專利名稱：凝血因子vii的糖基型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含凝血因子VII以及其它具有改變的天冬酰胺連接型糖基化模式的凝血因子的組合物。
背景技術：
與凝血級聯(lián)反應有關的蛋白包括，例如凝血因子VII，凝血因子VIII，凝血因子IX，凝血因子X，以及蛋白C，它們經證實都可以作為有效治療劑用于治療各種病癥。因此，對包含這些蛋白并預先確定了臨床效力的單一形式可藥用配制劑的需求不斷增長。
由于使用人血漿作為藥用產物的來源有諸多不利，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中制備這些蛋白。但凝血蛋白都有多種多樣的翻譯和翻譯后修飾，包括，例如glu殘基的天冬酰胺連接的(N-連接的)糖基化；O-連接的糖基化；以及γ-羧基化。當使用異源細胞作為宿主來大量制備所述蛋白時，這些修飾可能存在質或量的差異。特別是，在異源細胞中的制備通常導致糖基型(glycoform)的不同排列，即相同的多肽具有不同的共價連接的寡糖結構。
在不同的系統(tǒng)中，治療性蛋白的寡糖結構的變化至少與致免疫性和體內清除的改變有關。因此，本領域需要能提供凝血蛋白制劑的組合物和方法，尤其是包含重組人凝血因子VII，修飾的凝血因子VII，或凝血因子VII相關多肽的制劑，且所述制劑具有預先確定的糖基型模式。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，它們表現(xiàn)出預先確定的糖基型模式。本文中，凝血因子VII或凝血因子VII相關制劑是指已經從合成它們的細胞中分離出來的多種凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽，包括變體和化學修飾形式，以及經蛋白裂解活化的形式(如凝血因子VIIa)。糖基型是指制劑中具有多樣化結構、并與凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽共價連接的寡糖鏈的分布。
本發(fā)明一個方面提供了包含多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的寡糖鏈并且具有以下一或多種特征(i)約94-100％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分；(ii)約0-7％的寡糖鏈為電中性；(iii)約16％以下(如約6-16％)的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基；(iv)約25％以下(如約6-9％)的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基；或(v)約30％以下(如約11-23％)的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基。在一些實施方案中，除了(i)-(v)的一或多項以外寡糖鏈中的所有唾液酸殘基與半乳糖經由α2-＞3鍵連接；至少部分唾液酸殘基除了包含N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)以外，還包含N-乙醇酰神經氨酸(Neu5Gc)；和/或寡糖鏈包含巖藻糖殘基，它通過α1-＞6鍵與核心N-乙酰葡糖胺連接。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100％的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且所有的唾液酸殘基都經由α2-＞3鍵與半乳糖連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100％的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且至少一部分唾液酸殘基為N-乙醇酰神經氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100％的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且至少部分所述鏈包含N-乙酰半乳糖胺。本發(fā)明的制劑因此不包含已從人血漿中分離出來但未在體外經糖苷酶處理而被修飾的野生型凝血因子VII或凝血因子VIIa。
本發(fā)明另一方面提供了包含多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的寡糖鏈且其中至少約2％的寡糖鏈包含至少一個與天線式(antennary)N-乙酰葡糖胺殘基(即，與Man殘基經由β1-＞2，4或6鍵連接的N-乙酰葡糖胺殘基)經由α1-＞3鍵連接的巖藻糖。優(yōu)選至少約5％的寡糖鏈包含至少一個上述天線式巖藻糖殘基；更優(yōu)選至少約10％或20％；最優(yōu)選至少約40％。
本發(fā)明的制劑可包含一或多種下述物質未經修飾的野生型凝血因子VII；經過化學修飾和/或酶修飾的野生型凝血因子VII；以及在相對于野生型凝血因子VII的氨基酸序列中包含一或多個改變的凝血因子VII變體。本發(fā)明的制劑可以衍生自，由其內源性凝血因子VII基因表達凝血因子VII的人類細胞，或經編程而由重組基因表達凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的細胞。
本發(fā)明另一方面提供了包含凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的制劑，所述凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽表現(xiàn)出一或多種改進的功能特性，包括，但不限于，保存穩(wěn)定性、生物可利用度和/或半壽期都提高。
本發(fā)明另一方面包括對凝血因子VII和凝血因子VII相關多肽的糖基型模式進行測定和/或最優(yōu)化的方法，包括以下步驟(a)在第一組預定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的細胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽，以便獲得包含所述多肽的制劑；和(c)分析與所述多肽相連的寡糖的結構，以便確定該制劑的糖基型模式。
本發(fā)明還可包括將步驟(a)的培養(yǎng)條件變?yōu)榈诙M預定培養(yǎng)條件；以及重復所述步驟，直至獲得所需的糖基型模式。備選地，所述方法還可包括對制劑進行化學處理或酶處理，以改變寡糖的結構；并重復所述步驟，直至獲得所需糖基型模式。所述方法還可以進一步包括以下步驟對具有預定的糖基型模式的制劑進行至少一種檢測生物活性或其它功能(如藥代動力學特性譜或穩(wěn)定性)的試驗，并將特定的糖基型模式與特定的生物活性或功能特性聯(lián)系起來。
本發(fā)明另一方面提供了制備包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑的方法，所述凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽具有預定的N-連接的糖基化模式。在一些實施方案中，所述方法通過培養(yǎng)能表達所述多肽的細胞來進行，其中與凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽連接的至少約94％的天冬酰胺-連接型寡糖包含至少一個唾液酸殘基，例如，1、2、3、或4個唾液酸殘基。在一些實施方案中，所述方法通過培養(yǎng)能表達所述多肽的細胞來進行，其中至少約5％的寡糖鏈包含至少一個與天線式N-乙酰葡糖胺殘基以α1-＞3鍵相連的巖藻糖。在一些實施方案中，凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽，不管是何種來源，都接受酶處理，以便獲得所需糖基型模式。
本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明制劑的藥用配制劑以及預防和/或治療那些應答凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽而出現(xiàn)的綜合征的方法。所述方法包括，在增強或抑制凝血效應的條件下，對需要治療的患者給藥所述藥用配制劑。在一組實施方案中，在希望增強凝血的情況下，給藥凝血因子VII制劑，所述情況如血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，或von Willebrand??；伴有凝血因子抑制劑存在的綜合征；外科手術或抗凝血治療之前、期間、或之后；或受創(chuàng)后。在另一組實施方案中，給藥凝血因子VII相關多肽的制劑(即相對于野生型凝血因子VII具有降低的或改變的生物活性的制劑)以便減少凝血，這類情況例如，接受血管成形術的患者，或罹患以下疾病的患者深部靜脈血栓癥，肺栓塞，休克，彌漫性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥相關的肺部和腎臟纖維蛋白沉積，或心肌梗塞。根據本發(fā)明，還可以在需要改變(如降低)經由組織因子(TF)介導的途徑進行的細胞內信號傳遞的情況中給藥凝血因子VII相關多肽的制劑，以便治療，例如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥應答綜合征(SIRS)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，多發(fā)性器官功能衰竭(MOF)，以及血小板減少性紫癜(TTP)。
