專利名稱：修飾的病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于在基因治療中應(yīng)用的新的重組病毒。這種重組病毒展示了改變的向性，其向性是由于在一或多種病毒成分中摻入一或多種非天然多肽，或者用非天然多肽替代這些成分而造成的。這些非天然多肽可包含能模擬起始病毒成分的結(jié)構(gòu)的元件，從而能在功能性病毒體顆粒中包含所述多肽。這些非天然多肽還可以包含能使所述病毒體顆粒具有非天然配體結(jié)合功能(即改變的向性)的元件。本質(zhì)上，本發(fā)明中應(yīng)用的非天然多肽具有能使它們?cè)诓溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞核以及胞質(zhì)溶膠中正確折疊并隨后能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一級(jí)和二級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)使得能裝配出功能性重組病毒體顆粒，且所述病毒體具有完整無損的非天然結(jié)合功能并因此具有改變的向性。
臨床基因治療首次出現(xiàn)在1989。當(dāng)時(shí)的目的是通過在體外將健康基因?qū)牖颊叩娜毕菁?xì)胞并將處理過的細(xì)胞回輸給患者而糾正免疫系統(tǒng)中的基因缺陷。自那時(shí)起，對(duì)基因治療的說明和可能的分子應(yīng)用大大增多。在十余年后的現(xiàn)在，人們已經(jīng)正視基因治療在治療諸如血管疾病，癌癥，炎性疾病和傳染病如HIV中的用途。
但是直至目前，基因治療在人類醫(yī)學(xué)中仍然不算一種有效的方法。一個(gè)主要的原因是，基因治療要求包裝基因，以便將它們運(yùn)送至基因載體，而這些載體必須能給藥于人類并將上述基因僅靶向目標(biāo)細(xì)胞。迄今尚無可靠的這類載體。
已有數(shù)類病毒被考慮作為基因治療中的載體，最常用的是腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒和腺伴隨病毒。
理想的基因治療載體是那些能全身給藥且能將遺傳物質(zhì)特異性運(yùn)送至目標(biāo)細(xì)胞或組織的載體。但是，目前考慮用于人類基因治療的病毒具有較廣泛的向性，能感染人體中多種不同類型的細(xì)胞。這使病毒載體的安全性受限，不能全身給藥。因此，開發(fā)能僅僅感染所選細(xì)胞的靶向型病毒載體成為基因治療的神圣目標(biāo)。
一種已得到最廣泛研究的基因治療載體是腺病毒。人類腺病毒可分為六個(gè)血凝素組(A-F)，每個(gè)血凝素組又可以再分為不同血清型。共有40種以上不同的人類腺病毒血清型。最常用于人類基因治療的腺病毒是腺病毒5型(Ad5)，它屬于血凝素C組。
腺病毒(Ad)是無包膜的DNA病毒，為規(guī)則的二十面體形狀，直徑60-85nm。
腺病毒衣殼包含252個(gè)殼粒，240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體(Ginsberg等，Virology，28，782-83(1966))。其六鄰體和五鄰體都來自三種病毒蛋白。六鄰體含有三個(gè)相同的蛋白，每個(gè)有967個(gè)氨基酸，稱為多肽II。五鄰體有一個(gè)基座與衣殼結(jié)合，還有一個(gè)尾絲(fiber)，它與五鄰體的基座非共價(jià)結(jié)合并且從該基座凸出。腺病毒外殼還有蛋白IX，VI和IIIa，一般認(rèn)為它們使病毒衣殼穩(wěn)定。
細(xì)胞結(jié)合通過尾絲蛋白完成，這些蛋白錨著在病毒體的二十面體頂部。尾絲蛋白并非完整病毒體裝配和釋放所必需。病毒體的裝配發(fā)生在被感染細(xì)胞的核內(nèi)。
尾絲蛋白是尾絲多肽(稱為腺病毒多肽IV)的同型三聚體，它包含三個(gè)功能不同的部分N-末端尾部，使尾絲非共價(jià)錨著在病毒體的五鄰體基座上，并且還包含核定位信號(hào)；莖區(qū)(shaft domain)，含有不同數(shù)量的重復(fù)單元，每個(gè)單元有大約15個(gè)氨基酸的尾絲莖區(qū)基元，(例如，在Ad3中重復(fù)六次，在Ad2和Ad5中重復(fù)22次)；和C-末端球形區(qū)，稱為“頂球(knob)”，它含有與細(xì)胞上Ad-受體結(jié)合的配體(Chrobozek等，Microbiology和Immunology，(1995)，p.163-200)。此頂球還負(fù)責(zé)使尾絲形成三聚體(即，它摻入一個(gè)三聚體化基元)。
每一莖區(qū)重復(fù)單元有兩個(gè)形成β折疊的3-氨基酸區(qū)和兩個(gè)組成天然延伸的尾絲莖區(qū)的轉(zhuǎn)角的氨基酸區(qū)。三聚體化的細(xì)胞結(jié)合區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確，它顯示出特有的不同于其它反-平行β-夾心的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Xia等，Structure 21259-1270，(1993))。尾絲與病毒體的五鄰體基座的結(jié)合也可以發(fā)生在無細(xì)胞的系統(tǒng)中，即尾絲可以與無尾絲的病毒體結(jié)合(Boudin等，Virology，116589604，(1982))。
對(duì)腺病毒尾絲進(jìn)行修飾(如產(chǎn)生重組尾絲蛋白)，從而改變腺病毒載體的特性，如改變其向性或與細(xì)胞結(jié)合的特性，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有這方面的報(bào)道。
腺病毒尾絲蛋白行使數(shù)種生物學(xué)功能，這些功能是產(chǎn)生活性病毒顆粒所必需維持的功能。以下的尾絲特性被視為在構(gòu)建功能性修飾型尾絲蛋白時(shí)十分重要i)形成平行的同型三聚體的能力。該功能由野生型尾絲頂球的N-末端氨基酸序列介導(dǎo)。
ii)與五鄰體基座結(jié)合，從而形成五鄰體殼粒的能力。該功能由野生型尾絲的尾部介導(dǎo)。
iii)表達(dá)與細(xì)胞結(jié)合的配體，從而能附著于靶細(xì)胞的能力。在天然狀態(tài)下，該功能由野生型尾絲頂球(其與細(xì)胞上的Ad-受體結(jié)合)介導(dǎo)。
iv)轉(zhuǎn)運(yùn)至被感染細(xì)胞的核內(nèi)的能力，這是形成病毒的關(guān)鍵。該功能主要由野生型尾絲的尾部介導(dǎo)，但也可能還有其它部位來介導(dǎo)。
此前關(guān)于改變腺病毒向性的嘗試涉及對(duì)尾絲和頂球的基因修飾。但是，這種方法經(jīng)證實(shí)并不是十分成功。主要問題在于，如何將新配體摻入功能性病毒(context)中，使其能改變向性而又不影響尾絲的三聚體化。例如，在頂球的C-末端添加一個(gè)較短的肽配體(Michael等，Gene Therapy，2660-8，(1995))和在其中一個(gè)頂球“環(huán)”中引入九肽(Dmitriev等，J.Virol.，72(12)9706-9713(1998))。但是，這種頂球由于三個(gè)尾絲亞單位之間的相互作用而具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而上述相互作用是確保與細(xì)胞結(jié)合以及三聚體化所必需的。因此，這種頂球僅能耐受少量氨基酸的插入，目前尚無構(gòu)建功能性、遺傳再靶向(re-targete)的腺病毒尾絲的通用方法。
還有人嘗試將新配體導(dǎo)入腺病毒顆粒的其它部位。將FLAG四氨基酸基元引入Ad五鄰體，有可能將Ad引向通常情況下不被Ad感染的細(xì)胞。這種再靶向可通過用雙特異性抗體進(jìn)行靶向而實(shí)現(xiàn)，這種雙特異性抗體的其中一種特異性是針對(duì)FLAG肽，另一種針對(duì)新的靶細(xì)胞(Wickham等，J.Virol.，706831-6838，(1996))。
在制備用于基因治療的有效重組病毒時(shí)，遇到了一個(gè)此前未曾遇到的問題，即如何確保表達(dá)在宿主細(xì)胞的核以及胞質(zhì)溶膠中的重組成分發(fā)生功能性折疊。尤其是，當(dāng)進(jìn)行改造的野生型病毒的復(fù)制需要利用表達(dá)在這些細(xì)胞內(nèi)部位的成分時(shí)，例如，在腺病毒的情況中。折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，尤其是那些依靠半胱氨酸之間的二硫鍵來維持功能性正確構(gòu)象的結(jié)構(gòu)，如衍生自抗體的結(jié)構(gòu)，當(dāng)作為重組病毒成分表達(dá)在核和胞質(zhì)溶膠的還原環(huán)境中時(shí)，可能發(fā)生錯(cuò)誤折疊，變成無功能結(jié)構(gòu)。因此，本領(lǐng)域目前仍然需要能在作為病毒成分表達(dá)于上述細(xì)胞內(nèi)空間時(shí)維持功能性構(gòu)象的蛋白結(jié)構(gòu)，以便使這些結(jié)構(gòu)所包含或支持的結(jié)合功能維持有效，尤其是在缺乏結(jié)合所需的配體時(shí)。
因此在對(duì)腺病毒尾絲進(jìn)行遺傳工程改造，以便其可用于構(gòu)建人類基因治療所需的重組再靶向腺病毒(Ad-病毒)時(shí)仍然存在很大的問題。這些問題被認(rèn)為很重要，因?yàn)楦嗟幕颊呤怯孟俨《据d體而不是用任何其它類型的載體進(jìn)行治療(Trapnell等，Biotechnology，5617-625，(1994))。本發(fā)明在構(gòu)建用于基因治療的遺傳再靶向病毒時(shí)繞開了這些問題，通過將與細(xì)胞結(jié)合的新配體引入病毒成分蛋白而獲得了新的病毒向性。
本文所述本發(fā)明有一部分涉及制備具有新向性的功能性重組腺病毒尾絲蛋白，方法是去除(例如封閉或滅活)天然的細(xì)胞結(jié)合區(qū)，將它替換為，或者添加含有外來的細(xì)胞結(jié)合性配體和外來的三聚體化基元的非天然多肽。Curiel等在WO 99/41359中，Wickham等在WO 98/54346中以及Spooner和Epenetos在US 5,885,808中，都公開了為了制備具有改變的向性的重組病毒而對(duì)腺病毒成分進(jìn)行的各種修飾。這些文獻(xiàn)無一提供了解決在宿主細(xì)胞的核和胞質(zhì)溶膠中表達(dá)功能性非天然病毒成分時(shí)遇到的問題的方法，或者根本沒有提到、甚至沒有認(rèn)識(shí)到這些問題，而本發(fā)明解決了這樣的問題。
因此，本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種包含非天然多肽的修飾的病毒，所述多肽包含一或多個(gè)框架半分子，每個(gè)框架半分子包含一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述多肽能在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中表達(dá)為缺乏所述結(jié)合半分子的配體時(shí)能維持的一種構(gòu)象，該構(gòu)象允許所述結(jié)合半分子隨后與所述配體結(jié)合，所述多肽能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這種修飾的病毒由所述結(jié)合半分子賦予它改變的向性。
本發(fā)明中“修飾的”病毒因此是指不同于天然(即野生型)病毒的病毒。通常，病毒經(jīng)過修飾后，該病毒的成分相對(duì)于天然或野生型(即未修飾的)成分發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化，或者使該病毒增加了在天然或野生型中未出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)成分或特性。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明，改變所述成分的特性或行為。換而言之，修飾的病毒與未修飾(天然/野生型)病毒相比，功能不同(例如，表現(xiàn)出已改變的向性)。如上所述(也如下所述)，優(yōu)選用遺傳工程技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行常規(guī)修飾。相應(yīng)地，本發(fā)明修飾的病毒優(yōu)選為重組病毒。
本發(fā)明修飾的病毒可以衍生自任何病毒，尤其是任何可作為基因治療之病毒載體的基礎(chǔ)來用的病毒。病毒的代表類型包括，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒和腺伴隨病毒，特別包括腺病毒科的成員，或者病毒結(jié)構(gòu)成分在宿主細(xì)胞的核或胞質(zhì)溶膠中合成和/或裝配的其它病毒科，如呼腸孤病毒科(Reoviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，乳多空病毒科(Papovaviridae)和杯狀病毒科(Caliciviridae)。在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明修飾的病毒是腺病毒的修飾形式，尤其是人類腺病毒，更尤其是人類腺病毒5型。
本文中“非天然多肽”是指具有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽序列，其完整序列并未發(fā)現(xiàn)于野生型病毒氨基酸序列中的功能等效位置，或更尤其未發(fā)現(xiàn)于將被改造的野生型病毒成分蛋白中的功能等效位置在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，“非天然多肽”還可以是指自然界未曾出現(xiàn)過，即為人工合成或人工構(gòu)建或制備的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，非天然多肽在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)以后的構(gòu)象，以及更重要的是，它在細(xì)胞外環(huán)境中的構(gòu)象，應(yīng)使它能結(jié)合所需配體，例如表達(dá)在所述修飾病毒所靶向細(xì)胞外表面上的受體或其它分子。
如上所述，優(yōu)選本發(fā)明的非天然多肽表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，具有在缺乏該多肽上結(jié)合半分子的配體時(shí)能維持的構(gòu)象。這種構(gòu)象因此是穩(wěn)定的構(gòu)象。換而言之，通過在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，所述多肽呈現(xiàn)一種在細(xì)胞質(zhì)中、以及當(dāng)該多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)并摻入或裝配至病毒顆粒中時(shí)能維持的構(gòu)象。而且，該構(gòu)象使得所述多肽的一或多個(gè)結(jié)合半分子在暴露于它們的配體時(shí)能與之結(jié)合。
因此，本發(fā)明非天然多肽的一個(gè)重要特征是，它能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或胞質(zhì)溶膠中正確折疊，即呈現(xiàn)一種能允許結(jié)合半分子維持功能(即，結(jié)合半分子維持它們與相應(yīng)配體結(jié)合的活性)的三維結(jié)構(gòu)。換而言之，結(jié)合半分子維持與其配體進(jìn)行功能性結(jié)合的能力。
一般認(rèn)為重組蛋白的可溶性是它們正確折疊的良好指示。因此本發(fā)明的非天然多肽不僅可以根據(jù)結(jié)合半分子的功能、構(gòu)象的穩(wěn)定性以及成為裝配病毒體的一部分的能力來進(jìn)行選擇，還可以根據(jù)表達(dá)非天然多肽、或含有非天然多肽之病毒成分蛋白的細(xì)胞內(nèi)部的可溶性來進(jìn)行選擇。例如，可以測(cè)定重組尾絲蛋白自真核細(xì)胞(如昆蟲細(xì)胞)中的總表達(dá)，以及它們回收在細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分中的比例。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，對(duì)以重組蛋白形式表達(dá)在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中的尾絲-配體融合構(gòu)建體進(jìn)行表型分析，其結(jié)果顯示它們的可溶性程度與有活力的重組腺病毒的回收相關(guān)。因此，優(yōu)選本發(fā)明的任何非天然多肽，或含有非天然多肽的病毒成分蛋白(例如尾絲-配體融合構(gòu)建體)，它們的特征在于可溶性以及作為重組蛋白與靶細(xì)胞的結(jié)合特性，而不是相應(yīng)基因向病毒(例如腺病毒)基因組中的再插入。
本發(fā)明因此提供了一種修飾的病毒，其中所述非天然多肽用該非天然多肽或含有該非天然多肽的病毒成分蛋白的可溶性試驗(yàn)來選擇。對(duì)非天然多肽的選擇應(yīng)使得，在表達(dá)非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白的細(xì)胞裂解后的可溶性級(jí)分中，有超過25％，優(yōu)選超過30％，更優(yōu)選超過50％或甚至70％的非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白。一個(gè)合適的試驗(yàn)在本文實(shí)施例中描述，其經(jīng)過必要的修改(mutatis mutandis)后可以應(yīng)用于其它細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。本文中，在細(xì)胞環(huán)境中可溶的非天然多肽或含有非天然多肽的病毒成分蛋白應(yīng)該解釋為當(dāng)細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分中有至少25-30％的所述多肽時(shí)，可以認(rèn)為該多肽是“可溶的”。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種確定用于制備病毒載體的非天然多肽(如重組病毒融合蛋白)的可溶性的方法，即測(cè)定該多肽在細(xì)胞系統(tǒng)中的可溶性。更具體地，本發(fā)明提供了一種分析本發(fā)明的非天然多肽或修飾的病毒蛋白成分的可溶性的方法，包括以下步驟i)在容許細(xì)胞中表達(dá)非天然多肽或含有該非天然多肽的病毒成分蛋白；ii)裂解這些細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；iii)分離細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分；iv)分析所述細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和v)比較所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中的相對(duì)含量，從而確定可溶性。
本發(fā)明結(jié)合半分子的配體可以是對(duì)應(yīng)于該結(jié)合半分子的配體，或者說，是設(shè)計(jì)或選擇的結(jié)合半分子能結(jié)合的配體。因此，所述配體能與所述結(jié)合半分子結(jié)合。因此配體與其結(jié)合半分子可以看作是親和結(jié)合對(duì)的成員，其中的配體是結(jié)合半分子的結(jié)合配對(duì)物。
因此，結(jié)合半分子具有針對(duì)目標(biāo)配體的結(jié)合特異性，或者能與目標(biāo)配體特異性結(jié)合?！敖Y(jié)合特異性”或“特異性結(jié)合”是指，結(jié)合半分子能與目標(biāo)配體(或“靶”)以一種不同于與非靶分子或配體結(jié)合的方式進(jìn)行結(jié)合。因此，結(jié)合半分子或者不與非靶分子結(jié)合，或者與非靶分子的結(jié)合很弱或大大減弱(與結(jié)合靶配體的能力相比)，例如，僅為本底水平。結(jié)合半分子因此能特異性識(shí)別靶配體。
結(jié)合半分子的這種結(jié)合特異性因此允許所述修飾病毒的選擇性靶向。換而言之，可以對(duì)結(jié)合半分子進(jìn)行設(shè)計(jì)或選擇，使修飾的病毒與所需細(xì)胞或“靶”細(xì)胞結(jié)合。可以對(duì)結(jié)合半分子進(jìn)行設(shè)計(jì)或選擇，使其與靶細(xì)胞表達(dá)、或者表達(dá)在靶細(xì)胞上(例如細(xì)胞表面)的配體結(jié)合。
配體因此可以是任何所需的配體，優(yōu)選表達(dá)在靶細(xì)胞表面的分子，所述靶細(xì)胞是希望所述修飾的病毒能在其中表達(dá)的細(xì)胞。配體因此可以是細(xì)胞表面受體，或細(xì)胞表面抗原。配體通常是蛋白或多肽分子，但也可以是任何類型的分子，例如脂質(zhì)或碳水化合物。
這樣一來，修飾的病毒經(jīng)過修飾后，可以結(jié)合所需的靶細(xì)胞，而相應(yīng)的天然(野生型)病毒不能與該細(xì)胞結(jié)合，或者修飾的病毒經(jīng)過修飾后，可以比野生型病毒具有更嚴(yán)格的結(jié)合特異性，換而言之，僅與野生型病毒所能結(jié)合的眾多類型的靶細(xì)胞群體中特定的或具體的亞組或亞型靶細(xì)胞結(jié)合。病毒的向性因此被改變。故，“改變的向性”是指修飾的病毒展現(xiàn)與其相應(yīng)野生型病毒相比已經(jīng)改變的，或不同的靶細(xì)胞結(jié)合特異性。
通常，本發(fā)明的非天然多肽包含至少一個(gè)框架半分子和一或多個(gè)結(jié)合半分子，并能與其它病毒成分相互作用而形成功能性、感染性病毒體。作為組成部分而組建功能性病毒體的能力，可以通過在病毒體裝配過程中，在該非天然多肽內(nèi)包含一或多個(gè)影響該多肽(或包含該多肽的病毒成分)與其它病毒成分相結(jié)合的序列而得到促進(jìn)。
本發(fā)明非天然多肽可以替代或摻入能與靶細(xì)胞相互作用的任何病毒成分蛋白。修飾的(例如重組的)病毒成分或者由于保留了該病毒成分本身的天然結(jié)構(gòu)特性而具有結(jié)合細(xì)胞的功能，或者由于摻入了非天然多肽以及任何其中所含的結(jié)構(gòu)而賦予它新的結(jié)構(gòu)，從而具有結(jié)合細(xì)胞的功能。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，將非天然多肽引入或摻入野生型病毒的病毒蛋白成分(例如，腺病毒尾絲蛋白)，或者與該成分形成融合蛋白，尤其優(yōu)選將非天然多肽摻入后，野生型尾絲頂球(或至少其細(xì)胞結(jié)合區(qū))被除去(即被替代)。
但是，在另一個(gè)實(shí)施方案中，保留了野生型尾絲頂球(或其細(xì)胞結(jié)合區(qū))，并借助所述非天然多肽的結(jié)合半分子而添加了另一個(gè)細(xì)胞結(jié)合區(qū)。細(xì)胞結(jié)合功能相對(duì)于將要改造的野生型病毒發(fā)生改變，使得改變的病毒向性出現(xiàn)在修飾的病毒中，這是本發(fā)明的特征。當(dāng)保留野生型尾絲頂球(或其細(xì)胞結(jié)合區(qū))時(shí)，這種改變的向性可以通過修飾野生型頂球/其細(xì)胞結(jié)合區(qū)，來滅活或封閉天然或野生型細(xì)胞結(jié)合功能而獲得(或促進(jìn))。
正如下文將述，有時(shí)可能希望構(gòu)建或改造一種修飾的病毒，使其中可以對(duì)改變的向性的表達(dá)進(jìn)行控制(例如，暫時(shí)控制)。因此，在這種修飾的病毒中，可以通過保留野生型尾絲頂球(或其細(xì)胞結(jié)合區(qū))而保留天然或野生型向性，另外還提供能賦予改變的向性的非天然多肽。例如，這可以用于在本領(lǐng)域已知的常規(guī)細(xì)胞系中繁殖修飾的病毒，方式是在修飾的病毒中另外包含野生型結(jié)合功能，例如，由誘導(dǎo)型控制元件(如啟動(dòng)子)控制野生型腺病毒尾絲基因的表達(dá)。
需要時(shí)，可通過控制(例如阻止)另外的野生型病毒成分基因的表達(dá)，或者在表達(dá)后，通過去除或滅活野生型頂球/區(qū)，使得由非天然多肽賦予的改變的向性表達(dá)，從而改變野生型向性。本發(fā)明中“改變的向性”因此包括“潛在的”改變的向性，即表達(dá)改變的向性的潛能。它還包括除了野生型向性以外的另外一種改變的向性。
如上所述，本發(fā)明修飾的病毒優(yōu)選用遺傳工程技術(shù)制備，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，非天然多肽以與病毒蛋白成分形成的融合蛋白的形式來提供，優(yōu)選與腺病毒尾絲蛋白形成的融合蛋白。這種融合蛋白，或者更一般地，這種修飾的病毒成分蛋白，代表了本發(fā)明的一個(gè)方面。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的病毒成分是含有上述非天然多肽的修飾的腺病毒尾絲蛋白。
用于制備這種非天然多肽并將它們引入病毒或病毒成分的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，有很多相關(guān)文獻(xiàn)。因此，例如，可采用分子生物學(xué)或遺傳工程技術(shù)來制備本發(fā)明的、能表達(dá)為修飾的病毒或病毒成分的基因序列構(gòu)建體。正如以下實(shí)施例將進(jìn)一步描述的，可以對(duì)編碼病毒成分蛋白(如腺病毒尾絲蛋白)的核酸分子或核苷酸序列進(jìn)行修飾，以便引入編碼非天然多肽的核苷酸序列，從而，例如編碼一種融合蛋白，它包含部分或完整的腺病毒尾絲蛋白以及所述非天然多肽。
根據(jù)插入了本發(fā)明非天然多肽的病毒成分蛋白，或者該多肽所替代的成分，本發(fā)明的非天然多肽可以選擇包含另一種元件，該元件模擬該病毒成分的天然結(jié)構(gòu)或功能(即，是該病毒成分的功能性等效物)，從而促進(jìn)功能性病毒粒子的裝配。在本發(fā)明修飾的腺病毒尾絲的例子中，腺病毒尾絲在病毒體裝配、尤其衣殼裝配方面的功能完整性，通過外部氨基酸三聚體化基元(如來自人肺表面活性物質(zhì)蛋白D的頸區(qū)的螺旋狀氨基酸基元(Hoppe等，F(xiàn)EBS Letters，344191-195(1994))能維持?？梢詫⑦@種以及本領(lǐng)域已知的其它三聚體化基元功能性改造至尾絲莖部，作為尾絲三聚體化信號(hào)，產(chǎn)生無頂球的尾絲。例如，適于包含在修飾的病毒中的三聚體化基元參見WO98/54346和WO 99/41359。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，出現(xiàn)在非天然多肽中的非天然三聚體化基元是來自人肺表面活性物質(zhì)D的頸區(qū)肽。
如下文實(shí)施例將述，將任何這樣的額外或外部基元或特征借助“接頭”序列引入病毒可能是便利的或必需的。這種通過連接至接頭序列而引入DNA或氨基酸序列的構(gòu)建技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，也是蛋白質(zhì)/遺傳工程的常規(guī)技術(shù)。
本文中“框架半分子”是在細(xì)胞核以及胞質(zhì)溶膠環(huán)境中保留了功能性(如折疊的)結(jié)構(gòu)(或構(gòu)象)的多肽(如蛋白)結(jié)構(gòu)。這種功能性結(jié)構(gòu)是能允許結(jié)合半分子連接或插入該框架半分子、以便在缺乏配體時(shí)保留配體結(jié)合構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。這促進(jìn)了隨后與該配體的結(jié)合，例如，重新裝配的病毒體離開細(xì)胞環(huán)境之時(shí)。
