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用于生物活性物質(zhì)給藥的草本制劑領(lǐng)域，更準(zhǔn)確地說，用于打算腸道外施用生物活性物質(zhì)(尤其是藥物)的可控釋放的微粒。更具體地說，本發(fā)明涉及制備這種含生物活性物質(zhì)的顆粒的新方法和可以實(shí)現(xiàn)可控釋放的新穎顆粒。發(fā)明背景很多藥物必須以注射方式給藥，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝岳缈诜⒔?jīng)鼻或經(jīng)直腸途徑等方式給藥時(shí)或是會(huì)發(fā)生降解，或是不能被充分吸收。打算腸道外使用的藥物必須滿足許多要求才能被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人類。它必須是生物相容的和可生物降解的，而且所用的物質(zhì)及其降解產(chǎn)物必須都是無(wú)毒的。此外，打算注射的顆粒狀藥物必須小得足以通過注射針頭，這意味著它們應(yīng)小于200μm。在制備或貯存期間或服用后，制劑中的藥物不應(yīng)有任何顯著的降解，而且應(yīng)該以生物活性形式和可重復(fù)的動(dòng)力學(xué)方式釋放。
一類符合生物相容性和生物降解成無(wú)害終產(chǎn)物的要求的聚合物是基于乳酸、羥基乙酸及其混合物的線性聚酯。這些聚合物以后也稱作PLGA。PLGA通過酯水解被降解成乳酸和羥基乙酸，并已顯示出具有優(yōu)異的生物相容性。PLGA的無(wú)害本質(zhì)還可以用管理機(jī)構(gòu)，包括美國(guó)食品與藥物管理局，對(duì)基于這些聚合物的幾種腸道外緩釋制劑的批準(zhǔn)使用來(lái)作為例證。
目前市售的基于PLGA的腸道外給藥緩釋產(chǎn)品包括DecapeptylTM(Ibsen Biotech)，Prostap SRTM(Lederle)，DecapeptylDepot(Ferring)和Zoladex(Zeneca)。這些制劑中的藥物全是肽。換言之，它們由濃縮到聚合物中的氨基酸構(gòu)成，該聚合物具有較低的聚合度，而且沒有任何確定的三維結(jié)構(gòu)。這往往使得在制備這些產(chǎn)品時(shí)可以使用較為嚴(yán)厲的條件。例如，可以采用擠壓和隨后減小尺寸的操作，而這些技術(shù)多半不能用于蛋白質(zhì)，因?yàn)橐话銇?lái)說，它們不能承受這樣嚴(yán)厲的條件。
因此，還需要有用于蛋白質(zhì)的可控釋放制劑。蛋白質(zhì)與肽相似，也是由氨基酸組成，但其分子更大，而且大多數(shù)蛋白質(zhì)就其很多性質(zhì)(包括生物活性和免疫原性)而言都依賴于完全確定的三維結(jié)構(gòu)。它們的三維結(jié)構(gòu)比較容易被例如高溫、表面誘導(dǎo)變性，以及在很多情形下被接觸有機(jī)溶劑所破壞。在將本身是一種優(yōu)異材料的PLGA用于蛋白質(zhì)緩釋時(shí)，一個(gè)很嚴(yán)重的缺點(diǎn)是需要用有機(jī)溶劑溶解該P(yáng)LGA，其附帶的危險(xiǎn)是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性會(huì)受到危害，而且蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化會(huì)引起患者的免疫反應(yīng)，這會(huì)由于形成抑制性抗體而造成療效喪失和有毒的副作用。因?yàn)橐隙ǖ嘏袛嘁环N復(fù)雜的蛋白質(zhì)是否在每一方面都保持其三維結(jié)構(gòu)十分困難，所以避免將蛋白質(zhì)暴露在可能引起構(gòu)象變化的條件非常重要。
盡管在改進(jìn)PLGA技術(shù)以避免在生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性這一固有問題方面作了很多努力，但在這一領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)展很慢，主要原因大概是大多數(shù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)太過于靈敏，無(wú)法承受使用的制造條件和由于PLGA基質(zhì)降解所形成的化學(xué)上酸性的環(huán)境?？茖W(xué)文獻(xiàn)中對(duì)于制造PLGA微球時(shí)由于接觸有機(jī)溶劑而產(chǎn)生的穩(wěn)定性問題有大量描敘。作為在PLGA基質(zhì)降解時(shí)形成的酸性環(huán)境的實(shí)例，近來(lái)已經(jīng)表明，在直徑約40μm的PLGA微球中pH值下降到1.5，這足以使很多可用于治療的蛋白質(zhì)變性或受到損害(Fu等，Visual Evidence of Acidic Environment withinDegrading Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)Microspheres，Pharmaceutical Research，Vol.17，No.1，2000，100-106)。假如微球的直徑較大，由于酸性降解產(chǎn)物更難擴(kuò)散走，而且自催化反應(yīng)加強(qiáng)，該pH值預(yù)期會(huì)進(jìn)一步下降。
目前最常用來(lái)包封水溶性物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)和肽)的技術(shù)是使用多重乳狀液體系。將藥物溶在水或緩沖溶液中，隨后與含有溶解的聚合物且與水不混溶的有機(jī)溶劑混合，結(jié)果形成以水相為內(nèi)相的乳狀液。為產(chǎn)生這種初始乳狀液，常使用不同類型的乳化劑和激烈的混合。然后將該乳狀液在攪拌下轉(zhuǎn)移到另一種液體(通常是水)中，該液體內(nèi)含有另一聚合物，例如聚乙烯醇，這樣產(chǎn)生了水/油/水三重乳狀液。隨后用某種方式使微球硬化，最常用的方式是使用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑，一般是二氯甲烷，并蒸發(fā)掉該溶劑。如果該有機(jī)溶劑不是與水完全不混溶，則可以采用連續(xù)萃取方法，向該三重乳狀液中加更多的水。文獻(xiàn)中還描述了這一通用步驟的某些變型。在某些情形，將最初的乳狀液與一非水相混合，例如與硅油混合。也可以使用固體藥物代替溶解的藥物。
WO-A1-9013780中描述了含蛋白質(zhì)的PLGA微球，其主要特點(diǎn)是在制備微球期間采用很低的溫度，以便保護(hù)蛋白質(zhì)的高生物活性。對(duì)于被包封的超氧化物歧化酶測(cè)定了活性，但只限于已經(jīng)從顆粒中釋放出的部分。在WO-A1-9412158中曾用這一方法制備含有人生長(zhǎng)激素的PLGA微球，其中人生長(zhǎng)激素是分散在含PLGA的二氯甲烷中，得到的分散體被噴霧到在一層液氮之下的冷凍的乙醇的容器中，以便使細(xì)小的液滴凍結(jié)，并在氮?dú)庵谐两档揭掖忌?。隨后使乙醇解凍，微球開始在乙醇中沉降，二氯乙烷被萃取到乙醇中，微球被硬化。采用這一方法，可以比大多數(shù)用來(lái)在PLGA微球中包封蛋白質(zhì)的其它方法更好地保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并且近來(lái)已有一種產(chǎn)品被美國(guó)的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。然而，對(duì)于其它蛋白質(zhì)仍然需要明確的證實(shí)，而且仍然存在被包封的生物活性物質(zhì)在PLGA基質(zhì)變性期間會(huì)暴露于很低pH的問題。
在以上的基于用PLGA包封的方法中，活性物質(zhì)仍暴露于有機(jī)溶劑中，一般來(lái)說，這對(duì)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有害。再者，所述的乳狀液方法復(fù)雜，而且在作任何放大成工業(yè)規(guī)模的嘗試時(shí)多半會(huì)有問題。另外，在很多這類方法中使用的有機(jī)溶劑，許多都存在環(huán)境問題，而且它們與PLGA聚合物的高親合性使得它們難以去除。
為了解決由于生物活性物質(zhì)暴露于微球基質(zhì)生物降解期間的化學(xué)上酸性的環(huán)境以及制造過程中的有機(jī)溶劑而引起的上述問題，已進(jìn)行了許多努力。為了避免降解期間的酸性環(huán)境，曾試圖用產(chǎn)生化學(xué)中性的降解產(chǎn)物的聚合物代替PLGA作為微球的基質(zhì)，而為了避免生物活性物質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，曾試圖事先制出微球，只是在已經(jīng)加工和干燥后才裝載生物活性物質(zhì)，或是試圖在制造微球期間排除或限制有機(jī)溶劑。
例如，曾經(jīng)將高度支化的較低分子量淀粉(麥芽糖糊精，平均分子量約5000道爾頓)用丙烯酰基共價(jià)改性，以便將這種淀粉轉(zhuǎn)化成能固化成微球的形式，所得到的聚丙烯?；矸弁ㄟ^在以甲苯/氯仿(4∶1)作為外相的乳狀液中輻射聚合，轉(zhuǎn)化成顆粒形式(Characterization of Polyacryl Starch Microparticles asCarriers for Proteins and Drugs，Arturason et al，J PharmSci，73，1507-1513，1984)。蛋白質(zhì)能被包封在這些微球中，但是制備條件中使生物活性物質(zhì)在制備乳狀液時(shí)既接觸有機(jī)溶劑又受到高剪切力。所得到的微球是以酶促方式溶解，預(yù)期其pH可保持中性。由于多種原因，這樣得到的微球不適合腸道外給藥，尤其是反復(fù)的腸道外給藥。最主要的是淀粉基質(zhì)(BiodegradableMicrospheres IV.Factors Affecting the Distribution andDegradation of Polyacryl Starch Microparticles，Laakao etal，J pharm Sci 75，962-967，1986)和將淀粉分子交聯(lián)的合成聚合物鏈的生物降解都不完全而且很慢。再者，這些微球過分地小，直徑小于2μm，不適合注射到組織內(nèi)持續(xù)釋放，因?yàn)榻M織的巨噬細(xì)胞很容易吞噬它們。通過引入潛在的可生物降解的酯基將丙烯?；Y(jié)合到這種高度支化的淀粉上以便提高降解速度和降解度的試圖，未能產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果，而且即使這些聚丙烯?；矸畚⑶蛟诤侠淼臅r(shí)間范圍內(nèi)生物降解也太慢和很不完全(BIODEGRADABLE MICROSPHERESSome Properties of PolyacrylStarch Microparticles Prepared from Acrylic acidEsterified Starch，Laakso and sjoholm，1987(76)，pp.935-939，J Pharm sci.)。