發(fā)明詳述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，具有預定的糖基型模式的凝固蛋白的制劑表現(xiàn)出改進的功能特性。相應地，本發(fā)明涉及提供這些蛋白制劑的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及包含凝血因子VII多肽和凝血因子VII相關多肽的制劑，所述制劑具有預定的特異性天冬酰胺-連接型(N-連接型)寡糖模式。本發(fā)明的制劑表現(xiàn)出改變的特性，包括，但不限于，改進的藥代動力學特性和改進的臨床效力。本發(fā)明還包括含有這些制劑的藥用配制劑，以及應用這些配制劑進行的治療方法。
凝血因子VII多肽和凝血因子VII相關多肽本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽，如具有美國專利4,784,950中公開的氨基酸序列的那些(野生型凝血因子VII)。本文中，“凝血因子VII”或“凝血因子VII多肽”包括野生型凝血因子VII，以及生物學活性與野生型凝血因子VII相比實質上相同或有改進的凝血因子VII變體。術語“凝血因子VII”旨在包括凝血因子VII多肽的未切割形式(酶原形式)，以及經過蛋白裂解性加工產生了各自的生物活性形式的那些多肽，它們可稱為凝血因子VIIa。通常，凝血因子VII在殘基152和153之間切割而產生凝血因子VIIa。
本文中，“凝血因子VII相關多肽”包括多肽和變體，其中凝血因子VIIa的生物學活性與野生型凝血因子VIIa相比得到實質上的修飾或已減弱。這些多肽包括，但不限于，經過化學修飾的凝血因子VII或凝血因子VIIa，以及引入了特異性氨基酸序列改變從而修飾或破壞了該多肽的生物活性的凝血因子VII變體。
凝血過程中，凝血因子VIIa的生物學活性源于其以下能力(i)與組織因子(TF)結合，和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X的蛋白裂解性切割，從而產生活化的凝血因子IX或X(分別為凝血因子IXa或Xa)。為了本發(fā)明的目的，凝血因子VIIa的生物學活性可以通過利用凝血因子VII-缺陷型血漿和凝血酶致活酶測量制劑促進凝血的能力來定量，如美國專利5,997,864所述。在該試驗中，將生物學活性表示為凝血時間相對于對照樣品的減少，并將其與含有1單位/ml凝血因子VII活性的人血清標準品進行比較而轉換為“凝血因子VII單位”。定量凝血因子VIIa的生物學活性的另一種方法是(i)測量凝血因子VIIa在含有包埋于脂質膜中的TF的系統(tǒng)中產生凝血因子Xa的能力以及產生凝血因子X的能力(Persson等，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)測量凝血因子X在含水系統(tǒng)中的水解(參見下文實施例5)；(iii)測量其與TF的物理結合，使用基于表面胞質團共振(surfaceplasmon resonance)的儀器(Persson，F(xiàn)EBS Letts.413359-363，1997)；(iv)測量合成底物的水解(參見下文實施例4)；和(v)測量TF-非依賴性體外系統(tǒng)中凝血酶的產生。
具有與野生型凝血因子VIIa相比實質上相同或有改進的生物學活性的凝血因子VII變體包括在上述凝血試驗、蛋白裂解試驗和/或TF結合試驗中測得，比活性為相同細胞類型產生的野生型凝血因子VIIa的至少約25％，優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約75％，最優(yōu)選至少約90％的那些。具有與野生型凝血因子VIIa相比實質上減弱的生物學活性的凝血因子VII變體包括在上述凝血試驗、蛋白裂解試驗和/或TF結合試驗中測得，比活性為相同細胞類型產生的野生型凝血因子VIIa的至少約25％，優(yōu)選至少約10％，更優(yōu)選至少約5％，最優(yōu)選至少約1％的那些。具有與野生型凝血因子VII相比有實質修飾的生物學活性的凝血因子VII變體包括，但不限于，具有TF-非依賴性凝血因子X的蛋白裂解活性的凝血因子VII變體，以及結合TF但不裂解凝血因子X的那些。
凝血因子VII的變體，無論是具有與野生型凝血因子VII實質上相同或更好的生物活性，還是具有與野生型凝血因子VII相比有實質修飾的或減弱的生物活性，這樣的變體可包括，但不限于具有因插入、缺失、或取代一或多個氨基酸而不同于野生型凝血因子VII的氨基酸序列的多肽。具有與野生型凝血因子VII相比實質上相同的生物學活性的凝血因子VII變體包括S52A-FVIIa，S60A-FVIIa(1ino等，Arch.Biochem.Biophys.352182-192,1998)；具有增強的蛋白裂解穩(wěn)定性的FVIIa變體，其公開在美國專利5,580,560中；已經在殘基290和291之間或殘基315和316之間被蛋白裂解的那些凝血因子VIIa(Mollerup等，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；以及氧化型凝血因子VIIa(Komfelt等，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)。具有與野生型凝血因子VII相比實質上減弱或有修飾的生物學活性的凝血因子VII變體包括R152E-FVIIa(Wildgoose等，Biochem293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，F(xiàn)FR-FVIIa(Holst等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，以及缺乏Gla結構域的凝血因子VIIa(Nicolaisen等，F(xiàn)EBS Letts.317245-249，1993)?；瘜W修飾的凝血因子VII多肽以及序列變體的非限制性實例參見，例如，美國專利5,997,864。
天冬酰胺-連接型糖基化本發(fā)明提供了凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關多肽的制劑，它包含特定譜的凝血因子VII糖基型，即具有預定的天冬酰胺-連接型(N-型)寡糖鏈的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽。
本文中，N-連接型糖基化的“模式”或糖基型“模式”，“分布”，或“譜”，是指給定的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽群體內具體的寡糖結構。這類模式的非限制性實例包括寡糖鏈的以下相關部分(i)具有至少一個唾液酸殘基；(ii)缺乏任何唾液酸殘基(即，為電中性)；(iii)具有至少一個末端半乳糖殘基；(iv)具有至少一個末端N乙酰半乳糖胺殘基；(v)具有至少一個“未加帽”的天線(antenna)，即，具有至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基；或(vi)具有至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺殘基連接的巖藻糖。
本文中，寡糖鏈是指與單個天冬酰胺殘基共價連接的整個寡糖結構。凝血因子VII通常在Asn 145和Asn 322發(fā)生糖基化。人體中原位產生的凝血因子VII上的N-連接型寡糖鏈可以是雙-，三，或四天線式，每一天線中，Neu5Ac(α2-＞3或α2-＞6)Gal(β1-＞4)GlcNAc與Man殘基以(β1-＞2，4，或6)連接，所述Man殘基與Man(β1-＞4)GlcNAc(β1-＞4)GlcNAc-Asn以(α1-＞3或6)連接。(Neu5Ac表示N-乙酰神經氨酸(唾液酸)，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖)。寡糖鏈還可包含巖藻糖殘基，其可與GlcNAc以α1-＞6連接。當凝血因子VII在人體中原位產生時，一些寡糖鏈缺失核心的巖藻糖殘基；所有鏈缺乏天線式巖藻糖殘基；且所有鏈都幾乎被徹底唾液酸化，即，每一天線的末端糖是與半乳糖經α2-＞3或α2-＞6鍵連接的N-乙酰神經氨酸。