因此可將框架半分子看成一種“分子支架”結(jié)構(gòu)，它提供框架以便支持或“支撐”結(jié)合半分子，使之處于合適的狀態(tài)或構(gòu)象，從而允許與其配體結(jié)合?？蚣馨敕肿舆€提供了分子內(nèi)相互作用，使得有可能在胞質(zhì)溶膠中形成穩(wěn)定的構(gòu)象。框架半分子因此可以是蛋白或多肽分子，它呈現(xiàn)一種特定的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)，并能耐受一或多個(gè)特定區(qū)域中的修飾，例如通過添加、插入、缺失或取代氨基酸序列進(jìn)行的修飾，或事實(shí)上插入多肽序列。
因此，本文中“結(jié)合半分子”是附著于或包含本發(fā)明所述框架半分子的一部分的多肽結(jié)構(gòu)，當(dāng)宿主細(xì)胞的核和胞質(zhì)溶膠中表達(dá)了所述非天然多肽后，作為其中一個(gè)部分的上述多肽結(jié)構(gòu)仍保留與所需(靶)配體結(jié)合的功能。
結(jié)合半分子可以是鄰接的或非鄰接的氨基酸序列，而且可以看成它提供了結(jié)合靶配體的位點(diǎn)。因此，結(jié)合半分子應(yīng)該是蛋白或多肽分子的區(qū)域，例如，表面區(qū)域，如一組“表面”氨基酸殘基。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，框架半分子和結(jié)合半分子可以有不同的來源(例如來自不同蛋白)，它們可通過將所需半分子“移植”或連接至所需框架而獲得，或衍生。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合半分子可以在蛋白的“框架”結(jié)構(gòu)內(nèi)部，通過修飾框架蛋白的特定區(qū)域或殘基而產(chǎn)生，見下文詳述。在這種實(shí)施方案中，框架半分子可以是“恒定的”或未經(jīng)修飾的殘基，而結(jié)合半分子可以是“可變的”或修飾的殘基。
因此，本發(fā)明的非天然多肽可以是一種組合蛋白，它通過使具體的蛋白結(jié)構(gòu)隨機(jī)化(隨機(jī)誘變)，產(chǎn)生具有修飾的或增強(qiáng)的新結(jié)合特性的結(jié)合蛋白。這種合成的、“人工”的(即非天然)、蛋白性質(zhì)的親和結(jié)合分子(即，通過改造而具有特定的或新的結(jié)合功能的蛋白)是本領(lǐng)域公知的。
這種組合蛋白可以使用各種肽和蛋白作為起始結(jié)構(gòu)來制備(Nygren和Uhlen，Current Opinion in Structural Biology，7463-469，1997)。這種蛋白是本領(lǐng)域已知的，一般如下制備對(duì)靶蛋白進(jìn)行隨機(jī)誘變，在諸如絲狀噬菌體表面表達(dá)這些變體的整個(gè)文庫，然后選出展示所需結(jié)合特性的蛋白。這種選擇通常涉及，變體蛋白與一般情況下被固定的靶配體(結(jié)合配對(duì)物)之間的結(jié)合反應(yīng)，且這種選擇可在體內(nèi)或體外進(jìn)行。誘變是隨機(jī)的，最終所得由任何特定密碼子編碼的氨基酸通常不是預(yù)先確定的，但引入突變的位置通常是事先定好的。誘變可能涉及氨基酸的取代、缺失、或添加(例如，插入)。
優(yōu)選作為本發(fā)明非天然多肽使用的組合蛋白是本領(lǐng)域通常稱為親和體(affibody)的蛋白。術(shù)語“親和體”在本文中是指衍生自細(xì)菌受體蛋白，或其結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一種親和結(jié)合分子，其中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被修飾(例如，經(jīng)蛋白/基因工程改造)，因此修飾(例如，改變或增強(qiáng))了它的結(jié)合特性。優(yōu)選地，所述親和體是非天然蛋白(指并非天然存在的)，還優(yōu)選具有新的結(jié)合位點(diǎn)。這種蛋白分子的實(shí)例和進(jìn)一步詳述見WO 95/19374。
噬菌體表面展示等表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用在基因型和表型之間提供了一種重要聯(lián)系；有一種自身包含的單元，它可根據(jù)其特異性結(jié)合來選擇并且還帶有編碼負(fù)責(zé)所述結(jié)合特性的蛋白的核酸。這使得能表達(dá)有效量的根據(jù)其結(jié)合特性而被選出的蛋白，這種表達(dá)通常發(fā)生在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主中。
根據(jù)其結(jié)合靶配體(例如所需細(xì)胞表面分子)的能力而選出的蛋白，隨后可用于制備本發(fā)明的修飾的病毒或病毒成分，或更具體地，可以如此使用編碼所需組合蛋白的核苷酸序列。
構(gòu)建蛋白分子的組合文庫并隨后進(jìn)行篩選，以便獲得具有所需結(jié)合特性的蛋白性質(zhì)的結(jié)合分子，該過程所用的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(Nygren，P.和Uhlen，M.Current Opinion in Structural Biology(1997)7463-469)。通常，使用可能具有內(nèi)在有利特性，如溫度或pH不敏感性(insensitivity)、或組合穩(wěn)定性的蛋白分子作為“支架”或“框架”，然后通過對(duì)蛋白進(jìn)行隨機(jī)但靶向的氨基酸取代(或其它突變)來構(gòu)建組合文庫，以便產(chǎn)生具有不同結(jié)合特性的分子文庫。表面殘基通常是隨機(jī)誘變的目標(biāo)。
除了噬菌體展示技術(shù)(Smith等，Meth.Enzym.217，228-57，(1993))，其它用于文庫構(gòu)建和篩選的方法包括，例如，核糖體展示(Hanes等，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA 944937-4942(1997))、質(zhì)粒上的肽(Schatz等，MethodsEnzymol.，(1996)26783-109)、RNA蛋白融合體(Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9412297-12302(1997))和DNA-蛋白連接(STABLE)(Doi等，F(xiàn)EBSLett，457(2)227-30，(1999))。
適當(dāng)?shù)牡鞍卓蚣芸梢詢H僅是線性肽，但優(yōu)選所述框架具有折疊的三維結(jié)構(gòu)，它具有潛在的較高親和力并且不易被蛋白裂解性降解。可以重新(denovo)設(shè)計(jì)框架，但通常選用天然存在的蛋白或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)一步的改造。為避免疑問，應(yīng)注意本說明書全文中，“蛋白”用于指完整蛋白分子及其結(jié)構(gòu)域或片段，多肽或肽。
對(duì)蛋白框架的選擇取決于數(shù)種參數(shù)，包括在所需宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中有效表達(dá)的能力。所述蛋白還應(yīng)該在其表面包含足夠大的區(qū)域，這樣的區(qū)域應(yīng)該是對(duì)取代(或插入或缺失等)耐受，而且不破壞總體的三維結(jié)構(gòu)。如果文庫要通過合成來產(chǎn)生，必需先有一個(gè)較小的總量。當(dāng)所選框架蛋白具有結(jié)合功能時(shí)，參與該相互作用的氨基酸殘基可以作為隨機(jī)化的標(biāo)靶。隨機(jī)化可以用于增強(qiáng)已知的結(jié)合特性或使結(jié)合分子具有新的特異性。
適當(dāng)?shù)目蚣芊肿尤鏝ygren等(同上)所述，包括一段有限序列中的環(huán)形肽(這種有限序列中的氨基酸殘基的數(shù)量并非關(guān)鍵，可以是5或更多，例如，5-10或更多，例如40或更多)、含有Fv或單鏈(scFv)結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白-樣支架、細(xì)菌受體如58-殘基的單一結(jié)構(gòu)域葡萄球菌蛋白A(SPA)類似物Z(“Z結(jié)構(gòu)域”是SPA的B結(jié)構(gòu)域的衍生物)、或SPA的其它結(jié)構(gòu)域或類似物、DNA-結(jié)合蛋白尤其鋅指結(jié)構(gòu)以及蛋白酶抑制劑。
特別有興趣的是細(xì)菌受體結(jié)構(gòu)域Z。Nord等在Protein Engineering 8(6)601-608(1995)中描述了一種構(gòu)建基于Z結(jié)構(gòu)域的蛋白分子的組合文庫的方法，其適用于很多框架分子。所述方法有固相的輔助，并且基于隨機(jī)化單鏈寡核苷酸的逐步裝配。
在分子中修飾氨基酸序列或殘基，從而產(chǎn)生結(jié)合半分子，的另一種方法是，將結(jié)合半分子引入框架半分子，例如插入或添加由結(jié)合半分子組成或包含結(jié)合半分子的多肽，結(jié)合半分子因此可以與框架半分子結(jié)合。在這種情況下，結(jié)合半分子可以由所需靶配體的親和結(jié)合配對(duì)物來提供。
本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合半分子可以衍生自，但不限于，細(xì)胞表面受體的配體(即結(jié)合配對(duì)物)、抗受體的抗體(或抗體片段或衍生物)、細(xì)胞特異性肽、單鏈抗體(ScFv)、單一結(jié)構(gòu)域抗體、抗體的最小識(shí)別單位如Fv片段的互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)。結(jié)合半分子因此可以從抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或者抗原結(jié)合或識(shí)別/區(qū)獲得或者衍生出，而這種抗體可以是天然的或合成的。
本發(fā)明還涉及從任何形式的肽或多肽衍生的結(jié)合半分子，所述肽或多肽包括從各種蛋白文庫鑒定的激素、抗體、T細(xì)胞受體、親和體及配體。
如上所述，非天然多肽的一個(gè)重要特征是在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)和核中維持構(gòu)象，從而保留該結(jié)合半分子的結(jié)合功能。如下將述，這可以通過提供能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)和核中維持正確折疊的非天然多肽而獲得。業(yè)已發(fā)現(xiàn)這種正確折疊可以用不依賴二硫鍵維持構(gòu)象(即不含有二硫鍵)的非天然多肽而獲得。如下文將詳述，本發(fā)明非天然多肽的另一優(yōu)選特征是存在α-螺旋結(jié)構(gòu)。
WO 95/19374描述了數(shù)種框架蛋白，它們具有共同的不依賴S-S鍵維持構(gòu)象的有利特征。這種框架蛋白可作為本發(fā)明的框架半分子來使用。這些包括細(xì)菌受體的結(jié)構(gòu)域，如葡萄球菌蛋白A(ααα型)、蛋白G(IgG結(jié)合部分，ββαββ型)、蛋白L(ββαββ型)、以及蛋白G(HSA結(jié)合部分，ααα型)。本發(fā)明的框架半分子也可以衍生自各種細(xì)菌受體，例如，但不限于表1所列的那些
表1G+細(xì)菌受體的實(shí)例受體[配體]a來源Fc[IgG]受體I型金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)II型化膿性葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes)[A族]III型 鏈球菌(Streptococcus)C族、G族、L族IV型牛的G族鏈球菌V型 獸瘟鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)[C族]VI型獸瘟鏈球菌S212纖連蛋白受體+ 金黃色葡萄球菌，鏈球菌M蛋白 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)[A族]纖溶酶受體A族鏈球菌膠原受體 金黃色葡萄球菌，鏈球菌纖維蛋白原受體鏈球菌A族、C族、G族蛋白L[6輕鏈] 大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白H[人IgG] 化膿性鏈球菌[A族]蛋白B[人IgA，A1] 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactie)[B族]蛋白Arp[人IgA]A族鏈球菌血清白蛋白受體鏈球菌A族、C族、G族a當(dāng)不能用受體的名稱清楚表示時(shí)用配體表示本發(fā)明的框架半分子并不限于來自細(xì)菌受體的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中還可以使用其它含有α螺旋結(jié)構(gòu)的多肽，所述α螺旋結(jié)構(gòu)通常稱為α-螺旋型卷曲螺旋，已知它們有多種來源(Cohen等，Science 263488-489，(1994)；Harbury等，Science 2621401-1407，(1993))。構(gòu)成這些肽中的框架的螺旋由重復(fù)的氨基酸序列組成，這些序列含有特征性分布的疏水殘基。α-螺旋型卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)不依賴于分子內(nèi)部或分子間的二硫橋來維持穩(wěn)定。α-螺旋型卷曲螺旋的實(shí)例有人肺部表面活性物質(zhì)蛋白D的頸部區(qū)肽，血影蛋白超家族，亮氨酸拉鏈，以及流感病毒血凝素的多個(gè)部分。
特別優(yōu)選將三-螺旋束家族的成員作為本發(fā)明非天然多肽的來源(例如，葡萄球菌蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然多肽包含基于細(xì)菌受體衍生的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的框架半分子。優(yōu)選本發(fā)明框架半分子的結(jié)構(gòu)衍生自或基于α-α-α-(ααα)-三-螺旋束或者β-β-α-β-β結(jié)構(gòu)類型。還優(yōu)選所述結(jié)構(gòu)基于或衍生自α-螺旋型卷曲螺旋家族，尤其2-，3-或4-螺旋型卷曲螺旋家族任一個(gè)中的成員。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合半分子出現(xiàn)在一或多個(gè)螺旋束和/或一或多個(gè)與這些束相連的環(huán)的內(nèi)部。
本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，框架半分子基于源自葡萄球菌蛋白A，鏈球菌蛋白G或大消化鏈球菌蛋白L的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明更尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，框架半分子是葡萄球菌蛋白A中結(jié)合免疫球蛋白的Z結(jié)構(gòu)域的衍生物(Nord等，同上)。
在這樣的實(shí)施方案中，結(jié)合半分子可以通過上述組合蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生。在其它實(shí)施方案中，所選的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)(例如，Z結(jié)構(gòu)域)可以以野生型形式作為本發(fā)明的非天然多肽來使用。
如上所述，通過對(duì)，例如，位于Z結(jié)構(gòu)域表面的殘基進(jìn)行組合蛋白質(zhì)工程改造，可以構(gòu)建文庫，利用與所需靶配體的結(jié)合從這樣的文庫中選出新的變體(即新的結(jié)合分子)作為Z結(jié)構(gòu)域的親和體(Hansson等，Immunotechnology 4237-52(1999))。
優(yōu)選的基于Z結(jié)構(gòu)域的非天然多肽可能包含以下氨基酸序列VDNKFNKEXXXAXXEIXXLPNLNXXQXXAFIXSLXDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[SEQ ID NO45]；和VDNKFNKEXXXAXXEIXXXXXXXXXQXXAFIXSLXDXXXXSANLLAEAKKLNDAQAPK[SEQ ID NO46]，其中X是任何氨基酸。
在上述多肽中，可以認(rèn)為保守的(即，具體指明的)氨基酸殘基構(gòu)成了框架半分子，它與可變殘基X一起組成結(jié)合半分子。
此外，本發(fā)明的框架半分子無需依賴α-螺旋來維持它們的穩(wěn)定，只要在所述非天然多肽于宿主細(xì)胞的核以及胞質(zhì)溶膠中表達(dá)后，所述結(jié)合半分子與配體結(jié)合所需的構(gòu)象仍能維持既可。這種框架可以包括本領(lǐng)域已知的、衍生自特定抗體和它們的衍生物的框架，它們無需二硫橋的存在來維持結(jié)構(gòu)，因此可以作為重組病毒成分的一個(gè)部分表達(dá)在宿主細(xì)胞的核或胞質(zhì)溶膠中，并仍然維持功能性構(gòu)象以及行使所需配體的結(jié)合半分子的功能。本發(fā)明的其它抗體結(jié)構(gòu)包括下述抗體結(jié)構(gòu)，其中與結(jié)構(gòu)相關(guān)的半胱氨酸殘基已經(jīng)被丙氨酸殘基取代，但仍保留了該抗體的結(jié)合特異性。
本發(fā)明還涉及另外的框架半分子，如衍生自下述抗體的序列，所述抗體例如是單克隆抗體，以及轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溞问綇亩靡耘c病毒成分構(gòu)建遺傳融合體或?qū)Σ《境煞诌M(jìn)行修飾的抗體。當(dāng)使用衍生自抗體的框架半分子時(shí)，類似于上文所述，可以通過蛋白質(zhì)/遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合半分子(例如通過修飾特定的氨基酸殘基)或者可以將結(jié)合半分子引入(例如，連接至或移植至)所述抗體框架。
賦予所需結(jié)合活性的抗體片段可以通過如下處理而作為結(jié)合半分子使用將具有所需向性的抗體的互補(bǔ)決定環(huán)或區(qū)(CDR)移植至，能在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生有效(productive)折疊(即能保留所結(jié)合或插入的結(jié)合半分子的結(jié)合特異性)、隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至發(fā)生病毒裝配的細(xì)胞核中的框架半分子。換而言之，結(jié)合半分子可以是抗體的CDR。
此外，根據(jù)本發(fā)明，特定抗體的結(jié)構(gòu)框架可以用作框架半分子，例如與基于抗體或衍生于抗體的結(jié)合半分子(如特異性決定環(huán)(CDR))聯(lián)合，直接構(gòu)建出適于構(gòu)建再靶向的病毒成分的抗體。
抗體框架可用作本發(fā)明的框架半分子(例如接受CDR環(huán)作為結(jié)合半分子)，只要它能在細(xì)胞質(zhì)中有效折疊并隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中?？梢灾苽鋪碜詥慰寺】贵w的不含二硫鍵的單鏈Fv片段(Proba等，J.Mol.Biol.，275245-53，(1998))。這種ScFv抗體只要符合上述功能標(biāo)準(zhǔn)，就可用在本發(fā)明的框架半分子上。結(jié)合半分子可以是ScFv抗體本身的結(jié)合部位，或可以如上所述進(jìn)一步改造。
來自多克隆群體的功能性抗體的細(xì)胞內(nèi)選擇也可以實(shí)現(xiàn)(Gargano等，F(xiàn)EBS Letters 414537-40，(1997))。這種選擇技術(shù)可用于鑒定適于腺病毒遺傳再靶向的抗體片段，即適于用作本發(fā)明的框架，和/或結(jié)合半分子。
其它可用的抗體框架包括基于camel抗體的那些(它們天然缺乏輕鏈)，或衍生自常規(guī)抗體的特定VH區(qū)。
本發(fā)明能在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生有意義的折疊的抗體框架的一個(gè)實(shí)例是，一種具體的抗β-半乳糖苷酶單鏈Fv片段。該單鏈可變區(qū)(VK，接頭，VH)與β-半乳糖苷酶反應(yīng)，并能在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，見前述(Martineau P和Betton J-MJ.Mol.Biol.292，921-929(1999)。因此，本發(fā)明還提供了一種修飾的病毒，它含有框架半分子，該半分子包含編碼該抗β-半乳糖苷酶單鏈Fv片段[SEQID.47.]及其功能等效變體的序列。
本發(fā)明不限于基于抗體和親和體(如受體)結(jié)構(gòu)的框架半分子，還包括其它結(jié)構(gòu)，只要它們?cè)诟腥炯?xì)胞的胞質(zhì)溶膠/核中表達(dá)時(shí)能保留所附著或摻入的結(jié)合半分子的結(jié)合特異性。
本發(fā)明的修飾的病毒中可以有兩種或多種非天然多肽，例如具有不同結(jié)合特異性的多肽，或者可以將非天然多肽摻入兩種或多種不同的結(jié)合半分子中，或摻入事實(shí)上兩種或多種不同的框架/結(jié)合半分子構(gòu)建體中。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種修飾的病毒，它們包含結(jié)合靶細(xì)胞的第一非天然多肽以及結(jié)合生產(chǎn)細(xì)胞或容許細(xì)胞的第二非天然多肽。
本發(fā)明的非天然多肽因此可以以含有雙-或多重功能性框架半分子(或框架/結(jié)合半分子構(gòu)建體)的形式出現(xiàn)在重組病毒成分中，所述半分子通過使兩或多種不同框架半分子(框架/結(jié)合半分子構(gòu)建體)發(fā)生遺傳融合而構(gòu)建。使用這種框架半分子(或框架/結(jié)合半分子構(gòu)建體)可以，例如，賦予重組病毒對(duì)多重細(xì)胞標(biāo)靶的感染性。
本發(fā)明還提供了一種修飾的病毒，該病毒中的本發(fā)明非天然多肽含有切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)的位置使非天然多肽的結(jié)合半分子能從該修飾的病毒上切割下來，例如，所述位置是該結(jié)合半分子位于尾絲上相對(duì)于裝配成的病毒體而言的遠(yuǎn)端。合適的切割位點(diǎn)的實(shí)例是易于被因子Xa酶或蛋白酶如人類鼻病毒3C蛋白酶切割的位點(diǎn)。如果是在基因水平上進(jìn)行切割，例如，在含有部分或全部重組腺病毒基因組的核酸分子內(nèi)發(fā)生切割，可以在，例如能產(chǎn)生所述病毒或作為所述病毒標(biāo)靶的特定細(xì)胞群體中，使用易于被合適的限制酶或核酶切割的位點(diǎn)。
本發(fā)明的非天然多肽能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)。正如本領(lǐng)域已知，這是病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制期間病毒成分所必備的特征，在所述宿主細(xì)胞中這些病毒成分在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)，而這些成分的裝配發(fā)生在該宿主細(xì)胞的核中，例如腺病毒的復(fù)制。
可以認(rèn)為本發(fā)明的非天然多肽行使雙重功能，第一是提供新的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即賦予改變的向性)，第二是發(fā)揮病毒成分的功能，即作為病毒成分(病毒蛋白，例如病毒衣殼蛋白)的功能性部分。非天然多肽因此可以作為病毒蛋白的一部分而發(fā)揮功能。換而言之，非天然多肽在構(gòu)建或裝配病毒粒子時(shí)，扮演結(jié)構(gòu)角色或有功能。
含有本發(fā)明的修飾的病毒，或者被該病毒感染的細(xì)胞，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述細(xì)胞可以是任何來源，只要該細(xì)胞類型能攜帶或繁殖所述病毒。但一般情況下，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞可以被膜成分(例如膜蛋白)轉(zhuǎn)染，所述膜成分允許該修飾的病毒感染該細(xì)胞，并因此允許在特定細(xì)胞系中繁殖具有非天然向性的病毒，例如，在所述細(xì)胞系中，本領(lǐng)域已知的常規(guī)細(xì)胞系中的繁殖由于病毒向性的改變而被阻止。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明非天然多肽、或修飾的病毒成分蛋白、或修飾的病毒的核酸分子。含有所述核酸分子，或編碼所述非天然多肽、或修飾的病毒成分蛋白、或修飾的病毒的核苷酸序列的載體，無論是用于繁殖所述修飾的病毒或者是進(jìn)一步對(duì)修飾的病毒進(jìn)行改造，都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還有一方面提供了一種在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生本發(fā)明修飾的病毒的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟對(duì)病毒進(jìn)行遺傳修飾，以便產(chǎn)生修飾的(例如，重組的)含有非天然多肽的病毒，其中所述多肽含有一或多個(gè)框架半分子，每個(gè)框架半分子含有一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述多肽能在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中表達(dá)，并在缺乏所述結(jié)合半分子的配體的情況下，在那里呈現(xiàn)和維持一種構(gòu)象，該構(gòu)象使得所述結(jié)合半分子隨后與所述配體結(jié)合，所述多肽還能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其中所述重組病毒具有由所述結(jié)合半分子賦予的改變的向性；用所述病毒感染容許細(xì)胞；培養(yǎng)所述細(xì)胞，以便產(chǎn)生病毒(例如，以足夠高的滴度)，收獲，并可選擇純化所產(chǎn)生的修飾性病毒。
可以使Ad載體相對(duì)于容許細(xì)胞具有或不具有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力。在腫瘤治療中，具有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力的Ad有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，即它可以在腫瘤中復(fù)制并擴(kuò)散(Miller等，Gene Therapy，3557-559)。理論上，這可以使選定的效應(yīng)物機(jī)制相比于用不具有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力的載體所得到的增強(qiáng)。而且，感染性病毒可以通過在感染細(xì)胞中發(fā)揮致細(xì)胞病變效應(yīng)以及激發(fā)一種可能損害感染細(xì)胞的抗病毒免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗-腫瘤效應(yīng)。
