用于檢測(cè)核苷酸修飾的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及修飾的胞嘧啶殘基，如5-甲基胞嘧啶（5mC）、5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）和5-甲?；奏ぃ?fC）的識(shí)別，以與樣品核苷酸序列中的胞嘧啶（C）區(qū)別開(kāi)來(lái)。本方法可包括氧化或還原包括樣品核苷酸序列的多核苷酸的第一部分；用重亞硫酸鹽處理氧化的或還原的多核苷酸的第一部分和第二部分；在步驟ii）和iii）后，測(cè)序群體中第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中胞嘧啶的第一和第二核苷酸序列中的殘基。這些方法例如可用于基因組DNA和/或RNA的分析中。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)核苷酸修飾的方法
[0001]本發(fā)明涉及修飾的胞嘧啶殘基的檢測(cè)，特別地，涉及包含修飾的胞嘧啶殘基的核苷酸的測(cè)序。
[0002]5-甲基胞嘧啶(5mC)是充分研究的、在基因沉默和基因組穩(wěn)定性中扮演著重要角色的表觀遺傳DNA標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)其富含于CpG 二核苷酸中(I)。在后生動(dòng)物中，5mC可通過(guò)10-11轉(zhuǎn)位(TET)家族的酶氧化成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC) (2，3)。5hmC的整體水平大概比5mC的整體水平低10倍，并在組織之間變化(4)。相對(duì)高數(shù)量的5hmC(~所有胞嘧啶的0.4%)存在于胚胎干(ES)細(xì)胞中，其中5hmC被認(rèn)為在建立和/或維護(hù)多能性中發(fā)揮作用(2，3，5-9)。5hmC已被提議在活躍的DNA脫甲基中作為中間體，例如通過(guò)脫氨基或經(jīng)由進(jìn)一步的利用TET酶將5hmC氧化為5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5cC)，隨后是涉及胸苷嘧啶-DNA糖基酶(TDG)的堿基切除修復(fù)或在復(fù)制中未能保持標(biāo)記(10)。然而，5hmC本身也可構(gòu)成表觀遺傳標(biāo)記。
[0003]在總基因組DNA中通過(guò)包括薄層色譜法和串聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜法的分析方法檢測(cè)和定量5hmC的水平是可能的(2，11，12)。因此，映射5hmC的基因組位置迄今為止通過(guò)富集法實(shí)現(xiàn)，該方法采用化學(xué)法或抗體用于DNA碎片的5hmC特異性沉淀，然后對(duì)DNA碎片進(jìn)行測(cè)序(6-8、13-15)。這些拖下(pull-down)方法具有相對(duì)較差的分辨率(IOs-1OOs的核苷酸)，并且只給出相對(duì)的定量信息，這在富集中有可能受到分配偏置?？闪炕?mC的單核苷酸序列已使用重亞硫酸鹽測(cè)序(BS-Seq)完成，所述重亞硫酸鹽測(cè)序利用重亞硫酸鹽介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，這樣相應(yīng)的5mC的轉(zhuǎn)化是較慢的(16)。但是，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，5mC和5hmC在重亞硫酸鹽反應(yīng)中脫氨基都是很慢的，因此這兩個(gè)堿基不能夠被區(qū)別(17，18)。兩個(gè)相對(duì)新的和簡(jiǎn)潔的單分子方法在以單核苷酸的分辨率檢測(cè)5mC和5hmC中顯示出希望。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT)已在基因組DNA中被示出以檢測(cè)衍生的5hmC(19)。然而，包含5hmC的DNA碎片的富集 是必需的，它將導(dǎo)致定量信息的損失(19)。5mC可通過(guò)SMRT被檢測(cè)到，盡管具有較低的精確度(19)。此外，SMRT具有相對(duì)高的測(cè)序錯(cuò)誤比率(20)，修飾的峰值呼叫(calling)是不精確的(19)，并且所述平臺(tái)還不能測(cè)序整個(gè)基因組。蛋白質(zhì)和固態(tài)納米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，有可能測(cè)序未擴(kuò)增的DNA分子(21，22)。
[0004]本發(fā)明人已設(shè)計(jì)了允許修飾的胞嘧啶殘基(如5-甲基胞嘧啶(5mC)、5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲?；奏?5fC))以單核苷酸的分辨率區(qū)別于胞嘧啶(C)的方法。這些方法適用于所有的測(cè)序平臺(tái)，并且例如在基因組DNA和/或RNA的分析中可能是有用的。
[0005]本發(fā)明的一方面提供了一種在樣品核苷酸序列中識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法，包括:
[0006](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0007](ii)氧化或還原所述群體的第一部分，
[0008](iii)用重亞硫酸鹽處理氧化或還原的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分，
[0009](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；