曾經(jīng)在雙水相體系中制備了聚丙烯?；暇厶俏⑶?Stenekes et al，The Preparation of Dextran Microsphares in an All-AqueousSystemEffect of the Formulation Parameters on ParticleCharicteristics，Pharmaceutical Research，Vol.15，No.4，1998，557-561，and Franssen and Hennink，A novelpreparation method for polymeric microparticlee withoutusing organic solvents，Int J Pharm 168，1-7，1998)。利用這種方式，防止了生物活性物質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，但在其它方面，微球的性質(zhì)與以上對(duì)聚丙烯?；矸畚⑶蛩龅南喈?dāng)，這使得它們不適合反復(fù)的腸道外給藥?？紤]到人類不具有特異的葡聚糖降解酶，其降解速度甚至?xí)染郾；矸畚⑶蚋?。使用葡聚糖還有引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)。
曾描述過利用油作為外相，用非化學(xué)改性的淀粉制造淀粉微球(US4,713,249；Schroder，U.，Crystallized carbohydrate spheres for slow release andtargeting，Methods Enzymol，1985(112)，116-128，Schroder，U.，Crystallized carbohydrate spheres as a slow releasematrix for biologically active substances，Bio-materials5100-104，1984)。在這些情形微球是通過在丙酮中沉淀被固化，這導(dǎo)致生物活性物質(zhì)在制造過程中既與有機(jī)溶劑接觸，又使得淀粉通過物理交聯(lián)固化的自然趨勢(shì)無(wú)法利用。這又會(huì)產(chǎn)生具有內(nèi)在不穩(wěn)定性的微球，因?yàn)檫@種淀粉在重新懸浮于水中和暴露于體液中時(shí)，會(huì)力圖形成這類交聯(lián)。為了得到油包水的乳狀液，需要使用高剪切力，所形成的微球太小，不適合腸道外持續(xù)釋放。
EP 213303 A2描述了在雙水相體系中利用淀粉物理交聯(lián)的形成而固化的天然能力制備未作化學(xué)改性的淀粉微球，以及在這些微球中將一種物質(zhì)固定，以避免生物活性物質(zhì)暴露于有機(jī)溶劑中。所描述的方法與所限定的淀粉質(zhì)量的組合未得到完全生物降解的顆粒。所得到的顆粒也不適合注射，特別是較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的反復(fù)注射，因?yàn)樗龅牡矸圪|(zhì)量中含有太大量的外源植物蛋白。與該專利所聲稱的相反，現(xiàn)已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，如果使用比形成雙水相體系所需的高得多的聚合物濃度，則可以使生物活性分子的收率和裝載率顯著提高，而且在得到穩(wěn)定、不聚結(jié)的微球及其尺寸分布的條件方面也有優(yōu)越性。所述的溫度處理不能用于敏感的大分子，這同樣適用于包括用乙醇或丙酮進(jìn)行干燥的加工過程。
曾報(bào)道過另一種在雙水相體系中制備微球的方法。在US 5981719中，將生物活性大分子與聚合物在接近該大分子的等電點(diǎn)的pH下混合來(lái)制備微球，并通過施加能量，優(yōu)選加熱，使微球穩(wěn)定。制劑中的大分子(即生物活性物質(zhì))的最低份額為40％，這對(duì)于大多數(shù)用途都太高，并且造成了活性物質(zhì)注射量的不確定性，因?yàn)槲⒘５膭┝孔兊锰?。雖然該制造方法被描述成是溫和的，并且能保持所截留的生物活性物質(zhì)的生物活性，但是微粒是通過加熱來(lái)穩(wěn)定，在給出的實(shí)施例中，在至少58℃下加熱30分鐘，在很多情形是在70-90℃加熱相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，不能期望敏感的蛋白質(zhì)能忍受這一條件，它們的生物活性依賴于三維結(jié)構(gòu)，即使該蛋白質(zhì)在表觀上能承受這一制備過程，仍然存在蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生小的、但不是不重要的變化的危險(xiǎn)。作為外相，總是使用兩種組合的聚合物，通常是聚乙烯吡咯烷酮和PEG，這使得制備過程變得復(fù)雜，因?yàn)檫@兩種物質(zhì)都必須以可重復(fù)和可靠的方式從微球中洗掉。所形成的微球太小(在實(shí)施例中，引用的直徑值低于0.1μm)，不適合例如皮下注射后的腸道外持久釋放，因?yàn)樵诮M織內(nèi)存在的專門吞噬顆粒的巨噬細(xì)胞能容易地吞噬直至5-10μm(可能至20μm)的微球，而被吞噬的顆粒在胞內(nèi)位于溶酶體中，在那里顆粒和生物活性物質(zhì)均被降解，從而失去療效。這種很小的顆粒尺寸還使微球的加工更復(fù)雜，因?yàn)椴荒懿捎闷谕姆椒?，例如過濾。這同樣適用于US 5849884。
US 5 578 709和EP 0 688 429 B1描述了使用雙水相體系制備大分子微粒溶液和脫水大分子經(jīng)化學(xué)交聯(lián)或熱交聯(lián)形成微粒。生物活性大分子的化學(xué)交聯(lián)，無(wú)論是自身交聯(lián)還是與微?；|(zhì)交聯(lián)，都是完全不受歡迎的，因?yàn)檫@類化學(xué)改性有許多嚴(yán)重的缺點(diǎn)，例如敏感性蛋白質(zhì)的生物活性降低和對(duì)新的蛋白質(zhì)抗原決定簇引入免疫響應(yīng)的危險(xiǎn)，結(jié)果需要進(jìn)行廣泛的毒理學(xué)研究以查驗(yàn)產(chǎn)品的安全性。先前已知用戊二醛化學(xué)交聯(lián)制成的微粒，一般認(rèn)為它們不適合對(duì)人類腸道外反復(fù)給藥。US 5 578 709中所述的微粒一般來(lái)說有對(duì)于US 5 981 719所述的同樣缺點(diǎn)，采用了不適合敏感性蛋白質(zhì)的制備條件，使其經(jīng)受化學(xué)改性或有害的溫度，并且其微粒尺寸分布太窄，不適合腸道外持續(xù)釋放，而且使微球的制備后的處理復(fù)雜化。
WO 97/14408描述了使用空氣懸浮技術(shù)制備用于腸道外給藥后持續(xù)釋放的微球，生物活性物質(zhì)不會(huì)與有機(jī)溶劑接觸。然而，該文獻(xiàn)沒有對(duì)本發(fā)明方法或據(jù)此可得到的新穎顆粒提供指導(dǎo)。
在US 5 470 582中，利用兩步法制備了由PLGA構(gòu)成的含大分子的微球，其中先用有機(jī)溶劑制備出微球本身，然后在后一步驟向已除去了有機(jī)溶劑的微球中裝入大分子。這一方法得到的生物活性物質(zhì)的含量太低，一般為1-2％，而且很大一部分是注射后立即釋放，這通常是完全不合適的。這一太快的初始釋放在1％裝載量時(shí)已經(jīng)很高，而當(dāng)微球中的生物活性物質(zhì)含量提高時(shí)還會(huì)更為顯著。在PLGA基質(zhì)降解時(shí)，pH會(huì)下降到敏感的大分子通常無(wú)法接受的水平。
淀粉在理論上是用于微粒的很合適的，或許是理想的基質(zhì)材料，這是早就知道的事實(shí)，因?yàn)榈矸鄄恍枰茉谟袡C(jī)溶劑中并具有自然固化的傾向，而且因?yàn)槿梭w內(nèi)有能夠?qū)⒌矸鄯纸獬蓛?nèi)源性和中性的物質(zhì)(最終是葡萄糖)的酶，還因?yàn)榈矸垡扬@示出是非免疫原性的，這可能是由于它與內(nèi)源性糖原的相似性。雖然經(jīng)過認(rèn)真的努力，但至今仍未報(bào)道具有能制造適合腸道外使用的微粒的性質(zhì)的淀粉，和能在溫和條件下制造完全生物降解的微粒的條件，這些條件使敏感的生物活性物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))得以被截留。
淀粉顆粒中天然地含有雜質(zhì)，例如淀粉蛋白質(zhì)，這使其不適合用于腸道外注射。在未充分純化的淀粉無(wú)意識(shí)沉積的情形，例如在手術(shù)中很多類型的手術(shù)手套敷有穩(wěn)定化的淀粉顆粒，可能會(huì)產(chǎn)生很嚴(yán)重的副作用。淀粉顆粒也內(nèi)在地不適合反復(fù)的腸道外給藥，因?yàn)樗鼈冊(cè)诳梢越邮艿臅r(shí)間間隔內(nèi)不能完全生物降解。
由酸解的和純化的淀粉制成的微球已經(jīng)用于對(duì)人的腸道外給藥。這類微球是在強(qiáng)堿性條件下用表氯醇化學(xué)交聯(lián)制成的。淀粉由此獲得的化學(xué)改性導(dǎo)致生物降解能力降低，因此，該微球可以被內(nèi)源性酶(例如α-淀粉酶)完全溶解，但不能完全轉(zhuǎn)化成作為終產(chǎn)物的葡萄糖。無(wú)論是制造方法，還是所得到的微球，都不適合用于敏感性蛋白質(zhì)的固定，這種基本上以水解的直鏈淀粉為基礎(chǔ)的酸解淀粉也不適合制備可完全生物降解的淀粉微球，或含有高載量生物活性物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的淀粉微球。
羥乙基淀粉(HES)是作為血漿代用品以高劑量對(duì)人腸道外施用。HES是由得自大體上只含高度支化的支鏈淀粉(所謂的“含蠟玉米”)的淀粉的淀粉顆粒制備的，將其酸解以降低分子量分布，隨后在堿性條件下羥乙基化，并再次酸解，達(dá)到平均分子量約為200,000道爾頓。在這之后，過濾并用丙酮萃取，進(jìn)行噴霧干燥。羥乙基化的目的是延長(zhǎng)作用的持續(xù)時(shí)間，因?yàn)槲锤男缘闹ф湹矸酆芸炀捅沪?淀粉酶降解，它在循環(huán)中的停留時(shí)間約為10分鐘。HES不適合制備可完全生物降解的含生物活性物質(zhì)的微球，因?yàn)榛瘜W(xué)改性造成了生物降解速度和完全性降低，并造成了淀粉通過形成非共價(jià)交聯(lián)而固化的天然傾向的消失。再者，高度濃縮的HES溶液太粘，無(wú)法用于制造微粒。在這樣高劑量使用HES確實(shí)表明了可以制備出能腸道外使用的淀粉，雖然HES不適合制備沒有化學(xué)交聯(lián)和不用有機(jī)溶劑沉淀的微球。
WO 99/00425描述了使用具有很寬的pH優(yōu)值的耐熱蛋白水解酶來(lái)清洗表面結(jié)合了蛋白質(zhì)的淀粉顆粒。所得到的顆粒不適合腸道外給藥，因?yàn)樗鼈內(nèi)院写嬖谟陬w粒內(nèi)的淀粉蛋白質(zhì)，而且還有在顆粒內(nèi)留下所加蛋白水解酶殘余物的危險(xiǎn)。這些顆粒也不適合在雙水相體系中制備可腸道外給藥的淀粉微球，因?yàn)榧仁乖诘斫庵?，也不具備能在足夠高濃度下使用的正確的分子量分布，而且在可以得到微球的場(chǎng)合，它們多半不能完全生物降解。
在US 5,455,342和WO 93/21008中描述了利用剪切來(lái)調(diào)整淀粉的分子量分布，以便制備出用于生產(chǎn)片劑的更好的淀粉。所得到的淀粉不適合腸道外給藥，因?yàn)樗牡矸鄣鞍踪|(zhì)含量高，這些蛋白質(zhì)在剪切后可能以變性形式存在，而且所得到的淀粉也不適合制備用于腸道外給藥的可生物降解的淀粉微球，或用于在雙水相體系中制備這類淀粉微球。如WO 96/10042中所述，剪切還被用來(lái)制備羥乙基淀粉。然而，由于類似的原因，這些羥乙基淀粉既不適合腸道外給藥，也不適合制備上面述及的微球。