在基因治療中，希望存在一種手段(means)可以控制具有競(jìng)爭(zhēng)力的修飾性病毒的復(fù)制。
其它控制修飾性腺病毒復(fù)制的手段也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的修飾病毒可包含編碼病毒復(fù)制所必需的病毒蛋白的基因，所述蛋白受控于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或遺傳元件。例如，可以將腺病毒前-終止蛋白(pTP)置于四環(huán)素應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄激活因子(trTA)的調(diào)控之下，使得pTP僅在有強(qiáng)力霉素時(shí)表達(dá)?；蛘?，本發(fā)明的修飾病毒可以包含對(duì)基因組的修飾，導(dǎo)致該病毒僅在DNA合成-凋亡調(diào)節(jié)途徑有缺陷的細(xì)胞中復(fù)制。
通常，這可以在本發(fā)明的修飾性病毒中實(shí)現(xiàn)，方法是，在結(jié)合半分子上游、或者在能使結(jié)合半分子從所述修飾病毒上切割下來的任何這類位置，例如，在尾絲莖和結(jié)合半分子之間，引入另一切割位點(diǎn)。
因此，本發(fā)明另一方面還提供了一種調(diào)節(jié)修飾性病毒的復(fù)制的方法，包括以下步驟構(gòu)建一種修飾性病毒，使切割位點(diǎn)(例如易于被酶裂解或化學(xué)裂解的位點(diǎn))位于細(xì)胞感染所必需的結(jié)合半分子與含有該結(jié)合半分子的重組病毒成分的剩余部分之間，使所述重組病毒與能將所述結(jié)合半分子從所述病毒成分上切割下來的切割試劑或切割手段(例如，酶，化學(xué)物質(zhì)，或者在光敏性切割位點(diǎn)的情況下，光照)接觸，從而阻止重組病毒進(jìn)行進(jìn)一步的感染周期。
如果上述方法中的切割手段是酶解，則所述切割酶可以編碼在重組病毒的基因組中，并且可以是誘導(dǎo)型的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，切割位點(diǎn)由因子Xa酶來切割。本發(fā)明還包括使用其它本領(lǐng)域已知的蛋白酶，例如，人類鼻病毒3C蛋白酶，它可以作為GST融合蛋白的形式來提供(Walker等，Bio/Technology 12601(1994))。該蛋白酶在4℃具有活性，能識(shí)別并切割序列LEVLFQ//GP。
利用與本領(lǐng)域已知的噬菌體展示技術(shù)類似的方式，從文庫中篩選在核和胞質(zhì)溶膠中正確折疊的肽以及所需的結(jié)合功能后，可以從文庫中選出本發(fā)明的非天然多肽。這種文庫可以由與本發(fā)明野生型或修飾(如重組)的病毒成分(如腺病毒尾絲蛋白)融合的候選肽組成。尾絲融合體文庫可以表達(dá)在腺病毒粒子上，并用于通過觀察那些促進(jìn)復(fù)制的候選融合體來選出正確的胞質(zhì)溶膠和核構(gòu)象。
本發(fā)明修飾的病毒也可以用出現(xiàn)在或編碼在基因組中的野生型病毒成分以及修飾的病毒成分來構(gòu)建，必要時(shí)，還可使每種成分基因受控于不同的遺傳控制元件，例如，啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明修飾的病毒可以包含修飾的病毒成分(即經(jīng)過修飾而包含非天然多肽)和等效的或相應(yīng)的未經(jīng)修飾的病毒成分，例如，野生型尾絲，和修飾的尾絲。
例如，重組腺病毒可以用野生型尾絲和修飾的或重組的尾絲(即含有或插入了非天然多肽的修飾的尾絲)來構(gòu)建，例如，所述修飾的尾絲衍生自“尾絲-候選結(jié)合肽”融合體文庫，該文庫在E1缺失型腺病毒中于不同啟動(dòng)子控制下表達(dá)。例如，本發(fā)明人顯示，可以將受控于CMV啟動(dòng)子的重組腺病毒尾絲基因克隆至穿梭載體pAdTrack的多克隆位點(diǎn)，用Ad載體pAdEasy通過同源重組產(chǎn)生既能表達(dá)WT尾絲又能表達(dá)重組尾絲的病毒(He T-C，Zhou S，DaCosta LT，Yu J，Kinzler KW和Vogelstein BA simplified system forgenerating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci，USA，952509-2514，1998)。
還可以在腺病毒載體基因組中包含受控于一或多個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的一或多種尾絲基因(例如野生型基因和修飾的基因)，從而允許每種基因分別開啟或關(guān)閉。例如，在所需的Ad構(gòu)建體中，可以將野生型尾絲基因克隆成不在它通常的位置，也不受主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的控制，而受激素誘導(dǎo)型MMTV啟動(dòng)子的控制，從而可以被地塞米松(dexamethasone)誘導(dǎo)。該啟動(dòng)子允許野生型尾絲在繁殖該載體的細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，將修飾的尾絲克隆至相同的Ad載體基因組中，例如，位于能在所需細(xì)胞系中開啟的TRE(四環(huán)素應(yīng)答元件)序列元件的下游。在表達(dá)tTA蛋白(與TRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活因子)的細(xì)胞中，TRE可以在缺乏Tc(四環(huán)素)或Dox(強(qiáng)力霉素(doxacyclin))的情況下被激活?；蛘卟⑶腋鼉?yōu)選，Ad載體構(gòu)建體可以在表達(dá)反式tTA(rtTA)的細(xì)胞中繁殖，在這些細(xì)胞中，TRE，以及對(duì)修飾的尾絲的表達(dá)，在有Tc(或Dox)的情況下被激活。
所述文庫中重組尾絲蛋白的野生型尾絲頂球可以被外源三聚體化基元和肽文庫的一或多個(gè)成員(或其它非天然多肽)替代。一旦在能繁殖病毒的細(xì)胞培養(yǎng)中，重組腺病毒通過表達(dá)野生型尾絲而得以繁殖，就可以以類似于噬菌體展示的方式篩選具有所需結(jié)合活性的重組尾絲蛋白。
相應(yīng)地，具有改變的向性的修飾病毒需要能被其感染并因此允許其繁殖的細(xì)胞。故本發(fā)明還提供了本發(fā)明病毒的容許細(xì)胞，它能通過培養(yǎng)而繁殖所述病毒。不具有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力的病毒(通常在其基因組中包含缺失，因而失去競(jìng)爭(zhēng)力)需要特殊的生產(chǎn)型細(xì)胞或繁殖型細(xì)胞，它們能提供該病毒所缺失或丟失的遺傳信息以便復(fù)制。這種細(xì)胞或細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的。具有改變的向性的修飾病毒可能不能感染這類細(xì)胞，正如本領(lǐng)域已知的那樣。相應(yīng)地，本發(fā)明包括對(duì)這類繁殖型細(xì)胞進(jìn)行修飾，以使其包括所述修飾病毒的結(jié)合半分子的結(jié)合配對(duì)物(配體)(例如，使所述細(xì)胞在它們的表面表達(dá)這類配體)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，優(yōu)選體外或回體(ex-vivo)的真核細(xì)胞，它含有本發(fā)明的修飾的病毒或病毒成分。
本發(fā)明還涉及，通過在包含野生型結(jié)合半分子(即，頂球)的病毒成分中安置新的向性-改變結(jié)合半分子，并在這些半分子之間安排一個(gè)切割位點(diǎn)(如因子Xa或人類鼻病毒3C蛋白酶的切割位點(diǎn))，使具有改變的向性的修飾性病毒與野生型病毒在相同細(xì)胞中繁殖。經(jīng)由野生型結(jié)合半分子的作用而在常規(guī)細(xì)胞中繁殖后，所述病毒成分被裂解，從而除去野生型結(jié)合半分子(例如，野生型頂球)，暴露出新的結(jié)合半分子，并賦予新的向性。本發(fā)明還涉及，所暴露的結(jié)合半分子可以特異于一種配體，該配體自身具有結(jié)合細(xì)胞的能力。例如，所述結(jié)合分子可以特異于抗體的Fc區(qū)，從而允許使用對(duì)所需細(xì)胞類型具有細(xì)胞特異性的抗體。通過切割去除野生型結(jié)合半分子并使病毒暴露于細(xì)胞特異性抗體，就能使所述抗體吸附至所述病毒，并因此將所述病毒靶向所述抗體特異性針對(duì)的細(xì)胞。
本發(fā)明的非天然多肽優(yōu)選賦予重組病毒以相對(duì)于引入該非天然多肽的病毒的向性而言改變了的向性。這種改變的向性使本發(fā)明的重組病毒可以用于治療人類或動(dòng)物受試者的疾病，無論是對(duì)需要治療的受試者進(jìn)行體內(nèi)治療，或者是對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞回體治療。
本發(fā)明修飾的病毒的向性經(jīng)過改變后，該病毒可以通過一或多個(gè)結(jié)合半分子靶向特定的細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了一種修飾的病毒，其中一種非天然多肽含有能結(jié)合細(xì)胞特異性配體的結(jié)合半分子，所述配體可以是前列腺特異性膜抗原，EGF受體，Her-2/Neu，VEGF受體，CD22，gp120，MHC/肽復(fù)合體或表達(dá)在或出現(xiàn)在增生細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞表面的膜結(jié)構(gòu)或表面分子。
有多種方式可以將本發(fā)明展示改變的向性的修飾性病毒應(yīng)用在基因治療中。在腫瘤疾病的情況中，有以下選擇I.使用載體將轉(zhuǎn)基因引入腫瘤，所述轉(zhuǎn)基因如-反義癌基因-自殺基因
-免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)或腫瘤抗原的基因-抗-造血因子的基因適于包含在本發(fā)明的修飾性病毒中的轉(zhuǎn)基因?qū)嵗蟹戳x癌基因，自殺基因，免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的基因，腫瘤抗原的基因，抗-造血因子的基因，細(xì)胞因子基因，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制物的基因，致膜融合的糖蛋白的基因，細(xì)胞毒基因，編碼將前體藥物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)的酶的基因，胞嘧啶脫氨酶的基因，尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的病毒含有編碼胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因，它們可以是各自單獨(dú)的基因，或者，更優(yōu)選是合并在一起作為雙功能融合基因。
在應(yīng)用本發(fā)明的具有胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因的病毒進(jìn)行治療的方法中，優(yōu)選所述病毒與一或多種二氫嘧啶脫氫酶的抑制劑一起存在或一起給藥。這能使這些轉(zhuǎn)基因形成的產(chǎn)物的毒性效應(yīng)相對(duì)于前體藥物，5-氟胞嘧啶增加。
本發(fā)明還提供了一種修飾的病毒，它含有受控于一或多種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或遺傳元件的一或多種病毒成分或轉(zhuǎn)基因，它們可以是組織特異性的，或者能應(yīng)答外源的表達(dá)調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在。
II.感染性病毒的用途。這比應(yīng)用非復(fù)制型載體有額外的價(jià)值，它使病毒可以在腫瘤內(nèi)從細(xì)胞擴(kuò)散至細(xì)胞，從而增強(qiáng)最初對(duì)腫瘤的打擊，或效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞不僅可以通過工程化安裝至所述載體中的細(xì)胞-破壞機(jī)制來破壞，還可以通過病毒感染本身所伴隨的細(xì)胞破壞作用以及機(jī)體免疫應(yīng)答對(duì)病毒感染細(xì)胞的攻擊來破壞。該原理已通過直接向腫瘤內(nèi)注射腺病毒而在人體中驗(yàn)證，其中的腺病毒已經(jīng)通過基因改造而只能在p53突變的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。從有限的對(duì)“頭頸部”大腫瘤的試驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)也有令人鼓舞之處11例接受治療的腫瘤中有2例完全消退，這些病例都是對(duì)任何形式的已知治療耐受者(Shen YPersonal communication)。
本發(fā)明還提供了一種修飾的病毒，其中編碼腺病毒死亡蛋白(ADP)的基因受控于允許該蛋白過度表達(dá)的啟動(dòng)子之下，所述修飾性病毒的裂解能力因此而增強(qiáng)。
因此，對(duì)于基因治療而言，修飾的病毒可以進(jìn)一步用本領(lǐng)域廣知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、原則和方案進(jìn)行修飾，以便摻入或包含所需治療基因或治療性核酸分子?！爸委熜浴痹诒疚闹袕V泛用于包括治療(指對(duì)于已經(jīng)存在或被確診的病癥進(jìn)行的治愈性或緩解性治療)和預(yù)防。所述基因可以編碼所需治療性產(chǎn)物(例如，治療性多肽或反義分子)。
在本發(fā)明另一方面，所述修飾的病毒可以包括用于插入所需治療性基因/核酸分子的位點(diǎn)(如，限制性位點(diǎn))。
在基因治療中使用野生型病毒(即使是根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行了修飾以后)的一個(gè)好處是，用該病毒治療的人類或動(dòng)物受試者，可以擁有事先形成的、針對(duì)仍存在于所述修飾性病毒中或者僅被部分修飾的野生型病毒成分的抗體。例如人的腺病毒血清型5的六鄰體蛋白通常是預(yù)先形成的抗體的靶。盡管對(duì)單一病毒成分，如含有本發(fā)明多肽的成分進(jìn)行修飾，就足以減弱由事先形成的抗體對(duì)所述修飾性病毒的初始免疫應(yīng)答，但優(yōu)選修飾該病毒的其它成分，以便進(jìn)一步減弱宿主的免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明修飾的病毒，其中的另一種病毒成分被等效的成分替代或者被修飾，從而事先形成的、針對(duì)野生型病毒的抗體與該病毒的結(jié)合減少。例如，腺病毒血清型Ad5可包含一種六鄰體蛋白，它被替換為另一種不同血清型的六鄰體蛋白，針對(duì)后者的抗體比血清型Ad5的抗體水平低，例如，所述不同血清型可以是Ad37?；蛘撸揎椀南俨《究梢园环N六鄰體蛋白的表位序列，該蛋白可被事先形成的抗體結(jié)合，所述病毒已經(jīng)被修飾，從而能產(chǎn)生缺乏免疫原性表位的重組六鄰體。
而且，修飾的腺病毒可以包含一種六鄰體蛋白，該蛋白進(jìn)一步含有能結(jié)合蛋白(如人血清白蛋白等非免疫系統(tǒng)蛋白)的肽，該肽足以覆蓋該六鄰體上可被事先形成的抗體結(jié)合的免疫原性表位。
本發(fā)明還提供了，根據(jù)本發(fā)明修飾的病毒在治療或者在制備用于治療腫瘤細(xì)胞或增生細(xì)胞的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明的修飾的病毒以及一種可藥用的載體或賦形劑。
本發(fā)明參照以下非限制性實(shí)施例詳細(xì)說明，其中

圖1圖示不同重組尾絲的構(gòu)建順序。
A.利用PCR使NRP序列側(cè)翼帶有Sph1和Xho1位點(diǎn)，并將該序列連接至已在側(cè)翼帶有EcoR1和Xho1位點(diǎn)的WT尾絲中。所得尾絲稱為A1，它含有尾絲尾部，最初的莖部重復(fù)單元以及NRP基元。
B.通過SOE將EGF與尾絲A1相連。在此過程中，在NRP和EGF序列之間添加一個(gè)氨基酸接頭和一個(gè)Cla1限制性位點(diǎn)。所得尾絲命名為A1EGF。在此尾絲中，通過在Cla1和Xho1位點(diǎn)進(jìn)行連接就可以將EGF替換為新的配體。
C.對(duì)尾絲A1 EGF的NRP-接頭-EGF部分進(jìn)行PCR。在此過程中，在序列中引入一個(gè)上游Nhe1位點(diǎn)，使之與WT尾絲序列在一個(gè)讀框中。AT克隆之后，將該序列用Nhe1和Xho1連接至WT尾絲，得到尾絲A7 EGF。A7區(qū)別于A1之處在于，A7包含Ad5尾絲的最初7個(gè)莖部重復(fù)單元。在A7 EGF構(gòu)建體中，可以通過在Cla1和Xho1位點(diǎn)進(jìn)行連接而將EGF替換為新的配體。
圖2圖示本申請(qǐng)使用的不同重組尾絲。
A.Ad5野生型尾絲。
B.上述A7 EGF尾絲。
C.A7 scFv C242尾絲，其通過如上所述的連接將A7 EGF尾絲中的EGF替換為scFv片段而產(chǎn)生。
D.A7 scFv G250尾絲，其通過如上所述的連接將A7 EGF尾絲中的EGF替換為scFv片段而產(chǎn)生。
E.A7 Affi IgG尾絲，其中A7 EGF尾絲中的EGF已如上所述替換為結(jié)合IgG的親和體。
F.A7 Affi IgA尾絲，其中A7 EGF尾絲中的EGF已如上所述替換為結(jié)合IgA的親和體。
G.A7 Affi IgG/Affi IgA尾絲，其中A7 EGF尾絲中的EGF已如上所述替換為結(jié)合IgG的親和體，所述結(jié)合IgG的親和體與結(jié)合IgA的親和體如上所述相連。
H.A7 ZIgG/ZIgG尾絲，其中A7 EGF尾絲中的EGF已如上所述替換為結(jié)合IgG的親和體，所述結(jié)合IgG的親和體與另一結(jié)合IgG的親和體如上所述相連。
I.A7 ZIgG Xa尾絲頂球，其中A7 EGF尾絲中的EGF已替換為結(jié)合IgG的親和體，所述結(jié)合IgG的親和體與一種可切割的野生型尾絲頂球相連。
圖3顯示ZIgG親和體插入表達(dá)在病毒體上的尾絲中之后的結(jié)合。
A組當(dāng)病毒或蛋白與膜結(jié)合后，將其與Fc3(1)一起保溫，再與HRP偶聯(lián)的抗人IgG一起保溫，然后顯色。1＝病毒A7 ZIgG Xa頂球；2＝相同病毒經(jīng)Xa切割；3＝WT病毒；4＝具有兩個(gè)尾絲(如WT和A7 ZIgG)的病毒；5＝Fc3(1)；6＝蛋白A；7＝蛋白AG。
B組當(dāng)病毒或蛋白與膜結(jié)合后，將其與Fc3一起保溫，再與HRP偶聯(lián)的抗人IgG一起保溫，然后顯色。1＝病毒A7 ZIgG Xa頂球；2＝相同病毒經(jīng)Xa切割；3＝WT病毒；4＝具有兩個(gè)尾絲(如WT和A7 ZIgG)的病毒；5＝Fc3；6＝蛋白A；7＝蛋白AG。
C組對(duì)照，顯示膜上存在病毒。1＝病毒A7 ZIgG Xa頂球；2＝相同病毒經(jīng)Xa切割；3＝WT病毒。與病毒結(jié)合后，將膜與HRP偶聯(lián)的抗Ad5六鄰體一起保溫，然后顯色。
D組處理的方法同A組和B組中膜的處理，但不與Fc保溫。1＝病毒A7 ZIgG Xa頂球；2＝WT病毒；3＝蛋白A；4＝蛋白AG。說明已知Fc3(1)與ZIgG和蛋白A結(jié)合。已知Fc3僅與蛋白G(AG)結(jié)合。
圖4圖示實(shí)施例11中所述尾絲。NRP-接頭插入在NRP上游的NheI位點(diǎn)中。
圖5顯示凝膠照片，證實(shí)重組尾絲在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)和可溶性。(A)全細(xì)胞裂解物；(B)可溶性級(jí)分。用桿狀病毒感染細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，用等滲緩沖液裂解，將細(xì)胞裂解物分成兩個(gè)等份。其中一份在10,000xg離心10min并取上清(B組)，另一份以全細(xì)胞裂解物的形式進(jìn)行分析(A組)。兩個(gè)等份均在SDS-樣品緩沖液中加熱變性，用常規(guī)SDS-PAGE進(jìn)行分析，并進(jìn)行印跡。使印跡與4D2.5mAb(特異于尾絲尾部)和放射性標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)。免疫印跡通過放射自顯影掃描來定量。定量的數(shù)據(jù)表示為可溶性尾絲含量相對(duì)于尾絲總含量的百分比，見表7。
實(shí)施例主要方法和起始物質(zhì)重組腺病毒尾絲用基于連接和PCR的方法(Clackson等，Generalapplication of PCR to gene cloning and manipulation，in PCR，A PracticalApproach，Eds McPherson MJ，Quirke P and Taylor GR，IRL Press，Oxford，page 187，(1992))，即PCR-連接-PCR法(Alvaro等，BioTechniques 18746-750(1995))來構(gòu)建，并通過重疊延伸來剪接(SOE)(Horton等，Recombination andmutagenesis of DNA sequences using PCR，in McPherson MJ(ed)，DirectedMutagenesis，IRL Press 1991，p 217.)。通常將PCR所得基因產(chǎn)物用所謂的TA克隆法(Clark J.M.，Nuc.Acids Res.169677-86，(1988))克隆至載體pCRII(Invitrogen Corp.)中。按照標(biāo)準(zhǔn)方法再克隆(Sambrook等，Molecular cloning.Alaboratory manual.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))至載體pGEX-4T-3(Amersham Pharmacia Biotech)中。編碼重組尾絲的基因用Perkin Elmer ABI Prism測(cè)序儀測(cè)序，用下述載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞，COS7，來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，VA，USA)中表達(dá)，用桿狀病毒表達(dá)法(Kitts等，Biotechniques 14(5)810-7，(1993))在昆蟲細(xì)胞(Sf9細(xì)胞，來自草地夜蛾(S.frugiperda)，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，VA，USA)(病毒和載體來自Clontech，Palo Alto，CA，USA)，用特異于尾絲尾部、三聚體尾絲以及結(jié)合細(xì)胞的新配體的單克隆抗體染色。通過免疫染色評(píng)價(jià)以下參數(shù)i)核轉(zhuǎn)運(yùn)ii)結(jié)合細(xì)胞的新配體的功能性表達(dá)iii)形成三聚體的能力可通過近期開發(fā)的方法(如本文實(shí)施例7所述)將重組尾絲拯救至Ad基因組中。可以用含有完整Ad5基因組(為Pac1-Pac1片段)的質(zhì)粒pTG3602(Chartier等，J.Virol.，704805-4810，(1996))作為起始物質(zhì)。將Spe1和Pac1之間的含有野生型尾絲基因的近9kb基因組片段單獨(dú)克隆至pBluescript中。由該片段進(jìn)一步克隆Sacl和Kpnl之間的近3kb片段。在此3kb片段中產(chǎn)生天然尾絲基因的缺失，但不缺失尾絲的Nde1位點(diǎn)上游的N-末端核苷酸，取而代之的是引入一個(gè)Xho1位點(diǎn)以便將重組尾絲連接至缺失了尾絲的3kb片段(3kb尾絲穿梭體)中的Nde1和Xho1之間。
利用在大腸桿菌中的同源重組將帶有重組尾絲的3kb尾絲穿梭體重新引入已被Nhe1切割的9kb片段中(Chartier等，同上)。所得9kb重組片段最后用Spe1和Pac1從載體上切下來，經(jīng)粘?？寺《c分離的27kb片段連接。
具有預(yù)期特性的插入子的存在通過在所有粘?？寺≈羞M(jìn)行PCR來檢驗(yàn)。粘?？寺∫灿肏ind III進(jìn)行限制性處理，具有預(yù)期大小的限制性片段的存在在凝膠上檢驗(yàn)。
用Pac 1進(jìn)行限制性處理后，分離出重組的Ad基因組，用于轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞。通過對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鏡檢來確定空斑的出現(xiàn)。
所用引物的寡核苷酸引物名稱列表(都按照5′-3′順序)[SEQ.ID.NO.20]名稱149TTCCTCGAGTTATTCTTGGGCAATGTATGA[SEQ.ID.NO.21]名稱175GGGGAATTCGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAA[SEQ.ID.NO.22]名稱196GCTCGAGTTATCCGTTTGGAAACAACTCTAC[SEQ.ID.NO.23]名稱228CTCGAGTCATCTCAATTCCCACCACTT[SEQ.ID.NO.24]名稱238TGGCATGCCTGACGTAGCAAGCTTACGA[SEQ.ID.NO.25]名稱253GGGGAATTCATCGATGCAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT[SEQ.ID.NO.26]名稱265CAGGTCCAGTTGGTGCAGTCT[SEQ.ID.NO.27]名稱269GGGGGCCTGGGCGTCGTTCAGCTTCTTGGCTCCGTTTGGAAACAACTCTAC[SEQ.ID.NO.28]名稱270CTGAACGACGCCCAGGCCCCCAAGAGCGACCCATCGATCATGAACTCCGACTCCGAATGT[SEQ.ID.NO.29]名稱273CCCCTGGAGTTAAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCT[SEQ.ID.NO.30]名稱274GGGGAATTCATCGATGGACTACAAAGATATTGTGATGACGCAGGCT[SEQ.ID.NO.31]名稱275CIACCTCGAGTTAACACTCATTCCTGTTGAAGC[SEQ.ID.NO.32]名稱326GGGGCTAGCCCCTGACGTAGCAAGCTTACGA名稱403GGG CTC GAG TTA CTC GAT GGG GGC TGG GAG GGC[SEQ.ID.NO.34]名稱414GGCCCCCGAGGCCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGT[SEQ.ID.NO.35]名稱416GGCCCAGCCCACGAATTCATCGATGGATATTGTGATGACGCAGGCT[SEQ.ID.NO.36]名稱418AGA CTG CAC CAA CTG GAC CTG(SNN)18CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGT(S是dA、dG或dC，N是dA、dG、dC或dT)[SEQ.ID.NO.37]名稱473GGC AAT TCC ATC GAT CGC CAC CAT GGA CAT TGT GAT GACCCA GTC T[SEQ.ID.NO.38]名稱474CCC CTC GAG TTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT[SEQ.ID.NO.39]名稱476ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCTGAT GCT GCA CCA ACT GTA[SEQ.ID.NO.40]名稱478TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT[SEQ.ID.NO.41]名稱503GGGCCATCGATCGTAGACAACAAATTCAACAAA[SEQ.ID.NO.42]名稱504GGGCTCGAGTTATTTCGGCGCCTGAGCATCATT[SEQ.ID.NO.43]名稱550TCGGTTTGGAAACAACTCTACCTTTTTTTTCGGCGCCTGAGCATCATT[SEQ.ID.NO.44]名稱551AAAAAGGTAGAGTTGTTTCCAAACGGAGTAGACAACAAATTCAACAAA實(shí)施例1將三聚體化基元(人肺表面活性物質(zhì)D的頸區(qū)肽)通過遺傳技術(shù)插入腺病毒尾絲用上游引物(引物175)和下游引物(引物149)經(jīng)PCR從Adt病毒制劑獲得編碼Ad 5 WT尾絲的基因，所述上游引物為尾絲的前6個(gè)密碼子外加一個(gè)EcoR1位點(diǎn)，所述下游引物是能與尾絲的6個(gè)末端密碼子退火的序列外加一個(gè)Xho1位點(diǎn)。利用這些限制性位點(diǎn)將所得尾絲[SEQ.ID.NO.1]克隆至載體pBluescript中，并可用相同的限制酶進(jìn)一步克隆至其它載體中。