但是，在其它情況下產生時，凝血因子VII可能包含以下寡糖鏈，它們在一或多個天線上具有不同末端結構，如缺乏唾液酸殘基；包含N-乙醇酰神經氨酸(Neu5Gc)殘基；包含末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)殘基以替代半乳糖；等等。如果是在有牛血清時培養(yǎng)的BHK細胞中產生，凝血因子VII具有以下寡糖模式--87-93％的寡糖鏈包含至少一個單個的唾液酸殘基；--7-13％為中性(無任何唾液酸)；--9-16％包含至少一個末端半乳糖殘基；--19-29％包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基；和--30-39％包含至少一個未加帽的天線，即，包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基。
本發(fā)明人制備了包含預定的特異性寡糖模式的凝血因子VII制劑，其寡糖模式不同于已經描述的那些。本發(fā)明涉及含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關多肽的制劑，所述多肽具有一或多種下述糖基型模式(i)約94-100％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，如約94-99％，約95-98％，或約96-97％。在不同的實施方案中，至少約94％，95％，96％，或97％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。
(ii)6％或更少的寡糖鏈為中性，如約1.5-6％或約2-4％。
(iii)約16％以下，優(yōu)選約10％以下的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖，如約6-10％或約8-9％；(iv)約25％以下，優(yōu)選約10％以下的寡糖鏈包含至少一個末端GalNAc殘基，如約69％或約7-8％；(v)約30％以下，優(yōu)選約25％以下的寡糖鏈包含至少一個未加帽的天線，如約11-23％或約12-18％；和
(vi)至少約2％，優(yōu)選至少約5％，更優(yōu)選至少約10％或20％，最優(yōu)選至少約40％的寡糖鏈包含至少一個與天線式N-乙酰葡糖胺殘基以α1-＞3連接的巖藻糖(即，以β1-＞2，4，或6鍵與Man殘基連接的N-乙酰葡糖胺殘基)。
可以理解，上述(i)-(vi)的每一項代表了包含在本發(fā)明中的一種不同的糖基型模式，即，本發(fā)明的制劑可以用上述(i)-(vi)中的僅一項來描述。也可以根據具體的糖基型模式，用上述(i)-(vi)的不止一項來描述本發(fā)明的制劑。
此外，本發(fā)明的制劑可以用上述(i)-(vi)中的一或多項結合一或多個其它結構特征來描述。例如，本發(fā)明包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，所述多肽中的唾液酸殘基(Neu5Ac或Neu5Gc)與半乳糖僅以α2-＞3構型連接。本發(fā)明還包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，所述多肽包含以α1-＞6鍵與核心的N-乙酰葡糖胺連接和/或以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖。在一系列實施方案中，本發(fā)明的制劑包含下述凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽，其中99％以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且(a)所述唾液酸殘基僅以α2-＞3構型連接和/或(b)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖殘基和/或(c)可檢測的數量的天線止于N-乙酰半乳糖胺。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有野生型凝血因子VIIa的制劑，所述因子中，99％以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且該唾液酸殘基與半乳糖僅以α2-＞3構型連接。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含野生型凝血因子VIIa的制劑，所述因子中，99％以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且至少部分寡糖鏈包含N-乙酰半乳糖胺。本發(fā)明不涉及從人血漿中分離出來并且未通過用糖苷酶處理而回體(exvivo)修飾的野生型凝血因子VII或野生型凝血因子VIIa。
在一個實施方案中，凝血因子VIIa制劑包含下述寡糖鏈，其有單個巖藻糖以α1-＞3構型與N-乙酰葡糖胺連接。在另一實施方案中，凝血因子VIIa制劑包含下述寡糖鏈，其具有以α1-＞3構型與雙天線寡糖的每一天線N-乙酰葡糖胺殘基連接的巖藻糖殘基(唾液酸Lewis X結構)。在另一實施方案中，凝血因子VIIa制劑包含下述寡糖鏈(i)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖，和(ii)具有以α1-＞3構型與一個天線式N-乙酰葡糖胺連接的單個巖藻糖。在另一實施方案中，凝血因子VIIa包含以下寡糖鏈(i)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖，和(ii)具有以α1-＞3構型與雙天線寡糖的每一天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖殘基。
在實施本發(fā)明時，N-連接的寡糖的模式可以用本領域任何已知方法確定，如高效液相層析(HPLC)；毛細電泳(CE)；核磁共振(NMR)；利用諸如高速粒子(fast-atom)轟擊或電噴射等離子化技術，或基質輔助激光解析(MALDI)進行的質譜分析(MS)；氣相色譜(GC)；以及用外切糖苷酶進行處理并結合陰離子交換(AIE)-HPLC，大小排阻層析(SEC)，或MS。參見，例如Weber等，Anal.Bio-chem.225135 (1995)；Klausen等，J.Chromatog.718195(1995)；Morris等，in Mass Spectrometry of Biological Materials，McEwen等編，Marcel Dekker，(1990)，pp 137167；Conboy等，Biol.Mass Spectrom.21397，1992；Hellerqvist，Meth.EnzymoL 193554(1990)；Sutton等，Anal.Biohcem.31834(1994)；Harvey等，Organic Mass Spectrometry 29752(1994)。
在用上述任一種方法(或能分辨具有不同結構的寡糖鏈的其它任何方法)分辨出凝血因子VII-衍生的寡糖鏈之后，可將分辨出的種類分配到上述(i)-(v)中。將上述(i)-(v)中每一種的相對含量計算為，被分配到該組的寡糖總量相對于樣品中寡糖鏈總含量的比率。
例如，利用AIE-HPLC進行分辨時，可從BHK產生的重組凝血因子VII制劑中分辨出13個或更多個N-連接型寡糖峰，例如，參見Klausen等，Mol.Biotechnol.9195，1998。其中5個峰(在Klausen等人的文章中命名為1-5)不包含唾液酸，有8個峰(6，7，和10-15)包含唾液酸。
可以理解，在具體的分析中，包含唾液酸的鏈和缺乏唾液酸的鏈的數量和分布取決于(a)所要表達的多肽；(b)細胞類型和培養(yǎng)條件；以及(c)所采用的分析方法，而且所得到的模式也會因此有所不同。
任何情況下，一旦將含有唾液酸的寡糖與不含唾液酸的寡糖分辨清楚，就可以用常規(guī)數據分析程序來計算每一峰以下的面積；總的峰面積；以及具體的峰占總峰面積的百分比。如此一來，對于給定的制劑而言，含唾液酸的峰的總面積/總的峰面積×100就是本發(fā)明制劑的％唾液酸化值(即，具有至少一個唾液酸殘基的寡糖鏈的比例)。用類似的方法可以計算不具有唾液酸或至少有一個半乳糖或N-乙酰葡糖胺的鏈的百分比。
制備具有預定的N連接型寡糖模式的凝血因子VII制劑的方法具有預定的N-連接型寡糖模式的凝血因子VII、凝血因子VII變體、或凝血因子VII相關多肽的制劑，可以用表達凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的任何合適的宿主細胞來產生。
宿主細胞在一些實施方案中，宿主細胞是表達內源性凝血因子VII基因的人類細胞。在這些細胞中，所述內源基因可以是完整的或者可以被原位修飾，或者凝血因子VII基因以外的一種序列可以被原位修飾，使該內源性凝血因子VII基因的表達被改變?？梢允褂萌魏文鼙磉_內源性凝血因子VII基因的人類細胞。