因此，極其需要一種具有以下特點(diǎn)的制備可腸道外給藥的淀粉制劑的方法●能將敏感的生物活性物質(zhì)截留在微球中并保持其生物活性；●能在生物活性物質(zhì)不暴露于有機(jī)溶劑、高溫或高剪切力的條件下將其截留并保持其生物活性；●使得可腸道外給藥的制劑能大量承載敏感性生物活性物質(zhì)；●可以制備出基本上可完全生物降解和生物相容的制劑，它們適合腸道外注射并在降解時(shí)形成化學(xué)上中性的內(nèi)源性物質(zhì)；●制備出粒度超過20μm，優(yōu)選超過30μm的可腸道外注射的制劑，以便避免組織巨噬細(xì)胞的吞噬，并簡(jiǎn)化制備中的加工工藝；●能制備出含生物活性物質(zhì)的微粒，該微粒可作為中間產(chǎn)物，用來(lái)制備可控、持續(xù)或延遲釋放的制劑，并且能對(duì)被截留的生物活性物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制；●使用腸道外可接受的淀粉，該淀粉適合制備基本上可完全生物降解的淀粉微粒；
●一種基本上可完全生物降解和生物相容的微粒制劑，該制劑適合腸道外注射，并在降解時(shí)形成化學(xué)上中性的內(nèi)源性物質(zhì)；●一種含生物活性物質(zhì)并具有一定的顆粒大小分布的微粒制劑，它適合用空氣懸浮技術(shù)包覆，并具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行此項(xiàng)處理。
通過下面定義的本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了這些目標(biāo)及其它目標(biāo)。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，它涉及一種制備微粒的方法。更具體地說，涉及制備含生物活性物質(zhì)的微粒，該微粒計(jì)劃用于對(duì)動(dòng)物，尤其是人，腸道外施用該生物活性物質(zhì)。所述的腸道外施用主要是指該微粒打算用于注射。
因?yàn)樵撐⒘Ｖ饕蛩阌糜谧⑸洌运绕涫且粋€(gè)制備平均粒徑為10-200μm，一般為20-100μm，特別是20-80μm的顆粒的問題。
本發(fā)明中所說的“微?！笔菍?duì)于本領(lǐng)域已知的一定大小的顆粒的一般表示。一類微粒是基本為球形的微球，但微粒一詞一般可以包括與這樣一種理想的球形的偏離。與已知作法相一致，本領(lǐng)域已知的術(shù)語(yǔ)微膠囊也包括在微粒一詞中。
本發(fā)明的方法更具體地包括a)制備含淀粉的淀粉水溶液，淀粉中支鏈淀粉的含量超過85％重量，其中該支鏈淀粉的分子量已被降低，使得該物質(zhì)的至少80％重量處于10-10,000×103道爾頓之間，每克淀粉干重中的氨基酸氮含量少于50μg，溶液中的淀粉濃度為至少20％重量，b)將生物活性物質(zhì)與淀粉溶液在一定條件下混合，結(jié)果形成該物質(zhì)在淀粉溶液中的溶液、乳狀液或懸浮液等形式的組合物，c)將步驟b)中得到的組合物與能形成雙水相體系的聚合物水溶液混合，從而形成淀粉液滴的乳狀液，該液滴在聚合物溶液的外相中含有生物活性物質(zhì)作為內(nèi)相，d)使步驟c)中得到的淀粉液滴藉助淀粉固化的自然傾向發(fā)生膠凝，形成淀粉顆粒，e)將該淀粉顆粒干燥，及f)任選地向干燥的淀粉顆粒施涂一個(gè)用于控制釋放的生物相容和可生物降解的聚合物殼層，優(yōu)選用空氣懸浮法施涂。
換言之，本發(fā)明的一個(gè)重要方面是使用一定類型的淀粉作為微粒基質(zhì)。在瑞典專利申請(qǐng)No.0003616-0中描述了一種特別合適的淀粉及其制備方法。在這種情形利用剪切實(shí)現(xiàn)分子量降低。在與本發(fā)明共同未決的一項(xiàng)標(biāo)題為“淀粉”的PCT申請(qǐng)中公開了另一種適用的淀粉。
在后面提到的情形，分子量降低是用酸解法完成。
換言之，關(guān)于淀粉的細(xì)節(jié)可以由所述專利申請(qǐng)中得到，它在這方面的內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的方式引入本文中。
這樣一種淀粉的另一些重要特點(diǎn)將在下面說明。為了能在雙水相體系中形成具有高的活性物質(zhì)收率的可完全生物降解的微粒，以及得到的淀粉微粒能具有下面敘述的性質(zhì)，該淀粉通常必須主要由高度支化的淀粉構(gòu)成，它以自然狀態(tài)位于淀粉顆粒中，被稱作支鏈淀粉。它還應(yīng)具有一定的分子量分布，使得有可能獲得所要求的濃度和膠凝速度。
在這方面可以補(bǔ)充的是，術(shù)語(yǔ)“可生物降解的”意味著微粒在腸道外給藥后被溶在體內(nèi)，形成內(nèi)源性物質(zhì)，最終形成例如葡萄糖。生物降解能力能夠通過在體外與合適的酶，例如α-淀粉酶，一起培養(yǎng)來(lái)測(cè)定或檢驗(yàn)。在這種情形，在培養(yǎng)期間宜加酶若干次，以便確保在培養(yǎng)混合物中活性酶一直存在。生物降解能力也能夠通過腸道外注射(例如皮下或肌內(nèi)注射)微粒并在各個(gè)時(shí)間對(duì)組織進(jìn)行組織檢驗(yàn)來(lái)確定。
可生物降解的淀粉微粒通常在幾周內(nèi)，一般在一周內(nèi)，從組織中消失。在淀粉微粒包覆著控制釋放的殼層(例如帶涂層淀粉)的情形，一般是該殼層決定了生物降解速度，而這又決定了α-淀粉酶何時(shí)可被淀粉基質(zhì)利用。
生物降解能力也可以通過腸道外(例如皮下或肌內(nèi))施用微粒并對(duì)組織進(jìn)行組織檢驗(yàn)來(lái)確定，重要的是要記住，生物活性物質(zhì)(經(jīng)常是蛋白質(zhì))如果施用在另一物種中，自身能引發(fā)免疫防衛(wèi)反應(yīng)。例如，很多種重組生成的人類蛋白質(zhì)能在試驗(yàn)動(dòng)物中產(chǎn)生免疫響應(yīng)。
淀粉還必須具有對(duì)于制造可腸道外給藥的制劑合格的純度。它還必須能在足夠高的濃度形成充分穩(wěn)定的溶液，以使生物活性物質(zhì)能在可以保留其生物活性的條件下進(jìn)行混合，同時(shí)必須能自發(fā)地以可控方式固化，以便得到穩(wěn)定而又可生物降解的微粒。為了防止生物活性物質(zhì)分布到外相或內(nèi)相與外相之間的界面上的數(shù)量達(dá)到不可接受的程度，淀粉的高濃度也是重要的。
關(guān)于淀粉的一些優(yōu)選的實(shí)施方案如下。
淀粉的純度優(yōu)選為每克淀粉干重中含至多20μg，更優(yōu)選為至多10μg，最好是5μg氨基酸氮。
上述支鏈淀粉的分子量?jī)?yōu)選被降低，例如至少80％重量的物質(zhì)的分子量處在100-4000×103道爾頓的范圍，更優(yōu)選為200-1000×103道爾頓，最好是300-600×103道爾頓。
此外，淀粉中上述分子量降低的支鏈淀粉的含量?jī)?yōu)選超過95％重量，更優(yōu)選超過98％重量。當(dāng)然也可以由100％重量的這種支鏈淀粉構(gòu)成。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，淀粉屬于溶在水中的濃度能超過25％重量的那一類型。這通常意味著能根據(jù)本身已知的技術(shù)在水中溶解，即，通常在升溫下(例如最高達(dá)約80℃)溶解。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，淀粉中基本上沒有在羥乙基淀粉中存在的那類共價(jià)結(jié)合的附加化學(xué)基團(tuán)。這一般意味著，淀粉基本上只含有在天然淀粉中存在的那類基團(tuán)，而且未以任何方式進(jìn)行例如羥乙基淀粉中的那類改性。
另一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及內(nèi)毒素含量少于25EU/g的淀粉。
再一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及每克中含有少于100個(gè)微生物，甚至常少于10個(gè)微生物的淀粉。
該淀粉可以進(jìn)一步定義成，利用堿水溶液洗滌，基本上純化除掉了定位于表面的蛋白質(zhì)、類脂和內(nèi)毒素，利用剪切處理降低了分子量，以及利用離子交換色譜法，優(yōu)選利用陰離子交換色譜法，純化去除了內(nèi)部蛋白質(zhì)。
就所有上下文中涉及的純度而言，一般來(lái)說，“本質(zhì)上”或“基本上”這類表達(dá)通常是指最少90％，例如95％、99％或99.9％。
交鏈淀粉構(gòu)成所用淀粉的主要組分一般是指，以淀粉的干重為基礎(chǔ)計(jì)算，其份額為60-100％重量。
在某些情形，使用較小份額，例如2-15％重量的短鏈直鏈淀粉對(duì)于調(diào)節(jié)步驟d)中的膠凝速度會(huì)有好處。該直鏈淀粉的平均分子量?jī)?yōu)選為2.5-70×103道爾頓，尤其是5-45×103道爾頓。關(guān)于短鏈直鏈淀粉的其它細(xì)節(jié)可以由美國(guó)專利說明書3,881,991得到。
在步驟a)的淀粉溶液的形成中，一般采用本身已知的技術(shù)加熱以溶解淀粉。一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案同時(shí)涉及將淀粉在壓熱下溶解，它還優(yōu)選地被滅菌。這一壓熱處理是在水溶液中，例如在注射用水或合適的緩沖液中實(shí)現(xiàn)的。
如果生物活性物質(zhì)是一種敏感性蛋白或其它的熱敏性物質(zhì)，則淀粉溶液在與所述物質(zhì)混合前必須先冷卻到合適的溫度。什么溫度合適首先取決于生物活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，但是一般來(lái)說，低于約60℃，優(yōu)選低于55℃的溫度是合適的。
根據(jù)一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案，活性物質(zhì)是與溫度最高60℃，更優(yōu)選最高55℃，最好是20-45℃，特別是30-37℃的淀粉溶液混合。
另外，對(duì)于步驟b)中的混合操作，淀粉∶生物活性物質(zhì)的重量比宜在3∶1至10,000∶1的范圍內(nèi)，優(yōu)選為3∶1至100∶1。
對(duì)于混合操作，同樣是在形成步驟c)中的雙水相之前，先將活性物質(zhì)與淀粉溶液混合。該活性物質(zhì)可以是溶解在例如緩沖液中的形式，或者是固體(無(wú)定形的或晶體)，并處在合適的溫度，一般是在室溫(20℃)和45℃之間，優(yōu)選最高為37℃?？梢詫⒌矸廴芤杭拥缴锘钚晕镔|(zhì)中，或者是反向操作。因?yàn)檫m合用于這一體系的生物活性物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)，一般都是大分子，所以在將大分子溶液與淀粉混合時(shí)，有可能形成一種乳狀液，其中大分子一般代表內(nèi)相，或是沉淀物。這是完全可以接受的，只要生物活性物質(zhì)保持或不明顯地喪失其生物活性。于是，通過用合適的技術(shù)進(jìn)行攪拌產(chǎn)生了均勻的溶液、乳狀液或懸浮液。這種技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，例如磁力攪拌、葉片攪拌或者使用一種或多種靜態(tài)混合器。本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案在這種情形的代表是使用葉片式攪拌。