制成尾絲肽，其中的頂球被一種外部三聚體化基元替代(見下述)。引入外部三聚體化基元有兩個(gè)目的a)除去含有天然三聚體化信號(hào)的頂球以及尾絲的細(xì)胞結(jié)合部分，b)同時(shí)提供必要的三聚體化信號(hào)。這種情況下，用到一種特定的氨基酸基元，即來自人的“肺表面活性物質(zhì)蛋白D”的36aa“頸區(qū)肽”＝NRP[SEQ.ID.NO.2](Hoppe等，同上)。應(yīng)注意，所用序列略長(zhǎng)于NRP的實(shí)際三聚體化部分，其中位于人肺表面活性物質(zhì)蛋白D的三聚體化信號(hào)之后的8個(gè)氨基酸(KKVELFPN)，在所有含有NRP序列的構(gòu)建體中都得以保留。KKVELFPN可作為人肺表面活性物質(zhì)D的三聚體化信號(hào)和C-末端碳水化合物結(jié)構(gòu)域之間的有效接頭，并被認(rèn)為在本文所述重組尾絲中具有相同的重要功能。合成、克隆并通過測(cè)序驗(yàn)證三聚體化基元的DNA序列。
為了將NRP基元引入腺病毒尾絲，用上游引物238和下游反向引物196對(duì)NRP序列進(jìn)行PCR(Clackson等，同上)，所述上游引物在NRP編碼的N末端含有Sph1，所述下游引物在該編碼序列的C末端含有Xho1。用Sph1和Xho1切割后，將NRP序列連接至也用相同酶切割的WT尾絲基因。所得重組尾絲A1[SEQ.ID.NO.3]含有尾絲尾部和第一個(gè)頸區(qū)重復(fù)單元，后接所述NRP三聚體化基元。構(gòu)建體和構(gòu)建途徑的圖示參見圖1和2。
為了替代所述頂球的細(xì)胞結(jié)合功能，除了外部的三聚體化氨基酸基元，還將一個(gè)新的細(xì)胞結(jié)合配體隨后引入該尾絲(見下文)。
實(shí)施例2用表皮生長(zhǎng)因子(EGF)以及來自人肺表面活性物質(zhì)D的外部三聚體化基元裝配編碼重組腺病毒的基因構(gòu)建體構(gòu)建體和構(gòu)建途徑的圖示參見圖1和2。
在本項(xiàng)目中合成、克隆并測(cè)序人EGF[SEQ.ID.NO.4]的DNA序列。然后將該序列通過利用重疊延伸進(jìn)行的剪接而與上述A1尾絲連接。在這種情況下，用上游引物(270)和下游引物(228)對(duì)EGF進(jìn)行PCR，上游引物(等同于前7個(gè)密碼子)含有葡萄球菌蛋白A的氨基酸接頭突出端的序列[SEQ.ID.NO.5]和一個(gè)Cla1限制性位點(diǎn)，下游引物互補(bǔ)于+鏈末端的7個(gè)密碼子并含有一個(gè)Xho1位點(diǎn)。用上游引物(175)和下游引物(269)對(duì)A1尾絲基因進(jìn)行PCR，所述上游引物為該基因的前6個(gè)密碼子外加一個(gè)EcoR1位點(diǎn)，所述下游引物互補(bǔ)于+鏈末端7個(gè)密碼子，還有一個(gè)突出端互補(bǔ)于EGF序列的反向(Back)引物的突出端。在標(biāo)準(zhǔn)SOE條件(Horton等，同上)下，對(duì)上述兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR，產(chǎn)生尾絲A1 EGF[SEQ.ID.NO.6]。
為了構(gòu)建帶有前7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元的尾絲，用上游引物(326)和下游引物(228)對(duì)NRP三聚體化信號(hào)、葡萄球菌接頭和EGF、尾絲A1EGF進(jìn)行PCR，所述上游引物為NRP序列的前7個(gè)5′三聯(lián)體外加一個(gè)上游Nhe1位點(diǎn)，所述下游引物與A1正鏈的最后7個(gè)三聯(lián)體互補(bǔ)。克隆之后，將PCR產(chǎn)物用Nhe1和Xho1進(jìn)行限制性消化，并連接至已用相同酶消化的WT尾絲中，獲得尾絲A7 EGF[SEQ.ID.NO.7]，它與A1EGF類似，區(qū)別是它含有Ad5尾絲的前7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元。
實(shí)施例3用單鏈抗體以及來自人肺表面活性物質(zhì)D的外部三聚體化基元裝配編碼重組腺病毒尾絲的基因構(gòu)建體使用了兩種單克隆抗體單鏈片段來構(gòu)建重組腺病毒尾絲。第一種是單克隆抗體G250的單鏈片段(scFv)，其以高度選擇性與人的腎癌細(xì)胞表面的蛋白抗原反應(yīng)(Oosterwijk等，Int.J.Cancer 38489-94，(1986))。第二種是單克隆抗體C242的單鏈片段，其與i.a.結(jié)直腸癌和胰腺癌反應(yīng)(Johansson C.，Thesis，University of Gteburg，(1991))。
G250構(gòu)建體抗體G250的單鏈片段(κ鏈可變區(qū)或VK，重鏈可變區(qū)或VH，連接序列和重鏈恒定區(qū)2或CH2)如前文所述來構(gòu)建(Weijtens等，J.Immunol.，152(2)836-43，(1996))。該G250構(gòu)建體是[SEQ.ID.NO.8]。為了能克隆至上述A1和A7尾絲構(gòu)建體中，用引物416和403通過PCR在所述單鏈片段上游添加一個(gè)Cla1位點(diǎn)，在下游添加一個(gè)Xho1位點(diǎn)。
C242構(gòu)建體抗體C242的單鏈片段κ鏈可變區(qū)，接頭，重鏈可變區(qū)和κ鏈恒定區(qū)或CK)[SEQ.ID.NO.9]如下所述，用來自產(chǎn)生該抗體的雜交瘤的cDNA作為起始模板經(jīng)SOE而制備。VKCK用引物274和275進(jìn)行擴(kuò)增，VHCH1用引物253和273進(jìn)行擴(kuò)增。scFv(單鏈可變片段)(VK LinkLib VH)如下述通過SOE構(gòu)建。用上述VKCK和VHCH1作為模板，用引物416/418和265/414分別擴(kuò)增VK和VH，并利用引物414和416通過SOE連接。在構(gòu)建體VKLinkLib VH中，VK和VH之間的接頭是隨機(jī)化的18個(gè)氨基酸的序列，如前述(Tang等，J.Biol.Chem.，27115682-86，(1996))。該接頭的核苷酸序列出現(xiàn)在引物418中。將構(gòu)建體VK LinkLib VH克隆至載體pAK100(Krebber等，J.Immunological Methods 20135-55，(1997))。使用前述方法(Krebber等，同上)進(jìn)行噬菌體展示并通過淘選(panning)對(duì)抗原結(jié)合物進(jìn)行選擇。在這些實(shí)驗(yàn)中，將與抗體C242反應(yīng)的CanAg抗原吸附至生物素化的抗體C241(它與C242結(jié)合所述抗原上的不同表位)，而抗體C241結(jié)合至鏈親和素包被的試管上(CanAg Diagnostics Ltd，G′teburg，Sweden)。分離出數(shù)種結(jié)合物，它們顯示含有不同的接頭。一種特殊的VK Linker VH構(gòu)建體經(jīng)測(cè)序顯示含有接頭PPDFVPPAASFPDHSPRG(單字母氨基酸密碼)，選擇它進(jìn)行進(jìn)一步的基于抗原結(jié)合能力的工作。通過SOE將CK與該構(gòu)建體連接，獲得C242 VKLink VHCK形式。在此SOE中，用引物416和478擴(kuò)增VK LinkLib VH，用引物476和474擴(kuò)增CK。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用引物416和474通過SOE連接。
在上述PCR反應(yīng)中，給單鏈片段的基因序列提供了一個(gè)上游Cla1位點(diǎn)(出現(xiàn)在引物416和473中)和一個(gè)下游Xho1(出現(xiàn)在引物403和474中)，以便連接至前述的A1和A7尾絲構(gòu)建體中(構(gòu)建體和構(gòu)建途徑的圖示參見圖1和2)，從而構(gòu)建尾絲A1 G250，A7 G250，A1 C242和A7 C242(圖1和[SEQ I.D.NOS.10-13])。
實(shí)施例4用多種抗體以及來自人肺表面活性物質(zhì)D的外部三聚體化基元裝配編碼重組腺病毒尾絲的基因構(gòu)建體為了研究基于單一葡萄球菌蛋白A結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的一價(jià)和二價(jià)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)插入重組腺病毒尾絲后能否功能性表達(dá)，制備了用于哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞表達(dá)的基因構(gòu)建體。如下裝配編碼重組腺病毒尾絲的基因構(gòu)建體，所述尾絲含有衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合型Z結(jié)構(gòu)域(ZIgG)(NilssonB.，Prot.Eng.1，107-13，(1987))[SEQ.ID.NO.14]或利用噬菌體展示技術(shù)選出的Z結(jié)構(gòu)域衍生型IgA-特異性親和體(ZIgA)(Gunneriusson E.等，App.Env.Micro.，654134-40，(1999))[SEQ.ID.NO.15]。
使用以下質(zhì)粒作為模板，用引物503和504經(jīng)PCR擴(kuò)增編碼每種親和半分子的基因用于Z結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體的pEZZmpl8(Tang等，同上)和用于ZIgA構(gòu)建體的pKN1-dZIgA(Clackson等，同上)。
在PCR擴(kuò)增中，在兩種不同親和配體的基因中的適當(dāng)讀框內(nèi)提供了上游ClaI位點(diǎn)和下游XhoI位點(diǎn)，以便隨后連接至上述尾絲基因A7 EGF，導(dǎo)致分別獲得編碼重組尾絲A7 ZIgG[SEQ.ID.NO.16]和A7 ZIgA[SEQ.ID.NO.17]的構(gòu)建體，它們可用于隨后在Ad基因組中拯救(見下文)，從而產(chǎn)生攜帶新結(jié)合特異性的重組病毒。另外，通過將修飾的ZigG連接至上述尾絲A1 EGF中，構(gòu)建了尾絲A1 ZIgG(也參見圖1)。
還裝配了第三種基因構(gòu)建體，它編碼含有上述兩種親和結(jié)構(gòu)域的尾絲。該構(gòu)建體編碼的尾絲含有尾絲尾部，前7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元，NRP序列，葡萄球菌蛋白A接頭，結(jié)合IgG的Z結(jié)構(gòu)域，來自NRP的8氨基酸接頭(KKVELFPN)，后面是結(jié)合IgA的親和體。為了構(gòu)建這種尾絲，首先將兩種不同親和結(jié)構(gòu)域用引物550和551經(jīng)SOE連接在一起，使其具有與編碼接頭序列KKVELFPN的核苷酸序列互補(bǔ)的突出端。在該P(yáng)CR中，利用所述引物引入上游ClaI位點(diǎn)和下游XhoI位點(diǎn)，以便與含有尾絲A7 EGF基因構(gòu)建體的載體pGEX-4T-3連接，得到尾絲A7 ZIgG/ZIgA[SEQ.ID.NO.18]。
還裝配了另一種基因構(gòu)建體，它編碼含有兩個(gè)相連的ZigG結(jié)構(gòu)域的尾絲。該基因編碼尾絲A7 ZIgG/ZIgG[SEQ.ID.NO.19]，用裝配A7 ZIgG/ZIgA的方式進(jìn)行裝配，不同的是在PCR反應(yīng)中使用ZIgG基因而非ZIgA。
構(gòu)建體和構(gòu)建途徑的圖示參見圖1和2。
實(shí)施例5結(jié)合研究將編碼重組尾絲的基因克隆至載體pcDNA(其靶向表達(dá)在胞質(zhì)溶膠中的蛋白)和pSecTag(其靶向表達(dá)為分泌產(chǎn)物的蛋白)，并用Lipofectamin(LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD，USA)按照廠家建議轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中，所述兩種載體都來自Invitrogen BV，Groningen，荷蘭。
重組尾絲的表達(dá)和細(xì)胞定位用以下第一試劑通過免疫染色來評(píng)估第一試劑
小鼠單克隆抗體4D2.5(抗-Ad5尾絲)(Dr Geoffrey Engler惠贈(zèng)，University of Birmingham，Alabama，USA)(Shin Hong等，Virology 185758-767，(1991))。
小鼠單克隆抗體2A6.36(抗-三聚體Ad5尾絲)(Dr Geoffrey Engler惠贈(zèng)，University of Birmingham，Alabama，USA)(Shin Hong等，同上)。
抗表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的小鼠單克隆抗體＝a-EGF(Cambio，Cambridge，UK，Cat no CA 954)。
生物素化的抗單克隆抗體C242的小鼠單克隆抗獨(dú)特型抗體＝a-Id C242(Lindholm等，未發(fā)表的結(jié)果)。
生物素化的抗單克隆抗體G250的小鼠單克隆抗獨(dú)特型抗體＝a-Id C250(Reinder Bolhuis惠贈(zèng)，Daniel Den Hoed Cancer Center，Rotterdam，荷蘭)。
用于評(píng)估親和體活性的人的多克隆IgG和IgA＝HIgG(Sigma-AldrichFine Chemicals，Cat no 14506)和HIgA(Sigma-Aldrich Fine Chemicals，Cat noI1010)。
第二試劑用于鑒定小鼠抗體FITC標(biāo)記的F(ab)2兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKOA/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0313)＝aMIg。
用于鑒定人的IgGFITC標(biāo)記的F(ab)2兔抗人IgG(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0315)＝aHIgG。
用于鑒定人的IgAFITC標(biāo)記的F(ab)2兔抗人IgA(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0316)＝aHIgA。
用于鑒定生物素化抗體FITC標(biāo)記的鏈親和素(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，Cat no F0422)。
簡(jiǎn)言之，在Shandon Cytosin2細(xì)胞離心機(jī)(cytocentrifuge)中將細(xì)胞離心至顯微鏡載玻片上，室溫風(fēng)干過夜，用3％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液pH7.4(PBS)固定，所述緩沖液已用0.1％Triton-X100的PBS透化處理。在PBS中洗滌后，將制品與第一試劑于37℃潮濕小室中溫育30分鐘，在PBS中再進(jìn)行洗滌，然后與第二試劑于37℃潮濕小室中溫育30分鐘。在PBS中洗滌后，將制品浸沒在(mount)含有50％甘油的PBS中，用配備了適于FITC的光源和濾片的Zeiss Axophot顯微鏡進(jìn)行觀察。
結(jié)果示于下表2和3。顯而易見的是，所有不同配體當(dāng)其相應(yīng)尾絲以分泌產(chǎn)物的形式表達(dá)時(shí)都顯示相應(yīng)的結(jié)合。但是，當(dāng)尾絲表達(dá)在胞質(zhì)溶膠中并隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至核時(shí)，僅有親和體顯示預(yù)期的正確結(jié)合。因此，不是所有配體能在胞質(zhì)溶膠和核內(nèi)正確折疊。有趣的是，能經(jīng)受胞質(zhì)溶膠和核內(nèi)環(huán)境的配體(親和體)都是不依賴S-S橋維持其構(gòu)象的小α-螺旋結(jié)構(gòu)，而顯示在胞質(zhì)溶膠/核內(nèi)不能正確表達(dá)的配體都具有依靠S-S橋維持的構(gòu)象，而這種S-S橋在胞質(zhì)溶膠中很弱或根本無法形成。
表2靶向COS細(xì)胞中的分泌的重組腺病毒尾絲的表達(dá)和功能性配體結(jié)合檢測(cè)試劑尾絲4D2+2A6+a-EGF+a-MIga-Id+HigG+HigA+aMIgaMIgaMIg aMIg aHIgGaHIgAWT + + NDND ND ND NDA7 EGF + + + ND ND ND NDA7 G250 + + ND++ND NDA7 C242 + + ND++ND NDA1 ZIgG + ND NDND ND +-A7 ZIgG + ND NDND ND +-A7 ZIgG/ZIgG+ ND NDND ND +-A7 ZIgA + ND NDND ND -+A7 ZIgG/ZIgA+ ND NDND ND ++
表3天然型和選定的重組型尾絲靶向胞質(zhì)溶膠中的表達(dá)后，在COS細(xì)胞的核內(nèi)的表達(dá)和配體結(jié)合功能。
檢測(cè)試劑尾絲 4D2+2A6+a-EGF+a-MIga-Id+HigG+HigA+aMIgaMIgaMIg aMIgaaHIgGaHIgAWT + + NDND ND ND NDA7 EGF + + - ND ND ND NDA7 G250 + + ND+-ND NDA7 C242 + + ND+-ND NDA1 ZIgG + ND NDND ND +-A7 ZIgG + + NDND ND +-A7 ZIgG/ZIgG + ND NDND ND +-A7 ZIgA + + NDND ND -+A7 ZIgG/ZIgA + ND NDND ND ++A7 ZIgGxa頂球+ ND NDND ND +-上述結(jié)果明顯暗示了用于人類基因治療的再靶向(re-targeted)病毒(即腺病毒)的構(gòu)建，其中含有新的細(xì)胞結(jié)合配體的病毒結(jié)構(gòu)成分在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中合成。以下兩個(gè)實(shí)施例明示如何構(gòu)建這種再靶向病毒。
實(shí)施例6移植CDR環(huán)單克隆抗體的某些單鏈構(gòu)建體即使在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中也能保留它們的結(jié)合特異性(Cattaneo等，TIBTECH 17115-121，(1999))。這就是所謂的抗體可變區(qū)之框架區(qū)的功能。已知結(jié)合抗原的CDR環(huán)可以通過重組DNA技術(shù)從一種抗體轉(zhuǎn)移至另一抗體，所得抗體具有來自一種抗體的框架特性和來自另一抗體的結(jié)合特性(方法參見Emery等，Strategies forHumanizing Antibodies，in Antibody Engineering，Carl A.K.Borrebaeck，(ed.)，Oxford University Press 1995，page 159)。
這種環(huán)-移植型單鏈抗體，基于能在胞質(zhì)溶膠中折疊、并隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核的可變區(qū)框架，所得抗體隨后可提供基因水平的適當(dāng)克隆位點(diǎn)，與編碼尾絲A7 RGD的基因連接，在腺病毒基因組中拯救，見下述(實(shí)施例7)。
實(shí)施例7在腺病毒基因組中拯救重組尾絲將Ad基因組中編碼的野生型尾絲通過本項(xiàng)目中開發(fā)的以下方法取代為重組尾絲。在所述方法中，用質(zhì)粒pTG3602中的野生型Ad5基因組(Emery等，同上)作為編碼重組尾絲的基因的受體。該質(zhì)粒含有完整的野生型Ad5基因組，它與質(zhì)粒骨架通過Pac1接頭相連。由于該Ad基因組中缺乏Pac1位點(diǎn)，因此用Pac1切割后，回收的基因組是線性DNA片段。然后可用所得線性Ad DNA轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞，產(chǎn)生病毒(Chartier等，同上)。也可以用Pac1和Spe1酶將該質(zhì)粒上的所述Ad基因組切割為兩種片段27kb和9kb。將9kb片段克隆至pBluescript中。該9kb片段含有所述尾絲，可從中再克隆出一段含有所述尾絲基因的3kb Sac1-Kpn1片段。該尾絲基因缺失尾絲尾部的Nde1位點(diǎn)和緊接該尾絲基因下游的Mun1位點(diǎn)之間的片段，并在Nde1和Mun1位點(diǎn)之間引入了含有Xho1位點(diǎn)的銜接子及下游序列，從而獲得一種尾絲穿梭載體。已將數(shù)種重組尾絲連接在該穿梭載體的Nde1和Xho1之間，然后通過在大腸桿菌中的同源重組而拯救至上述9kb片段中(Chartier等，同上)。這意味著，完整保留了調(diào)節(jié)尾絲表達(dá)所需的所有正常元件。
最后，通過粘?？寺》▽⒍喾N重組9kb片段分別與27kb片段連接，以便重新產(chǎn)生完整的Ad基因組。
所述27kb片段也可以衍生自另一種腺病毒基因組，如He等人所述的Ad-YFG(He T-C，Zhou S，DaCosta LT，Yu J，Kinzler KW and Vogelstein BAsimplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci，USA，952509-2514，1998)。如果該27kb片段衍生自pTG3602，所得基因組將為WT E1+；如果該27kb片段衍生自Ad-YFG，將產(chǎn)生E1缺陷型病毒，它們需要，例如，低傳代數(shù)的293來進(jìn)行復(fù)制。
用上述方法獲得的重組Ad基因組可用Pac1切割成線性片段，用于轉(zhuǎn)染容許細(xì)胞系，當(dāng)該基因組具有功能時(shí)，可產(chǎn)生病毒空斑?？梢杂肍uGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)進(jìn)行這些轉(zhuǎn)染。
可以將各種重組尾絲拯救至Ad基因組，并隨后轉(zhuǎn)染至容許細(xì)胞中。結(jié)果見表4。這些尾絲中，僅有那些含有WT頂球的尾絲和親和體A7 ZIgG/IgG能產(chǎn)生功能性病毒體。這些結(jié)果與表2和3所示完全一致。
表4將重組尾絲拯救至病毒體中尾絲 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 出現(xiàn)病毒空斑A7 WT頂球 293 有A7 EGFA549無A7 C242 Colo 205無A7 G250 A75 無A7 ZIgG/ZIgG 293/Fc*有(*)293/Fc是用來自人類IgG、表達(dá)為膜蛋白的Fc3(1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。為了產(chǎn)生293/Fc，從與Z區(qū)反應(yīng)的人類IgG克隆Fc3(1)(Jendeberg，L.，Nilsson，P.，Larsson，A.，Nilsson，B.，Uhlen，M.和Nygren，P.-A(1997)“Engineering of Fcl and Fc3 from human immunoglobulin G to analysesubclass specificity for staphylococcal protein A”J.Imm.Methods 201，25-34.)，將其連接至載體pDisplay(Invitrogen)中，與該載體中的PDGFR跨膜區(qū)序列同在一個(gè)讀框。利用限制酶SfiI和NotI將與PDGFR跨膜區(qū)序列融合的含有該Fc序列的編碼序列從該載體中切割下來，連接至也用相同酶切割的載體pSecTag(其攜有Zeocin抗性基因)。將重新構(gòu)建的載體用FuGENE轉(zhuǎn)染低傳代數(shù)的293細(xì)胞，用Zeocin選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。分離克隆，用FITC標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A(Sigma)檢驗(yàn)?zāi)そY(jié)合型Fc3(1)的膜表達(dá)。用一個(gè)均勻表達(dá)膜結(jié)合型Fc的293克隆轉(zhuǎn)染含有基因組的A7 ZIgG/ZIgG，以便產(chǎn)生病毒體。
實(shí)施例8裝配編碼重組腺病毒尾絲的基因構(gòu)建體，所述尾絲帶有親和體和可切割的野生型頂球可切割的尾絲包含帶有外部配體(這里是親和體)的非天然多肽，并且在其C-末端有野生型頂球，用位于細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)之間的活化因子X位點(diǎn)來構(gòu)建，使得可以將所述頂球切割下來，從而暴露親和體。這允許病毒在293細(xì)胞中產(chǎn)生，隨后，將頂球通過蛋白裂解作用去除后，通過親和體識(shí)別并感染新的靶細(xì)胞。
為了構(gòu)建用于連接不同配體的可切割型尾絲的基因，用上游引物(437)和下游引物149對(duì)WT尾絲進(jìn)行PCR，所述上游引物在重復(fù)單元22的前7個(gè)三聯(lián)體之前引入Cla1，Mun1和因子Xa識(shí)別位點(diǎn)，下游引物對(duì)應(yīng)于尾絲頂球的末端。克隆并用Cla1和Xho1消化后，將DNA片段克隆至上述A7尾絲構(gòu)建體中。所得尾絲基因從N-末端開始，依次包含尾部序列，前7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元，NRP三聚體化信號(hào)，來自葡萄球菌蛋白A的接頭，Cla1位點(diǎn)，Mun1位點(diǎn)，Xa切割位點(diǎn)，重復(fù)單元22和野生型頂球。為了連接成該尾絲基因，用引物503和505經(jīng)PCR產(chǎn)生親和體ZIgG，其帶有上游Cla1位點(diǎn)和下游Mun1位點(diǎn)，將其連接至上述“Xa尾絲”基因。所得尾絲基因從N-末端開始，依次包含尾部序列，前7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元，NRP三聚體化信號(hào)，來自葡萄球菌蛋白A的接頭，Cla1位點(diǎn)，新接頭，Mun1位點(diǎn)，Xa切割位點(diǎn)，重復(fù)單元22和野生型頂球。