在其它實施方案中，異源宿主細胞經過改造后能由重組基因表達人凝血因子VII。所述宿主細胞可以是脊椎動物、昆蟲或真菌的細胞。優(yōu)選所述細胞是能表達哺乳動物的N-連接型糖基化；O-連接型糖基化；和γ-羧基化的所有形式的哺乳動物細胞。參見，例如美國專利4,784,950。優(yōu)選的哺乳動物細胞系包括CHO(ATCC CCL 61)，COS-1(ATCC CRL 1650)，幼年倉鼠腎細胞(BHK)和HEK293(ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.3659-72，1977)細胞系。優(yōu)選的BHK細胞系是tk-ts13 BHK細胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791106-1110，1982)，后文稱BHK 570細胞。BHK 570細胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852獲得，其ATCC保藏號為CRL 10314。tk-ts13 BHK細胞系也可以選用ATCC CRL 1632。還可使用其它多種細胞系，包括大鼠Hep I(大鼠肝細胞癌；ATCC CRL 1600)，大鼠Hep II(大鼠肝細胞癌；ATCC CRL1548)，TCMK(ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCCCCL 9.1)和DUKX細胞(CHO細胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)。(DUKX細胞也稱為CXB11細胞)，和DG44(CHO細胞系)(Cell，33405，1983，和Somatic Cell and Molecular Genetics 12555，1986)。也可以使用3T3細胞，Namalwa細胞，骨髓瘤以及骨髓瘤與其它細胞的融合體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是已經適應了在沒有血清的條件下生長、并已經經過改造能表達凝血因子VII的BHK 21細胞。在一些實施方案中，所述細胞可以是表達糖基化酶(糖基轉移酶和/或糖苷酶)的突變細胞或重組細胞，但其表達的量或質量不同于天然表達這些酶的細胞類型。所述細胞也可以被改造為表達其它異源肽或蛋白，包括，如截短型凝血因子VII。
在一個實施方案中，宿主細胞是下述CHO細胞，其經過改造可以共表達所需凝血因子VII多肽(即，凝血因子VII或凝血因子-VII相關多肽)和另一種異源肽或多肽，如修飾酶或凝血因子VII片段。
方法本發(fā)明涉及制劑制備方法，所述制劑包含上述(i)-(vi)的任一種糖基型模式，在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及使凝血因子VII和凝血因子VII相關多肽的糖基型分布最優(yōu)化的方法。這些方法包括以下步驟(a)在第一組預定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的細胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽，以獲得包含這些多肽的制劑；和(c)分析與這些多肽連接的寡糖的結構，從而確定糖基型模式。
所述方法還包括(d1)改變步驟(a)的培養(yǎng)條件，得到第二組預定的培養(yǎng)條件；(e1)重復步驟(b)-(d1)，直至獲得所需的糖基型模式。
或者，所述方法還包括(d2)對所述制劑進行化學處理和/或酶處理，以改變寡糖的結構；和(e2)重復步驟(b)-(d2)，直至獲得所需糖基型模式。
這些方法可能還包括，使具有預定糖基型模式的制劑接受至少一種有關生物活性(包括，如凝血活性，使凝血因子X裂解的活性，或TF結合的活性)或其它功能(如動力學譜或穩(wěn)定性)的檢驗，并將具體的糖基型模式與具體的生物活性或功能特性相關聯(lián)，從而鑒定出所需糖基型模式。
步驟(d1)中可能被改變的培養(yǎng)條件包括，但不限于細胞來源，如來自不同于起始物種的另一物種；或突變細胞或重組細胞，它們在糖基化機制中的一或多種糖基轉移酶或糖苷酶或其它成分中具有改變(參見，Grabenhorst等，Glycoconjugate J.1681，1999；Bragonzi等，Biochem.Biophys.Acta 1474273，2000；Weikert，Nature Biotechnol.171116，1999)；多肽的表達水平；代謝條件，如葡萄糖或谷氨酰胺濃度；有或無血清；維生素K的濃度；蛋白水解物，激素，痕量金屬，鹽以及諸如溫度、溶氧量和pH等參數。
步驟(d2)中可能用于改變制劑的寡糖模式的酶處理包括，但不限于，依次用一或多種唾液酸酶(神經氨酸酶)，半乳糖苷酶，巖藻糖苷酶；半乳糖基轉移酶，巖藻糖基轉移酶，和/或唾液酸轉移酶，在能使具有特定末端結構的寡糖鏈的分布發(fā)生所需改變的條件下，進行處理。糖基轉移酶可以購自Calbiochem(LaJolla，CA)，糖苷酶可以購自Glyko，Inc.，(Novato，CA)。
在一系列實施方案中，表達凝血因子VII或相關多肽的宿主細胞在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述條件能使所述細胞分泌具有所需寡糖結構的所需模式的糖基化凝血因子VII多肽，如上述(i)-(vi)任一項所述。這樣的培養(yǎng)條件包括，但不限于，血清減量或完全缺乏。優(yōu)選宿主細胞經過適應后能在無血清的條件下生長，并且是在生長期和生產期都缺乏血清的條件下培養(yǎng)。對這類適應過程的描述參見Scharfenberg等，Animal Cell TechnologyDevelopments towards the 21St Century，E.C.Beuvery等(編)，KluwerAcademic Publishers，pp.619-623，1995(BHK和CHO細胞)；Cruz，BiotechnoLTech.11117-120，1997(昆蟲細胞)；Keen，Cytotechnol.17203-211，1995(骨髓瘤細胞)；Berg等，Biotechniques 14972-978，1993(人類腎293細胞)。在一優(yōu)選實施方案中，細胞培養(yǎng)基不含蛋白或分離自動物組織或動物細胞培養(yǎng)的任何成分。參見，例如以下實施例1。一般情況下，除了常規(guī)成分以外，適于制備凝血因子VII的培養(yǎng)基包含0.1-50mg/L維生素K，這是凝血因子VII中的谷氨酰胺殘基發(fā)生γ-羧基化所必需的。
在另一系列的實施方案中，本發(fā)明的糖基型是通過對凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的制劑中的N-連接型寡糖進行酶修飾和/或化學修飾而制備的。
凝血因子VII制劑本文中，“凝血因子VII制劑”是指多種凝血因子VII多肽，凝血因子VIIa多肽，或凝血因子VII相關多肽，包括變體和化學修飾形式，它們已經從合成它們的細胞中被分離出來。
將多肽從它們的細胞來源中分離可以用本領域已知的任何方法實現(xiàn)，包括，但不限于，從貼壁細胞培養(yǎng)物上取出包含所需產物的細胞培養(yǎng)基；離心或過濾以便除去未貼壁的細胞；等等。
任選地，凝血因子VII多肽可以被進一步純化。純化可以用本領域任何已知方法實現(xiàn)，包括，但不限于，在諸如抗-凝血因子VII抗體柱上進行親和層析(參見，例如Wakabayashi等，J.Biol.Chem.26111097，1986；和Thim等，Biochem.277785，1988)；疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳(如制備型等電聚焦(IEF))，差異溶解(如硫酸銨沉淀)，或提取等等。一般性描述參見，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，NewYork，1982；和Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989。純化后，制劑中可能含有總重量的約10％以下、更優(yōu)選約5％以下、最優(yōu)選約1％以下的、來源于宿主細胞的非-凝血因子VII蛋白。
凝血因子VII和凝血因子VII相關多肽可通過蛋白裂解性切割來活化，其使用凝血因子XIIa或其它具有胰蛋白酶-樣特異性的蛋白酶，如凝血因子IXa，激肽釋放酶，凝血因子Xa，和凝血酶。參見，例如Osterud等，Biochem.112853(1972)；Thomas，美國專利4,456,591；和Hedner等，J.Clin.Invest.711836(1983)?；蛘?，凝血因子VII可以因通過離子交換層析柱，如MonoQ(Pharmacia)等而被活化。所得活化的凝血因子VII然后可以如下配制并給藥。
凝血因子VII制劑的功能特性本發(fā)明具有預定的寡糖模式的凝血因子VII多肽和凝血因子VII相關多肽的制劑，具有相對于參照制劑改進的功能特性。所述改進的功能特性可包括，但不限于a)物理特性，如保存穩(wěn)定性；b)藥代動力學特性，如生物可利用度和半壽期；和c)在人體中的致免疫性。