在本發(fā)明的淀粉微粒的制備中，要將生物活性物質(zhì)摻入淀粉溶液中并將溶液中的淀粉轉(zhuǎn)化成固體形式，淀粉的濃度應(yīng)至少為20％重量以便能形成具有良好性質(zhì)的淀粉微球。實(shí)際上，在各種情形下效果最佳的淀粉濃度應(yīng)該在微球中的承載物是各情形中所需物質(zhì)的情況下，以簡(jiǎn)單的方式對(duì)各生物活性物質(zhì)逐步增量確定。在這方面應(yīng)該指出，要摻入微粒中的生物活性物質(zhì)會(huì)影響兩相體系和淀粉的膠凝性質(zhì)，這也意味著，為了確定各個(gè)情形下的最佳條件，要進(jìn)行通常的預(yù)備性試驗(yàn)。這些試驗(yàn)通常表明，淀粉濃度最好應(yīng)至少為30％重量，在某些特殊情形至少為40％重量。作為最高極限，通常可用50％重量，尤其是至多45％重量。如果不使用分子量降低的高度支化的淀粉，一般不可能得到這些高淀粉濃度。
關(guān)于步驟c)中用于形成雙水相體系的聚合物，單就該技術(shù)領(lǐng)域而言，已提到了很多種能與作為內(nèi)相的淀粉形成雙水相體系的聚合物。所有這些聚合物都必須被認(rèn)為屬于本發(fā)明的領(lǐng)域。然而，這方面特別合適的一種聚合物是聚乙二醇。這種聚乙二醇優(yōu)選平均分子量為5-35×103道爾頓，更優(yōu)選為15-25×103道爾頓，尤其是約20×103道爾頓。
將聚合物以合適的濃度溶于水或水溶液(這種說法也包括了緩沖液)，并將溫度調(diào)節(jié)至合適溫度。該溫度優(yōu)選在4至50℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為10-40℃，最好是10-37℃。水溶液中的聚合物濃度至少為20％重量，優(yōu)選至少為30％重量，而更合適的是至多45％重量。特別優(yōu)選的濃度范圍是30-40％重量。
步驟c)中的混合操作可以以很多種不同方式進(jìn)行，例如使用葉片攪拌或者至少一種靜態(tài)混合器?；旌贤ǔＴ?-50℃、優(yōu)選20-40℃、經(jīng)常是在約37℃下進(jìn)行。在一種間歇式方法中，可以將淀粉溶液加到聚合物溶液中，或者反過來(lái)。當(dāng)使用靜態(tài)混合器或摻合機(jī)的情形，操作時(shí)宜將兩種溶液泵入兩根分開的管道中，再并入包含摻合機(jī)的總管道。
乳狀液可以利用低剪切力形成，因?yàn)榕c油/水或水/油乳狀液不同，水/水乳狀液的相間不存在高表面張力，而且在這種情形，要使液滴達(dá)到一定的大小分布要克服的主要是淀粉溶液的粘度。在大多數(shù)情形，磁力攪拌或葉片攪拌已經(jīng)足夠。在規(guī)模較大時(shí)，例如當(dāng)要制備的微粒的量超過50g時(shí)，宜使用所謂的折流板以便在所用的容器內(nèi)實(shí)現(xiàn)更有效的攪拌。另一種形成水/水乳狀液的方法是使用至少一個(gè)靜態(tài)混合器，將淀粉溶液適宜地以受控速度泵入放置了靜態(tài)混合器的管道中。泵送可以用任何類型的合適的泵進(jìn)行，只要它在這些條件下給出均勻的流速，不使混合物受到不必要的高剪切力，并且在純度和不泄漏不良物質(zhì)方面對(duì)于制備腸道外制劑是可接受的。在使用靜態(tài)混合器產(chǎn)生乳狀液的那些情形，在具有合適攪拌的容器中進(jìn)行形成微粒的固化過程也是有利的。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是在步驟c)中以至少兩步將聚合物溶液加到組合物中，其中在乳狀液已經(jīng)生成或開始生成之后再進(jìn)行混合。
當(dāng)然，分成多步加入聚合物，以及改變例如所用聚合物的平均分子量和/或濃度，例如為了在需要時(shí)增加內(nèi)相中的淀粉濃度，也屬于本步驟c)中的混合操作還適宜在這樣的條件下進(jìn)行，在該條件下形成的淀粉液滴具有微粒所需要的尺寸，即，優(yōu)選其平均直徑在干燥狀態(tài)下為10-200μm，優(yōu)選20-100μm，更優(yōu)選20-80μm。
在制備本發(fā)明的微粒時(shí)，重要的是要通過淀粉膠凝的自然傾向或者能力發(fā)生固化，而不是通過用有機(jī)溶劑(例如丙酮)沉淀。后一方法可能導(dǎo)致在很多情形是不可接受的生物活性物質(zhì)與有機(jī)溶劑的接觸，以及為了以可控方式得到穩(wěn)定的微粒所需要的自然形成物理交聯(lián)不再存在。
就微粒的固化而言，重要的是它應(yīng)該在對(duì)于所摻入的生物活性物質(zhì)是溫和的條件下進(jìn)行。換言之，主要問題是所用的溫度不要損害現(xiàn)有的物質(zhì)。在這方面，已經(jīng)令人驚奇地表明，如果在固化期間使用一個(gè)以上的溫度或溫度水平，則更容易滿足這一標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)于形成具有合適大小分布的穩(wěn)定微粒的要求。如果雙水相體系內(nèi)的固化過程的起始溫度比固化最終階段所用的溫度較低，則特別有利。一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在1-20℃開始固化過程，優(yōu)選1-10℃，尤其是4℃左右，但在20-55℃結(jié)束，優(yōu)選25-40℃，尤其是37℃左右。
對(duì)于所選擇條件的正確性和適當(dāng)性的證實(shí)可以由以下幾方面確定淀粉微粒具有所要求的大小分布，在隨后的洗滌和干燥操作中穩(wěn)定，在體外完全用酶促法可基本上溶解，以及/或摻入的物質(zhì)被有效的包封并保持其生物活性。最后所說的一點(diǎn)通常是在微粒于溫和的條件下經(jīng)酶促溶解之后用色譜法或用本領(lǐng)域已確立的方法在體外或體內(nèi)檢驗(yàn)，并且是保證敏感性生物活性物質(zhì)能被健全和可靠地制備的重要因素。微粒能在溫和條件下完全溶解是一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@減小了在需要有機(jī)溶劑溶解微粒時(shí)常常發(fā)現(xiàn)的制備誘發(fā)的人為效應(yīng)物，例如在包含PLGA基質(zhì)時(shí)的情形。
所形成的微粒優(yōu)選以合適的方式洗滌，以便除去外相和任何多余的活性物質(zhì)。這種洗滌宜用過濾方式進(jìn)行，微粒的良好的機(jī)械穩(wěn)定性和合適的大小分布使其成為可能。用離心方式洗滌，去掉清液并再懸浮于洗滌介質(zhì)中，常常也是合適的。在每個(gè)洗滌過程中使用一種或多種合適的洗滌介質(zhì)，該介質(zhì)一般是含緩沖劑的水溶液。在這方面，如果需要，可以利用篩分以調(diào)節(jié)微粒的大小分布，例如除掉太小的那部分微粒和保證最終產(chǎn)物中沒有一定尺寸以上的微粒。
微?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆绞礁稍?，例如噴霧干燥、冷凍干燥或真空干燥。在各個(gè)情形中選擇何種干燥方法常常取決于什么最適合保持被包封的生物活性物質(zhì)的生物活性。工藝考慮也起作用，例如生產(chǎn)能力和純度。冷凍干燥經(jīng)常是優(yōu)選的干燥方法，因?yàn)樵谡_的設(shè)計(jì)條件下，它對(duì)于被包封的生物活性物質(zhì)是特別溫和。所摻入的生物活性物質(zhì)保持其生物活性可以用適合微粒的分析方法在該物質(zhì)于溫和條件下酶催溶解后確定。適合與淀粉一起使用的酶是α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶，單獨(dú)使用或組合使用，重要的是要確定它們不含可能存在的能降解蛋白質(zhì)的蛋白酶。蛋白酶的存在可以用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)，例如，在對(duì)照試驗(yàn)中將生物活性物質(zhì)與打算使用的酶混合物混合，在以后準(zhǔn)備用于溶解微粒的條件下培養(yǎng)后，按常用方式測(cè)定其完整性。
所用的酶可能需要純化以除掉沾染的蛋白酶，以避免在微粒中摻入的敏感性物質(zhì)，例如重組蛋白，發(fā)生人為降解。這這用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行，例如利用與合適的色譜材料結(jié)合的α2-巨球蛋白進(jìn)行色譜分離。
為了調(diào)節(jié)微球的釋放性質(zhì)，還可以涂上一個(gè)由可生物降解和生物相容的聚合物組成的殼層或涂層。這方面的合適的聚合物實(shí)例可在先有技術(shù)，例如EP 535 937中查到，特別要提到的是乳酸和羥基乙酸的聚合物(PLGA)。所述的殼層優(yōu)選用空氣懸浮法施涂。在WO97/14408中描述了一種特別合適的這類技術(shù)，這方面的細(xì)節(jié)可以由該文獻(xiàn)得到，其內(nèi)容包括在本文中作為參考文獻(xiàn)。用本發(fā)明方法得到的淀粉微粒非常適合于用空氣懸浮技術(shù)包覆，所得到的包覆過的微粒特別適合腸道外給藥。
在使用制得的微粒時(shí)，它們或是用或不用控制釋放的外殼包覆，干燥的微粒則懸浮于合適的介質(zhì)中，使得有可能用于注射。這方面的此類介質(zhì)和方法是本領(lǐng)域所熟知的，這里不再詳細(xì)說明。實(shí)際的注射可通過合適的針頭或用無(wú)針注射器完成。還可以用干粉注射器注射微粒，而不必事先再懸浮于注射介質(zhì)中。
除了上面已討論的優(yōu)點(diǎn)以外，本發(fā)明的方法還具有其它優(yōu)點(diǎn)，即，生物活性物質(zhì)的收率通常很高，可以做到微粒內(nèi)生物活性物質(zhì)含量很高，同時(shí)保持其生物活性；得到的微粒具有適合用于腸道外可控(例如延遲或持續(xù))釋放的大小分布，因?yàn)樗鼈兇蟮貌荒鼙痪奘杉?xì)胞吞噬，而又小得足以經(jīng)過小號(hào)針頭(例如23G-25G)注射；以及微球在降解時(shí)形成內(nèi)源性和中性降解產(chǎn)物，這意味著可以防止活性物質(zhì)暴露于過低的pH值。再者，該方法本身特別適合于嚴(yán)格的質(zhì)量控制。
本發(fā)明方法對(duì)于蛋白質(zhì)、肽、多肽、聚核苷酸和多糖，或者一般來(lái)說，對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感或于其中不穩(wěn)定的其它藥物或生物活性物質(zhì)，主要是水溶性物質(zhì)，尤其有用。重組形成的蛋白質(zhì)是很有意義的一組生物活性物質(zhì)。然而一般來(lái)說，本發(fā)明不限于這些物質(zhì)的存在，因?yàn)楸景l(fā)明的概念適用于可以腸道外給藥的任何生物活性物質(zhì)。除了與敏感性或不穩(wěn)定性問題有關(guān)之外，本發(fā)明在去除溶劑會(huì)很困難或者可能產(chǎn)生毒性或其它環(huán)境問題的情形也會(huì)特別有用。
