專利名稱：修飾的dna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)次黃苷和鳥苷的改良方法，次黃苷和鳥苷是生產(chǎn)5′一次黃苷酸和5′烏苷酸的原料;本發(fā)明還涉及用于該方法的新的微生物以及用于衍生該新微生物的新的DNA。
就次黃苷和鳥苷的生產(chǎn)來說，使用微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)是一種有利的方法，已提出和實(shí)施了多種工藝方法。
迄今對(duì)核酸發(fā)酵的多方面研究表明，一組一般稱為嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)的物質(zhì)、如次黃苷、鳥苷、腺苷及其堿基(如次黃嘌呤)和磷酸化化合物(如5′一次黃苷酸)的生物合成，受到終產(chǎn)物如腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)(如腺苷或其磷酸化化合物如5′一腺苷酸)或鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)(如鳥苷或其磷酸化化合物，如5′一鳥苷酸)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
在發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)時(shí)，通常將培養(yǎng)基中腺嘌呤或其相關(guān)物質(zhì)的量限制在很低的濃度，以避免使嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)的生物合成途徑受到腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，另外，還使用了缺乏腺苷酸基琥珀酸合成酶的需要腺嘌呤的突變株((Y.Nakao，Microbial Technology，Vol.1，P311-354，editod by H.J.Peppler and D.Perlman，Academic Press，New York，USA)。也已知道了使用芽孢桿菌屬(U.S.Patent No.3，960，661，Japanese Patent Publication NO.41915/1982，US Patent No.4701，413，US PatentNo.3，912，587和US Patent No.4，283，346)和短桿菌屬(US.Patent No.3，736，228和Japanese Patent Publication NO.17592/1983)細(xì)菌的方法，條件是除了有需要腺嘌呤的特性外，還對(duì)各種藥物如所謂核酸類似物等具有抗性，從而有利于產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷。
得到這些突變株的常規(guī)方法是采取用紫外光照射、用亞硝基胍(NTG)處理等人工誘變手段，然后分離在適當(dāng)選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的所需突變株。
然而，因?yàn)猷堰屎塑账嵯嚓P(guān)物質(zhì)是負(fù)責(zé)生物體重要遺傳信息的物質(zhì)，所以其生物合成中存在著十分精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，并且不總是很容易地大量產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷。此外，用常規(guī)方法得到的突變體也不總是令人滿意的，因?yàn)榫幋a嘌呤核苷酸生物合成酶之所需基因的突變很不穩(wěn)定，以致伴有因誘變處理引起的染色體其他部位的不需要的突變。因此，從嘌呤相關(guān)物質(zhì)的工業(yè)重要性考慮，期望發(fā)展它們的更好的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的改良方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于本發(fā)明工藝的、屬于芽孢桿菌屬的新的微生物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供新的染色體DNA，其含有適于芽孢桿菌屬微生物之嘌呤操縱子表達(dá)的控制順序及該順序的3′相鄰區(qū)域，而且它被改變而用于衍生本發(fā)明的新的微生物。
從以下參考附圖所作的描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解本發(fā)明的這些目的及其他目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1顯示重組質(zhì)粒pPEC32的限制性酶切圖，該質(zhì)粒含有下述實(shí)施例1ⅱ)中制得的、編碼嘌呤生物合成途徑之酶的基因(purE)。圖中實(shí)線代表被插入的含purE的DNA片段。空白部分代表pBR322。
圖2顯示pPEC32和pUH32的限制性酶切圖，質(zhì)粒pUH32含有下文實(shí)施例1ⅲ)中制得的purE的5′上游區(qū)域。其中虛線代表由同一限制酶切斷的位點(diǎn)。
圖3顯示下文實(shí)施例1ⅳ)中測(cè)得的pUH32之EcoRV-SphI片段的核苷酸順序，其中示出了purE的啟動(dòng)子和起始密碼子。
圖4顯示實(shí)施例1ⅴ)中構(gòu)建的質(zhì)粒pBX118-9的限制性酶切圖，其中缺少嘌呤操縱子的控制區(qū)域，且在同一圖內(nèi)顯示了其核苷酸順序的一部分。圖中實(shí)線代表含pUrE的DNA片段，空白部分代表pUC118。顯示了從多克隆位點(diǎn)KpnI到purE之起始密碼子的核苷酸順序。
圖5顯示下文實(shí)施例1ⅶ)中制得的SP啟動(dòng)子的核苷酸順序。
圖6顯示實(shí)施例1ⅷ)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBXSC19的限制性酶切圖。黑色部分代表SP啟動(dòng)子，劃陰影線部分代表氯霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，實(shí)線部分代表含purE的DNA片段，空白部分代表pUC19。
圖7顯示下文實(shí)施例3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSB22的限制性酶切圖，及其一部分核苷酸順序?？瞻撞糠执韕UC118。
圖8顯示下文實(shí)施例3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBE1203的限制性酶切圖，及其部分核苷酸順序。空白部分代表pUC118。
圖9顯示下文實(shí)施例3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pDT32的限制性酶切圖?？瞻撞糠执韕BR322，加陰影部分代表氯霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
本發(fā)明人為得到新的微生物菌株進(jìn)行了廣泛深入的研究，其中降低了腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)和鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)對(duì)嘌呤核苷酸生物合成基因(嘌呤操縱子)的抑制。結(jié)果，本發(fā)明人成功地構(gòu)建了DNA，其中使用重組DNA技術(shù)使與嘌呤操縱子的表達(dá)有關(guān)的DNA區(qū)域被修飾，從而提高了嘌呤操縱子的表達(dá)，和/或用適當(dāng)選擇的不同啟動(dòng)子取代啟動(dòng)子區(qū)域;并且還成功地衍生了新的微生物，其中負(fù)責(zé)嘌呤核苷酸生物合成的酶的表達(dá)沒有受到腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)和/或鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)的抑制。然后發(fā)現(xiàn)，使用該技術(shù)由芽孢桿菌屬微生物接受體衍生的新的微生物能夠持續(xù)地大量積聚次黃苷和/或鳥苷。