將尾絲基因拯救至腺病毒基因組(見實(shí)施例7)。用重組基因組轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生病毒體，在CsC1梯度上純化。純化的病毒體用活化的因子X(Xa)(Sigma)在50mM Tris-Cl pH8.0；100mM NaCl；5mM CaCl2中室溫切割48小時(shí)。5uL病毒懸液使用1UXa。
ZIgG親和體與病毒體結(jié)合的試驗(yàn)基本如下所述。將病毒懸液印跡至PVDF膜(BioRad)。膜用3％明膠的Tris緩沖鹽水，pH7.4(TBS)封閉后，與FC 10ug/mL在1％明膠的TBS溶液中室溫溫育90分鐘，洗滌，與抗-人IgG-HRP(Dakopatts)在TBS/1％明膠中室溫溫育90分鐘，洗滌，用4-氯萘酚試劑(BioRad)顯色。對(duì)WT病毒和重組病毒以及不同對(duì)照的染色結(jié)果見圖3。顯然，重組病毒與結(jié)合WT Z的Fc3(1)結(jié)合，而不結(jié)合WT Z的Fc3(Jendeberg，L.，Nilsson，P.，Larsson，A.，Nilsson，B.，Uhlen，M.和Nygren，P.-A.(1997)“Engineering of Fcl and Fc3 from human immunoglobulin G to analysesubclass specificity for staphylococcal protein A”J.Imm.Methods 201，25-34)不能結(jié)合重組病毒。WT病毒不與任何一種Fc制劑結(jié)合。
實(shí)施例9分析非天然多肽的功能性構(gòu)象和結(jié)合特異性通過將相應(yīng)編碼序列插入適當(dāng)?shù)臉?gòu)建體，可以將候選多肽表達(dá)為病毒成分蛋白的組成部分。所述構(gòu)建體包含完整病毒基因組，其中一或多個(gè)成分已被相應(yīng)的重組成分基因取代，該構(gòu)建體可以在適于所述重組病毒基因組所編碼的重組病毒繁殖的細(xì)胞系中表達(dá)。根據(jù)重組基因組中是否保留結(jié)合WT細(xì)胞的功能，有兩種主要的可能性。
如果保留了結(jié)合WT細(xì)胞的功能，病毒可以在正常能產(chǎn)生該病毒的細(xì)胞系(producer line)中產(chǎn)生，如對(duì)于腺病毒而言的293細(xì)胞。非天然多肽表達(dá)為允許其結(jié)合胞外配體并作為功能性病毒體的一部分的能力，可以通過對(duì)病毒體的結(jié)合研究來分析。該方法實(shí)例如以上實(shí)施例8中所用策略，其中病毒尾絲既含有WT頂球也含有非天然的結(jié)合配體，并且所述頂球可以通過蛋白裂解作用去除。非天然多肽的結(jié)合功能通過標(biāo)準(zhǔn)固相免疫技術(shù)來證實(shí)。另一種策略是產(chǎn)生帶有WT尾絲以及重組尾絲的病毒體，后者含有非天然多肽以代替天然頂球。
如果結(jié)合WT細(xì)胞的功能已從病毒基因組中刪除，病毒體將依賴于非天然多肽來與細(xì)胞結(jié)合。因此，所述細(xì)胞系必需能允許重組病毒進(jìn)入，必要時(shí)，還能提供重組病毒所缺的遺傳信息，例如E1的序列。如果所述重組基因組為E1缺陷型，一種解決方法是，使用E1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如293，并用能結(jié)合該重組病毒基因組所編碼的非天然多肽的受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。所述非天然多肽表達(dá)為允許其與相應(yīng)受體結(jié)構(gòu)結(jié)合并成為功能性病毒體的一部分的能力，可以通過篩選該病毒基因組所轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的空斑形成來分析。該策略實(shí)例如上述實(shí)施例7，其中使用穩(wěn)定表達(dá)來自人類IgG膜結(jié)合型Fc的293來產(chǎn)生病毒，所述病毒中WT結(jié)合功能已被親和體ZIgG替代。非天然多肽的確切結(jié)合特性可以進(jìn)一步在以下研究中測(cè)定使病毒與結(jié)構(gòu)上相關(guān)于負(fù)責(zé)細(xì)胞結(jié)合的非天然多肽的多肽，對(duì)結(jié)合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
實(shí)施例10抗β-半乳糖苷酶單鏈Fv片段在續(xù)接實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)中，將一種單鏈可變區(qū)片段(VK，接頭，VH)克隆至上述A7尾絲構(gòu)建體中，該片段能與β-半乳糖苷酶反應(yīng)，并能表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(Martineau P和Betton J-MJ.Mol.Biol.292，921-929(1999))。該單鏈片段是[SEQ.ID.NO.47)。為了能克隆至上述A7尾絲構(gòu)建體中，可以用Nco1/EcoR1從質(zhì)粒pPM163R4(Martineau P and Betton J-M同上)中切出該片段，連接至含有上述尾絲R7 EGF的質(zhì)粒中，后一質(zhì)粒提供了Cla1-Nco1-EcoR1-Xho1銜接子，可用于將單鏈片段連接在同一讀框中。
在續(xù)接實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)中，含有可與β-半乳糖苷酶反應(yīng)的單鏈可變區(qū)片段(VK，接頭，VH)的重組尾絲，用以下額外的第一試劑β-半乳糖苷酶-生物素(SIGMA，G 5025)，通過免疫染色來評(píng)估其表達(dá)和細(xì)胞定位。
除了表2所示結(jié)果，抗β-半乳糖苷酶單鏈Fv片段尾絲構(gòu)建體的同等實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表5
表5靶向COS細(xì)胞中分泌的重組腺病毒尾絲的表達(dá)和功能性配體結(jié)合尾絲 4D2+aMIg 2A6+aMIg β-半乳糖苷酶+StrAv-FITCR7a-β-半乳糖苷酶 + + +除了表3所示結(jié)果，抗β-半乳糖苷酶單鏈Fv片段尾絲構(gòu)建體的同等實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表6表6天然的以及選定的重組尾絲靶向胞質(zhì)溶膠中的表達(dá)后，在COS細(xì)胞核中的表達(dá)和功能性配體結(jié)合尾絲 4D2+aMIg 2A6+aMIgβ-半乳糖苷酶+StrAv-FITCR7a-β-半乳糖苷酶 ++ +實(shí)施例11尾絲蛋白的表型分析以下是本發(fā)明的修飾病毒的另一實(shí)例，其中在修飾的腺病毒尾絲蛋白中引入了復(fù)合多肽配體。該實(shí)例證實(shí)了產(chǎn)生再-靶向的可變和功能性Ad載體的重要性，所述載體具有兩個(gè)特點(diǎn)(i)尾絲結(jié)構(gòu)的修飾應(yīng)該仍然允許該病毒有效附著并進(jìn)入細(xì)胞，和(ii)插入該尾絲的配體應(yīng)該能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中正確折疊?？梢苑奖愕厥褂每扇苄詠碓u(píng)估正確折疊，它通常與缺乏二硫鍵有關(guān)。優(yōu)選本文所述非天然多肽具有的二硫鍵不超過2個(gè)，通常不超過1個(gè)，最優(yōu)選不含二硫鍵。
材料和方法細(xì)胞。HEK-293細(xì)胞得自Microbix Inc.(Toronto，Ontario，Canada)。Cos7，A431和Colo205細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas，Virginia)，A75和G43得自Reinder Bolhuis(Daniel Den Hoed Cancer Center，Rotterdam，The Netherlands)。所有細(xì)胞在37℃和5％CO2的條件下，在添加了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)和50mg/ml慶大霉素(Gibco BRL)的Iscove′s培養(yǎng)基(Gibco BRL)中維持。草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細(xì)胞(ATCC)培養(yǎng)在28℃的有上述相同添加劑的TC 100培養(yǎng)基(Gibco BRL)中。
抗體。抗表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的單克隆抗體(mAb)購(gòu)自Cambio Ltd.(Cambridge，UK)?？箚捂淭-細(xì)胞受體(scTCR)的Vα和Vβ結(jié)構(gòu)域的抗體，以及抗mAb G250的抗-獨(dú)特型抗體(NUH31和NUH84)由Reinder Bolhuis惠贈(zèng)?？刮步z尾部的MAb(4D2.5)，及抗尾絲三聚體的mAb(2A6.36)得自JeffEngler(University of Alabama at Birmingham，AL)?？刮步z頂球的CAR-封閉型mAb 1D6.14由Buck Rogers(UAB，Birmingham，AL)提供。特異于O-連接的GlcNAc殘基的單克隆抗體RL2通過Jeff Engler得自Larry Gerace?？筸Ab C242的生物素化抗-獨(dú)特型抗體(Id1，Id13和Id20)從原始雜交瘤產(chǎn)生。辣根過氧化物酶(HRP)-標(biāo)記的鏈親和素，異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的兔抗-小鼠免疫球蛋白G和鏈親和素-FITC購(gòu)自DAKO(Glostrup，DK)。
重組無頂球的尾絲的制備和命名。重組尾絲基因用基于連接、PCR、以及經(jīng)由重疊延伸而進(jìn)行的剪接(SOE)的方法來構(gòu)建。PCR所得序列在亞克隆之前進(jìn)行測(cè)序。編碼Ad5 WT尾絲的基因用正向引物(SEQ ID NO48)5′-CTC GGA TCC GAT GAA GCG CGC AAG ACC GTC TGA A-3′和反向引物(SEQ ID NO49)5′-TTC CTC GAG TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA-3′經(jīng)PCR得自pAB26(Microbix，Toronto，Canada)，所用引物在上游引入Bam HI位點(diǎn)，在下游引入XhoI位點(diǎn)。重組尾絲中的頂球區(qū)已被衍生自人肺表面活性蛋白D頸區(qū)肽(NRP)的36個(gè)氨基酸(aa)的外來三聚體化基元替代。將后接葡萄球菌蛋白A之接頭序列(Staph-A接頭AKKLNDAQAPKSD)的NRP序列(PDVASLRQQVAELQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG)(SEQ ID NO2)，連接至具有不同長(zhǎng)度(1，7或22重復(fù)單元)的尾絲莖區(qū)的C-末端。
將所得構(gòu)建體分別命名為R1，R7和R22。在Staph-A接頭的C-末端添加再-靶向配體。為了便于克隆各種配體，在接頭序列之后引入ClaI和XhoI位點(diǎn)。下述所有配體都帶有這些限制性位點(diǎn)，配體的名稱表示在尾絲名稱中莖區(qū)重復(fù)單元數(shù)目之后。例如，R1-RGD，R7-EGF等(圖4)。R7-頂球表示截短型尾絲莖區(qū)(重復(fù)單元1-7)，它含有NRP，Staph-A接頭和天然頂球區(qū)，包括最后一個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元以及莖區(qū)-頂球連接部位(圖4)。在兩種R7-頂球尾絲構(gòu)建體中，在NRP的N-末端側(cè)NheI位點(diǎn)插入額外的接頭。這些接頭來自Ad5 WT尾絲莖區(qū)重復(fù)單元17(L17TTTACAGCTTCAAACAATTCCAAAAAGCTTGAG)和尾絲莖區(qū)重復(fù)單元22(L22 GGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGTGACC)，將它們分別命名為R7-L17-頂球和R7-L22-頂球。尾絲圖示見圖4。
靶向配體。多肽配體。含有RGD或ACDCRGDCFCG(縮寫為RGD4C)基元的雙鏈DNA片段合成為帶有單鏈末端銜接子的互補(bǔ)寡核苷酸，使它們退火在一起。含有莖區(qū)重復(fù)單元22的片段，莖區(qū)-頂球連接部位以及完整頂球通過PCR從WT Ad5尾絲基因獲得。合成、克隆并經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)人EGF的DNA序列。特異于Magel/HLA A1的克隆化單鏈T-細(xì)胞受體(含二硫鍵)得自Reinder Bolhuis。所用scTCR具有Vα-接頭-VβCβ形式。
單克隆抗體。使用了兩種mAb單鏈片段(scFv)。第一種scFv由mAbG250的κ鏈可變區(qū)(或VK)，間隔接頭，重鏈可變區(qū)(或VH)，連接序列(JS)和重鏈恒定區(qū)2(或CH2)組成。MAb G250顯示對(duì)人腎癌細(xì)胞的表面抗原具有高度特異性。
親和體。第二種scFv含有相同的基本結(jié)構(gòu)VK-接頭-JS-VH，并衍生自mAb C242，該抗體與結(jié)直腸癌和胰腺癌反應(yīng)。但是，為了獲得對(duì)所設(shè)計(jì)的靶細(xì)胞更好的選擇性，用產(chǎn)生mAb的雜交瘤細(xì)胞的cDNA作為原始模板，通過SOE制備了C242 scFv-衍生的親和體庫。在VK和VH區(qū)之間插入了一段18個(gè)氨基酸的肽配體(SNN)18，其中S是dA，dG或dC，N是dA，dG，dC或dT。通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞Colo205上進(jìn)行的噬菌體展示而篩選親和體，將序列PPDFVPPAASFPDHSPRG鑒定為肽配體。然后，根據(jù)C242 scFv VK-(PPDFVPPAASFPDHSPRG)-VH的抗原結(jié)合能力，選擇它進(jìn)行下一步工作。
尾絲的細(xì)胞表達(dá)和定位以及配體反應(yīng)性。將編碼重組尾絲的基因克隆至載體pcDNA3.1和pSecTag2(Invitrogen BV，Groningen，Germany)中，以便分別進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞外釋放。用Lipofectamin(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD，USA)按照廠家建議將所述載體轉(zhuǎn)染至Cos7中。如下通過免疫染色評(píng)估具有新的細(xì)胞結(jié)合配體的尾絲的表達(dá)、核轉(zhuǎn)運(yùn)和功能性表達(dá)。將細(xì)胞在Shandon Cytospin2細(xì)胞離心機(jī)中離心至顯微鏡載玻片上，并室溫風(fēng)干過夜。將制劑在3％多聚甲醛的PBS中固定，用0.1％Triton-X100的PBS進(jìn)行透化處理。在PBS中洗滌后，將制劑與第一抗體(抗-尾絲mAb，或抗-配體mAb)于37℃潮濕小室中溫育30分鐘，再在PBS中洗滌，與FITC標(biāo)記的第二抗體于37℃潮濕小室中溫育30分鐘。在PBS中洗滌后，將制劑浸沒在含有50％甘油的PBS中，在配備了相應(yīng)光源和針對(duì)的FITC濾片的Zeiss Axioskop顯微鏡下觀察。
尾絲蛋白的表型分析。將重組尾絲蛋白表達(dá)在用重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中，根據(jù)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析(i)可溶性，(ii)三聚體化作用，(iii)糖基化作用，和(iv)與重組五鄰體基座體內(nèi)裝配，形成五鄰體殼粒。
(i)為了對(duì)可溶性和不溶性重組尾絲級(jí)分進(jìn)行免疫定量，將Sf9在0℃的低滲緩沖液(10mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.5)中裂解，將細(xì)胞裂解物調(diào)整為等滲條件(150mM NaCl在10mM Tris-HCl中，pH7.5)，15,000xg離心10min。然后用抗-尾部的4D2.5mAb作為第一抗體、用[35S]SRL-標(biāo)記的抗-小鼠IgG作為第二抗體(Amersham Pharmacia Biotech；100μCi/ml；5μCi/印跡)通過常規(guī)SDS-PAGE和免疫印跡分析上清和沉淀。(ii)尾絲的寡聚化狀態(tài)借助非變性SDS-PAGE(稱為NDS-PAGE)和常規(guī)的變性SDS-PAGE分析。NDS-PAGE區(qū)別于SDS-PAGE之處在于，電泳前，未將樣品置于SDS樣品緩沖液中煮沸變性。(iii)重組尾絲的糖基化可通過在印跡上與單克隆抗體RL2的免疫反應(yīng)來評(píng)估，也可以用DIG Glycan檢測(cè)試劑盒(Roche)進(jìn)行化學(xué)檢測(cè)。(iv)帶有五鄰體基座的尾絲的裝配通過用兩種重組AcNPV共轉(zhuǎn)染相同的Sf9細(xì)胞來評(píng)估，所述AcNPV之一表達(dá)五鄰體基座，另一表達(dá)尾絲蛋白。
于感染后40小時(shí)的細(xì)胞裂解物中檢測(cè)五鄰體殼粒的存在，并通過天然條件下、低電壓、冷卻過夜的PAGE分析。天然五鄰體、五鄰體基座和尾絲蛋白的免疫定量如上所述進(jìn)行，使用相應(yīng)的第一抗體(抗-五鄰體基座或抗-尾絲)，隨后用[35S]SRL-標(biāo)記的抗-小鼠或抗-兔完整IgG的第二抗體。將印跡暴露于放射性膠片(Hyperfilm beta-max，Amersham Pharmacia Biotech)在610nm，用自動(dòng)顯象密度計(jì)(REP-EDC，Helena Laboratories，Beaumont，TX)對(duì)放射自顯影圖進(jìn)行掃描?；蛘?，將蛋白帶從印跡上切下來，于閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman LS-6500)中測(cè)量放射活性。
在病毒體中拯救重組修飾性尾絲。如上所述在Ad5基因組中拯救重組尾絲。簡(jiǎn)言之，用Spe I和Pac I消化pTG3602產(chǎn)生來自于Ad5基因組的9kb-片段，該片段跨作圖單位(mu)75.4-100并包含WT尾絲基因。質(zhì)粒pTG3602包含以兩個(gè)Pac I位點(diǎn)為界的完整WT Ad5基因組。然后將此75.4-100mu-片段克隆至pBluescript II SK(-)(Stratagene)，在其MCS中添加PacI位點(diǎn)后，得到質(zhì)粒pGAG9。將pGAG9的Sac I-Kpn I 3kb-片段亞克隆至pBluescript IISK(-)。在該3kb-片段中于Nde I位點(diǎn)(位于Ad5尾絲的尾部區(qū)域中)下游創(chuàng)建一個(gè)大的缺失，所缺失的序列被含有Xho I位點(diǎn)的接頭取代。將所得質(zhì)粒pGAG3(它能接收我們的所有尾絲基因構(gòu)建體)插入Nde I和Xho I位點(diǎn)之間。利用在大腸桿菌BJ5183中的同源重組，將插入pGAG3的重組尾絲再引入已用Nhe I消化的pGAG9中。然后，將所得pGAG9用Spe I和Pac I從該載體上切下來，通過粘?？寺》ㄟB接至分離的代表Ad5基因組的左側(cè)節(jié)段的27kb-片段(0-75.5mu)(SuperCos lCosmid Vector Kit和Gigapack III GoldPackagingExtract，Stratagene)。粘粒克隆中正確的重組尾絲的存在，通過PCR以及用Spe I和Hind III進(jìn)行的限制性分析來驗(yàn)證。
為了產(chǎn)生病毒，將重組粘粒基因組用Pac I進(jìn)行限制性處理，然后分離，轉(zhuǎn)染至表達(dá)受體的細(xì)胞，所述受體對(duì)應(yīng)于插入了尾絲的配體。在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染反應(yīng)中，根據(jù)廠家建議，每個(gè)35-mm的孔中添加2μg DNA和3μl FUGEN(Roche)。用攜帶尾絲基因的Ad5基因組轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，所述尾絲基因含有RGD基元或WT尾絲頂球作為配體。在帶有其它配體的尾絲的情況中，用帶有EGF配體的Ad5基因組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，用scFv-C242轉(zhuǎn)染Colo 205細(xì)胞，用scFv-G250轉(zhuǎn)染A75細(xì)胞，用特異于Magel/HLA A1的scTCR轉(zhuǎn)染G43細(xì)胞。同時(shí)進(jìn)行了至少3種不同的轉(zhuǎn)染，每種使用一個(gè)6孔板。用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物，從而確定空斑率。使用特異于每種尾絲構(gòu)建體的引物經(jīng)PCR驗(yàn)證重組尾絲序列。
對(duì)重組尾絲和Ad5病毒體的鑒定細(xì)胞表達(dá)。為了評(píng)估尾絲的表達(dá)用10pfu/細(xì)胞的WT，R7-頂球和R7-RGD病毒感染293細(xì)胞。收獲細(xì)胞，凍融4次，用SDS-PAGE和western印跡分析。使印跡與4D2.5反應(yīng)并用HRP-標(biāo)記的抗-小鼠IgG(DAKO)顯示。
Ad5病毒體的尾絲含量。Ad5病毒體經(jīng)CsCl純化后，如上述用SDS-PAGE和western印跡分析它的尾絲拷貝數(shù)。將丙烯酰胺凝膠中的病毒上樣量，按照對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行病毒滴定所得的感染顆粒(表示為空斑形成單位/ml；PFU/fml)進(jìn)行等量標(biāo)準(zhǔn)化，按照通過蛋白分析(BioRad)測(cè)定的物理顆粒(PP)進(jìn)行等量標(biāo)準(zhǔn)化。PP的數(shù)量通過對(duì)Ad5重組體進(jìn)行SDS-PAGE分析和考馬斯蘭染色來確定，一同電泳的還有一系列牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品(2x crystallized，BioRad)。六鄰體帶的蛋白含量通過在自動(dòng)密度計(jì)(REP-EDC，Helena Laboratories，Beaumont，TX)中掃描，并與BSA標(biāo)準(zhǔn)品泳帶進(jìn)行比較而評(píng)估。樣品中Ad5 PP的數(shù)量按照每個(gè)病毒體2.91×10e-16g的質(zhì)量(也就是每10e+13個(gè)病毒體2.91mg)來計(jì)算。感染指數(shù)代表了感染性顆粒相對(duì)于物理(physical)顆粒的比率。
重組Ad5的生長(zhǎng)速率。通過在293細(xì)胞中產(chǎn)生空斑來測(cè)量生長(zhǎng)速率。在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中，于37℃1小時(shí)將病毒的PBS液吸附至細(xì)胞單層(4×104細(xì)胞/樣品)。洗滌細(xì)胞，進(jìn)一步與添加了10％FCS和50mg/ml慶大霉素的Iscove培養(yǎng)基于37℃溫育。于感染后(pi)24，48和72h之時(shí)收獲細(xì)胞，離心，溶于0.2ml PBS中，凍融4次。將上清在293細(xì)胞上滴定，將滴度表示為空斑形成單位/ml。Ad蛋白總含量用IDEATM腺病毒試劑盒(DAK0)測(cè)量。
基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效力。如上所述用10pfu/細(xì)胞的重組病毒感染24孔板上的293細(xì)胞。24hpi收獲細(xì)胞，用冰冷卻的PBS洗滌，隨后在0.5％戊二醛中固定15min。在PBS中洗三次后，用FACScan cytometer中的FL1發(fā)射通道(emission channel)(Becton-Dickinson，San Jose，CA)，分析細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因GFP的表達(dá)。
對(duì)病毒衣殼中尾絲頂球的分析。病毒體中可接近的頂球的存在與否通過ELISA分析。將純化的病毒體用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液pH9.6稀釋至終濃度為5×105PFU/ml。取100ml等份試樣吸附至ELISA平板上，4℃過夜。將吸附在孔中的材料用0.5％戊二醛固定，然后用含有0.1％Tween-20的PBS(洗滌緩沖液)洗滌，用200ml含有1％BSA的PBS封閉2h。然后在洗滌緩沖液中將孔洗3次，并于室溫下與100ml濃度為1mg/ml的生物素化抗-頂球mAb 1D6.14溫育1h。結(jié)合的抗體用1∶2,000稀釋的HRP-鏈親和素(DAKO)室溫作用1h來檢測(cè)。用TMB底物(CanAg Diagnostics，Goteborg，Sweden)顯色，用0.12M HCl作用10min以便終止反應(yīng)。在設(shè)定為450nm的微滴板讀板儀上讀數(shù)。
構(gòu)建重組尾絲的原理構(gòu)建帶有外源三聚體化基元(NRP，來自人肺表面活性蛋白D)的無頂球尾絲，它們具有不同數(shù)量的莖區(qū)重復(fù)單元和不同的配體結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)和功能的角度看，這些尾絲構(gòu)建體的三種組成型元件應(yīng)該是(i)尾絲支架，(ii)彈性接頭，和(iii)細(xì)胞配體。
尾絲支架。尾絲根據(jù)其莖區(qū)重復(fù)單元的數(shù)目以及配體來命名。例如，R7-EGF含有尾絲尾部，7個(gè)N-末端莖區(qū)重復(fù)單元，NRP基元，以C-末端EGF肽作為細(xì)胞配體。R1-RGD尾絲僅含有1個(gè)(第1個(gè))莖區(qū)重復(fù)單元，以RGD為配體。在三種可能的莖區(qū)長(zhǎng)度，即短單元(1個(gè)重復(fù))、中長(zhǎng)單元(7個(gè)重復(fù))和長(zhǎng)單元(22個(gè)重復(fù))中，選擇帶有7個(gè)重復(fù)單元的中等大小尾絲作為進(jìn)一步構(gòu)建并研究不同配體的支架?；谝韵略?，對(duì)R7的選擇是基于它作為重組蛋白具有高溶解度，能保留尾絲的絕大部分生物學(xué)功能，并能產(chǎn)生Ad5/FibR7病毒后代。用R1-RGD，R7-RGD和R22-RGD尾絲研究了不同長(zhǎng)度的尾絲莖區(qū)的相對(duì)優(yōu)勢(shì)，這三種構(gòu)建體都攜帶相同的細(xì)胞配體RGD。
接頭。為了評(píng)估尾絲莖區(qū)中額外的接頭的可能優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了兩種R7-NRP-頂球尾絲，它們?cè)谇o區(qū)和NRP基元之間插入了一個(gè)額外的肽接頭。據(jù)此檢驗(yàn)了兩種衍生自病毒的接頭，Ad5莖區(qū)重復(fù)單元17(L17)和Ad5莖區(qū)重復(fù)單元22(L22)。所得重組尾絲分別命名為R7-L17-頂球和R7-L22-頂球。