要使用的各類生物活性物質(zhì)是例如重組蛋白，糖基化的重組蛋白，聚乙二醇化的重組蛋白，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，凝血因子，單克隆抗克，LHRH類似物及疫苗。
這些物質(zhì)的具體實(shí)例是生長(zhǎng)激素，紅細(xì)胞生成素及其類似物，干擾素(α，β，γ)，凝血因子V-XIII，C蛋白，胰島素及其衍生物，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞集落刺激因子，白介素，胰高血糖素樣肽1或2，C-肽，瘦身蛋白，腫瘤壞死因子和表皮生長(zhǎng)因子。
適用的非蛋白質(zhì)藥物類型的生物活性物質(zhì)可以從下列物質(zhì)中選擇抗腫瘤劑，抗生素，消炎劑，抗組胺藥，鎮(zhèn)鎮(zhèn)劑，肌肉松馳劑，抗癲癇藥，抗抑郁藥，抗過敏劑，支氣管擴(kuò)張劑，強(qiáng)心劑，抗心律不齊劑，血管擴(kuò)張劑，抗糖尿病藥，抗凝血?jiǎng)?，止血?jiǎng)?，麻醉劑和甾族化合物?br> 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它還涉及可用本發(fā)明方法得到的那類新穎微粒。然而，本發(fā)明的這種新穎微粒不限于可用所述方法制備的那些微粒，而是包括所述的各類微粒，不管其制備方法如何。
更具體地說，這些是適合以腸道外方式，優(yōu)選以注射方式，向哺乳動(dòng)物，尤其是向人給藥的微粒，微粒中含有生物活性物質(zhì)，該微?；旧嫌芍ф湹矸酆砍^85％重量的淀粉構(gòu)成，其至少80％重量的平均分子量在10-1000×103道爾頓的范圍，氨基酸含量少于每克干重淀粉中50μg，并且淀粉分子之間沒有共價(jià)化學(xué)交聯(lián)。
作為所述微粒的基礎(chǔ)的淀粉優(yōu)選是以上就本發(fā)明方法所限定的幾類淀粉之一。
根據(jù)本發(fā)明微粒的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案，微粒中的生物活性物質(zhì)的生物活性至少是該物質(zhì)摻入到淀粉中之前所顯示的生物活性的80％，優(yōu)選至少為90％。該生物活性最好是在微粒中基本上保留或保存。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案表現(xiàn)為微粒在體外于α-淀粉酶和/或淀粉葡糖苷酶存在下是可生物降解的。
另一實(shí)施方案顯示出微粒是可生物降解的，在皮下或肌內(nèi)給藥后會(huì)從組織中消除。
一項(xiàng)特別優(yōu)選的微粒實(shí)施方案表現(xiàn)出這些顆粒帶有由至少一種成膜、可生物降解及生物相容的聚合物構(gòu)成的控制釋放的殼層。
所述聚合物優(yōu)選是由α-羥基酸制成的均聚物或共聚物，該α-羥基酸優(yōu)選是乳酸和/或羥基乙酸。另一種變型是α-羥基酸的環(huán)狀二聚體，優(yōu)選選自乙交酯和丙交酯。
這些聚合物或二聚體(例如PLGA型)在先有技術(shù)中有確切的描述，因此其進(jìn)一步細(xì)節(jié)可由它們得到。
另一實(shí)施方案表現(xiàn)為，微球中的殼層除了該聚合物以外，還含有至少一種調(diào)節(jié)釋放的物質(zhì)。這種物質(zhì)優(yōu)選是水溶的或是水中微溶的。它優(yōu)選選自乳酸，含乳酸的低聚物和羥基乙酸。
它還可有利地選自聚乙二醇(PEG)和含PEG作為嵌段之一的嵌段共聚物。
另一有意義的實(shí)施方案的代表是帶有一個(gè)外層的微粒，該外層由具有防止微粒聚結(jié)的能力的至少一種水溶性物質(zhì)構(gòu)成。
微粒的另一優(yōu)選實(shí)施方案的代表當(dāng)然是利用上述的方法，一般地或以所述方法的任何優(yōu)選實(shí)施方案的形式，可得到的或制得的那些微粒。
關(guān)于含活性物質(zhì)的微粒的生物活性的測(cè)定，必須以適合各個(gè)生物活性物質(zhì)的方式進(jìn)行。在用動(dòng)物試驗(yàn)的形式進(jìn)行測(cè)定的情形，注射一定數(shù)量的摻入到淀粉微粒中的生物活性物質(zhì)，這也許是在這些微粒預(yù)先在溫和條件下酶促溶解之后，將生物響應(yīng)與注射相應(yīng)數(shù)量的同一生物活性物質(zhì)的合適溶液之后的響應(yīng)作比較。在體外進(jìn)行比較的情形，例如在試管或在細(xì)胞培養(yǎng)物中比較，該生物活性物質(zhì)最好是在評(píng)價(jià)前通過將淀粉微球于溫和條件下酶促溶解變成可充分利用，隨后測(cè)定活性并與具有相同濃度該生物活性物質(zhì)的對(duì)照溶液進(jìn)行比較?？傊?，評(píng)價(jià)應(yīng)包括淀粉微球的降解產(chǎn)物的任何非特異性作用。
現(xiàn)在將參照以下的非限制性實(shí)施例解釋本發(fā)明。除非另外說明，這些實(shí)施例與本文的其它部分一樣，所述的百分含量是指重量百分含量。實(shí)施例1至7涉及對(duì)比試驗(yàn)，而實(shí)施例8至13代表本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1a-1e-b對(duì)照試驗(yàn)制備淀粉微球的步驟是按照EP 213303 A2。這些對(duì)照試驗(yàn)的目的是顯示現(xiàn)有技術(shù)水平。淀粉濃度通常為5％，PEG濃度為6％(平均分子量6000道爾頓)。將10g淀粉溶液倒入5g PEG溶液(溫度調(diào)節(jié)至70℃)中并穩(wěn)定之，同時(shí)在室溫下攪拌過液。然后將該物質(zhì)再懸浮于95％乙醇中，因?yàn)闊o(wú)法將其過濾。在各個(gè)不同階段觀察分離的微球的產(chǎn)生，并在可能時(shí)在回收后于體外用α-淀粉酶分析其生物降解能力。最初試圖用過濾法回收微球，但因無(wú)法進(jìn)行，故采用離心(Sorfvall，SS34，5分鐘，10000rpm，20℃)，去掉上層清液，加入10ml 95％乙醇。
實(shí)施例1a由土豆淀粉制備淀粉微球土豆淀粉(Acros organics，Lot No.A013642301)即使在5％也形成很高粘度的透明溶液。經(jīng)穩(wěn)定過夜后，未形成分離的微球，而是形成一種沉淀。用95％的乙醇洗后，沒有發(fā)現(xiàn)分離的淀粉微球，而是一種相當(dāng)硬的粘性團(tuán)塊。
實(shí)施例1a-b制備含BSA的淀粉微球按照實(shí)施例1a制備淀粉微球，其不同在于，將蛋白質(zhì)(牛血清蛋白(BSA)，20％，0.1mL)與淀粉溶液混合，然后生成雙相體系。在穩(wěn)定過夜后，未形成分離的微球，而是一種沉淀，在用95％乙醇洗后得到粘稠的團(tuán)塊，但沒有分離的微球。
實(shí)施例1b
由可溶性淀粉制備淀粉微球可溶性淀粉(Baker BV-Deventer Holland，Lot No.M27602)在熱至95℃時(shí)形成有些乳光的溶液。在攪拌過夜后無(wú)分離的微球形成，而是形成一種沉淀。在用95％乙醇洗后，觀察不到分離的微球，而是淀粉以小礫石樣的顆粒形式沉淀。經(jīng)干燥后，由總計(jì)500mg淀粉中得到約4mg顆粒。在體外用α-淀粉酶培養(yǎng)時(shí)，約65％的淀粉基質(zhì)具有抗性，不溶解。
實(shí)施例1b-b在由可溶性淀粉制備的淀粉微球中摻入BSA重復(fù)實(shí)施例Ib的方法，但是將BSA(20％，0.1ml)與淀粉溶液混合，然后產(chǎn)生雙相體系。在穩(wěn)定過夜后，形成了分離的顆粒，將其回收，隨后在體外用α-淀粉酶培養(yǎng)，分析生物降解能力，結(jié)果是約57％的基質(zhì)可溶。蛋白質(zhì)收率低，不能定量測(cè)定，因?yàn)槲⑶虿糠秩芙夂蟮玫降臐舛缺菻PLC方法標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低標(biāo)準(zhǔn)要低。
實(shí)施例1c由氧化的可溶性淀粉制備淀粉微球淀粉(Perfectamyl A3108，stadex)在熱至95℃后形成透明的溶液。在穩(wěn)定過夜后不形成分離的微球，而且樣品中完全看不到固體物質(zhì)。
實(shí)施例1c-b向由可溶性淀粉制備的微球中摻入BSA重復(fù)實(shí)施例1c的方法，只是用BSA(20％，0.1ml)與淀粉溶液混合，然后生成雙相體系。在穩(wěn)定化后，觀察到與淀粉不相似的沉淀，在洗滌和干燥后，得到約2mg固體物質(zhì)。
實(shí)施例1d由天然的高度支化淀粉(支鏈淀粉)制備淀粉微球。
天然的支鏈淀粉(Cerestar SF 04201)在熱至95℃時(shí)形成透明的粘稠溶液。攪拌過夜后，觀察不到分離的微球，但該樣品中含某種沉淀物。用95％乙醇洗后，樣品變成漿狀塊體，不含分離的淀粉微粒。
實(shí)施例1d-b在由天然的高度支化淀粉(支鏈淀粉)制得的淀粉微球中摻入BSA
重復(fù)實(shí)施例1d的方法，但是用BSA(20％，0.1ml)與淀粉溶液混合，然后生成雙相溶液。在穩(wěn)定化后，觀察到與淀粉不相似的沉淀，經(jīng)洗滌和干燥后得到粘稠的團(tuán)塊。
實(shí)施例1e由酸解和經(jīng)剪切的支鏈淀粉制備淀粉微球淀粉最初由酸解的含蠟玉米(Cerestar 06090)構(gòu)成，經(jīng)機(jī)械剪切以得到更適合在雙水相體系中制備淀粉微球的分子量分布。在加熱至約95℃之后，得到透明的溶液。經(jīng)攪拌過夜后，觀察不到分離的微球，但試樣中含一種沉淀物。用95％乙醇洗后，觀察不到分離的微球，但淀粉已形成小顆粒。
實(shí)施例1e-b在由酸解和剪切過的淀粉(支鏈淀粉)制備的淀粉微球中摻入BSA重復(fù)實(shí)施例1e的方法，但是用BSA(20％，0.1ml)與淀粉溶液混合，然后生成雙相體系。在穩(wěn)定過夜后，觀察不到分離的微球。另一方面，可看到極小的沉淀物?；厥盏玫降臄?shù)量小得無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。
實(shí)施例2由直鏈淀粉制備淀粉微球由直鏈淀粉(得自Serva)制備淀粉微球，目的是分析其在體外和體內(nèi)的生物降解能力。因?yàn)橹辨湹矸勰z凝太快，無(wú)法進(jìn)行手工制備，所以使用能連續(xù)制備的機(jī)械。該機(jī)械的中心部分是一個(gè)能將淀粉迅速加熱至150℃的微波裝置，隨后冷卻至約45℃，然后與蛋白質(zhì)溶液或緩沖液混合。將淀粉溶液配制在蒸餾水中，因?yàn)椴蝗凰谖⒉ㄑb置中加熱時(shí)會(huì)變成棕色。該淀粉由預(yù)膠化的直鏈淀粉(4％)構(gòu)成，盡管反復(fù)均化，仍留下許多團(tuán)塊。流速調(diào)節(jié)如下淀粉(5ml/分)，Tris緩沖液，pH7.8(1.2ml/分)，PEG溶液(2.4％重量的PEG，平均分子量300×103道爾頓)，其中還含6.9％氯化鈉和14.3％甘露醇。將微粒在室溫下穩(wěn)定幾小時(shí)，然后在冰箱中過夜。通過在離心機(jī)中連續(xù)洗滌將其回收3次用70％乙醇，3次用5 mM磷酸鹽緩沖的食鹽溶液(pH7.4)，其中含1mM氯化鈣和0.02％疊氮化鈉，最后3次用99.5％乙醇。將微粒真空干燥。因?yàn)橹破分杏幸恍┖苄〉念w粒，所以在99.5％乙醇中沉降三次試圖將其除掉，但未能完全去掉。得到總計(jì)9.5g微粒，沉降后留下8.5g。