[0010](V)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一和第二核苷酸序列中的殘基。
[0011]在第一和第二核苷酸序列中識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的殘基，表明胞嘧啶殘基的修飾。
[0012]例如，胞嘧啶殘基可能存在于樣品核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位置。在第一和第二核苷酸序列中的這些一個(gè)或多個(gè)位置上的殘基可以被識(shí)別。在樣品核苷酸序列的位置上修飾的胞嘧啶可從第一和第二核苷酸序列中分別在那位置上識(shí)別的殘基的組合被識(shí)別(如C和C、U和U、C和U、或U和C)。通過(guò)不同組合表明胞嘧啶的修飾，如表1所示。
[0013]修飾的胞嘧啶殘基可能包含在5位的修飾。適當(dāng)修飾的胞嘧啶包括5-取代的胞嘧啶。
[0014]在胞嘧啶5位可被取代的基團(tuán)包括:甲基(m);輕甲基(hm)或甲?；?f)基團(tuán)。
[0015]在本文中描述的方法可用于識(shí)別和/或區(qū)別樣品核苷酸序列中的胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲?；奏?5fC)。例如，本文中描述的方法可用于將由胞嘧啶(C)、5_甲基胞嘧啶(5mC)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲?；奏?5fC)組成的組中的一個(gè)殘基區(qū)別于組中的其它殘基。
[0016]優(yōu)選的，修飾的胞嘧啶殘基，如5-羥甲基胞嘧啶，在步驟ii)的氧化或還原之前，在所述群體的第一部分中并未標(biāo)記，例如并未標(biāo)記有取代基，如葡萄糖。
[0017]在本發(fā)明的一些實(shí)`施例中，所述群體中的多核苷酸的第一部分可以被氧化。例如，多核苷酸的第一部分中5-羥甲基胞嘧啶殘基通過(guò)氧化可以被轉(zhuǎn)化為5-甲?；奏?5fC)，之后多核苷酸的第一部分用重亞硫酸鹽處理。
[0018]在樣品核苷酸序列中識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法可以包括:
[0019](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0020](ii)氧化所述群體的第一部分，
[0021](iii)用重亞硫酸鹽處理氧化的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分，
[0022](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；
[0023](V)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一和第二核苷酸序列中的殘基。
[0024]在第一和第二核苷酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)位置上識(shí)別出的殘基為第一和第二核苷酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中的胞嘧啶，表明樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
[0025]在樣品核苷酸序列中5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)可被識(shí)別。第一核苷酸序列中的位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的尿嘧啶殘基和第二核苷酸序列中相同位置上的胞嘧啶，表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。
[0026]例如，在樣品核苷酸序列中識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)殘基或在樣品核苷酸序列中將5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)區(qū)別于胞嘧啶(C)、5_甲基胞嘧啶和5-甲?；奏?5fC)的方法可包括:
[0027](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，[0028](ii)氧化所述群體的第一部分，
[0029](iii)用重亞硫酸鹽處理氧化的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分，
[0030](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；
[0031](V)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一和第二核苷酸序列中的殘基;
[0032]其中，在第一核苷酸序列中存在尿嘧啶殘基和在第二核苷酸序列中存在胞嘧啶，表明在樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-羥甲基胞嘧啶。
[0033]5-甲基胞嘧啶(5mC)在樣品核苷酸序列中可被識(shí)別。在第一和第二兩個(gè)核苷酸序列中位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的胞嘧啶，表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
[0034]例如，在樣品核苷酸序列中識(shí)別5-甲基胞嘧啶或在樣品核苷酸序列中將5-甲基胞嘧啶區(qū)別于胞嘧啶(C)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)的方法可包括:
[0035](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0036](ii)氧化所述群體的第一部分，
[0037](iii)用重亞硫酸鹽處理氧化的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分，
[0038](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；
[0039](V)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一和第二核苷酸序列中的殘基，
[0040]其中，在第一和第二兩個(gè)核苷酸序列中存在胞嘧啶，表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
[0041]在第一和第二兩個(gè)核苷酸序列兩者中的位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的尿嘧啶殘基，表明在樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基不是5-甲基胞嘧啶，也不是5-羥甲基胞嘧啶，即，胞嘧啶殘基為未修飾的胞嘧啶或5-甲?；奏?。
[0042]表1示出了在樣品核苷酸序列中的位置上的胞嘧啶修飾的總結(jié),所述胞嘧啶的修飾通過(guò)在第一和第二核苷酸序列中的該位置上的胞嘧啶和尿嘧啶的具體組合表明。
[0043]所述多核苷酸群體的第一和第二部分可用重亞硫酸鹽處理和/或同時(shí)的或相繼的測(cè)序。
[0044]在一些實(shí)施例中，在步驟ii)中第一部分被氧化，可以不用處理第二部分來(lái)識(shí)別或區(qū)別樣品核苷酸序列中修飾的胞嘧啶殘基。例如，表1示`出，氧化及用重亞硫酸鹽處理所述多核苷酸群體的第一部分足以在樣品核苷酸序列中識(shí)別5-甲基胞嘧啶。在樣品核苷酸序列中識(shí)別5-甲基胞嘧啶或?qū)?-甲基胞嘧啶區(qū)別于胞嘧啶(C)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲?；奏?5fC)的方法可包括:
[0045](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0046](ii)氧化所述群體，
[0047](iii)用重亞硫酸鹽處理氧化的所述群體，
[0048](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的多核苷酸，以生成處理的核苷酸序列，以及；
[0049](V)識(shí)別處理的核苷酸序列中的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的殘基，其中，在處理的核苷酸序列中存在胞嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
[0050]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述群體的多核苷酸的第一部分可在步驟ii)中被還原。在樣品核苷酸序列中識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法可包括:
[0051](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0052](ii)還原所述群體的第一部分，
[0053](iii)用重亞硫酸鹽處理還原的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分，
[0054](iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的第一和第二部分的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及；
[0055](V)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一和第二核苷酸序列中的殘基。
[0056]該方法用于在樣品核苷酸序列中識(shí)別和/或區(qū)別5-甲?；奏?5fC)。
[0057]在實(shí)施例中，第一部分被還原，第一核苷酸序列中的位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的胞嘧啶和第二核苷酸序列中這個(gè)位置上的尿嘧啶殘基表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲?；奏?；在第一和第二核苷酸序列中位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基`的尿嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為未修飾的胞嘧啶；并且在第一和第二兩個(gè)核苷酸序列兩者中的位置上的對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的胞嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。
[0058]表1示出了在樣品核苷酸序列中位置上的胞嘧啶修飾的總結(jié),所述胞嘧啶修飾通過(guò)在第一和第二核苷酸序列中位置上的胞嘧啶和尿嘧啶的具體組合表明。
[0059]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括測(cè)序已被氧化或用重亞硫酸鹽處理的多核苷酸的第一部分；已用重亞硫酸鹽處理的多核苷酸的第二部分；已被還原或用重亞硫酸鹽處理的所述群體的多核苷酸的第三部分。例如，方法可包括:
[0060](i)提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0061](ii)提供所述群體的第一、第二和第三部分，