細(xì)胞配體。檢驗(yàn)了數(shù)種配體并比較了它們的功能。這些配體被設(shè)計(jì)成能將Ad5載體再靶向分布廣泛的細(xì)胞表面分子，如整聯(lián)蛋白或HLA分子，或再靶向分布不那么廣泛的分子，如惡性細(xì)胞特異性決定簇。它們?cè)诖笮『蛷?fù)雜性方面各不相同，從單個(gè)三肽基元(如RGD)到較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)(如scTR或scFv，它們由多個(gè)需要正確折疊的多肽結(jié)構(gòu)域組成)。
尾絲和配體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。首先，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使重組尾絲在其中瞬時(shí)表達(dá)。重組尾絲由兩種不同載體表達(dá)，一種被設(shè)計(jì)為在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白，另一種被設(shè)計(jì)為經(jīng)由分泌途徑使重組蛋白釋放至細(xì)胞外。分析細(xì)胞中的尾絲表達(dá)水平、細(xì)胞定位及其配體的功能。所檢驗(yàn)的所有不同尾絲，當(dāng)以分泌蛋白的形式收獲時(shí)，均表現(xiàn)出與相應(yīng)配體的明顯結(jié)合。至于由細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體合成的尾絲，在除了R7-L22-頂球以外的所有情況中都觀察到核定位。這暗示，修飾的尾絲象WT Ad5尾絲一樣有效地發(fā)生了胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和跨核孔過程。
但是，沒有一種與尾絲融合的外源配體顯示出預(yù)期的結(jié)合活性?？梢栽诤藘?nèi)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的R7-scTCR尾絲，并可以用識(shí)別不依賴Va區(qū)構(gòu)象的表位的抗-Va mAb對(duì)其染色，但用另一種依賴于構(gòu)象的抗Vb區(qū)mAb檢測(cè)不到染色。為了檢測(cè)尾絲結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞內(nèi)配體反應(yīng)性的可能的不利影響，還從載體pcDNA表達(dá)了我們的配體，為另外的構(gòu)建體。非融合的細(xì)胞內(nèi)配體與它們的特異性mAb之間未檢測(cè)到結(jié)合，表明游離的或與尾絲融合的配體有相似的行為。
被設(shè)計(jì)為分泌的以及被設(shè)計(jì)為胞質(zhì)表達(dá)的尾絲-配體融合體之間存在結(jié)合能力的較大差異。這提示，被設(shè)計(jì)為經(jīng)歷分泌途徑的尾絲-配體融合蛋白發(fā)生了正確折疊，表現(xiàn)出正確構(gòu)象。這并不暗示，所有的細(xì)胞內(nèi)尾絲-配體融合蛋白都不能正確折疊，因?yàn)榧?xì)胞環(huán)境似乎也在該過程中起作用。在Cos7和Sf9細(xì)胞中，可以檢測(cè)到尾絲-配體融合蛋白的折疊模式和反應(yīng)性有顯著性差異。對(duì)于R7-L22-頂球的尾絲頂球結(jié)構(gòu)域，R7-EGF的EGF配體，以及R7-G250(顯示出在Sf9細(xì)胞中具有一定的反應(yīng)性，但在Cos7細(xì)胞中沒有反應(yīng)性)的scFV配體而言，情況便是如此。
昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組尾絲的表型。為了進(jìn)一步分析帶有配體的尾絲的特性，將我們的不同構(gòu)建體在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)為重組蛋白，并分析了在Sf9細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的可溶性、三聚體化、糖基化以及通過與五鄰體基座發(fā)生體內(nèi)裝配形成五鄰體的情況。
蛋白的可溶性和構(gòu)象。重組蛋白的可溶性提出被認(rèn)為可以很好地指示它們的正確折疊。我們因此檢測(cè)了我們的所有重組尾絲蛋白在昆蟲細(xì)胞中的總表達(dá)，并確定了回收在細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分中的比例。所有所述尾絲重組體都在Sf9細(xì)胞中高水平表達(dá)，其水平與WT Ad5尾絲類似，但它們相互間的可溶性程度有顯著差異。我們估計(jì)，當(dāng)可溶性級(jí)分含有所表達(dá)的尾絲總量的50％上時(shí)，尾絲具有類似于WT的可溶性并因此能正確折疊。當(dāng)尾絲的可溶性級(jí)分占總量的不足20％時(shí)，可以認(rèn)為它錯(cuò)誤折疊。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，WT、R7-頂球、R7-L17-頂球、R7-L22-頂球、R1-RGD，R7-RGD和R7-RGD4C尾絲主要回收在可溶性級(jí)分中(60-95％可溶性)。相比之下，僅22％的R22-RGD和不到15％的R7-EGF，R7-C242及R7-scTCR尾絲被發(fā)現(xiàn)可溶，證實(shí)它們的、通過不能與其相應(yīng)mAb反應(yīng)而提示的非正確折疊。可溶性最差的尾絲構(gòu)建體是R7-G250，其有95％回收在不溶性級(jí)分中(參見圖5和以下表7)。
表7.對(duì)桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中表達(dá)重組尾絲的表型鑒定(a)三聚體化(b)尾絲 糖基化 NDS-PAGEIF與五鄰體基 可溶性座裝配(c) (d)(％)WT + + + + 60R7-頂球+ + + + 72R7-L17-頂球+ + + + 70R7-L22-頂球+ + + + 75R1-RGD - - + + 89R7-RGD - + + + 94R22-RGD- + + + 22R7-RGD4C + + + + 78R7-EGF - ND(e) + ND13R7-C242- ND - ND11R7-G250- ND - ND5R7-scTCR - ND + ND12(a)桿狀病毒感染48小時(shí)后收獲Sf9細(xì)胞，分析重組尾絲的不同生物學(xué)功能，可溶性，O-GlcNAc糖基化，三聚體化，以及五鄰體殼粒的形成。
(b)測(cè)定尾絲的三聚體化狀態(tài)，方法是體外不經(jīng)熱變性而使得Sf9細(xì)胞的裂解物在SDS-凝膠中電泳(NDS-PAGE)，以及用抗-三聚體mAb(2A6.36)對(duì)已被固定的細(xì)胞進(jìn)行原位免疫熒光染色。
(c)尾絲與五鄰體基座裝配而形成五鄰體殼粒的能力，通過用兩種不同的重組桿狀病毒共轉(zhuǎn)染相同的Sf9細(xì)胞來分析，所述重組病毒，一種表達(dá)Ad尾絲，另一種表達(dá)Ad五鄰體基座。共感染48h后，分析Sf9細(xì)胞裂解物中五鄰體(基座+尾絲)的出現(xiàn)，方法是使天然蛋白在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳(Karayan等，1994)。
(d)分析單個(gè)被桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中的可溶性。將感染48h后收獲的細(xì)胞在等滲緩沖液中裂解，將細(xì)胞裂解物分成兩個(gè)等份。其一于10,000xg離心10min并保留上清，另一作為全細(xì)胞裂解物來分析。兩等份均在100℃的SDS-樣品緩沖液中變性，在變性的SDS-凝膠中電泳，并印跡。使印跡與抗-尾絲-尾部的mAb 4D2.5、放射性標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，如圖5所示。免疫印跡通過放射性自顯影掃描來定量，結(jié)果表示為可溶性尾絲相對(duì)于總尾絲含量的百分比。取三次測(cè)定的平均值，SD取報(bào)道值均值(mean)的15％以內(nèi)。
(e)ND，無法檢測(cè)。
三聚體化。不同尾絲自我裝配成三聚體的能力，通過在體外對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行NDS-PAGE電泳分析，以及對(duì)已被固定的細(xì)胞進(jìn)行原位免疫熒光染色而確定。根據(jù)它們的電泳模式，R7-EGF、R7-C242、R7-G250和R7-scTCR不能形成同型三聚體，而R7-頂球、R7-L17-頂球、R7-L22-頂球、R7-RGD，R22-RGD和R7-RGD4C以WT的水平三聚體化(表7)。但是，用抗-三聚體mAb 2A6.36對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的免疫熒光染色顯示，除了R7-C242和R7-G250以外的所有尾絲都形成三聚體(表7)。這種明顯差異可能是由于檢測(cè)方法的不同，和/或是由于R7-EGF，R7-C242，R7-G250和R7-scTCR尾絲三聚體在體外有可能變得不穩(wěn)定。不管是什么原因，如果細(xì)胞內(nèi)形成的尾絲三聚體效力極低，這種情況下，免疫熒光染色將更敏感，也更適于檢測(cè)三聚體。
糖基化。同樣的，尾絲的糖基化用RL2(特異于肽-連接的O-GlcNAc殘基的mAb)經(jīng)western印跡來分析。能夠與之反應(yīng)的尾絲構(gòu)建體除了WT，還有R7-L17-頂球、R7-L22-頂球、R7-頂球、和R7-RGD4C(表7)。
與五鄰體基座的裝配。當(dāng)用表達(dá)Ad尾絲和表達(dá)五鄰體基座的兩種不同桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞時(shí)，這兩種蛋白能在細(xì)胞內(nèi)相互作用，形成五鄰體殼粒。當(dāng)分析這一特性時(shí)，蛋白R(shí)7-EGF，R7-C242，R7-G250和R7-scTCR失去了它們與五鄰體基座裝配的能力，而其它8種重組尾絲保留了它們的裝配功能(表7)。
重組尾絲基因在病毒基因組中的拯救以及病毒的生存力。將我們的重組尾絲基因再插入Ad5病毒基因組中以替代WT尾絲基因。然后通過轉(zhuǎn)染將每種重組病毒基因組引入表達(dá)該重組尾絲的特有受體的相應(yīng)細(xì)胞系。有活力的重組病毒的拯救通過空斑形成來評(píng)估。攜帶WT尾絲、以及重組尾絲R7-頂球、R7-L17-頂球、R1-RGD，R7-RGD和R7-RGD4C的Ad5基因組都觀察到了空斑。
重組病毒的尾絲含量、感染力和生長(zhǎng)速率。在尾絲三聚體化、穩(wěn)定性、與五鄰體基座的裝配以及配體結(jié)合方面最合適的是攜帶7個(gè)莖區(qū)重復(fù)單元的重組R7-RGD Ad，將其選出。但這種無頂球的Ad的病毒裝配和生成不如WT病毒。在本實(shí)施例中，將攜帶頂球結(jié)構(gòu)域的Ad-R7-頂球與WT Ad和無頂球的Ad-R7-RGD進(jìn)行特性比較。我們首先分析了用這三種Ad中的每一種感染293細(xì)胞，于感染后(pi)不同時(shí)間點(diǎn)尾絲蛋白的生成。R7-頂球Ad的尾絲蛋白的生成水平與WT Ad的相當(dāng)，R7-RGD Ad的水平則低很多。
我們?nèi)缓蟊容^了R7-頂球Ad與WT Ad的每個(gè)病毒體的尾絲含量。當(dāng)根據(jù)物理顆粒(PP)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，兩種病毒顯示出相似的尾絲含量，但是當(dāng)將兩種病毒樣品按照感染性顆粒數(shù)(PFU)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，R7-頂球Ad的尾絲蛋白相對(duì)較多。這表明，R7-頂球Ad比WT感染力小。這一點(diǎn)通過感染力指數(shù)(PFU∶PP)得到證實(shí)，該指數(shù)可從感染滴度(表達(dá)為PFU/ml，通過在293細(xì)胞上進(jìn)行的滴定來確定)和PP濃度(通過生物化學(xué)方法確定)來計(jì)算。Ad-R7-頂球的感染力指數(shù)(1∶100-1∶200)比WT Ad5(1∶25-1∶50)低2-8倍。Ad-R7-RGD的感染力指數(shù)(1∶200-1∶500)在類似于Ad-R7-頂球的范圍內(nèi)。
比較Ad-R7-頂球與WT病毒的生長(zhǎng)速率。以相同的MOI感染等份的細(xì)胞樣品，通過在293細(xì)胞上進(jìn)行的空斑試驗(yàn)測(cè)定感染性病毒后代。三種病毒的生長(zhǎng)曲線相似，但感染性Ad R7-頂球和Ad-R7-RGD的產(chǎn)生次于WT。還檢測(cè)了Ad-R7-頂球的病毒攝取，并評(píng)估了它將GFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至293細(xì)胞的能力，與攜帶Ad5-GFP的WT尾絲(Ad-WTFib)進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R7-頂球Ad的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力/PP比Ad-WTFib的低6倍。
重組病毒體的受體-結(jié)合能力。分析Ad-FibR7-頂球相對(duì)于WT病毒的受體結(jié)合能力。發(fā)現(xiàn)WT Ad5和Ad-FibR7-頂球病毒體在ELISA中都與抗-頂球mAb反應(yīng)，表明這兩種病毒體表面的頂球表位都易于被mAb接近。但WTAd的頂球免疫反應(yīng)性高于Ad-FibR7-knob的。這提示，頂球由22-莖區(qū)-重復(fù)單元型尾絲攜帶(如在WT Ad5中)相比于由較短者(7-重復(fù)單元型尾絲)攜帶的情況，病毒體的細(xì)胞結(jié)合決定簇更有效和/或具有更高親和力。
這些結(jié)果表明，所有在胞質(zhì)溶膠和核中不正確折疊的配體具有高度依賴于二硫橋的形成的構(gòu)象。因此，應(yīng)該使用它們的缺乏二硫橋但保留了天然或修飾型表位結(jié)合的抗體或片段。
莖區(qū)部分的重復(fù)單元的數(shù)目?jī)?yōu)選至少約為7，例如6-12。野生型頂球(例如，為兩種尾絲蛋白之一，其中第二種已經(jīng)被修飾，以便再靶向)的存在可能有利于產(chǎn)生重組、有活力的Ad病毒體。
序列表序列表[SEQ.ID.NO.1]-腺病毒5的尾絲蛋白的編碼序列序列范圍1至174610 20 30 40 50atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccatatacttcgcgc gttctggcag acttctatgg aagttggggc acataggtat60 70 80 90100tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttgactgtgcctt tggccaggag gttgacacgg aaaagaatga ggagggaaac110120130140150tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgcatagggggtt acccaaagtt ctctcagggg gaccccatga gagaaacgcg160170180190200ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc atgcttgcgc tcaaaatggggataggcttg gagatcaatg gaggttaccg tacgaacgcg agttttaccc210220230240250caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc caaaatgtaagttgccggag agagacctgc tccggccgtt ggaatggagg gttttacatt260270280290300ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaaggtgacactc gggtggagag tttttttggt tcagtttgta tttggacctt310320330340350atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgctatagacgtg gggagtgtca atggagtctt cgggattgac accgacggcg360370380390400cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggcccgcgtggagat taccagcgcc cgttgtgtga gtggtacgtt agtgtccggg410420430440450cgctaaccgt gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctcgcgattggca cgtgctgagg tttgaatcgt aacggtgggt tcctggggag460470480490500acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa acatcaggcc ccctcaccactgtcacagtc ttcctttcga tcgggacgtt tgtagtccgg gggagtggtg510520530540550caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct ctaactactggtggctatcg tcatgggaat gatagtgacg gagtggggga gattgatgac560570580590600ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaatggtgaccatc gaacccgtaa ctgaactttc tcgggtaaat atgtgtttta610620630640650ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacctccttttgatc ctgatttcat gccccgagga aacgtacatt gtctgctgga660670680690700aaacactttg accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactttttgtgaaac tggcatcgtt gaccaggtcc acactgataa ttattatgaa710720730740750ccttgcaaac taaagttact ggagccttgg gttttgattc acaaggcaatggaacgtttg atttcaatga cctcggaacc caaaactaag tgttccgtta760770780790800atgcaactta atgtagcagg aggactaagg attgattctc aaaacagacgtacgttgaat tacatcgtcc tcctgattcc taactaagag ttttgtctgc810820830840850ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac caactaaatcggaatatgaa ctacaatcaa taggcaaact acgagttttg gttgatttag
860870880890900taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggatattctgatcc tgtcccggga gaaaaatatt tgagtcgggt gttgaaccta910920930940950attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaataattgatgt tgtttccgga aatgaacaaa tgtcgaagtt tgttaaggtt960970980990 1000aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgctatttcgaactc caattggatt cgtgacggtt ccccaactac aaactgcgat1010 1020 1030 1040 1050cagccatagc cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaatgtcggtatcg gtaattacgt cctctacccg aacttaaacc aagtggatta1060 1070 1080 1090 1100gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa attggccatg gcctagaattcgtggtttgt gtttagggga gttttgtttt taaccggtac cggatcttaa1110 1120 1130 1140 1150tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc cttagttttgactaagtttg ttccgatacc aaggatttga tccttgaccg gaatcaaaac1160 1170 1180 1190 1200acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaacttgtcgtgtcc acggtaatgt catcctttgt ttttattact attcgattga1210 1220 1230 1240 1250ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaaaacacctggt gtggtcgagg tagaggattg acatctgatt tacgtctctt1260 1270 1280 1290 1300agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttgtctacgattt gagtgaaacc agaattgttt tacaccgtca gtttatgaac1310 1320 1330 13401350ctacagtttc agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctggagatgtcaaag tcaaaaccga caatttccgt caaaccgagg ttatagacct1360 1370 1380 1390 1400acagttcaaa gtgctcatct tattataaga tttgacgaaa atggagtgcttgtcaagttt cacgagtaga ataatattct aaactgcttt tacctcacga1410 1420 1430 1440 1450actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt agaaatggagtgatttgtta aggaaggacc tgggtcttat aaccttgaaa tctttacctc1460 1470 1480 1490 1500atcttactga aggcacagcc tatacaaacg gtgttggatt tatgcctaactagaatgact tccgtgtcgg atatgtttgc cacaacctaa atacggattg1510 1520 1530 1540 1550ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgtgatagtcgaa taggttttag agtgccattt tgacggtttt cattgtaaca1560 1570 1580 1590 1600cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaaccagtcagttcaa atgaatttgc ctctgttttg atttggacat tgtgattggt1610 1620 1630 1640 1650ttacactaaa cggtacacag gaaacaggag acacaactcc aagtgcatacaatgtgattt gccatgtgtc ctttgtcctc tgtgttgagg ttcacgtatg1660 1670 1680 1690 1700tctatgtcat tttcatggga ctggtctggc cacaactaca ttaatgaaatagatacagta aaagtaccct gaccagaccg gtgttgatgt aattacttta1710 1720 1730 1740atttgccaca tcctcttaca ctttttcata cattgcccaa gaataataaacggtgt aggagaatgt gaaaaagtat gtaacgggtt cttatt[SEQ.ID.NO.2]-人肺表面活性物質(zhì)蛋白D的頸區(qū)PDVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKKVELFPNG[SEQ.ID.NO.3]-重組尾絲A1gaattcg atg aag cgc gca aga ccg tct gaa gat acc ttc aac ccc gtg tatcca tat gac acg gaa acc ggt cct cca act gtg cct ttt ctt act cct cccttt gta tcc ccc aat ggg ttt caa gag agt ccc cct ggg gta ctc tct ttgcgc cta tcc gaa cct cta gtt acc tcc aat ggc atg cct gac gta gca agctta cga caa cag gta gaa gcc ttg caa ggg cag gta caa cac tta cag gcggca ttt agc caa tac aaa aag gta gag ttg ttt cca aac gga gcc aag aagctg aac gac gcc cag gcc ccc aag agc gac cca tcg atc taa ctc gag[SEQ.ID.NO.4]-人的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)序列范圍1至18310 20 30 40 50gggaattcat gaactccgac tccgaatgtc cattgtccca cgacggttaccccttaagta cttgaggctg aggcttacag gtaacagggt gctgccaatgM N S D S E C P L S H D G Y>
60 70 80 90100tgtttgcacg acggtgtttg tatgtacatc gaagctttgg acaagtacgcacaaacgtgc tgccacaaac atacatgtag cttcgaaacc tgttcatgcgC L H D G V C M Y I E A L D K Y A>
110120130140150ttgtaactgt gttgttggtt acatcggtga aagatgtcaa tacagagactaacattgaca caacaaccaa tgtagccact ttctacagtt atgtctctgaC N C V V G Y I G E R C Q Y R D>
160170180tgaagtggtg ggaattgaga tgataagaat tccacttcaccac ccttaactct actattctta aggL K W W E L R *>[SEQ.ID.NO.5]-葡萄球菌蛋白A的氨基酸接頭序列范圍1至3910 20 30gccaagaagc tgaacgacgc ccaggccccc aagagcgaccggttcttcg acttgctgcg ggtccggggg ttctcgctgA K K L N D A Q A P K S D>