用Malvern Mastersizer測(cè)定粒度分布，發(fā)現(xiàn)分布很寬，最小的球約為5μm，最大的超過160μm。由體積算出的平均直徑為25μm。在與α-淀粉酶于37℃下體外培養(yǎng)2周后，約30-40％的淀粉基質(zhì)溶解。
此對(duì)照實(shí)施例表明在由直鏈淀粉制備微球時(shí)遇到的困難，因?yàn)楹茈y制成均勻的溶液，為使其溶解需要很高的溫度，而且在經(jīng)受這些高溫時(shí)容易降解，并且膠凝很快。此實(shí)施例還表明，所得到的微球在剛剛制備后和試圖將大小分布窄化的處理后其大小分布都太寬，而且尺寸小于10μm的微球的含量太高，不適合皮下或肌內(nèi)注射后的持續(xù)釋放。此實(shí)施例還表明，在體外分析得到的生物降解能力在進(jìn)行分析的時(shí)間段內(nèi)是不完全的。
實(shí)施例3制備含β-乳球蛋白的淀粉微球用直鏈淀粉(Serva)制備淀粉微球，以便分析固定一種模型蛋白-β-乳球蛋白的效率。因?yàn)檫@種直鏈淀粉膠凝太快，無(wú)法完全手工操作，故使用帶有微波裝置的機(jī)械，它能將淀粉快速加熱至150℃，隨后冷卻至約45℃，然后與蛋白質(zhì)溶液或緩沖液混合。該淀粉溶液(10％)是在蒸餾水中制備，流速設(shè)定為5g/分。將淀粉溶液(2.5ml)收集在塑料燒杯中，當(dāng)溫度降至50-70℃時(shí)，在磁力攪拌下向其中加入蛋白質(zhì)溶液(0.6ml，8.3％，在緩沖液中)。一般來(lái)說，隨后立即在磁力攪拌下向淀粉溶液中加入第一份PEG溶液(10％，平均分子量20000道爾頓，3.0ml)，攪拌1分鐘后，向該乳狀液加入第二份PEG溶液(40％，平均分子量20000道爾頓，10ml)，令其在室溫下放置以便穩(wěn)定，直至次日。用兩種不同的方法回收形成的微球，以證實(shí)它們保留足量蛋白質(zhì)裝載物的能力。第一種洗滌方法包括用緩沖液離心洗滌，這造成基本上所有的蛋白質(zhì)都被浸提出的淀粉微球。在第二種回收方法中，還使用異丙醇以增加微球中乳球蛋白的裝載量。在這一方法中，先用70％的異丙醇洗3次，然后用含1mM氯化鈣和0.02％疊氮化鈉的5mM磷酸鹽緩沖的氯化鈉溶液洗一次，再用同樣的緩沖液洗一次，然后在該緩沖液中于攪拌下放置1小時(shí)，接著用緩沖液洗5次，最后用100％異丙醇洗3次。將微球真空干燥。使用異丙醇時(shí)蛋白質(zhì)裝載量為3.6％，這相當(dāng)于理論收率的18％。
除了其它問題以外，此實(shí)施例指出了由直鏈淀粉制備含蛋白質(zhì)的微球中的重大實(shí)際困難。因?yàn)榈矸廴芤罕仨毥?jīng)受很高的溫度以使其完全溶解，而淀粉在這樣的高溫下容易發(fā)生化學(xué)變化，并且在冷卻到為使淀粉溶液能與敏感的蛋白質(zhì)混合的合理低溫時(shí)很快膠凝。由于需要使用兩種不同的PEG溶液以便能形成微球和在其中截留蛋白質(zhì)，生產(chǎn)過程被進(jìn)一步復(fù)雜化。另一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)是在回收微球時(shí)需要使用異丙醇來(lái)達(dá)到可接受的蛋白質(zhì)裝載量，因?yàn)榇蠖鄶?shù)敏感性蛋白質(zhì)不能忍受暴露于異丙醇或類似的有機(jī)溶劑中。由這種直鏈淀粉制備的淀粉微球在體外或體內(nèi)均不能被α-淀粉酶完全生物降解。
實(shí)施例4由豌豆制備直鏈淀粉利用浸提淀粉顆粒制備直鏈淀粉。將NUTRIO-P-star33(300g，Nordfalk)懸浮于水(7200g)中，將懸浮液在75℃加熱1小時(shí)。離心除去溶脹的顆粒，將得到的溶液過濾，先經(jīng)過活性炭過濾，然后經(jīng)過一個(gè)預(yù)濾器(Filtron，1.5μm)最后經(jīng)滅菌過濾器(Millipore，0.2μm)過濾。將濾過的溶液置于冰箱中過夜，直鏈淀粉沉淀出來(lái)，用離心法回收。將得到的沉淀物用乙醇(95％，700ml)洗2次，然后真空干燥。得到約30g直鏈淀粉。
實(shí)施例5由實(shí)施例4制得的直鏈淀粉制備淀粉微球，目的在于分析其體外和體內(nèi)生物降解能力。因?yàn)橹辨湹矸勰z凝太快，不能手工制備，所以用能夠連續(xù)生產(chǎn)的機(jī)械。該機(jī)械的中心部分是一個(gè)微波裝置，它能將淀粉迅速地?zé)嶂?50℃，隨即冷卻到約45℃，然后與蛋白質(zhì)溶液或緩沖液混合。淀粉溶液是配制在蒸餾水中，否則它在微波裝置中加熱時(shí)會(huì)變成棕色。該淀粉由得自豌豆的預(yù)膠化的直鏈淀粉(4％)構(gòu)成，盡管反復(fù)均化仍留有許多團(tuán)塊。調(diào)節(jié)流速如下淀粉(5ml/分)，Tris緩沖液，pH7.8(1.2ml/分)，PEG溶液(2.4％重量PEG，平均分子量300,000道爾頓)，其中還含6.9％的氯化鈉和14.3％甘露醇。令微粒在室溫下穩(wěn)定幾小時(shí)，然后在冰箱中放置過夜。利用在離心機(jī)中連續(xù)洗滌將其回收3次用70％乙醇；3次用5mM的磷酸鹽緩沖的氯化鈉溶液，其中含1mM氯化鈣和0.02％疊氮化鈉，pH7.4；最后用99.5％乙醇洗3次。將微粒真空干燥。因?yàn)樵谥破分杏幸恍┖苄〉念w粒，所以試圖利用在99.5％乙醇中沉降3次將其去除，但未能完全去掉。沉降后顆粒產(chǎn)量為8.5g，這期間洗掉了1g微球。
用Malvern Mastersizer測(cè)定顆粒大小分布。發(fā)現(xiàn)其值很寬，最小的微球?yàn)榧s5μm，最大的超過160μm。由體積算出的平均直徑為25μm。
利用與α-淀粉酶在體外培養(yǎng)，分析淀粉微球的生物降解能力。最初降解很快，一天后約35-45％已轉(zhuǎn)化成可溶的形式。隨后降解速度下降，6天后已溶解了約50％。此后的生物降解能力可以忽略，25天后仍有約50％的淀粉微球保持未溶解的形式。
這一對(duì)照實(shí)施例表明了在由直鏈淀粉制備微球時(shí)遇到的困難，因?yàn)樗茈y制成均勻的溶液，要溶解就需要很高的溫度，而在經(jīng)受這樣的高溫時(shí)容易降解，并且它膠凝很快。此實(shí)施例還表明，所形成的微球在剛制備后和試圖使大小分布變窄的處理后，其大小分布都太寬，而且小于10μm的微球含量太高，不適合皮下或肌內(nèi)注射后的持續(xù)釋放。此實(shí)施例還表明，體外分析得到的生物降解能力是不完全的。
實(shí)施例6分析由直鏈淀粉制得的淀粉微球的體內(nèi)生物降解能力按100μl的體積，將實(shí)施例4中由直鏈淀粉制備的淀粉微球(3.01mg)皮下注射到8只Spraque-Dawley品系的大鼠頸部，該大鼠已作過垂體切除術(shù)。注射8-9天后在所有大鼠注射部位的皮膚下都可探測(cè)出小結(jié)。在注射9天后解剖時(shí)，進(jìn)行宏觀檢查，發(fā)現(xiàn)所有鼠的注射部位均有小的白色囊腫。將此宏觀變化固定在4％磷酸鹽緩沖的甲醛中，包埋在石蠟內(nèi)，以5μm的公稱厚度切割，用蘇木精和曙紅染色，在光學(xué)顯微鏡下檢查。在可以發(fā)現(xiàn)淀粉微球的石蠟切片中，它們帶起來(lái)象是被一個(gè)含巨細(xì)胞的?；M織區(qū)域包圍的嗜曙紅性粒細(xì)胞小球，且組織反應(yīng)的特征是在皮下組織中慢性“內(nèi)芽腫”炎癥。在巨噬細(xì)胞內(nèi)也可觀察到淀粉微球。
試驗(yàn)表明，在注射9天后在皮下組織中發(fā)現(xiàn)了由直鏈淀粉制備的淀粉微球，因此它們?cè)谶@段時(shí)間內(nèi)還未被充分地生物降解以致溶解，而且至少有一定比例的微球小得足以被巨噬細(xì)胞吞噬。
實(shí)施例7分析由直鏈淀粉制備的淀粉微球的體內(nèi)生物降解能力將按實(shí)施例4自直鏈淀粉制備并懸浮在10ml磷酸鹽緩沖(5mM)的生理鹽水溶液(0.15M，pH7.2)中的淀粉微球，肌內(nèi)注射到小豬的腿中。兩只豬的劑量為120mg微球，另兩只為600mg微球。14天時(shí)宰殺動(dòng)物，檢查組織的宏觀變化，并在常用的包埋和染色過程后用于顯微鏡檢查變化。在第14天，組織中發(fā)現(xiàn)微球的程度取決于劑量。一些微粒已被巨噬細(xì)胞和巨細(xì)胞吞噬，并在胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，這表明微球的降解很慢。
此試驗(yàn)表明，在注射2周后于肌內(nèi)組織中發(fā)現(xiàn)了由直鏈淀粉制備的淀粉微球，表明這些微球的生物降解很慢。
實(shí)施例7b淀粉微球是由酸解的土豆直鏈淀粉(Reppal PSM 60U)制得，該淀粉經(jīng)過超過濾以去掉低分子量成分，目的在于分析它們的生物降解能力和摻入蛋白質(zhì)而不使其暴露于有機(jī)溶劑的能力。使用β-乳球蛋白作為模型蛋白質(zhì)。淀粉濃度為24％，將4ml淀粉溶液與1.6ml的蛋白質(zhì)溶液混合，后者的濃度為50mg/ml，溫度為37℃，再與PEG(平均分子量100×103道爾頓，15％，4ml)混合并攪拌，形成乳狀液。微球在攪拌下于室溫過夜固化。
在于緩沖液(5mM磷酸鈉，pH7.8)中離心洗滌期間，所有的蛋白質(zhì)都被從微球中浸提出來(lái)。如果只使用異丙醇，或使用最初為分子量100,000的15％PEG，隨后為分子量10,000的40％PEG，最后為異丙醇的系列組合，則在微球中可發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于1.5-3％的蛋白質(zhì)。分析該微球的體外生物降解能力。降解開始很快，24小時(shí)后約60％的基質(zhì)被轉(zhuǎn)化成可溶形式。隨后降解停止，7天后在此條件下約70％的基質(zhì)被生物降解。
為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在該微球中有一定裝載量必須用有機(jī)溶劑將蛋白質(zhì)沉淀，對(duì)于敏感性蛋白質(zhì)這不是可接受的方法。得到的微球在體外試驗(yàn)中也不能完全生物降解。
實(shí)施例7c由得自土豆的強(qiáng)烈酸解的直鏈淀粉(Reppal PSM 25，Reppe，Glykos，Vǎxjō)制備淀粉微球，以便分析它們的生物降解能力和摻入蛋白質(zhì)而不使其暴露于有機(jī)溶劑的能力。使用β-乳球蛋白作為模型蛋白質(zhì)。淀粉濃度為20％，取4ml與濃度為50mg/ml、溫度為37℃的1.6ml蛋白質(zhì)溶液混合，再與PEG(平均分子量100×103道爾頓，15％，4ml)混合，攪拌形成乳狀液。微球在攪拌下于室溫過夜固化。
在于緩沖液(5mM磷酸鈉，pH7.8)中離心洗滌期間，所有的蛋白質(zhì)都被浸提出微球。如果只用異丙醇，或者用最初為分子量100,000的15％PEG，隨后為分子量10,000的40％PEG，最后為異丙醇的系列組合，則在微球中可發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于約1.5-2.5％的蛋白質(zhì)。體外分析微球的生物降解能力。降解初始很快，24小時(shí)后約55％的基質(zhì)已轉(zhuǎn)化成溶解形式。隨后降解停止，7天后在此條件下有約70％的淀粉基質(zhì)被生物降解。
為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在該微球中的一定裝載量，必須用有機(jī)溶劑將蛋白質(zhì)沉淀，這對(duì)于敏感性蛋白質(zhì)是不可接受的。得到的微球在體外試驗(yàn)中也不能完全生物降解。