已基于上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，并提供了包含表達(dá)芽孢桿菌屬微生物嘌呤操縱子之DNA順序和該順序之3′相鄰區(qū)DNA的染色體DNA，其中所說的DNA順序的全部或部分已被修飾，以致提高了表達(dá)水平。此外，本發(fā)明還提供了包含被修飾之DNA的載體，能夠被本發(fā)明的DNA或載體轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的屬于芽孢桿菌屬的新微生物，以及生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬微生物以產(chǎn)生和積聚次黃苷和/或鳥苷，并收集所得產(chǎn)物。
本文中述及提高嘌呤操縱子表達(dá)所用的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的”或“修飾”，包括缺失負(fù)責(zé)表達(dá)嘌呤操縱子的部分DNA順序，在該順序中插入不同的DNA和/或用不同的DNA取代部分或全部順序。
本發(fā)明中使用的含有表達(dá)嘌呤操縱子之控制區(qū)的DNA并不一定含有嘌呤操縱子的整個(gè)區(qū)域，但它含有啟動(dòng)子順序、與嘌呤操縱子的表達(dá)有關(guān)的DNA順序，所說的順序是受一種或多種腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)(如腺嘌呤、腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷)調(diào)節(jié)的，并且與受一種或多種鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)(如鳥嘌呤、鳥苷、一磷酸鳥苷、二磷酸鳥苷、三磷酸鳥苷)調(diào)節(jié)的表達(dá)有關(guān)，其與啟動(dòng)子順序相鄰接并在3′相鄰區(qū)下游。該DNA最好還含有某些5′相鄰區(qū)。上述DNA自嘌呤操縱子第一個(gè)開放讀碼的N末端開始至少含有3′下游區(qū)的0.1千堿基對(duì)(Kbp)和5′上游區(qū)的大約0.4Kbp。以下該部分即被稱為與嘌呤操縱子表達(dá)的調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域。
這一DNA是使用重組DNA技術(shù)由微生物的染色體DNA中分離的。作為用于此目的的宿主-載體系統(tǒng)，可使用普遍使用的EK系統(tǒng)。即是說，作為宿主可適當(dāng)?shù)厥褂醚苌诖竽c桿菌K-12菌株的不同菌株，如大腸桿菌C600(T.Maniatis et al.，Molecular cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982，PP.504)、大腸桿菌JA221(IFO14359，ATCC33875)、大腸桿菌MM294(ATCC33625〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，4174(1976)〕或其衍生株。作為載體，可適當(dāng)?shù)厥褂胮BR322、pACYC184、pACYC177、pUC18、pUC19、pHSG396、pHSG298等。
此外也可使用其他宿主-載體系統(tǒng)，如與大腸桿菌DP50 SupF(Molecular Cloning，PP.504)、大腸桿菌NM538和NM539(J.Mol.Biol.，170，827)、大腸桿菌LE392(J.Biol.Chem.，218，97)等聯(lián)合的Charon 4A(Molecular Cloning，PP 31)、EMBL3和EMBL4(J.Mol.Biol.，170，827)等噬菌體載體。當(dāng)然，還可使用以芽孢桿菌屬微生物，如枯草芽孢桿菌MI114(Gene，24，255)或其突變株作為宿主，并以具有在芽孢桿菌屬微生物中自動(dòng)復(fù)制能力的質(zhì)粒，如pUB110、pC194、pE194、pS194、pSA2100、pHY300pLK等作為載體的宿主-載體系統(tǒng)。
原則上，對(duì)于含有與嘌呤操縱子表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)區(qū)域的DNA供體來源并沒有特殊限制，只要供體DNA的核苷酸順序與用作下文所述之接受體的芽孢桿菌屬微生物染色體上的區(qū)域有高度同源性即可，而且可使用任何微生物作為供體。這之中，當(dāng)使用芽孢桿菌屬微生物時(shí)，可實(shí)現(xiàn)所謂的自身克隆并優(yōu)選之，因?yàn)檫@樣將更易于操作。此外期望所得轉(zhuǎn)化體是穩(wěn)定的。再者，供體并不一定能產(chǎn)生次黃苷、鳥苷、黃苷或其嘌呤堿基。
這類DNA供體的例子包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣形芽孢桿菌。例如可使用下列微生物菌株枯草芽孢桿菌No.168(BGSC1A1)、枯草芽孢桿菌No.115(IFO14187，F(xiàn)ERMBP-1327)、枯草芽孢桿菌MI114(Gene，24，255)，短小芽孢桿菌ATCC7061和地衣形芽孢桿菌ATCC14580(其中BGSC是Bacillus Genetic Stock Center，IFO是Institute of Fermentation，Osaka，ATCC是The American Type Culture Collection)。
可按常規(guī)方法由這些供體中分離染色體DNA，例如用苯酚提取染色體DNA(H.Sato and K.Miura.Biochim，Biophy.Acta.，72，619)。用適當(dāng)選擇的限制酶切割如此得到的染色體DNA并用DNA連接酶連接到載體上。用連接混合物轉(zhuǎn)化嘌呤核苷酸生物合成酶有缺陷的宿主，該酶已在嘌呤操縱子上被編碼，從而利于選擇缺陷得以補(bǔ)償?shù)霓D(zhuǎn)化體。可按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化宿主。例如當(dāng)使用大腸桿菌時(shí)，可按S.N.Cohen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110)所述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在宿主是枯草芽孢桿菌的情況下，可按S.Chang和S.N.Cohen(Molec.Gen.Genet.，168，115)所述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
可使如此得到的轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在有或沒有嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)(必要時(shí)還含有其他必需營(yíng)養(yǎng)素)的培養(yǎng)基上，從而很容易地確定轉(zhuǎn)化體中嘌呤核苷酸生物合成酶的缺陷是否得以補(bǔ)償。