參照制劑是指與將要用于比較的本發(fā)明制劑包含相同的多肽、但具有不同的天冬酰胺-連接型糖基化模式的制劑(如野生型凝血因子VII或具體變體或化學修飾形式)。例如，參照制劑通常包含一或多種以下糖基型模式(i)約93％以下(如約92％以下或約90％以下)的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基；(ii)至少約6％(如至少約7.5％或至少約10％)的寡糖鏈不含任何唾液酸(即，為中性)；(iii)至少約10％(如至少約12.5％或至少約15％)的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基；(iv)至少約15％(如至少約20％至少約25％)的寡糖鏈包含至少一個N-乙酰半乳糖胺殘基；(v)至少約25％(如至少約30％或至少約35％)的寡糖鏈包含至少一個未加帽的天線(即，包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基)；或(vi)基本上不可能檢測到的(如約0.2％以下)的天線式巖藻糖殘基。
凝血因子VII制劑的保存穩(wěn)定性可以通過測定如下特性來評估(a)制劑在25℃以干粉形式保存時，損失20％的生物活性所需的時間；和/或(b)使制劑中凝血因子VIIa聚集物的比例加倍所需的時間。
在一些實施方案中，在25℃以干粉形式保存時，本發(fā)明的制劑損失20％的生物活性所需的時間，比參照制劑發(fā)生同樣現(xiàn)象所需的時間增加至少約30％，優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約100％。生物活性可以用以下任一種試驗來測定凝血試驗、蛋白裂解試驗、TF-結合試驗，或TF-非依賴性凝血酶生成的試驗。
在一些實施方案中，在25℃以干粉形式保存時，本發(fā)明的制劑使聚集物加倍所需的時間比參照制劑增加至少約30％，優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約100％。聚集物的含量可通過在Protein Pak 300 SW柱(7.5×300mm)(Waters，80013)上進行凝膠滲透HPLC而確定，方法如下將層析柱用洗脫液A(0.2M硫酸銨，5％異丙醇，用磷酸將pH調至2.5，然后用三乙胺將pH調至7.0)平衡，然后加載25μg樣品。用洗脫液A以0.5ml/min的流速洗脫30min，檢測215nm的吸光值。聚集物的含量用凝血因子VII聚集物的峰面積/所有凝血因子VII(單體和聚集物)的峰的總面積來計算。
“生物可利用度”是指在凝血因子VII或凝血因子VII相關制劑給藥后的預定時間點可檢測到的給藥劑量的比例。通常，生物可利用度如下檢測對動物給藥約25-250μg/kg該制劑；在給藥后的預定時間點獲得血漿樣品；和用凝血試驗(或任何生物試驗)、免疫分析或等效的試驗中的一或多種試驗測定樣品中凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的含量。數據通常用[凝血因子VII]對時間的圖來表示，生物可利用度則表示為曲線下的面積(AUC)。待測制劑的相對生物可利用度是指，待測制劑與參照制劑的AUC之比。
在一些實施方案中，本發(fā)明的制劑具有參照制劑的生物可利用度的至少約110％，優(yōu)選至少約120％，更優(yōu)選至少約130％，最優(yōu)選至少約140％。生物可利用度可以在任何哺乳動物物種中測定，優(yōu)選狗，用于計算AUC的預定時間點從10min漸增至8h。
“半壽期”是指凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的血漿濃度從一個具體值減少至它的一半所需的時間。半壽期可以用測定生物可利用度的方法來測定。在一些實施方案中，本發(fā)明制劑比參照制劑的半壽期增加至少約0.25h，優(yōu)選至少約0.5h，更優(yōu)選至少約1h，最優(yōu)選至少約2h。
制劑的“致免疫性”是指該制劑給藥至人體后，激發(fā)有害的體液和/或細胞免疫的能力。目前不清楚凝血因子VIIa多肽和凝血因子VIIa相關多肽能否在人體內激發(fā)可檢測的免疫應答。但是在任何亞人群中，可能存在對具體給藥蛋白敏感的個體。致免疫性可以如下檢測用本領域已知的常規(guī)方法定量敏感個體中抗-凝血因子VII抗體和/或凝血因子VII-應答型T-細胞的存在。在一些實施方案中，本發(fā)明制劑對敏感個體的致免疫性為參照制劑對敏感個體的致免疫性的至少約10％，優(yōu)選至少約25％，更優(yōu)選至少約40％，最優(yōu)選至少約50％。
藥用組合物和應用方法本發(fā)明制劑可用于治療任何凝血因子VII-應答性綜合征，如出血疾病，包括但不限于，因凝血因子缺乏所致的疾病(如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺陷)；血小板減少癥或von Willebrand病，或因凝血因子抑制劑所致疾病，或因任何原因所致過量出血。所述制劑還可以配合手術或其它創(chuàng)傷來給藥，或給藥至接受抗凝治療的患者。
包含本發(fā)明凝血因子VII相關多肽的制劑相對于野生型凝血因子VII的生物活性實質上減弱，它們可用作抗凝劑，用于例如正在接受血管形成術或其它有可能增加血栓或血管阻塞危險的手術的患者(如在再狹窄中發(fā)生的那樣)。其它可以開出抗凝劑處方的臨床指征包括，但不限于，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥有關的肺或腎內纖維蛋白沉積，或心肌梗塞；急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥應答綜合征(SIRS)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，MOF，和TTP。
包含本發(fā)明凝血因子VII和凝血因子VII相關制劑的藥用組合物，主要用于非胃腸道給藥，從而進行預防性和/或治療性處理。優(yōu)選所述藥用組合物通過非胃腸道途徑給藥，即，靜脈給藥，皮下給藥或肌肉內給藥。它們可以通過連續(xù)或脈動型(pulsatile)輸注方式給藥。
藥用組合物或配制劑包含本發(fā)明的制劑，其組合了，優(yōu)選溶于，可藥用載體，優(yōu)選含水載體或稀釋劑。有多種含水載體可以使用，如水，緩沖水，0.4％的鹽水，0.3％的甘油等等。本發(fā)明的制劑也可以配制成用于運送或靶向損傷部位的脂質體制劑。脂質體制劑的一般性描述可參見美國專利4,837,028、4,50l,728,和4,975,282。所述組合物可以通過常規(guī)的已知滅菌技術滅菌。所得含水溶液可以包裝備用或在無菌條件下過濾并凍干，凍干制劑可以在給藥前與無菌水溶液混合。
所述組合物可以包含可藥用的輔助物質或添加劑，包括但不限于，pH調節(jié)劑和緩沖劑和/或滲透壓調節(jié)劑，如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣等。
這些配制劑中凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的濃度可以有很大差異(即，從0.5％重量以下，通常為或至少約1％重量至15或20％重量)，主要依據與所選的具體給藥方式相應的流體體積、粘度等來選擇。
因此，用于靜脈輸注的典型藥用組合物可包含250ml無菌Ringer溶液和10mg所述制劑?？梢赃M行非胃腸道給藥的組合物的真實制備方法為本領域已知或很明顯，更詳細的描述可參見Remington’s PharmaceuticalSciences，18th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990)。
包含本發(fā)明制劑的組合物可以為了預防性和/或治療性處理的目的而給藥。在治療性處理中，組合物是給予如上所述的已經患病的受試者，給藥量足以治愈、緩解或部分控制所述疾病及其并發(fā)癥。足以完成這些目的的量就是“治療有效量”。每種目的的有效量取決于疾病或損傷的嚴重性以及受試者的體重和總體狀態(tài)。但一般情況下，有效量通常為約0.05mg-約500mg制劑/日/70kg受試者，更常用的是約1.0mg-約200mg制劑/日?？梢岳斫獾氖?，能用常規(guī)試驗確定合適的劑量，方法是構建關于值的矩陣，并測試該矩陣中的不同點。
本發(fā)明制劑的局部運送，例如，局部應用，可以，例如通過噴射、灌注、雙氣囊導管(double balloon catheters)、支架、摻入脈管移植物或支架、用于包被氣囊導管的水凝膠、或其它成熟的方法來進行。在任一種情況中，所述藥用組合物應該提供足以有效治療受試者的制劑量。
本發(fā)明的藥用組合物還可以包含其它生物活性制劑，如非-凝血因子VII-相關的凝血劑或抗凝劑。
以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明，并非限制。
實施例1制備并分析具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑用以下實驗制備具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑。
I.制備用編碼凝血因子VII的質粒轉化的BHK細胞系經過適應，能在沒有血清的情況下在懸浮培養(yǎng)中生長。將所述細胞在旋轉培養(yǎng)(spinnerculture)中連續(xù)傳代，隨著細胞數的增加，體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。