[0062](iii)氧化所述群體的第一部分，
[0063](iv)還原所述群體的第三部分，
[0064](V)用重亞硫酸鹽處理所述群體的第一、第二和第三部分，
[0065](vi)在步驟iii)、iv)和V)后，測(cè)序所述群體的第一、第二和第三部分中的多核苷酸，以分別生成第一、第二和第三核苷酸序列，以及；
[0066](vii)識(shí)別對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的第一、第二和第三核苷酸序列中的殘基。
[0067]例如，該方法可用于從胞嘧啶和/或其它修飾的胞嘧啶中識(shí)別和/或區(qū)別樣品核苷酸序列中的5-甲?；奏?5fC)。
[0068]第一和第二核苷酸序列中位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的尿嘧啶和第三核苷酸序列中這個(gè)位置上的胞嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲?；奏ぁ?br> [0069]在第一、第二和第三核苷酸序列中位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的胞嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
[0070]在第二和第三核苷酸序列中位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的胞嘧啶和第一核苷酸序列中這個(gè)位置上的尿嘧啶殘基表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。
[0071]在第一、第二和第三核苷酸序列中位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的尿嘧啶表明樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為未修飾的胞嘧啶。
[0072]表1示出了，在樣品核苷酸序列中位置上的胞嘧啶修飾的總結(jié),所述胞嘧啶修飾通過(guò)在第一、第二和第三核苷酸序列中位置上的胞嘧啶和尿嘧啶的具體組合表明。
[0073]樣品核苷酸序列可能已被認(rèn)知或它可能已被確定。樣品核苷酸序列為所述群體中未處理的多核苷酸的序列，即尚未被氧化、還原或用重亞硫酸鹽處理的多核苷酸。在樣品核苷酸序列中，修飾的胞嘧啶不能區(qū)別于胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶、5-甲?；奏ず?-羥甲基胞嘧啶的修飾的胞嘧啶均被表明是或確定為樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基。例如，本文中描述的任意一種方法可進(jìn)一步包括:
[0074]提供包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體的第四部分；以及
[0075]測(cè)序第四部分中的所述多核苷酸以生成樣品核苷酸序列。
[0076]第四部分中多核 苷酸的序列可通過(guò)任意適合的測(cè)序技術(shù)確定。
[0077]在樣品核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基的位置可被確定。這可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)序列分析完成。由于修飾的胞嘧啶不區(qū)別于胞嘧啶，那么在樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基可以是胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
[0078]第一和第二核苷酸序列以及可選的第三核苷酸序列可與樣品核苷酸序列相比較。例如，在第一和第二序列及可選的第三核苷酸序列中的位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基的殘基可被識(shí)別。
[0079]樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的修飾可由第一和第二核苷酸序列以及可選的第三核苷酸序列中對(duì)應(yīng)位置上的核苷酸的識(shí)別來(lái)確定。
[0080]所述群體中多核苷酸均包含相同的樣品核苷酸序列，即，樣品核苷酸序列與所述群體中所有的多核苷酸相同。
[0081]然后，如本文所描述的，可確定對(duì)樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的不同處理效果。
[0082]樣品核苷酸序列可以是基因組序列。例如，所述序列可包括基因序列的全部的或部分，包括外顯子、內(nèi)含子或上游或下游調(diào)控基因的基因序列，或所述序列可包括與基因無(wú)關(guān)的基因組序列。在一些實(shí)施例中，所述樣品核苷酸序列可包括一個(gè)或多個(gè)CpG島。
[0083]適合的多核苷酸包括DNA，優(yōu)選為基因組DNA，和/或RNA，如基因組RNA (如哺乳動(dòng)物、植物或病毒的基因組RNA)、mRNA、tRNA、rRNA和非編碼RNA。
[0084]包括樣品核苷酸序列的多核苷酸可以從細(xì)胞樣品中得到或分離，所述細(xì)胞樣品例如為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選為人類細(xì)胞。
[0085]適合的樣品包括分離的細(xì)胞和組織樣品，如活檢。
[0086]已在包括胚胎干細(xì)胞(ESCS)和神經(jīng)細(xì)胞的一系列細(xì)胞類型中檢測(cè)到包括5hmC和5fC的修飾的胞嘧啶殘基(2，3，11，37，38)。[0087]適合的細(xì)胞包括體細(xì)胞和生殖系細(xì)胞。