因此，可借助與已知枯草芽孢桿菌菌株的嘌呤操縱子的核酸順序、限制性酶切位點(diǎn)相比較(J.Biol.Chem.，Vol.262，PP8274-8287(1987))，或者可使用啟動(dòng)子探針載體(J.Bacteriol.，Vol.146，PP1162-1165)來確定克隆的DNA片段中是否存在包含與調(diào)節(jié)嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)的區(qū)域的DNA。此外，還可基于已知枯草芽孢桿菌菌株嘌呤操縱子的核苷酸順序資料，使用菌落雜交或噬斑雜交法(Molecular Cloning.PP312-328)來克隆含有與調(diào)節(jié)嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)的區(qū)域的DNA?？砂瓷鲜龇椒?Molecular Cloning.PP.86-93)大量制備含有轉(zhuǎn)化體之基因的DNA。
為了由如此得到的含有與調(diào)節(jié)嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)的區(qū)域的DNA構(gòu)建和分離本發(fā)明的新DNA，可方便地利用重組DNA技術(shù)并適當(dāng)?shù)剡x用大腸桿菌的宿主-載體系統(tǒng)。
在下述于大腸桿菌中構(gòu)建本發(fā)明之DNA的步驟中，許多情況下可方便地將DNA片段再克隆到新的載體中，或者使用多聚接頭連接之。為此目的，最好利用大腸桿菌載體pUC118和pUC119的多聚接頭部分來進(jìn)行再克隆，因?yàn)檫@樣可以很便利地構(gòu)建新的DNA和測(cè)定核苷酸順序。
可使用適當(dāng)?shù)南拗泼赣珊信c調(diào)節(jié)嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)區(qū)域的質(zhì)粒構(gòu)建并分離本發(fā)明的新DNA，必要時(shí)須使用具有由其末端消化雙股DNA之具有外切酶活性的酶(如BAL31)，以得到其中缺失與調(diào)節(jié)嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)的區(qū)域的剪短的DNA片段。在這種情況下，為了得到某中每條借助腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)負(fù)責(zé)抑制嘌呤操縱子的核苷酸順序、嘌呤操縱子啟動(dòng)子及借助鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)負(fù)責(zé)抑制嘌呤操縱子的核苷酸順序均缺失的DNA片段，可以經(jīng)改變所用酶的量和反應(yīng)時(shí)間，以得到有不同長(zhǎng)度和不同類型缺失的所需DNA片段，并可借助下文所述方法，如根據(jù)對(duì)片段之核苷酸順序測(cè)定的結(jié)果來選擇所需的片段。可以在適于核苷酸順序測(cè)定的載體如M13、pUC113或pUC119中再克隆DNA片段，然后用已知方法如F.Sanger等人所述的方法(proc.Natl.Acad.Scl.USA，79，5463)進(jìn)行核苷酸順序測(cè)定。
根據(jù)本方法，不僅可以除去借助腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)負(fù)責(zé)抑制嘌呤操縱子的區(qū)域和/或借助鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)負(fù)責(zé)抑制嘌呤操縱子的區(qū)域，而且還可能用適當(dāng)選擇的不同啟動(dòng)子置換啟動(dòng)子區(qū)域。為此目的，可使用T4DNA連接酶將其中嘌呤操縱子的啟動(dòng)子區(qū)已缺失的DNA片段連接到可在芽孢桿菌屬微生物中表達(dá)的啟動(dòng)子順序的下游。在這種情況下，如果將能在芽孢桿菌微生物中表達(dá)的標(biāo)志基因如藥物抗性基因連接上去，即可很方便地選擇該芽孢桿菌屬的轉(zhuǎn)化體。
此外，在這種情況下，如將嘌呤操縱子之啟動(dòng)子的5′相鄰區(qū)的一部分連接到被連接之啟動(dòng)子的上游將是方便的，因?yàn)檫@樣即可按下文所述在接受體的染色體上進(jìn)行雙交換式重組。
對(duì)用于本發(fā)明的啟動(dòng)子沒有具體限制，不管其來源如何(如可以是原核、其核或合成DNA)，只要它具有下一步能在接受體中表達(dá)的DNA順序即可。其例子包括得自芽孢桿菌屬微生物之染色體的啟動(dòng)子芽孢桿菌屬微生物的噬菌體、或具有在芽孢桿菌屬微生物細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)生長(zhǎng)之能力的質(zhì)粒。當(dāng)然，該啟動(dòng)子可以是芽孢桿菌屬微生物之嘌呤操縱子的啟動(dòng)子。在后一種情況下，修飾作用限于由腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)和/或由鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)調(diào)節(jié)的控制區(qū)域。這些啟動(dòng)子的具體例子有AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACASPOl-15[Lee，G and Pero，J，J.Mol.Biol.，152，247(1981)]AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAACSPOl-26[Lee et al.，Mol.Gen.Genet.，180，57(1980)]GAAAAGTGTTGAAAATTGTCGAACAGGGTGATATAATAAAAGAGTAφ29G3b[Marray，C.L.and Robinowtiz，J.C.，J.Biol.Chem.，257，1053(1982)]
GAAAAGGGTAGACAAACTATCGTTTAACATGTTATACTATAATAGAAφ29G2[Yoshikawa，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1336(1981)]ATTAATGTTTGACAACTATTACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATCφ29Al[Yoshikawa，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1336(1981)]可用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑦@些啟動(dòng)子由含有它們的DNA(質(zhì)粒)中切下來，然后用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離并回收之。另外，也可以使用市售的DNA合成儀(如Applied Biosystems Inc.USA制造的裝置)按照磷酰胺酯法合成含有上述啟動(dòng)子之核苷酸順序的DNA。
為了大量得到本發(fā)明的新的DNA，可用上述連接混合物轉(zhuǎn)化宿主微生物，然后選擇生長(zhǎng)在選擇性培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化體，如果利用藥物抗性作為選擇標(biāo)志，可使用含有相關(guān)藥物的培養(yǎng)基?？梢园凑找阎姆椒ǎ缟鲜觥禡olecular Cloning》第86～93頁(yè)所述的方法由轉(zhuǎn)化體中制備大量DNA。
為了由如此得到的質(zhì)粒中分離含有與嘌呤操縱子表達(dá)有關(guān)之修飾區(qū)域的DNA片段，按常規(guī)方法用限制酶切割質(zhì)粒，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離并用電洗脫器提取之。
下文說明通過用如此得到的新DNA轉(zhuǎn)化接受體而衍生新微生物的方法。