最后，將6L育種(seed)培養(yǎng)物接種至含有大孔Cytopore 1載體(Pharmacia)的100-升制備型反應器中，懸浮細胞因此被固定在所述載體上。將培養(yǎng)物維持在36℃、pH6.7-6.9和50％的DO中。隨著細胞數的增加，制備型反應器中的體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。當細胞密度達到約2×106細胞/ml時，開始進入生產期，每24小時更換培養(yǎng)基終止攪拌，使含有細胞的載體沉降，然后收獲80％的培養(yǎng)上清，代之以新的培養(yǎng)基。所收獲的培養(yǎng)上清經過濾除去未被捕獲的細胞和細胞殘渣，然后轉移以備進一步加工。
在生產期，細胞達到3-6×106細胞/ml，滴度為2-7mg凝血因子VII/升。
II.對重組血因子VII的糖基型模式的分析比較以下制劑的寡糖模式(a)第I部分中所述的重組凝血因子VII制劑(n＝7)；以及兩種參照制劑；(b)在有牛血清的情況下于BHK細胞中產生的重組凝血因子VII制劑(n＝10)；和(c)從人血漿純化得到的凝血因子VII制劑。
所述多肽經過化學切割(肼解作用，使用GlycoPrep1000設備，OxfordGlycoSciences)或酶切割(N-糖苷酶F，如來自Boehringer Mannheim)而釋放N-連接型寡糖。將所釋放的寡糖用2-氨基苯甲酰胺進行標記(使用單個標記試劑盒，K-404，Oxford Glyco-Sciences或Glyko)。被標記的寡糖在配有保護柱(4×50mm，Dionex，P/N 43054)的CarboPac PA100柱(4×250mm，Dionex，P/N 43055)上通過陰離子交換HPLC進行分析。該柱用150mM氫氧化鈉平衡，用0-150mM乙酸鈉的梯度、150mM氫氧化鈉來洗脫。寡糖用熒光來檢測，激發(fā)波長為330nm，發(fā)射波長為420nm。
各種凝血因子VII的寡糖結構(Klausen等，1998)的相對含量用陰離子交換HPLC分析中糖峰的相對峰面積來計算。根據每種寡糖的結構元素，將其如下分配(i)包含至少一個唾液酸的鏈；(ii)缺乏任何唾液酸(即，中性)的鏈；(iii)含有至少一個半乳糖殘基的鏈；(iv)含有至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基的鏈；和(v)含有至少一個未加帽的天線(即，至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基)的鏈。最后，分配至每一組的寡糖鏈的相對含量的總和用總寡糖鏈的百分比來計算。測定值的標準差為0.08％(一天內的差異)；0.7％(不同天之間的差異)；和0.5％(1-100μg間隔)。
所得糖基型模式見下表

本實施例所得重組凝血因子VII制劑(即，在不含血清的情況下所得)具有不同于有血清的情況下所制備的重組凝血因子VII以及從人血漿中分離的天然凝血因子VII的糖基型模式。在無血清的情況下制備的重組凝血因子VII，其寡糖的唾液酸化程度高于在有血清的情況下所得，并且其包含更少的中性鏈和更少的末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
III.生物可利用度以下實驗用來比較上述(I和II)制備的兩種凝血因子VII制劑與兩種參照凝血因子VII制劑(即，在有血清的情況下制備的制劑)(A和B)的生物可利用度。
以N-甘氨酰甘氨酸緩沖液(pH7.4)中25μg/kg(～100μg/大鼠)的劑量，對多個動物組(每組8只大鼠)給藥試驗制劑或參照制劑，所述緩沖液含有氯化鈉(7.87mg/ml)，二水氯化鈣(1.48mg/ml)，甘露醇(2.5mg/ml)和polysorbate80。在給藥后的10min和30min時取血樣。從血樣中獲得血漿，用ELISA定量凝血因子VII。根據10和30-min所取樣品得到凝血因子VII的血漿濃度曲線，每一樣品的生物可利用度表示為該曲線以下的經劑量調整的面積(AUC10-30/劑)。相對生物可利用度表示為試驗樣品和參照樣品的平均AUC10-30/劑×100的比例。相對生物可利用度的90％置信限根據不同制劑之間的差異的90％置信限來計算。
結果見下表。(如上述測得的每一制劑的唾液酸化百分比示于括號中)。

結果表明，即使具有至少一個唾液酸殘基的寡糖鏈所占比例只有很小的差異，例如93％與96或97％之間這樣的差異，也可以顯著影響生物可利用度(增加20-30％)。更有甚者，唾液酸化百分比增加10％將導致生物可利用度增加40-50％。
實施例2對具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑進行分析如實施例1所述制備凝血因子VII，不同的是從500-1培養(yǎng)物中收獲凝血因子VII。如實施例1所述進行糖基型分析。分析了三種不同的制劑(A，B，和C)，并將它們與參照制劑(D)比較。
生物可利用度在犬模型中如下測定將12只Beagle犬分為4組，進行四肢交叉研究。以N-甘氨酰甘氨酸緩沖液(pH5.5)中約90μg/kg的劑量，對每一動物給藥試驗制劑A，B，或C，或者給藥參照制劑D，所述緩沖液含有氯化鈉(2.92mg/ml)，二水氯化鈣(1.47mg/ml)，甘露醇(30mg/ml)和polysorbate 80。在給藥后的10，30，和60分鐘時以及2，3，4，6和8小時之時取血樣。從這些血樣中獲得血漿，用ELISA定量凝血因子VII。
每一樣品的生物可利用度表示為凝血因子VII的血漿濃度曲線以下的經劑量調整的面積(AUC/劑)。相對生物可利用度表示為試驗制劑和參照制劑的平均AUC/劑×100的比例，并計算相對生物可利用度的90％置信限。
結果見下表。如上述測得的每一制劑的唾液酸化百分比示于括號中。

結果表明，即使具有至少一個唾液酸殘基的寡糖鏈所占比例只有很小的差異，也可以顯著影響凝血因子VII的生物可利用度。更有甚者，唾液酸化百分比增加10％將導致生物可利用度增加30-50％，且三種試驗制劑以及參照制劑的線性關系非常接近。
實施例3具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑以下實驗用于制備具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑。
I.構建細胞系和制備凝血因子VII用于表達人FVII的質粒載體pLN174參見Persson和Nielsen.1996.FEBS Lett.385241-243)。簡言之，它攜帶編碼人FVII的cDNA核苷酸序列，其中包括在小鼠金屬硫蛋白啟動子控制之下的原肽(用于轉錄所插入的cDNA)，以及在SV40早期啟動子控制之下的小鼠二氫葉酸還原酶cDNA(用作選擇標記)。
為了構建編碼γ-羧基化識別序列的質粒載體，使用含有編碼FVII的cDNA包括其原肽的克隆載體(pBluescript II KS+，Stratagene)(pLN171)。(Persson等1997.J.Biol.Chem.2721991919924)。在所述編碼FVII的cDNA中，于FVII原肽之后，用上述克隆載體經過反向PCR-介導的誘變插入一個編碼終止密碼子的核苷酸序列。模板質粒用NaOH處理使之變性，隨后用Pwo(Boehringer-Mannheim)和Taq(Perkin-Elmer)聚合酶以及以下引物進行PCRa)5′-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3′b)5′-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3′所得混合物用DpnI處理，以便消化殘余的模板DNA，用所述PCR產物轉化大腸桿菌(Escherichia coli)。通過測序檢測克隆中是否存在突變。將來自正確克隆的cDNA以BamHI-EcoRI片段的形式轉移至表達質粒pcDNA3(Invitrogen)中。將所得質粒命名為pLN329。用等量的pLN174和pLN329經Fugene6法(Boehriner-Mannheim)轉染CHO K1細胞(ATCCCCI61)。轉染體通過添加氨甲喋呤至μM并添加G-418至0.45mg/ml來進行篩選。通過有限稀釋對匯集的轉染體進行克隆，測定這些克隆的FVII表達。
對一例高產克隆進行進一步克隆，選出在含有10％胎牛血清的Dulbecco-改良型Eagle培養(yǎng)基中以2.4pg/細胞/天的水平特異性表達FVII的克隆Ell。使該克隆在不含動物來源的成分的市售CHO培養(yǎng)基(JRHBioscience)中適應無血清的懸浮培養(yǎng)。
經過適應后的細胞在旋轉培養(yǎng)中連續(xù)傳代，隨著細胞數的增加，體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。25天后，將6L旋轉培養(yǎng)物接種至50-升的生物反應器中。使所述細胞在該生物反應器中繁殖，隨著細胞數的增加，體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。