＿＿＿＿_(dá)_a＿＿_(dá)SPA 48-60＿＿＿a＿＿＿＿_(dá)[SEQ.ID.NO.6]-尾絲構(gòu)建體A1 EGF序列范圍1至51310 20 30 40 50atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccatatacttcgcgc gttctggcag acttctatgg aagttggggc acataggtatM K R A R P S E D T F N P V Y P Y>
＿＿＿＿_(dá)_b＿＿＿＿＿b＿ 尾＿＿_(dá)b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿_(dá)_>
60 70 80 90100tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttgactgtgcctt tggccaggag gttgacacgg aaaagaatga ggagggaaacD T E T G P P T V P F L T P P F>
＿＿＿＿_(dá)_b＿＿＿＿＿b＿＿ 尾 ＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
110120130140150tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgcatagggggtt acccaaagtt ctctcagggg gaccccatga gagaaacgcgL S L R>
＿a＿＿＿＿＿>V S P N G F Q E S P P G V>＿＿＿＿＿b＿＿＿ 尾 ＿＿＿＿＿b＿＿＿＿>
160170180190200ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc atgcctgacg tagcaagcttgataggcttg gagatcaatg gaggttaccg tacggactgc atcgttcgaaL S E P L V T S N G M>＿＿＿＿＿a＿＿R1-_＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)>
P D V A S L>
＿＿＿_(dá)肺表面活性物質(zhì)＿＿＿_(dá)>
210220230240250acgacaacag gtagaagcct tgcaagggca ggtacaacac ttacaggcggtgctgttgtc catcttcgga acgttcccgt ccatgttgtg aatgtccgccR Q Q V E A L Q G Q V Q H L Q A>＿＿＿＿＿＿＿＿_(dá)肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM＿c＿＿＿＿＿＿>
260270280290300catttagcca atacaaaaag gtagagttgt ttccaaacgg agccaagaaggtaaatcggt tatgtttttc catctcaaca aaggtttgcc tcggttcttcA F S Q Y K K V E L F P N G>＿＿＿＿＿＿_(dá)_肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM＿＿_(dá)c_>
A K K>
＿＿＿＿_(dá)>
>Cla1|310320330 |340350ctgaacgacg cccaggcccc caagagcgac ccatcgatca tgaactccgagacttgctgc gggtccgggg gttctcgctg ggtagctagt acttgaggctM N S D>
_d＿＿＿＿＿>L N D A Q A P K S D>＿＿＿＿＿＿SPA 48-60_e＿＿＿＿＿>
P S I>
＿＿＿＿＿>
360370380390400ctccgaatgt ccattgtccc acgacggtta ctgtttgcac gacggtgtttgaggcttaca ggtaacaggg tgctgccaat gacaaacgtg ctgccacaaaS E C P L S H D G Y C L H D G V>
＿＿＿＿＿＿＿＿表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ST＿＿_(dá)>
410420430440450gtatgtacat cgaagctttg gacaagtacg cttgtaactg tgttgttggtcatacatgta gcttcgaaac ctgttcatgc gaacattgac acaacaaccaC M Y I E A L D K Y A C N C V V G>
＿＿＿＿＿＿＿_(dá)_表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ST＿＿_(dá)>
460470480490500tacatcggtg aaagatgtca atacagagac ttgaagtggt gggaattgagatgtagccac tttctacagt tatgtctctg aacttcacca cccttaactcY I G E R C Q Y R D L K W W E L R>
＿＿＿＿＿＿＿_(dá)_表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ ST ＿＿>
>xho1|| 510atgactcgag gggtactgagctc cccX>
＿＿>[SEQ.ID.NO.7]-尾絲構(gòu)建體A7 EGF序列范圍1至811>EcoR1||1020304050gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgtcttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcacaM>
＿＿>
M K R A R P S E D T F N P V>
＿＿j＿＿＿＿＿j＿＿＿ 尾 ＿＿＿＿＿_(dá)j＿＿＿＿_(dá)_>
60 70 80 90100atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactccttaggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgaggaY P Y D T E T G P P T V P F L T P>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_(dá) 尾 ＿_(dá)j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
110120130140150ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctcgggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagagL S>
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160170180190200tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctcaaaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagtL A L>
＿＿＿＿＿>L R L S E P L V T S N G M>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿_(dá)重復(fù)單元1_＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿＿>
210220230240250aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaatttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggttL T S Q>
＿f＿＿＿＿＿>K M G N G L S L D E A G N>＿＿＿＿＿g＿＿_(dá)重復(fù)單元2_＿＿＿g_＿＿＿_(dá)>
260270280290300aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaattacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtatttI N>
＿＿_(dá)>N V T T V S P P L K K T K S N>＿＿＿＿＿f＿＿＿_(dá)_重復(fù)單元3＿_(dá)_f＿＿＿＿_(dá)_f_＿＿>
310320330340350cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtggggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacaccL T V>
＿＿＿＿＿>L E I S A P L T V T S E A>＿＿＿＿_(dá)_e＿＿＿_(dá)重復(fù)單元4_＿_(dá)_e___＿＿＿_(dá)>
360370380390400ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatcagacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagtL T M Q S>
＿重復(fù)單元6＿＿_(dá)>A A A A P L M V A G N T>＿＿＿＿_(dá)_d＿_(dá)重復(fù)單元5＿＿＿＿_(dá)d＿＿_(dá)>
410420430440450caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagggtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttccL S I A T Q G>
＿_(dá)__重復(fù)單元7＿＿＿_(dá)>Q A P L T V H D S K>＿＿＿＿＿重復(fù)單元6＿c＿＿_(dá)_____>
460470480490500acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttactggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatg
L A>
＿_(dá)_a_>P L T V S E G K>＿＿＿_(dá)＿重復(fù)單元7＿_(dá)_b＿＿>
P D V A S L>
＿_(dá)肺表面活性物質(zhì)＿_(dá)>
510520530540550gacaacaggt agaagccttg caagggcagg tacaacactt acaggcggcactgttgtcca tcttcggaac gttcccgtcc atgttgtgaa tgtccgccgtR Q Q V E A L Q G Q V Q H L Q A A>＿＿_(dá)_______＿＿＿肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM_k＿＿＿＿_(dá)_>
560570580590600tttagccaat acaaaaaggt agagttgttt ccaaacggag ccaagaagctaaatcggtta tgtttttcca tctcaacaaa ggtttgcctc ggttcttcgaF S Q Y K K V E L F P N G>＿＿＿＿＿_(dá)_肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM＿＿＿>
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>Cla1|610620630 | 640650gaacgacgcc caggccccca agagcgaccc atcgatcatg aactccgactcttgctgcgg gtccgggggt tctcgctggg tagctagtac ttgaggctgaM N S D>
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660670680690700ccgaatgtcc attgtcccac gacggttact gtttgcacga cggtgtttgtggcttacagg taacagggtg ctgccaatga caaacgtgct gccacaaaca
S E C P L S H D G Y C L H D G V C>
＿＿＿＿＿＿＿＿_(dá)表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ST＿_(dá)_>
710720730740750atgtacatcg aagctttgga caagtacgct tgtaactgtg ttgttggttatacatgtagc ttcgaaacct gttcatgcga acattgacac aacaaccaatM Y I E A L D K Y A C N C V V G Y>
＿＿＿＿＿＿＿_(dá)表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ST ＿＿_(dá)>
760770780790800catcggtgaa agatgtcaat acagagactt gaagtggtgg gaattgagatgtagccactt tctacagtta tgtctctgaa cttcaccacc cttaactctaI G E R C Q Y R D L K W W E L E>
＿＿＿＿＿＿＿_(dá)_表皮生長(zhǎng)因子(尿抑胃素)；密碼子_ST＿＿_(dá)>
>xh01||810gactcgaggg gctgagctccc cX>
_>[SEQ.ID.NO.8]-G250構(gòu)建體序列范圍1至105610 20 30 40 50gacattgtga tgacccagtc tcaaagattc atgtccacaa cagtaggagactgtaacact actgggtcag agtttctaag tacaggtgtt gtcatcctctD I V M T Q S Q R F M S T T V G D>
＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
60 70 80 90100cagggtcagc atcacctgca aggccagtca gaatgtggtt tctgctgttggtcccagtcg tagtggacgt tccggtcagt cttacaccaa agacgacaacR V S I T C K A S Q N V V S A V>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
110120 130 140150cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttactcaggaccatagt tgtctttggt cctgttagag gatttgatga ctaaatgagtA W Y Q Q K P G Q S P K L L I Y S>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
160170180190200gcatccaatc ggtacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatccgtaggttag ccatgtgacc tcagggacta gcgaagtgtc cgtcacctagA S N R Y T G V P D R F T G S G S>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
210220230240250tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tatgcagtct gaagacctggaccctgtcta aagtgagagt ggtaatcgtt atacgtcaga cttctggaccG T D F T L T I S N M Q S E D L>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
260270280290300ctgatttttt ctgtcaacaa tatagcaact atccgtggac gttcggtggagactaaaaaa gacagttgtt atatcgttga taggcacctg caagccacctA D F F C Q Q Y S N Y P W T F G G>＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿c＿_(dá)VK＿＿_(dá)c＿＿＿＿＿c＿＿＿＿＿>
310320330340350ggcaccaagc tggaaatcaa aggatctggc tctacttccg gtagcggcaaccgtggttcg acctttagtt tcctagaccg agatgaaggc catcgccgttG T K L E I K>＿＿＿＿＿VK＿＿＿＿_(dá)c_>
G S G S T S G S G K>
＿＿＿＿d＿_(dá)連接＿_(dá)d＿＿＿＿＿>
360370380390400atcctctgaa ggcaaaggta ctagagacgt gaagctcgtg gagtctggggtaggagactt ccgtttccat gatctctgca cttcgagcac ctcagaccccD V K L V E S G>
＿＿_(dá)a＿＿＿VH＿a＿＿＿＿＿>S S E G K G T R>＿＿＿＿＿_(dá)連接＿＿＿d＿＿＿>
410420430440450gaggcttagt gaagcttgga gggtccctga aactctcctg tgcagcctctctccgaatca cttcgaacct cccagggact ttgagaggac acgtcggagaG G L V K L G G S L K L S C A A S>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
460470480490500ggattcactt tcagtaacta ttacatgtct tgggttcgcc agactccagacctaagtgaa agtcattgat aatgtacaga acccaagcgg tctgaggtctG F T F S N Y Y M S W V R Q T P E>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
510520530540550gaagaggctg gagttggtcg cagccattaa tagtgatggt ggtatcacctcttctccgac ctcaaccagc gtcggtaatt atcactacca ccatagtggaK R L E L V A A I N S D G G I T>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
560570580590600actatctaga cactgtgaag ggccgattca ccatttcaag agacaatgcctgatagatct gtgacacttc ccggctaagt ggtaaagttc tctgttacggY Y L D T V K G R F T I S R D N A>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
610620630640650aagaacaccc tgtacctgca aatgagcagt ctgaagtctg aggacacagcttcttgtggg acatggacgt ttactcgtca gacttcagac tcctgtgtcgK N T L Y L Q M S S L K S E D T A>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
660670680690700cttgttttac tgtgcaagac accgctcggg ctacttttct atggactactgaacaaaatg acacgttctg tggcgagccc gatgaaaaga tacctgatgaL F Y C A R H R S G Y F S M D Y>＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿a＿_(dá)VH＿＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿＿＿＿＿>
710720730740750ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct catgcccacc gtgcccagcaccccagttcc ttggagtcag tggcagagga gtacgggtgg cacgggtcgtW G Q G T S V T V S S>＿＿＿＿＿a＿＿_(dá)VH＿_(dá)a＿＿＿＿＿a＿>
A>
＿_(dá)>
C P P C P>
＿＿_(dá)_鉸鏈＿＿_(dá)_>
760770780790800cctgaactcc tagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaaggacttgagg atccccctgg cagtcagaag gagaaggggg gttttgggttP E L L G G P S V F L F P P K P K>＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_(dá)CH2＿＿_(dá)b_＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
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860870880890900acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggctgcactcggt gcttctggga ctccagttca agttgaccat gcacctgccgD V S H E D P E V K F N W Y V D G>
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960970980990 1000cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctgagtgcatggcc caccagtcgc aggagtggca ggacgtggtc ctgaccgactT Y R V V S V L T V L H Q D W L>
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1010 1020 1030 1040 1050atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccctaccgttcct catgttcacg ttccagaggt tgtttcggga gggtcgggggN G K E Y K C K V S N K A L P A P>
＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿b＿_(dá)CH2＿＿b＿＿＿＿＿b＿＿＿＿＿>
atcgagtagctcI E>
＿＿＿>[SEQ.ID.NO.9]-C242構(gòu)建體序列范圍1至793>Sfi >EcoR1 >Cla1| | || 10|20|30 40 50gcggcccagc cggccacgaa ttcatcgatg gatattgtga tgactcaggccgccgggtcg gccggtgctt aagtagctac ctataacact actgagtccgA Q P A T N S S M>
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D I V M T Q A>
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S L L H S N G N T Y L Y>
＿＿＿＿_(dá)_f＿＿_(dá)＿CDR1＿＿＿＿_(dá)_f＿＿＿_(dá)>
160170180190200ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtcaaggacgtct ccggtccggt cagaggagtc gaggactata tagcctacagF L Q R P G Q S P Q L L I Y R M S>＿＿＿＿_(dá)_d＿＿＿_(dá)__VK藥物＿＿＿＿＿＿＿＿_(dá)d＿＿＿＿_(dá)_>
R M S>
________>
210220230240250caaccttgtc tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaagttggaacag agtcctcagg gtctgtccaa gtcaccgtca cccagtccttN L V S G V P D R F S G S G S G>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿VK藥物＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿>N L V S>＿＿＿＿＿e＿＿>
260270280290300ctgctttcac actgagaatc agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgttgacgaaagtg tgactcttag tcatctcacc tccgactcct acacccacaaT A F T L R I S R V E A E D V G V>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿VK藥物＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿>
310320330340350tattactgtc tgcaacatct agagtatccg ttcacgttcg gtcctgggacataatgacag acgttgtaga tctcataggc aagtgcaagc caggaccctgL Q H L E Y P F T>
_a＿＿＿＿＿CDR3＿＿＿_(dá)a＿＿＿>Y Y C L Q H L E Y P F T F G P G T>＿＿＿＿＿d＿＿＿＿_(dá)VK藥物＿＿＿＿＿＿＿＿＿d＿＿＿＿＿>
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P P D FV P PA A S>
_1＿＿＿＿＿1＿825＿＿_(dá)1＿＿＿＿＿>
410420430440450tccctgatca ctcccctcgt ggccaggtcc agttggtgca gtctggacctagggactagt gaggggagca ccggtccagg tcaaccacgt cagacctggaQ V Q L V Q S G P>
＿＿VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿_(dá)>F P D H S P R G>＿＿＿＿＿825＿＿＿＿1＿_(dá)>
460470480490500gagctgaaga agcctggaga gacagtcaag atctcctgca aggcttctgactcgacttct tcggacctct ctgtcagttc tagaggacgt tccgaagactE L K K P G E T V K I S C K A S D>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿＿>