作為進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化的接受體，可以使用具有轉(zhuǎn)化之能力的任何微生物，即能使細(xì)胞外DNA摻入其中并在其部分染色體上引起重組(所說的染色體與DNA的核苷酸順序有高度同源性)，以改變其遺傳特性。該微生物不一定與嘌呤操縱子表達(dá)之調(diào)節(jié)相關(guān)區(qū)域的供體完全相同，只要染色體DNA中嘌呤操縱子表達(dá)調(diào)節(jié)之相關(guān)區(qū)域的3′下游區(qū)與外在DNA中所含嘌呤操縱子表達(dá)調(diào)節(jié)之相關(guān)區(qū)域的3′下游區(qū)有高度同源性即可。為了衍生具有大量產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷之能力的轉(zhuǎn)化株，從能夠積聚兩種或多種嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)(如次黃苷、鳥苷和黃苷)、能夠被轉(zhuǎn)化、沒有致病性等已知性質(zhì)，以及具有在發(fā)酵工業(yè)中長(zhǎng)期安全使用的歷史角度看，枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)、短小芽孢芽菌(Bacillus Pumilus)、地衣形芽孢桿菌(Bacillus Iicheniformis)等芽孢桿菌屬微生物是很適用的。
另外，在許多情況下，可對(duì)用作接受體的上述微生物提供一種或多種有利于積聚嘌呤核苷酸相關(guān)物質(zhì)的已知特性，如嘌呤類似物(如8-氮鳥嘌呤)抗性、核苷磷酸化酶缺乏、5′鳥苷酸還原酶缺乏、葉酸拮抗物抗性等，從而使之在產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的能力方面得到更大的改善。
芽孢桿菌屬接受體的例子包括Bacillus subtilis BM 1032(IFO 14559，F(xiàn)ERM BP-1242)Bacillus subtilis lA3(BGSC No.1A3)Bacillus subtilis NA-6011(IFO 14189，F(xiàn)ERM BP-291)Bacillus subtilis NA-6012(IFO 14190，F(xiàn)ERM BP-292)Bacillus subtilis NA-6128(IFO 14373，F(xiàn)ERM BP-617)Bacillus subtilis NA-7821(IFO 14368，F(xiàn)ERM BP-618)Bacillus subtilis ATCC 19221Bacillus subtilis ATCC 14662
Bacillus pumilus(FERM P-2116)Bacillus pumilus(FERM P-4832)Bacillus pumilus(FERM P-4829)Bacillus licheniformis IFO 12485本發(fā)明的新DNA用于轉(zhuǎn)化屬于芽孢桿菌屬的微生物，且在這種情況下可以以其在質(zhì)粒中的整合形式使用，或者以裂解質(zhì)粒或由本發(fā)明的DNA切下后得到的線性DNA形式使用?？砂凑找阎椒?C.Anagnostopoulos and J.Spizizen，J.Bacteriol.，81，741，(1961)，等文獻(xiàn))用該DNA片段轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬的微生物。
可以很容易地選擇轉(zhuǎn)化體，例如在使用藥物抗性基因作為選擇標(biāo)志的情況下，可在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平皿上培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體?？梢越柚鷻z測(cè)由嘌呤操縱子編碼的嘌呤核苷酸生物合成系統(tǒng)酶的活性，來確定如此得到的轉(zhuǎn)化體是否為具有所需特性的新微生物。例如，在已用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體中，其中與腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生之抑制作用有關(guān)的區(qū)域已受到修飾，此時(shí)即使向培養(yǎng)液中加入過量的腺嘌呤也不會(huì)使參予嘌呤核苷酸生物合成的酶(如PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶，其為生物合成的第一個(gè)酶)受到抑制，故可保留很高的酶促活性，而且在轉(zhuǎn)化體和接受體之間該活性有著很大差異。從而可容易確定該轉(zhuǎn)化體是新的微生物。
本發(fā)明之轉(zhuǎn)化體的典型例子包括下述實(shí)施例中制得的枯草芽孢桿菌BM2032(IFO14902，F(xiàn)ERM BP-2536)。
當(dāng)然，經(jīng)適當(dāng)選擇啟動(dòng)子和接受體，可以很容易地按照本文所述方法得到各種不同的轉(zhuǎn)化體。
可以采用常規(guī)發(fā)酵工藝，使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷。
即可以使用含有碳源、氮源、金屬離子，以及必要時(shí)還含有氨基酸、核酸、維生素等其他營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基。作為碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糖化淀粉、廢糖蜜等。這些碳源可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。作為氮源，可以單獨(dú)或聯(lián)合使用蛋白胨、大豆粉、干酵母、尿素等有機(jī)氮源，以及硫酸、硝酸、鹽酸、碳酸等的銨鹽和氨氣，氨水等無機(jī)氮源?？蛇m當(dāng)選擇并單獨(dú)或聯(lián)合使用各種無機(jī)鹽、氨基酸、維生素等微生物生長(zhǎng)所必需的其他營(yíng)養(yǎng)素。作為腺嘌呤源，可使用腺嘌呤、腺苷和腺苷酸以及含有這些化合物的微生物細(xì)胞或其提取物等。
此外，必要時(shí)可向培養(yǎng)基內(nèi)加入硅油、聚乙二醇醚等消泡劑，以及表面活性劑等。
通?？稍谡袷?、供氣深層培養(yǎng)等供氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的PH較好在4至9范圍內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)期間PH變化時(shí)，可加入硫酸、碳酸鈣、氫氧化鈉、氣態(tài)氨、氨水等將PH調(diào)到上述范圍。通?？稍?0至45℃范圍內(nèi)適當(dāng)選擇培養(yǎng)溫度，以利于所用微生物的生長(zhǎng)并積聚次黃苷和/或鳥苷。培養(yǎng)過程應(yīng)持續(xù)到次黃苷和/或鳥苷積聚量基本上達(dá)到最大值時(shí)為止。一般培養(yǎng)24至144小時(shí)即可獲得預(yù)期的結(jié)果。
可使用已知的純化方法分離得到次黃苷和/或鳥苷，例如沉淀法，及使用離子交換樹脂、活性炭等層析分離和純化方法。
根據(jù)本發(fā)明，可以以高產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)次黃苷和/或鳥苷的工業(yè)化生產(chǎn)，所得產(chǎn)物是生產(chǎn)重要的香味物質(zhì)5′次黃苷酸和5′鳥苷酸的原料。