最后，將50L育種培養(yǎng)物接種至含有大孔Cytopore 1載體(Pharmacia)的500-升制備型反應器中，懸浮細胞因此被固定在所述載體上。將培養(yǎng)物維持在36℃、pH7.0-7.1和50％飽和的溶解氧張力(Dissolved Oxygen Tension，DOT)中。隨著細胞數的增加，制備型反應器中的體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。當細胞密度達到約10-12×105細胞/ml時，開始進入生產期，每24小時更換培養(yǎng)基終止攪拌，使含有細胞的載體沉降，然后收獲80％的培養(yǎng)上清，代之以新的培養(yǎng)基。所收獲的培養(yǎng)上清經過濾除去未被捕獲的細胞(即，未固定在載體上的細胞)和細胞殘渣，然后轉移以備進一步加工。
在生產期，細胞達到2-3×107細胞/ml，滴度為8mg凝血因子VII/升。
II.糖基型分析A.將上述(a)所制備的凝血因子VII制劑的寡糖模式與下列進行比較(b)在有牛血清的情況下于BHK細胞中產生的重組凝血因子VII制劑；和(c)從人血漿純化得到的凝血因子VII制劑。所用方法基本如實施例1所述。
結果見下表。將寡糖如下分配(i)包含至少一個唾液酸的鏈；(ii)缺乏任何唾液酸(即，中性)的鏈；(iii)含有至少一個半乳糖殘基的鏈；(iv)含有至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基的鏈；和(v)含有至少一個未加帽的天線(即，至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基)的鏈。

B.將本實施例(a)中制備的5種不同凝血因子VII制劑的寡糖模式與下列進行比較(b)在有牛血清的情況下于BHK細胞中產生的重組凝血因子VII制劑；和(c)從人血漿純化得到的凝血因子VII制劑。所用分析方法如實施例1所述。
根據每種寡糖的結構元素，將其如下分配(i)包含至少一個唾液酸的鏈；(ii)缺乏任何唾液酸(即，中性)的鏈；(iii)含有至少一個與天線連接的巖藻糖的鏈。最后，每一組的寡糖鏈的相對含量的總和用總寡糖鏈的百分比來計算。測定值的標準差為0.08％(一天內的差異)；0.7％(不同天之間的差異)；和0.5％(1-100μg間隔)。
所得糖基型模式見下表

實施例1制備的重組凝血因子VII制劑(即，在無血清的情況下由CHO細胞系產生的制劑)具有不同于有血清的情況下所制備的重組凝血因子VII以及從人血漿分離的天然凝血因子VII的糖基型模式。在無血清的情況下由CHO細胞系282.4產生的重組凝血因子VII包括以下結構，其中巖藻糖與天線連接，而兩種參照制劑都沒有這樣的結構。純化其中的兩種結構，并通過如下方法進行鑒定基質輔助激光解析電離(ionization)質譜分析，用鍵特異性巖藻糖苷酶進行處理，以及進行陰離子交換HPLC，如上所述。結果，兩種結構都包含唾液酸Lewis x結構，即，在唾液酸化的寡糖中，巖藻糖以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接。
III.生物活性分析本實施例制備的5種凝血因子VII制劑的(a)凝血酶的生成和(b)與組織因子(TF)的結合，并與在有血清的情況下于BHK細胞中產生的重組凝血因子VII(參照)進行比較。下表顯示糖基型模式(含唾液酸的寡糖鏈的百分比以及含巖藻糖式天線的寡糖鏈的百分比)與兩種生物活性有關。

結果表明，具有巖藻糖式天線的凝血因子VII制劑比缺乏巖藻糖式天線的凝血因子VII制劑具有較高的TF-非依賴性凝血因子VII活性(如凝血酶生成試驗所示)。
實施例4體外水解試驗以下方法可用于分析凝血因子VIIa的生物活性。該試驗在微滴板(MaxiSorp，Nunc，丹麥)中進行。將生色底物D-Ile-Pro-Arg-對硝基苯胺(p-nitroanilide)(S-2288，Chromogenix，瑞典)以終濃度1mM加入50mMHepes，pH7.4中的凝血因子VIIa(終濃度100nM)中，所述Hepes中還含有0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白。用SpectraMax 340讀板儀(Molecular Devices，USA)連續(xù)讀取405nm處的吸光值。將20分鐘保溫期間的吸光值減去不含酶的空白孔的吸光值后，用于計算試驗凝血因子VIIa和對照凝血因子VIIa的活性比。
實施例5體外蛋白裂解試驗以下方法可用于分析凝血因子VIIa的生物活性。該試驗在微滴板(MaxiSorp，Nunc，丹麥)中進行。將100μl 50mM Hepes，pH7.4中的凝血因子VIIa(10nM)和凝血因子X(0.8μM)保溫15分鐘，所述Hepes中還含有0.1MNaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白。然后，通過加入50μl含0.1MNaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4而終止凝血因子X的裂解。所產生的凝血因子Xa的量通過添加終濃度為0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)來測量。用SpectraMaxTM340讀板儀(Molecular Devices，USA)連續(xù)讀取405nm處的吸光值。將10分鐘保溫期間的吸光值減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光值后，用于計算試驗凝血因子VIIa和對照凝血因子VIIa的蛋白裂解活性之比。
本文引用的所有專利、專利申請以及參考文獻都以其全文引入作為參考。
本領域技術人員根據本說明書的上述詳細描述，可以對本發(fā)明進行多種改動。這些顯而易見的改動都包括在所附權利要求的范圍內。
權利要求
1.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中94-99％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分。
2.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約1-7％的寡糖鏈為電中性。
3.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約6-16％的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基。
4.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約6-9％的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基。
5.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約11-23％的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基。
6.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約2％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3構型與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
7.權利要求1-6任一項的制劑，其中所述寡糖鏈中的唾液酸殘基以α2-＞3鍵與半乳糖連接。
8.權利要求1-7任一項的制劑，其中所述唾液酸殘基包含N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)和N-乙醇酰神經氨酸(Neu5Gc)。
9.權利要求1-8任一項的制劑，其中所述寡糖包含以α1-＞6鍵與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖。
10.權利要求1-9任一項的制劑，其中約95-98％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。
11.權利要求1-10任一項的制劑，其中約96-97％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。
12.權利要求1-11任一項的制劑，其中約2-4％的寡糖鏈為電中性。
13.權利要求1-12任一項的制劑，其中約8-12％的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基。
14.權利要求1-13任一項的制劑，其中約7-8％的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基。
15.權利要求1-14任一項的制劑，其中約12-18％的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基。
16.權利要求1-15任一項的制劑，其中至少約5％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
17.權利要求1-16任一項的制劑，其中至少約10％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