510520530540550ttataccttc acatactatg gaatgaactg ggtgaagcag gctccgggaaaatatggaag tgtatgatac cttacttgac ccacttcgtc cgaggcccttY T F T Y Y G M N W V K Q A P G>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿＿_(dá)h＿＿＿＿＿>
Y Y G M N>
＿＿＿cDR1＿＿＿>
560570580 590 600agggtttaaa gtggatgggc tggatagaca ccaccactgg agagccaacatcccaaattt cacctacccg acctatctgt ggtggtgacc tctcggttgtK G L K W M G W I D T T T G E P T>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿VH藥物[斷裂]_＿＿＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿＿>
W I D T T T G E P T>
＿＿＿＿CDR2[斷裂] _＿＿＿＿＿>
610620630640650tatgctgaag attttaaggg acggattgcc ttctctttgg agacctctgcatacgacttc taaaattccc tgcctaacgg aagagaaacc tctggagacgY A E D F K G R I A F S L E T S A>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿_(dá)VH藥物[斷裂]_＿＿＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿＿>Y A E D F K G>＿＿_(dá)CDR2[斷裂] _＿_(dá)i_>
660670680690700cagcactgcc tatttgcaga tcaaaaacct caaaaatgag gacacggctagtcgtgacgg ataaacgtct agtttttgga gtttttactc ctgtgccgatS T A Y L Q I K N L K N E D T A>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿_(dá)VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿_(dá)__h＿＿＿＿＿>
710720730740750catatttctg tgcaagacgg gggccttaca actggtactt tgatgtctgggtataaagac acgttctgcc cccggaatgt tgaccatgaa actacagaccR G P Y N W Y F D V>
＿_(dá)g＿＿＿＿_(dá)CDR3＿＿＿_(dá)g_＿＿＿>T Y F C A R R G P Y N W Y F D V W>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿＿＿＿>
>Xho(-)StopXho_adapt_[斷裂]|760770780 | 790ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ctcgattaac tcgccggttccct ggtgccagtg gcagaggagt gagctaattg agcL X>
＿＿＿>G Q G T T V T V S S>＿＿_(dá)VH藥物[斷裂]＿＿＿＿＿＿＿_(dá)>[SEQ.ID.NO.10]-尾絲構(gòu)建體A1 G250序列范圍1至1411>EcoR1|| 10 20 30 40 50gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgtcttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcacaM>
_＿>
M K R A R P S E D T F N P V>
＿_(dá)f＿＿＿＿＿f＿＿＿ 尾 ＿＿＿＿_(dá)＿f＿＿＿＿＿>
60 70 80 90100atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt tcttactccttaggtatact gtgcctttgg ccaggaggtt gacacggaaa agaatgaggaY P Y D T E T G P P T V P F L T P>
＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿f＿ 尾 ＿＿f＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿>
110120130140150ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctcgggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagagL S>
＿＿＿>
P F V S P N G F Q E S P P G V>
＿＿＿＿＿f＿＿＿＿＿ 尾 ＿＿＿_(dá)f＿＿＿＿＿f＿＿_(dá)>
160170180190200tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cctgacgtagaaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac ggactgcatcL R L S E P L V T S N G M>
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P D V>
＿＿＿＿＿>
210220230240250caagcttacg acaacaggta gaagccttgc aagggcaggt acaacacttagttcgaatgc tgttgtccat cttcggaacg ttcccgtcca tgttgtgaatA S L R Q Q V E A L Q G Q V Q H L>＿＿＿＿＿＿＿＿_(dá)肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM＿g＿＿＿＿＿>
260270280290300caggcggcat ttagccaata caaaaaggta gagttgtttc caaacggagcgtccgccgta aatcggttat gtttttccat ctcaacaaag gtttgcctcgA>
_＿>Q A A F S Q Y K K V E L F P N G>_＿＿＿＿＿＿＿_(dá)肺表面活性物質(zhì)蛋白D TRIM＿_(dá)g_＿＿＿_(dá)>
>Cla1|310320330340350caagaagctg aacgacgccc aggcccccaa gagcgaccca tcgatcgacagttcttcgac ttgctgcggg tccgggggtt ctcgctgggt agctagctgtK K L N D A Q A P K S D>＿＿＿＿＿b＿＿SPA 48-60＿＿＿＿b＿＿＿_(dá)>
P S I>
＿_(dá)c＿＿＿>
D>
_＿_(dá)>
360370380390400ttgtgatgac ccagtctcaa agattcatgt ccacaacagt aggagacaggaacactactg ggtcagagtt tctaagtaca ggtgttgtca tcctctgtccI V M T Q S Q R F M S T T V G D R>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_(dá)VK＿＿_(dá)j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
410420430440450gtcagcatca cctgcaaggc cagtcagaat gtggtttctg ctgttgcctgcagtcgtagt ggacgttccg gtcagtctta caccaaagac gacaacggacV S I T C K A S Q N V V S A V A W>＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿j＿_(dá)VK＿＿_(dá)j＿＿＿＿＿j＿＿＿＿＿>
460470480 490 500gtatcaacag aaaccaggac aatctcctaa actactgatt tactcagcatcatagttgtc tttggtcctg ttagaggatt tgatgactaa atgagtcgtaY Q Q K P G Q S P K L L I Y S A>_＿＿＿＿_(dá)j＿＿＿＿＿j＿_(dá)VK_＿＿j＿＿＿＿＿j_＿＿＿＿_(dá)>
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1110 1120 1130 1140 1150aactcctagg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggacttgaggatcc ccctggcagt cagaaggaga aggggggttt tgggttcctgE L L G G P S V F L F P P K P K D>＿＿＿＿＿i＿＿＿＿＿i＿_(dá)CH2＿＿_(dá)i＿＿＿＿＿i＿＿＿＿_(dá)>
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1310 1320 1330 1340 1350taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatggatggcccacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttaccY R V V S V L T V L H Q D W L N G>
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>Xho1||1410agtaactcga gtcattgagct c* L E>
＿＿＿＿a_>
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＿>[SEQ.ID.NO.11]-尾絲構(gòu)建體A7 G250序列范圍1至1702>EcoR1|| 10 20 30 40 50gaattcgatg aagcgcgcaa gaccgtctga agataccttc aaccccgtgtcttaagctac ttcgcgcgtt ctggcagact tctatggaag ttggggcacaM>
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110120130140150ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctcgggaaacata gggggttacc caaagttctc tcagggggac cccatgagagL S>
＿＿＿>P F V S P N G F Q E S P P G V>＿＿＿＿＿m＿＿＿＿＿ 尾 ＿＿＿m＿＿＿＿＿m＿_(dá)＿>
160170180190200tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctcaaaacgcggat aggcttggag atcaatggag gttaccgtac gaacgcgagtL A L>
＿_(dá)＿_(dá)＿＿>L R L S E P L V T S N G M>＿＿＿＿＿k＿＿＿重復(fù)單元1＿＿＿k＿＿＿＿＿>
210220230240250aaatgggcaa cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaatttacccgtt gccggagaga gacctgctcc ggccgttgga atggagggtt
L T S Q>
＿i＿＿＿＿＿>K M G N G L S L D E A G N>＿＿＿＿_(dá)_j_＿＿重復(fù)單元2＿＿＿_(dá)j＿＿＿_(dá)_>
260270 280290 300aatgtaacca ctgtgagccc acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaattacattggt gacactcggg tggagagttt ttttggttca gtttgtatttI N>
＿＿_(dá)>N V T T V S P P L K K T K S N>＿＿＿＿＿i＿＿_(dá)＿重復(fù)單元3＿＿_(dá)i＿＿＿＿＿i＿＿＿＿＿>
310320330340350cctggaaata tctgcacccc tcacagttac ctcagaagcc ctaactgtggggacctttat agacgtgggg agtgtcaatg gagtcttcgg gattgacaccL T V>
＿＿＿＿＿>L E I S A P L T V T S E A>＿＿＿＿＿h(yuǎn)＿＿_(dá)重復(fù)單元4＿＿＿_(dá)h＿＿＿＿＿>
360370380390400ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac catgcaatcagacggcggcg tggagattac cagcgcccgt tgtgtgagtg gtacgttagtL T M Q S>
＿_(dá)重復(fù)單元6＿＿>A A A A P L M V A G N T>＿＿＿＿＿g＿_(dá)重復(fù)單元5＿＿＿＿＿g＿＿>
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410420430440450caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagggtccggggcg attggcacgt gctgaggttt gaatcgtaac ggtgggttccL S I A T Q G>
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460470480490500acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc ccctgacgta gcaagcttactggggagtgt cacagtcttc ctttcgatcg gggactgcat cgttcgaatgL A>
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P D V A S L>
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權(quán)利要求
1.一種修飾的病毒，它包含一或多種非天然多肽，所述多肽包含一或多個(gè)框架半分子，每個(gè)框架半分子包含一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述多肽能在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中表達(dá)為缺乏所述結(jié)合半分子的配體時(shí)能維持的一種構(gòu)象，該構(gòu)象允許所述結(jié)合半分子隨后與所述配體結(jié)合，所述多肽能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這種修飾的病毒由所述結(jié)合半分子賦予它改變的向性。
2.權(quán)利要求1的修飾的病毒，它衍生自選自下組的病毒腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，腺伴隨病毒，呼腸孤病毒科，小RNA病毒科，細(xì)小病毒科，乳多空病毒科和杯狀病毒科。
3.權(quán)利要求1或2的修飾的病毒，它衍生自人類腺病毒。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的修飾的病毒，它衍生自人類腺病毒血清型5。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽，替代了野生型病毒的病毒蛋白成分，或摻入到這樣的成分中，或與這樣的成分形成融合蛋白。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽和/或包含該非天然多肽的病毒成分蛋白可溶于細(xì)胞環(huán)境。
7.權(quán)利要求6的修飾的病毒，其中所述非天然多肽或包含該非天然多肽的病毒成分蛋白有30％以上出現(xiàn)在細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分中，所述細(xì)胞是指表達(dá)所述非天然多肽或包含該非天然多肽的病毒成分蛋白的細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述病毒蛋白成分是腺病毒尾絲蛋白。
9.權(quán)利要求8的修飾的病毒，其中所述非天然多肽摻入至腺病毒尾絲蛋白中，使得野生型尾絲頂球或其細(xì)胞結(jié)合區(qū)被去除。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)另外的元件，所述元件模擬病毒成分蛋白的天然結(jié)構(gòu)或功能，所述病毒成分蛋白是摻入了所述非天然多肽者，或者是被所述非天然多肽替代者。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽不含任何二硫鍵。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含來源于抗體的框架半分子，其能在細(xì)胞質(zhì)中有效折疊并隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中。
14.權(quán)利要求13的修飾的病毒，其中所述框架半分子包含一或多個(gè)源自另一抗體的CDR的結(jié)合半分子。
15.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽是組合蛋白或親和體，或者它包含組合蛋白或親和體。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)源自細(xì)菌受體的框架半分子。
17.權(quán)利要求1-12或16任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述半分子出現(xiàn)在螺旋束的一或多個(gè)環(huán)內(nèi)和/或出現(xiàn)在與這些螺旋束相連的一或多個(gè)環(huán)內(nèi)。
18.權(quán)利要求16的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)框架半分子，所述半分子源自葡萄球菌蛋白A與免疫球蛋白結(jié)合的Z區(qū)或者鏈球菌蛋白G的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)框架半分子，所述半分子包含非天然三聚體基元。
20.權(quán)利要求19的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含一或多個(gè)框架半分子，所述半分子包含來自人肺表面活性物質(zhì)蛋白D的頸區(qū)肽。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的修飾的病毒，其包含兩種或更多種不同的非天然多肽。
22.權(quán)利要求21的修飾的病毒，其包含與靶細(xì)胞結(jié)合的第一非天然多肽以及與生產(chǎn)細(xì)胞或容許細(xì)胞結(jié)合的第二非天然多肽。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽在能使該非天然多肽的結(jié)合半分子從所述修飾的病毒上切割下來的部位中包含切割位點(diǎn)。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述病毒包括含所述非天然多肽的修飾的病毒成分以及相應(yīng)的未修飾的病毒成分，例如野生型尾絲和修飾的尾絲。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的修飾的病毒，其中所述非天然多肽包含能結(jié)合細(xì)胞特異性配體的結(jié)合半分子，所述配體可以是前列腺特異性膜抗原，EGF受體，Her-2/Neu，VEGF受體，CD22，gp120，MHC/肽復(fù)合物或膜結(jié)構(gòu)或由增生細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞所表達(dá)的或出現(xiàn)在其表面的分子。
26.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的修飾的病毒，其還包含能插入一或多個(gè)所需治療性基因或核酸分子的位點(diǎn)。
27.權(quán)利要求26的修飾的病毒，其包含編碼胞嘧啶脫氨酶和/或尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因?yàn)閱为?dú)的基因或者為雙功能融合基因。
28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的修飾的病毒，其還包含一種病毒成分，該成分被另一血清型的等效成分替代，或者被修飾，使得該病毒與預(yù)先形成的、針對(duì)野生型成分的抗體的結(jié)合減少。
29.權(quán)利要求28的修飾的病毒，其中所述病毒成分是六鄰體蛋白。
30.一種修飾的病毒蛋白，其包含權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)限定的非天然多肽。
31.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)限定的修飾的病毒或病毒蛋白。
32.一種容許細(xì)胞，其容許權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所限定的修飾的病毒，并且其通過培養(yǎng)能繁殖所述修飾的病毒。
33.一種在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)限定的修飾型病毒的方法，包括以下步驟i)對(duì)病毒進(jìn)行遺傳修飾，以便產(chǎn)生含一或多種非天然多肽的修飾的病毒，所述多肽包含一或多個(gè)框架半分子，每個(gè)框架半分子包含一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述多肽能在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中表達(dá)為缺乏所述結(jié)合半分子的配體時(shí)能維持的一種構(gòu)象，該構(gòu)象允許所述結(jié)合半分子隨后與所述配體結(jié)合，所述多肽能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這種修飾的病毒由所述結(jié)合半分子賦予它改變的向性；ii)用所述修飾的病毒感染容許細(xì)胞；iii)培養(yǎng)所述細(xì)胞，以便產(chǎn)生所述病毒；和iv)對(duì)所產(chǎn)生的修飾型病毒進(jìn)行收獲，并任選純化。
34.一種調(diào)節(jié)權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)所限定的修飾型病毒的復(fù)制的方法，包括以下步驟i)構(gòu)建修飾型病毒，使得感染細(xì)胞所需的結(jié)合半分子與該重組病毒成分上的其余部分之間有切割位點(diǎn)；和ii)使所述重組病毒與能將所述結(jié)合半分子從所述病毒成分上切割下來的切割試劑或切割工具接觸，從而阻止該重組病毒繼續(xù)其感染周期。
35.一種確定非天然多肽是否適用于制備病毒載體的方法，所述方法是確定該多肽在細(xì)胞系統(tǒng)中的可溶性。
36.權(quán)利要求35的方法，包括以下步驟i)在容許細(xì)胞中表達(dá)所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白；ii)裂解所述細(xì)胞，以便產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；iii)分離所述細(xì)胞裂解物的可溶性和不溶性級(jí)分；iv)分析所述細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和v)比較所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中的相對(duì)含量。
37.一種評(píng)估權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)限定的非天然多肽或權(quán)利要求30限定的修飾型病毒蛋白的可溶性的方法，包括以下步驟i)在容許細(xì)胞中表達(dá)所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白；ii)裂解所述細(xì)胞，以便產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；iii)分離所述細(xì)胞裂解物的可溶性和不溶性級(jí)分；iv)分析所述細(xì)胞裂解物的可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中，所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白的含量；和v)比較所述非天然多肽或含有所述非天然多肽的病毒成分蛋白在可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分中的相對(duì)含量。
38.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)限定的修飾型病毒在治療中的用途。
39.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)限定的修飾型病毒在制備用于治療腫瘤細(xì)胞或增生細(xì)胞的藥物中的用途。
40.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)限定的修飾型病毒以及可藥用的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種修飾的病毒，它包含一或多種非天然多肽，所述多肽包含一或多個(gè)框架半分子，每個(gè)框架半分子包含一或多個(gè)結(jié)合半分子，所述多肽能在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中表達(dá)為缺乏所述結(jié)合半分子的配體時(shí)能維持的一種構(gòu)象，該構(gòu)象允許所述結(jié)合半分子隨后與所述配體結(jié)合，所述多肽能跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這種修飾的病毒由所述結(jié)合半分子賦予它改變的向性，本發(fā)明還涉及所述病毒在治療中的應(yīng)用，尤其在腫瘤或其它癌性細(xì)胞的治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1443243SQ0181299
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月19日
發(fā)明者利夫·林霍爾姆, 安娜·K·諾德, 皮埃爾·A·布朗熱 申請(qǐng)人:獲取基因公司