即是說，可以使用能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物作為接受體并用本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化之，以解除由腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)和鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)的抑制作用，和/或用不同的啟動(dòng)子取代原啟動(dòng)子，而得到改善了嘌呤核苷酸生物合成系統(tǒng)之酶促活性的新的微生物。該新的微生物能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生大量次黃苷和/或鳥苷。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)地舉例闡述本發(fā)明，但它們并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限定。
除特別指出者外，實(shí)施例中的操作是按照下述方法(1)至(9)進(jìn)行的。
(1)用限制酶消化DNA使用由廠商規(guī)定的限制酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan生產(chǎn))的緩沖溶液。用10單位/μg DNA的酶37℃消化60分鐘。然后用TE緩沖液(10mM Tris-HCl(PH7.5)+1mMEDTA)飽和的苯酚提取反應(yīng)混合物。向提取物內(nèi)加入1/10體積的3M乙酸鈉(PH6)，再加入2.5體積的乙醇，離心該混合物以回收DNA。
(2)大量質(zhì)粒的提取按照《Molecular Cloning》第86-93頁(yè)所述的方法提取。即首先將攜帶質(zhì)粒DNA的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基(250ml;Bacto胰酶解胨10g/升，酵毋浸膏5g/升，氯化鈉5g/升)。培養(yǎng)過夜后收集細(xì)胞并洗滌。然后向洗過的細(xì)胞內(nèi)加入溶菌酶，再加入含有1%十二烷基硫酸鈉的0.2N氫氧化鈉溶液，以溶解細(xì)胞，加入5M醋酸鉀后，離心得到含有質(zhì)粒的上清液。向上清液中加入0.6體積的異丙醇以沉淀質(zhì)粒DNA，用乙醇洗滌后將其溶解于TE緩沖液中。向該溶液中加入氯化銫達(dá)到比重為1.60，再加入溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓達(dá)到終濃度為600μg/ml。用超速離心機(jī)(轉(zhuǎn)子V65Ti)，以50，000rpm將混合物20℃下離心12小時(shí)，然后收集紫外光下檢測(cè)到的質(zhì)粒帶。用正丁醇除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓后，進(jìn)行乙醇沉淀。
(3)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化按照《Molecular Cloning》第250頁(yè)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
即首先將大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基(3ml)上。培養(yǎng)過夜后，取其1ml接種到LB培養(yǎng)基(100ml)上并于37℃下振蕩保溫，直到細(xì)胞濃度達(dá)到約5×107細(xì)胞/ml。然后收集細(xì)胞，并加入含50mM氯化鈣和10mM Tris-HCl緩沖液(PH8)的冰冷的滅菌水懸浮并冰冷卻15分鐘。離心分離細(xì)胞并再次懸浮于含有50mM氯化鈣和10mM Tris-HCl緩沖液的滅菌水(6.7ml)。向其2ml部分內(nèi)加入DNA并將該細(xì)胞懸浮液冰冷卻30分鐘。向其中加入LB培養(yǎng)基(0.8ml)。細(xì)胞懸浮液于37℃下保溫1小時(shí)，散布于含有藥物的瓊脂平皿上并繼續(xù)于37℃下保溫過夜。
(4)BAL31消化處理進(jìn)行BAL31核酸酶消化處理，以從兩末端消化DNA的兩條鏈。亦即將限制酶消化的DNA(10μg)溶解于BAL31緩沖溶液〔100μl;12mM氯化鈣、12mM氯化鎂、200mM氯化鈉和20mMTris-HCl(PH8)，2mMEDTA〕并向其中加入BAL31核酸酶(1單位，Takara Shuzo Co.Ltd.，Japan生產(chǎn))。30℃下保溫該反應(yīng)混合物。消化后進(jìn)行苯酚提取和乙醇沉淀。為了使經(jīng)過酶切的DNA的末端變成平頭，將上述DNA懸浮在T4DNA聚合酶的緩沖溶液中〔20μl;含有33mMTris-乙酸(Ph7.9)、10mM醋酸鎂、0.5mM二硫蘇糖醇、66mM醋酸鉀、0.01%BAS、0.1mMdATp、0.1mMdGTp，0.1mMdCTP和0.1mMdTTp〕并向其中加入T4DNA聚合酶(5單位，Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan生產(chǎn))。反應(yīng)混合物于37℃保溫30分鐘。保溫后進(jìn)行苯酚提取和乙醇沉淀。
(5)DNA的連接使用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan生產(chǎn))連接2至3個(gè)DNA片段，連接反應(yīng)按廠商規(guī)定的條件進(jìn)行。
(6)枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化按照Dubnon等人所述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。即首先將微生物接種在LB培養(yǎng)基(5ml)上，于37℃下保溫過夜。取其0.5ml轉(zhuǎn)移到SPI培養(yǎng)基中(20ml，含有1.4%磷酸氫二鉀、0.6%磷酸二氫鉀、0.2%硫酸銨、0.1%檸檬酸鈉、0.02%硫酸鎂、0.5%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸、0.1%酵母浸膏、色氨酸50μg/ml和亮氨酸50μg/ml)并于37℃下保溫4小時(shí)。然后取10ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到SPⅡ培養(yǎng)基(100ml，含有1.4%磷酸氫二鉀、0.6%磷酸二氫鉀、0.2%硫酸銨、0.1%檸檬酸鈉、0.02%硫酸鎂、0.5%葡萄糖、氯化鈣75μg/ml和氯化鎂508μg/ml)并于37℃下保溫90分鐘。取其1ml加入DNA，將細(xì)胞懸液于37℃下保溫30分鐘。然后將細(xì)胞懸液散布在含有藥物的LB瓊脂平皿上并于37℃下保溫過夜。
(7)PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定將轉(zhuǎn)化體接種到LB培養(yǎng)基(5ml)中并于37℃下保溫過夜。取其0.2ml接種到含有腺嘌呤或鳥嘌呤(300μg/ml)的SPI培養(yǎng)基(20ml)上并于37℃下保溫3小時(shí)。收集細(xì)胞并用0.85%氯化鈉水溶液洗滌。再次用丙酮洗細(xì)胞并干燥之。然后將細(xì)胞懸浮于反應(yīng)溶液I〔1ml;100mMTris-HCl(PH7.5)、3.2mM氯化鎂、2.5mMPRPP和12mML-谷氨酰胺〕中并于37℃下保溫15分鐘。反應(yīng)混合物在沸水浴中放置3分鐘以終止反應(yīng)。離心反應(yīng)混合物并使用NAD和谷氨酸脫氫酶(Boehringer Mannheim Yamanouchi Co.，Ltd.，Japan生產(chǎn))測(cè)定上清液中的谷氨酸濃度。以所產(chǎn)生的谷氨酸nmol數(shù)/分鐘/mg干細(xì)胞表示活性。
(8)菌落雜交將已轉(zhuǎn)化的菌落接種到尼龍濾膜(由E.I.du Pont de Nemours & Co.，Inc.，USA生產(chǎn)的菌落/噬斑篩NEF-978X)，分別置于含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平皿和含氨芐青霉素的LB瓊脂平皿的母平皿上，并將它們于37℃下保溫過夜。
由平皿中取出尼龍濾膜，在0.5N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘再在1M Tris-HCl(pH7.5)中浸泡10分鐘。然后于室溫下干燥濾膜。