18.權利要求1-17任一項的制劑，其中至少約20％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
19.權利要求1-18任一項的制劑，其中至少約40％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
20.權利要求1-19任一項的制劑，其中所述多肽具有野生型凝血因子VII的氨基酸序列。
21.權利要求1-20任一項的制劑，其中所述多肽是野生型凝血因子VIIa。
22.權利要求1-19任一項的制劑，其中所述凝血因子VII多肽選自S52A-凝血因子VII，S60A-凝血因子VII，在殘基290和291之間被蛋白裂解的凝血因子VII，在殘基315和316之間被蛋白裂解的凝血因子VII；以及氧化型凝血因子VII。
23.權利要求1-19任一項的制劑，其中所述凝血因子VII相關多肽選自R152E-凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，F(xiàn)FR-凝血因子VII，以及缺乏Gla結構域的凝血因子VIIa。
24.包含多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中(i)約94-100％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分，且(ii)約6-9％的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基。
25.權利要求24的制劑，其中所述凝血因子VII多肽具有野生型凝血因子VII的序列。
26.包含多種凝血因子VIIa多肽的制劑，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，其中約94-99％的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。
27.包含多種凝血因子VIIa多肽的制劑，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，其中至少約2％的寡糖鏈包含至少一個以α1-＞3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。
28.權利要求1-27任一項的制劑，其中所述多肽產生于選自真菌細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞的宿主細胞。
29.權利要求28的制劑，其中所述細胞是哺乳動物的細胞。
30.權利要求29的制劑，其中所述哺乳動物細胞來自倉鼠。
31.權利要求30的制劑，其中所述倉鼠細胞選自CHO細胞或BHK細胞。
32.權利要求29的制劑，其中所述哺乳動物細胞來自人類。
33.權利要求32的制劑，其中所述人類細胞是HEK細胞。
34.權利要求1-33任一項的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約110％的生物可利用度，其中參照制劑中約93％或更少的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分。
35.權利要求34的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約120％的生物可利用度。
36.權利要求35的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約130％的生物可利用度。
37.權利要求36的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約140％的生物可利用度。
38.測定凝血因子VII和凝血因子VII相關多肽的糖基型模式的方法，該方法包括(a)在第一組預定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽的細胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關多肽，以獲得包含這些多肽的制劑；和(c)分析與這些多肽連接的寡糖的結構，從而確定所述制劑的糖基型模式。
39.權利要求38的方法，還包括(d1)改變步驟(a)的培養(yǎng)條件，得到第二組預定的培養(yǎng)條件；(e1)重復步驟(b)-(d1)，直至獲得所需的糖基型模式。
40.權利要求38的方法，還包括(d2)對所述制劑進行化學處理或酶處理，以改變寡糖的結構；和(e2)重復步驟(b)-(d2)，直至獲得所需糖基型模式。
41.制備含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關多肽的制劑的方法，所述多肽具有預定的N-連接型糖基化模式，所述方法包括培養(yǎng)能表達所述多肽的細胞，所用的培養(yǎng)條件使所述多肽上至少約94％的天冬酰胺-連接型寡糖包含至少一個唾液酸殘基。
42.一種藥用配制劑，其包含權利要求1-37任一項的制劑和一種可藥用載體或添加劑。
43.治療凝血因子VII-應答性綜合征的方法，所述方法包括，在使出血減少和/或使凝血增加的條件下，對需要相應治療的患者給藥權利要求42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII多肽。
44.權利要求43的方法，其中所述綜合征選自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，von Willebrand病，凝血因子抑制劑的存在，外科手術，創(chuàng)傷或抗凝治療。
45.預防不希望發(fā)生的出血的方法，所述方法包括，在使出血減少和/或使凝血增加的條件下，對需要相應治療的患者給藥權利要求42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII多肽。
46.預防不希望發(fā)生的凝血的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的條件下，對需要相應治療的患者給藥權利要求42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII相關多肽。
47.預防組織因子介導的反應的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的條件下，對需要相應治療的患者給藥權利要求42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII相關多肽。
48.權利要求46的方法，其中所述不希望發(fā)生的凝血與選自下組的疾病有關血管成形術，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥有關的肺或腎內纖維蛋白沉積，或心肌梗塞。
49.權利要求47的方法，其中所述組織因子介導的反應與選自SIRS，ARDS，MOF，HUS，或TTP的疾病有關。
50.權利要求1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑的用途，用于制備治療凝血因子VII應答性綜合征的藥物。
51.權利要求50的用途，，其中所述綜合征選自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，von Willebrand病，凝血因子抑制劑的存在，外科手術，創(chuàng)傷或抗凝治療。
52.權利要求1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑的用途，用于制備預防不希望發(fā)生的出血的藥物。
53.權利要求1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑的用途，用于制備預防不希望發(fā)生的凝血的藥物。
54.權利要求53的用途，其中所述不希望發(fā)生的凝血與選自下組的疾病有關血管成形術，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內毒素血癥有關的肺或腎內纖維蛋白沉積，或心肌梗死。
55.權利要求1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關多肽的制劑的用途，用于制備預防組織因子介導的反應的藥物。
56.權利要求55的用途，其中所述組織因子介導的反應與選自SIRS，ARDS，MOF，HUS，或TTP的疾病有關。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含凝血因子VII和其它凝血因子的制劑，所述因子具有改變的天冬酰胺－連接型糖基化模式。
文檔編號A61K38/48GK1468303SQ01816746
公開日2004年1月14日 申請日期2001年10月2日 優(yōu)先權日2000年10月2日
發(fā)明者漢斯·K·平格爾, 漢斯 K 平格爾, K 克勞森, 尼爾斯·K·克勞森 申請人:諾沃挪第克公司