實(shí)施例8在由高度支化和剪切過的淀粉制備的淀粉微球中以高裝載量固定BSA在50mM磷酸鈉溶液(pH8.3)中配制剪切過的高度支化的平均分子量為1600×103道爾頓的淀粉溶液(40％)，平均分子量20000的PEG溶液(38％)和BSA溶液(14％)。將淀粉溶液的溫度調(diào)節(jié)至50-55℃，PEG和BSA溶液為約33℃。將淀粉溶液(2g)與BSA溶液(0.7ml)混合。所得到的溶液抽吸到裝在注射泵上的注射器中。PEG溶液(29g)裝在固定在另一注射泵的另一注射器中。利用注射泵將淀粉/BSA混合物和PEG經(jīng)由靜態(tài)混合器泵入燒杯中并用葉片攪拌器(100rpm)攪拌該乳狀液，生成淀粉微球。此方法的這一部分從開始到徹底混合耗時(shí)2分鐘。燒杯內(nèi)的攪拌繼續(xù)10分鐘，將試樣溫度改變成4℃，于攪拌下放置4小時(shí)。隨后將溶液的pH值降至約5.5，令制品在37℃下放置過夜，不加攪拌。淀粉微球在Amicon(Amicon Ultrafiltration cell)中用5mM磷酸鈉(pH4.5)洗滌過濾，并冷凍干燥。
將干燥過的微球利用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的酶作用溶解，以確定蛋白質(zhì)和淀粉收率及蛋白裝載量。蛋白質(zhì)收率為94％，淀粉收率為89％，獲得的裝載率為10％。用Malvern Mastersizer測(cè)得的平均粒子大小為90μm，低于35μm的粒子少于10％。通過用α-淀粉酶或α-淀粉酶與淀粉葡糖苷酶培養(yǎng)，微球在48小時(shí)內(nèi)完全溶解。
此實(shí)施例說明，蛋白質(zhì)BSA可以以高收率固定，而且得到的微球具有高的蛋白質(zhì)裝載率。該微球是可生物降解的，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w外被α-淀粉酶完全溶解，并且這可以在溫和的條件下進(jìn)行，這使得可以對(duì)所固定的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的化學(xué)分析，而不會(huì)由于實(shí)際的萃取過程引入人為假象。此實(shí)施例還表明，所有被截留的蛋白質(zhì)在微球溶解后均可回收利用。
實(shí)施例9在由高度支化和剪切過的淀粉制備的淀粉微球中以高裝載率固定BSA使用配制在50mM磷酸鈉(pH8.3)中的剪切過的平均分子量為1600×103道爾頓的高度支化的淀粉溶液(40％)，PEG溶液(38％，平均分子量20000道爾頓)和BSA溶液(16％)制備含BSA的淀粉微球。將淀粉溶液的溫度調(diào)節(jié)到50-55℃，PEG和BSA溶液調(diào)節(jié)至約30℃。淀粉微球是在IKA反應(yīng)器(IKA實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器LR 250)中制備。將淀粉溶液(20g)與BSA溶液(6.7ml)混合。將PEG溶液(290g)在攪拌(100rpm)下泵入反應(yīng)器容器中約6分鐘，繼續(xù)攪拌約15分鐘。將制品改變至4℃并在攪拌下放置過夜。將溶液的pH值降至約5.5，改變至37℃，不加攪拌地放置約7小時(shí)。將含BSA的淀粉微球用5mM磷酸鈉(pH4.5)洗滌，冷凍干燥。
干燥過的微球利用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的酶作用溶解，以便測(cè)定蛋白質(zhì)和淀粉收率，以及蛋白質(zhì)裝載率。蛋白質(zhì)收率為99％，淀粉收率為91％，得到的裝載率為11.5％。用Malvern Mastersizer測(cè)得的平均粒子大小為48μm，17μm以下的粒子少于10％。通過與α-淀粉酶或α-淀粉酶與淀粉葡糖苷酶一起培養(yǎng)，該微球在48小時(shí)內(nèi)完全溶解。
實(shí)施例10在由高度支化和剪切過的淀粉制備的淀粉微球中以高裝載率固定BSA。
在50mM碳酸鈉溶液(pH9.8)中配制高度支化和剪切過的平均分子量為1930×103道爾頓的淀粉溶液(20％)，PEG溶液(38％，平均分子量20,000道爾頓)和BSA溶液(20％)。將淀粉溶液的溫度調(diào)節(jié)至50-55℃，其它溶液調(diào)節(jié)至約37℃。將淀粉溶液(3g)與BSA溶液(0.7ml)混合。將混合物抽吸到注射器中，在攪拌下加到在燒杯中的PEG溶液(28g)內(nèi)。將該制品改變至4℃，放置4小時(shí)后改變至37℃，放置過夜。含BSA的淀粉微球用pH4.5的5mM磷酸鈉洗，冷凍干燥。
干燥過的微球利用(α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的酶作用溶解，以便測(cè)定蛋白質(zhì)和淀粉的收率及蛋白質(zhì)裝載率。蛋白質(zhì)收率為91％，淀粉收率為90％，得到的裝載率為10.6％。用Malvern Mastersizer測(cè)得的平均粒子大小為44μm，低于21μm的粒子少于10％。通過用α-淀粉酶或α-淀粉酶與淀粉葡糖苷酶培養(yǎng)，該微球在48小時(shí)內(nèi)完全溶解。
實(shí)施例11在由高度支化和剪切過的淀粉以高的淀粉和PEG濃度及溫度循環(huán)得到的淀粉微球中，固定晶態(tài)的hGH(人生長(zhǎng)激素)人生長(zhǎng)激素鋅是按照EP 0 540 582 B1制備。該晶體的懸浮液是在含2mM乙酸鋅的10mM乙酸鈉(pH6.4)中制備。
淀粉溶液(40％)由平均分子量為378×103道爾頓的高度支化和經(jīng)剪切的淀粉在10mM磷酸鈉(pH6.4)中制備，平均分子量為20,000的PEG溶液的濃度為30％。用1M HCl將其pH調(diào)節(jié)至6.4。這些溶液的溫度調(diào)節(jié)如下淀粉溶液調(diào)節(jié)至50-55℃，PEG溶液37℃，Zn-hGH晶體的懸浮液調(diào)節(jié)至37℃。在攪拌下將4.9g淀粉溶液加到7ml Zn-hGH晶體的懸浮液中。在約20秒后，利用注射泵在約6分內(nèi)加入28g PEG溶液，同時(shí)繼續(xù)在400rpm下攪拌(Eurostardigital)。微球立即開始形成，約15分鐘后從37℃改變至4℃，在攪拌下保持4小時(shí)。穩(wěn)定4小時(shí)后，微球穩(wěn)定得可以轉(zhuǎn)移到37℃并在該溫度下靜置過夜。在37℃下穩(wěn)定約17-20小時(shí)后，利用在Amicon中過濾，將得到的微球用含2mM乙酸鋅的10mM乙酸鈉(pH6.4)洗3次，并冷凍干燥。
干燥的微球利用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的酶作用溶解，以便測(cè)定蛋白質(zhì)和淀粉收率，蛋白質(zhì)裝載率及蛋白質(zhì)質(zhì)量。蛋白質(zhì)收率為95.2％，淀粉收率68％，蛋白質(zhì)在微球中的裝載率為27.8％。用MalvernMastersizer測(cè)得的平均粒子大小為59μm，29μm以下的粒子不到10％。通過用α-淀粉酶或α-淀粉酶與淀粉葡糖苷酶培養(yǎng)，微球在48小時(shí)內(nèi)完全溶解。蛋白質(zhì)的二聚體含量為0.75％，聚合物含量＜0.1％。
試驗(yàn)說明，根據(jù)本發(fā)明，即使是已經(jīng)轉(zhuǎn)化成固體形式的蛋白質(zhì)也能以高收率被固定，形成具有高的蛋白質(zhì)裝載率的淀粉微球。此試驗(yàn)還說明，得到的淀粉微球能在溫和的條件下溶解，這使得有可能對(duì)所固定的蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，而不引入由試驗(yàn)性制備造成的人為現(xiàn)象，而且蛋白質(zhì)在此過程中不降解。得到的蛋白質(zhì)的質(zhì)量對(duì)于人腸道外給藥是可以接受的。
實(shí)施例12在高度支化的經(jīng)剪切的淀粉制備的淀粉微球中固定BSA，并分析體內(nèi)的生物降解能力在以下條件由平均分子量為1930×103道爾頓的高度支化和經(jīng)剪切的淀粉制備含BSA的淀粉微球?qū)⒌矸?30％，100ml)與PEG(38％，1466ml，平均分子量20000道爾頓)混合，先在20℃下攪拌6小時(shí)，然后在37℃下攪拌過夜。以皮下和肌內(nèi)方式對(duì)大鼠給藥，劑量為在由0.6％透明質(zhì)酸鈉(分子量2000×103道爾頓，Kraeber GmbH，Hamburg)組成的注射液中含30mg，注射部位準(zhǔn)備在3和7天后進(jìn)行組織分析。在第3天，觀察到注射部位的細(xì)胞發(fā)炎，在第7天時(shí)這些變化已消失。
此試驗(yàn)表明，由高度支化的經(jīng)剪切的淀粉制備的淀粉微球在體內(nèi)于1周內(nèi)迅速生物降解，組織也迅速正?；?。
實(shí)施例13淀粉微球在豬內(nèi)的生物降解能力測(cè)定由平均分子量529×103道爾頓的經(jīng)剪切的淀粉制備淀粉微球。將淀粉稱量到10mM的磷酸鈉溶液(pH6.4)中，使溶解后的濃度為30％，向同一緩沖液中加入PEG20，使其溶解后的最終濃度為27％。然后用壓熱法制備溶液。在一只帶有Eurostar數(shù)字型攪拌控制的IKA反應(yīng)器(Labosco)中進(jìn)行制備。制備時(shí)使用14.35g淀粉溶液，將其溶解后保持50℃下溫?zé)?，隨后向反應(yīng)器中加入200g PEG溶液。用葉片攪拌器以160rpm攪拌以形成乳狀液，8分鐘后將攪拌速度調(diào)節(jié)到140rpm，5小時(shí)后為110rpm，同時(shí)將溫度設(shè)定為在20℃下7小時(shí)，隨后在38℃下17小時(shí)。將得到的淀粉微球用300ml水洗4次(Amiconultrafiltration unit 8400)并冷凍干燥。將干燥的微球用38和100μm篩(Retsch sieveing machine)篩分。篩分前得到的淀粉微球總量為3.61g，這相當(dāng)于收率為約86％，篩分后為2.54g，相當(dāng)于約59％的收率。
將淀粉微球重新懸浮于1ml含0.11％透明質(zhì)酸鈉和4％甘露醇的注射用水中，向豬皮下注射100mg微球。準(zhǔn)備對(duì)注射部位作組織評(píng)價(jià)。注射7天后觀察不到淀粉微球。
此試驗(yàn)說明，該淀粉微球迅速地生物降解并在一周內(nèi)從注射部位消失。
權(quán)利要求