另一方面是制備探針。該制備使用多引物DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amasham Japan Co.，Ltd.，Japan生產(chǎn))并按廠商規(guī)定的程序進(jìn)行。
對(duì)尼龍濾膜的雜交方法同前所述。
(9)核苷酸順序的測(cè)定使用SEQUENASE(Toyo Boseki Kabushiki Kaisha，Japan生產(chǎn))并按照廠商規(guī)定的方法檢測(cè)核苷酸順序。
本文中所用的IFO編號(hào)是在Institute for Fermentation，Osaka的保藏登記號(hào)，F(xiàn)ERM BP是按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定在Fermantation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology(FRI)的保藏登記號(hào)。
實(shí)施例1ⅰ)染色體DNA的制備將枯草芽孢桿菌No.115(IFO14187，F(xiàn)ERM BP-1327，于1987年3月28日保藏)接種在LB培養(yǎng)基中并于37℃保溫過夜。用酚提取染色體DNA，得到5mg染色體DNA。
ⅱ)purE的克隆用ClaI消化上述ⅰ)中制得的染色體DNA(10μg)并以瓊脂糖凝膠電泳法分離，然后用單向電洗脫儀(International Biotechnologies，Inc.，USA生產(chǎn))回收相當(dāng)于3.6至4.5Kbp的DNA。
另一方面，用ClaI消化pBR322(0.5μg)并與上述DNA部分混合以進(jìn)行連接反應(yīng)。用該連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化purE缺陷性大腸桿菌PCO135(CGSC5403)菌株，擴(kuò)散于含有氨芐青霉素的M9cA瓊脂平皿(含有磷酸氫二鈉6g/升、磷酸二氫鈉2g/升、氯化鈉0.5g/升、氯化銨1g/升、葡萄糖2g/升、2mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣和酪蛋白氨基酸2g/升)，于37℃下保溫1天，得到轉(zhuǎn)化體大腸桿菌PCO135(pPEC32)(IFO14899，F(xiàn)ERM BP-2533，于1989年7月26日保藏)。由轉(zhuǎn)化體中得到質(zhì)粒pPEC32。然后提取大量pPEC32并用不同的限制酶切割之。根據(jù)其電泳圖形，使用HindⅢ消化的λDNA作為分子標(biāo)準(zhǔn)得到圖1所示的限制性酶切圖。
ⅲ)purE基因之上游部分DNA的制備用HindⅢ消化上述ⅰ)中得到的染色體DNA(10μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以回收相當(dāng)于大約2.0至2.6Kbp的DNA。
另一方面，用HindⅢ消化PBR322(0.5μg)，用堿性磷酸酶使之脫去磷酸基，并進(jìn)行酚提取和乙醇沉淀。使該DNA與上述DNA片段混合并連接。用此連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl(ATCC33849)并選擇氨芐青霉素抗性菌株。選擇出大約500個(gè)菌落，使用pPEC32的ClaI-StuI部分(620bp)作為探針進(jìn)行菌落雜交。與探針雜交的菌落中選出一個(gè)菌株，即大腸桿菌DHI(pUH32)(IFO14900，F(xiàn)ERM BP-2534，于1989年7月26日保藏)，從中得到質(zhì)粒pUH32。提取大量的pUH32并用各種限制酶消化之。根據(jù)其電泳圖形，得到圖2所示的限制性酶切圖。
ⅳ)嘌呤操縱子上游核苷酸順序的測(cè)定為了測(cè)定上述ⅲ)中得到的PUH32之EcoRV-SphI片段(約500bp)的核苷酸順序，用EcoRV和SphI雙重消化pUH32(1μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以得到一片段(約500bp)。然后將其與用SmaI和SphI雙消化的pUC119(0.5μg)連接，并用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.，Japan提供)，以得到氨芐青霉素抗性菌株。由其中一個(gè)菌株提取質(zhì)粒并測(cè)定其核苷酸順序。所測(cè)得的順序如圖3所示。該核苷酸順序與Ebbole，D.J.et al.，J.Biol.Chem.，262，8274-8287所報(bào)導(dǎo)者完全相同。
ⅴ)缺陷型質(zhì)粒pBX118-9的構(gòu)建用ClaI消化上述ⅱ)中得到的pPEC32(10μg)并用BAL31消化處理30秒鐘。然后用XbaI完全消化并用瓊脂糖凝膠電泳法分離之，以得到相當(dāng)于大約3.6Kbp的DNA片段。將該DNA連接到用SmaI和XbaI雙重消化的pUC118(0.5μg)上，并用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以選擇氨芐青霉素抗性菌株。結(jié)果得到圖4中所示的質(zhì)粒pBX118-9。
ⅵ)pSKC的構(gòu)建用BamHI和PstI雙重消化pCAT15(0.5μg，Japanese Patent Laid Open Publication No.62-82096)，并用T4 DNA聚合酶使其被消化的末端變成平頭。使該DNA與用SmaI切割的BLUESCRIPT SK(0.5μg，Toyo Boseki Kabushiki Kaisha，Japan生產(chǎn))連接，并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以選擇氨芐青霉素抗性和氯霉素抗性菌株。由該抗性菌株中得到質(zhì)粒pSKC。
ⅶ)SP啟動(dòng)子的制備使用DNA合成儀(Applied Biosystems Japan Co.，Ltd.，Japan制造的DNA合成儀381A)，并按照廠商規(guī)定的程序制備可在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的啟動(dòng)子(圖5)。然后將其連接到用EcoRI和SacI切割的PUC19(0.5μg)上，并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以得到整合了SP啟動(dòng)子的質(zhì)粒pSP19。
ⅷ)pBXSC19的構(gòu)建用KpnI和XbaI雙重消化上述ⅶ)中制得的pSP19(0.5μg)。同時(shí)用XbaI消化上述ⅵ)中制得的pSKC并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得到cat基因(約1.0Kbp)。進(jìn)一步用KpnI和XbaI雙重消化上述ⅴ)中得到的pBX118-9，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得到-DNA片段(約3.6Kbp)。
混合這三個(gè)片段，使之連接并用此轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以選擇氨芐青霉素抗性菌株，即大腸桿菌JM109(pBXSC19)(IFO14901，F(xiàn)ERM BP-2535，已于1989年7月26日保藏)。結(jié)果，得到圖6所示的質(zhì)粒pBXSC19。
實(shí)施例2ⅰ)用pBXSC19轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌168的PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性用實(shí)施例1 ⅷ)中得到的pBXSC19(1μg)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，以得到氯霉素抗性菌株。將其中一個(gè)菌株培養(yǎng)在分別含有腺嘌呤和鳥嘌呤的SPI培養(yǎng)基中，并測(cè)定PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性。作為對(duì)照，也測(cè)定了枯草芽孢桿菌168的活性。結(jié)果如表1所示。
表1菌株 SPI SPI +腺嘌呤 SPI+鳥嘌呤枯草芽孢桿菌168 5.4 1.4 1.0枯草芽孢桿菌168 18 18 11(pBXSC19)(單位數(shù))ⅱ)次黃苷-鳥苷生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌BM1032的轉(zhuǎn)化用實(shí)施例1 ⅷ)中得到的pBXSC19(1μg)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BM1032(IFO14459，F(xiàn)ERM BP-1242)，以得到氯霉素(10μg/ml)抗性菌株。其中一個(gè)轉(zhuǎn)化體被定名為枯草芽孢桿菌BM2032(IFO14902，F(xiàn)ERM BP-2536，于1989年7月26日保藏)。
ⅲ)枯草芽孢桿菌BM2032之次黃苷和鳥苷的生產(chǎn)量取1采菌環(huán)枯草芽孢桿菌BM2032接種到LB培養(yǎng)基(5ml)上，并于37℃下振蕩保溫12小時(shí)。取其1ml轉(zhuǎn)移到表2所示的培養(yǎng)基(20ml)上并于37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)完成后，用高效液相層析法檢測(cè)培養(yǎng)液中積聚的次黃苷和鳥苷的量。結(jié)果，次黃苷為14mg/ml，鳥苷為2mg/ml。
另一方面，按上述同樣條件培養(yǎng)枯草芽孢桿菌BM1032。結(jié)果可知次黃苷積聚量為8.0mg/ml鳥苷則僅為1.1mg/ml。
表2培養(yǎng)基成份 濃度(g/升)葡萄糖 120谷氨酸鈉 12硝酸銨 20DL-α-丙氨酸 0.3酪蛋白氨基酸 10色氨酸 0.2亮氨酸 0.2RNA 2生物素 0.0002磷酸二氫鉀 2氯化鉀 1硫酸鎂 1硫酸亞鐵 0.005硫酸錳 0.01碳酸鈣 15PH 7.5
實(shí)施例3ⅰ)缺陷型質(zhì)粒pSB22的構(gòu)建用SacI、SphI和StuI三重消化實(shí)施例1ⅲ)中制得的pUH32(0.5μg)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法分離回收含有啟動(dòng)子的片段(約800bp)然后將該DNA連接到用SacI和SphI雙重消化的pUC118(0.5μg)上，并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，選擇氨芐青霉素抗性菌株，得到質(zhì)粒pUSS118。
然后用SphI消化pUSS118(10μg)，用BAL31消化處理30秒鐘，用SacI消化并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以回收相當(dāng)于500bp的DNA片段。將該DNA連接到用SacI和SmaI雙重消化的pUC118(0.5μg)上并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以選擇氨芐青霉素抗性菌株。結(jié)果得到如圖7所示的質(zhì)粒pSB22。
ⅱ)pBEI203的構(gòu)建用KpnI消化實(shí)施例1ⅴ)中制得的pBX118-9(10μg)并進(jìn)行BAL31消化處理30秒鐘。然后用EcoRI消化并用瓊脂糖凝膠電泳法分離之，得到相當(dāng)于大約3.6Kbp的DNA。用HincⅡ和EcoRI雙重消化該DNA，連接到pUC118(0.5μg)上并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以選擇氨芐青霉素抗性菌株。結(jié)果得到了如圖8所示的質(zhì)粒pBEI203。
ⅲ)pDT32的構(gòu)建用EcoRV和HindⅢ雙重消化上述ⅰ)中得到的pSB22(0.5μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離得到一個(gè)約200bp的片段。使該DNA連接到用EcoRV和HindⅢ酶切的BLUESCRIPT SK上并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。選擇氨芐青霉素抗性菌株以得到質(zhì)粒pSK22。然后用EcoRI和PstI雙重消化pSK22(0.5μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離之，以回收一個(gè)長(zhǎng)約220bp的片段。另一方面，用PstI和HindⅡ雙重消化上述ⅱ)中得到的pBEI203(0.5μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以回收一個(gè)長(zhǎng)約1.2Kbp的片段。另外，用HindⅡ和BamHI雙重消化pCAT15(0.5μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以回收一個(gè)長(zhǎng)約1.0Kbp的片段。同樣地，用EcoRI和BamHI雙重消化pBR322(0.5μg)并用瓊脂糖凝膠電泳法分離以回收一個(gè)長(zhǎng)約3.9Kbp的片段?；旌喜⑦B接這四個(gè)片段，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294(ATCC33625)以選擇一個(gè)氨芐青霉素抗性菌株。結(jié)果得到如圖9所示的質(zhì)粒pDT32。
實(shí)施例4ⅰ)用pDT32轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌168的PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性用實(shí)施例3ⅲ)中得到的pDT32(1μg)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，以得到氯霉素(10μg/ml)抗性菌株。在SPI培養(yǎng)基、含有腺嘌呤的SPI培養(yǎng)基和含有鳥嘌呤的SPI培養(yǎng)基中培養(yǎng)其中一個(gè)菌株，并檢測(cè)PRPP酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性。作為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定枯草芽孢桿菌168的活性。結(jié)果如表3所示。
表3菌株 SPI SPI+腺嘌呤 SPI+鳥嘌呤枯草芽孢桿菌168 5.4 1.4 1.0枯草芽孢桿菌168 7.4 2.2 5.7(pDT32)(單位數(shù))ⅱ)次黃苷-鳥苷生產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌BM1032菌株的轉(zhuǎn)化用實(shí)施例3ⅲ)中得到的pDT32(1μg)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BM1032菌株，以得到氯霉素(10μg/ml)抗性菌株。其中一個(gè)菌株定名為枯草芽孢桿菌BM2232(IFO 15040，F(xiàn)ERM BP-2937，其已于1990年5月28日保藏)。
ⅲ)枯草芽孢桿菌BM2232菌株之次黃苷和鳥苷的生產(chǎn)量按照實(shí)施例2ⅲ)中所述的同樣方法培養(yǎng)上述ⅱ)中得到的枯草芽孢桿菌BM2232，并測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的次黃苷和鳥苷的量。結(jié)果測(cè)得次黃苷為13mg/ml，鳥苷為2mg/ml。另一方面，對(duì)照組枯草芽孢桿菌BM1032菌株的次黃苷積聚量?jī)H為8.0mg/ml，鳥苷積聚量?jī)H為1.1mg/ml。