1.一種制備可腸道外給藥、優(yōu)選注射給藥的含生物活性物質(zhì)的微粒的方法，該方法包括a)配制淀粉水溶液，其中含有支鏈淀粉含量超過85％重量的淀粉，該支鏈淀粉的分子量已被降低，使得該物質(zhì)的至少80％重量為10-10000×103道爾頓，而且其氨基酸氮含量少于每g淀粉干重50μg，溶液中的淀粉濃度至少為20％重量，b)將生物活性物質(zhì)與淀粉溶液在形成溶液，乳狀液或該物質(zhì)在淀粉溶液中的懸浮液等形式的組合物條件下混合，c)將步驟b)中得到的組合物與一種能形成雙水相體系的聚合物水溶液混合，從而形成作為內(nèi)相的含生物活性物質(zhì)的淀粉滴在該聚合物溶液的外相中的乳狀液，d)促使或者讓步驟c)中得到的淀粉滴藉助淀粉固化的自然能力膠凝成淀粉顆粒，e)將該淀粉顆粒干燥，優(yōu)選在事先通過洗滌去掉所述外相后干燥，和f)任選地向干燥的淀粉顆粒施涂一個(gè)由可生物相容和生物降解的聚合物構(gòu)成的控制釋放的殼層，優(yōu)選用空氣懸浮法施涂。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該淀粉的純度為每克淀粉干重有至多20μg、優(yōu)選至多10μg、更優(yōu)選至多5μg的氨基酸氮。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中淀粉中分子量被降低的支鏈淀粉的含量超過95％重量，優(yōu)選超過98％重量。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該支鏈淀粉的分子量被降低，以致于至少80％重量的該物質(zhì)的分子量為100-4000×103道爾頓，優(yōu)選200-1000×103道爾頓，更優(yōu)選300-600×103道爾頓。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的淀粉可以以超過25％重量的濃度溶于水中。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的淀粉基本上沒有在羥乙基淀粉中存在的那類共價(jià)鍵合的附加化學(xué)基團(tuán)。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中淀粉的內(nèi)毒素含量少于25EU/g，每克中含不到100個(gè)微生物。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中淀粉利用堿水溶液洗滌純化得基本上不含定位表面的蛋白質(zhì)、類脂和內(nèi)毒素，用剪切方法降低了分子量，并且用離子交換色譜法，優(yōu)選用陰離子交換色譜法，純化去除了內(nèi)部蛋白質(zhì)。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟a)中還使用2-15％重量的平均分子量為2.5-70×103道爾頓、優(yōu)選5-45×103道爾頓的直鏈淀粉作為淀粉，其中的重量百分份額是以淀粉的干重為基礎(chǔ)計(jì)算的。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟a)中配制濃度至少為30％重量的淀粉溶液。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟a)中配制濃度至多為50％重量，優(yōu)選至多為45％重量的淀粉溶液。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟a)中的淀粉水溶液用伴隨壓熱的方法制備。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟b)中將活性物質(zhì)與淀粉溶液在至多60℃，優(yōu)選20-45℃，尤其是30-37℃的溫度下混合。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟b)中形成一種組合物，組合物內(nèi)淀粉與生物活性物質(zhì)之間的重量比為3∶1至10000∶1，優(yōu)選3∶1至100∶1。
15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中水溶液內(nèi)的聚合物濃度至少為20％重量，優(yōu)選至少為30％重量。
16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中水溶液內(nèi)的聚合物濃度至多為45％重量，優(yōu)選為30-40％重量。
17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中的混合操作在4-50℃，優(yōu)選10-40℃，尤其是10-37℃的溫度下進(jìn)行。
18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中的混合藉助至少一個(gè)靜態(tài)混合器進(jìn)行。
19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中至少分兩步將聚合物加到組合物中，其中至少一次加入是在開始生成乳狀液之后進(jìn)行。
20.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中使用聚乙二醇作為水相聚合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中聚乙二醇的平均分子量為5-35×103道爾頓，優(yōu)選15-25×103道爾頓，尤其是約20×103道爾頓。
22.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟d)中的固化至少在兩個(gè)溫度下進(jìn)行，其中開始時(shí)比結(jié)束時(shí)的溫度要低。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的固化在1-20℃，優(yōu)選1-10℃，尤其是約4℃下開始，而在20-55℃，優(yōu)選25-40℃，尤其是約37℃下結(jié)束。
24.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟e)的干燥以噴霧干燥、冷凍干燥或真空干燥方式，優(yōu)選以冷凍干燥形式進(jìn)行。
25.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中摻入作為生物活性物質(zhì)的一種物質(zhì)，該物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、肽、多肽、聚核苷酸和多糖，尤其是重組制備的蛋白質(zhì)。
26.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述物質(zhì)是選自生長(zhǎng)因子，胰島素，紅細(xì)胞生成素，干擾素α，干擾素β，干擾素γ，凝血因子V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII，C蛋白，胰高血糖素樣肽1或2，C-肽，表皮生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)激素，促黃體素釋放激素類似物，civamide，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞集落刺激因子，瘦身蛋白和白介素，或是它們中任何一種的具有和母體物質(zhì)基本相同或改進(jìn)的藥理活性的類似物或衍生物。
27.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中形成具有微粒所要求的大小的淀粉滴，最好是在干燥狀態(tài)的平均粒徑為10-200μm，優(yōu)選20-100μm，更優(yōu)選20-80μm。
28.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟d)后用過濾法洗滌微粒，并任選地進(jìn)行篩分以得到所期望的粒子大小分布。
29.適合對(duì)哺乳動(dòng)物，尤其人類，以腸道外方式，優(yōu)選以注射方式給藥的含生物活性物質(zhì)的微粒，該微粒主要由淀粉構(gòu)成，淀粉中支鏈淀粉含量超過85％重量，其中至少80％重量的平均分子量在10-10000×103道爾頓的范圍內(nèi)，氨基酸氮含量少于每克干重淀粉50μg，而且淀粉分子之間沒有共價(jià)化學(xué)交聯(lián)。
30.權(quán)利要求29的微粒，其中淀粉屬于權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所定義的類型。
31.權(quán)利要求29和30中任一項(xiàng)的微粒，其中生物物質(zhì)的生物活性與該物質(zhì)摻入淀粉中之前表現(xiàn)的生物活性相比，至少保留了80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選基本上保留。
32.權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的微粒，該微粒在α-淀粉酶和/或淀粉葡糖苷酶存在下于體外可以生物降解。
33.權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的微粒，該微粒是可生物降解的，并在皮下或肌內(nèi)給藥后從組織中消除。
34.權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)的微粒，該微粒有一個(gè)由至少一種成膜的、生物相容和可生物降解的聚合物構(gòu)成的殼層。
35.權(quán)利要求34的微粒，其中的聚合物是一種含α-羥基酸單元的均聚物或共聚物。
36.權(quán)利要求35的微粒，其中的α-羥基酸是乳酸和/或羥基乙酸。
37.權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)的微粒，其中該殼層除了聚合物之外，還包含至少一種調(diào)節(jié)釋放的物質(zhì)。
38.權(quán)利要求37的微粒，其中所述物質(zhì)是水溶性的或微溶于水的。
39.權(quán)利要求37和38中任一項(xiàng)的微粒，其中所述物質(zhì)是選自乳酸、含乳酸的低聚物和羥基乙酸。
40.權(quán)利要求37和38的微粒，其中該物質(zhì)包括聚乙二醇(PEG)或含PEG作為嵌段之一的嵌段共聚物。
41.權(quán)利要求29-40中任一項(xiàng)的微粒，它有一個(gè)由具有防止微粒聚結(jié)能力的至少一種水溶性物質(zhì)構(gòu)成的外層。
42.權(quán)利要求29-41中任一項(xiàng)的微粒，它可用23G針頭注射。
43.權(quán)利要求29-42中任一項(xiàng)的微粒，它可用25G針頭注射。
44.權(quán)利要求29-41中任一項(xiàng)的微粒，它可利用干粉注射器穿過皮膚注射。
45.權(quán)利要求29-41中任一項(xiàng)的微粒，它可用無(wú)針頭注射器注射。
46.權(quán)利要求29-45中任一項(xiàng)的微粒，它可用權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的方法得到。
全文摘要
一種制備可腸道外給藥的微粒的方法，其中配制分子量被降低的、以支鏈淀粉為基礎(chǔ)的至少20％重量的純化淀粉水溶液，將此溶液與生物活性物質(zhì)混合，形成淀粉液滴在聚合物溶液外相中的乳狀液，使淀粉液滴變成凝膠，將膠凝的淀粉顆粒干燥。還可任選地向顆粒施涂一個(gè)控制釋放的殼層?；旧嫌稍摰矸劢M成的這些微粒的氨基酸含量少于50μg，而且沒有共價(jià)化學(xué)交聯(lián)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1468093SQ0181685
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2001年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月6日
發(fā)明者M·約恩松, N·O·古斯塔夫松, T·拉爾克索, M·雷斯羅, M 約恩松, 古斯塔夫松, 孤, 慫 申請(qǐng)人:杰格特克公司