權(quán)利要求
1.含有負(fù)責(zé)表達(dá)芽孢桿菌屬微生物之嘌呤操縱子的DNA順序及該順序3′相鄰區(qū)DNA的染色體DNA，所說的負(fù)責(zé)表達(dá)嘌呤操縱子之DNA順序的一部分或全部受到修飾，從而提高了表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中被修飾的DNA順序部分是與腺嘌呤相關(guān)物質(zhì)的抑制作用有關(guān)的DNA區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中被修飾的DNA順序部分是與鳥嘌呤相關(guān)物質(zhì)的抑制作用有關(guān)的DNA區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其中被修飾的DNA順序部分是嘌呤操縱子的啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA，其中嘌呤操縱子的啟動(dòng)子被可表達(dá)的不同啟動(dòng)子所取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA，其中不同的啟動(dòng)子是得自于芽孢桿菌屬微生物之染色體DNA或芽孢桿菌屬微生物之噬菌體的不同的啟動(dòng)子。
7.整合了根據(jù)權(quán)利要求1之DNA的載體。
8.整合了根據(jù)權(quán)利要求2之DNA的載體。
9.整合了根據(jù)權(quán)利要求3之DNA的載體。
10.整合了根據(jù)權(quán)利要求4之DNA的載體。
11.整合了根據(jù)權(quán)利要求5之DNA的載體。
12.整合了根據(jù)權(quán)利要求6之DNA的載體。
13.用根據(jù)權(quán)利要求1的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
14.用根據(jù)權(quán)利要求2的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
15.用根據(jù)權(quán)利要求3的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
16.用根據(jù)權(quán)利要求4的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
17.用根據(jù)權(quán)利要求5的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
18.用根據(jù)權(quán)利要求6的DNA轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
19.用根據(jù)權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
20.用根據(jù)權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
21.用根據(jù)權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
22.用根據(jù)權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
23.用根據(jù)權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
24.用根據(jù)權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化的能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物。
25.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生和積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
26.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
27.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求15的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
28.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生和積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
29.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求17的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生和積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
30.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求18的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
31.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求19的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
32.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求20的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
33.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求21的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
34.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求22的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
35.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求23的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
36.生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24的芽孢桿菌屬微生物，以產(chǎn)生并積聚次黃苷和/或鳥苷，然后收集所得產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了經(jīng)修飾的染色體DNA，該DNA含有負(fù)責(zé)表達(dá)芽孢桿菌屬微生物之嘌呤操縱子的DNA順序以及其3′相鄰區(qū)DNA，所說的負(fù)責(zé)表達(dá)嘌呤操縱子的DNA順序的一部分或全部受到了修飾，從而提高了表達(dá)的水平。還公開了被該已修飾之DNA整合的載體，用該DNA或載體轉(zhuǎn)化的、能夠產(chǎn)生次黃苷和/或鳥苷的芽孢桿菌屬微生物、以及使用上述微生物生產(chǎn)次黃苷和/或鳥苷的改良方法。
文檔編號(hào)C12P19/40GK1049186SQ9010664
公開日1991年2月13日 申請(qǐng)日期1990年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1989年8月4日
發(fā)明者宮川一郎, 神崎直之 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社