[0088]適合的細(xì)胞可處于培養(yǎng)的任意階段，包括徹底或部分分化的細(xì)胞或未分化的細(xì)胞或多能細(xì)胞，包括干細(xì)胞，如成熟或成體干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。
[0089]適合的細(xì)胞還可包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可來(lái)源于任意類型的體細(xì)胞。
[0090]例如，包括樣品核苷酸序列的多核苷酸可從神經(jīng)細(xì)胞中得到或分離，所述神經(jīng)細(xì)胞包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、收縮肌肉細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、激素合成細(xì)胞、皮脂細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮和尿路上皮細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。
[0091]適合的細(xì)胞包括疾病相關(guān)的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞，如癌、肉瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤或生殖系腫瘤細(xì)胞。
[0092]適合的細(xì)胞包括具有遺傳性疾病基因型的細(xì)胞，如亨丁頓舞蹈癥、囊胞性纖維癥、鐮狀細(xì)胞疾病、苯丙酮酸尿、唐氏綜合癥或馬方綜合征。
[0093]從細(xì)胞樣品中提取和分離基因組DNA和RNA的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，基因組DNA和RNA可使用任意適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)分離，如苯酚/氯仿提取和酒精沉淀法、氯化銫梯度離心、固相陰離子交換色譜法和以硅膠為基礎(chǔ)的技術(shù)。
[0094]在一些實(shí)施例中，在分離后，從細(xì)胞中分離的全部基因組DNA和RNA可直接被用作如本文所描述的多核苷酸的群體。在其它實(shí)施例中，分離的基因組DNA和/或RNA或許要經(jīng)受進(jìn)一步的準(zhǔn)備步驟。
[0095]基因組DNA和/或RNA可以是碎片的，例如通過(guò)超聲波法、剪切或核酸內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生基因組DNA碎片。可如本文中所描述的，使用基因組DNA和/或RNA的碎片。適合的基因組DNA和/或RNA的碎片可基于尺寸或其它標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施例中，可如本文中所描述的，使用富含CpG島(CGI)的基因組DNA和/或RNA的碎片。
[0096]基因組DNA和/或RNA可以是變性的，例如通過(guò)加熱或用變性劑處理。適用于基因組DNA和RNA變性的方法在本領(lǐng)域中是公知的。
[0097]在一些實(shí)施例中，在氧化或還原和用重亞硫酸鹽處理、或單獨(dú)用重亞硫酸鹽處理之前，基因組DNA和/或RNA可被修改用于測(cè)序。修改的本質(zhì)取決于所采用的測(cè)序方法。例如，對(duì)于一些測(cè)序方法，在分裂之后，引物可被結(jié)合到基因組DNA和/或RNA碎片的自由端。適合的引物可包含5mC，以防止引物序列在如本文所描述的氧化或還原和用重亞硫酸鹽處理、或單獨(dú)用重亞硫酸鹽處理的過(guò)程中改變。在其它實(shí)施例中，在如本文所描述的氧化、還原和/或用重亞硫酸鹽處理之后，基因組DNA和/或RNA可被修改用于測(cè)序。
[0098]在分餾、變性、修改和/或其它準(zhǔn)備步驟之后，基因組DNA和/或RNA可通過(guò)任意適合的技術(shù)純化。
[0099]在準(zhǔn)備之后，多核苷酸群體可被提供為如本文所描述的適于進(jìn)一步處理的形式。例如，多核苷酸群體在如本文所描述的處理之前可存在于沒(méi)有緩沖液的水溶液中。
[0100]如本文所描述使用的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈。
[0101]多核苷酸群體可 以被分為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的部分，它們中的每一個(gè)包含有包括樣品核苷酸序列的多核苷酸。這些部分可如本文所描述的被分別處理或測(cè)序。
[0102]優(yōu)選的，在氧化和/或還原之前，多核苷酸的這些部分不會(huì)被處理成添加標(biāo)簽或添加取代基團(tuán)(如葡萄糖)至樣品核苷酸序列中的5-羥甲基胞嘧啶殘基。
[0103]包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體的第一部分可被氧化。在樣品核苷酸序列中氧化可轉(zhuǎn)化任意的5-羥甲基胞嘧啶為5-甲?；奏ぁＱ趸梢允菬o(wú)酶介導(dǎo)的氧化，例如使用有機(jī)的或無(wú)機(jī)的化學(xué)氧化劑，優(yōu)選地在變性的條件下。
[0104]所述第一部分可通過(guò)用氧化劑處理被氧化。所述氧化劑為任意適于使醇生成醛的試劑。所述氧化劑或氧化步驟采用的條件可被選擇為使得任意的5-羥甲基胞嘧啶被選擇性氧化。因此，在多核苷酸中實(shí)質(zhì)上沒(méi)有其它官能團(tuán)在氧化步驟中被氧化。因此，氧化步驟不會(huì)引發(fā)其中存在的任意的胸腺嘧啶或5-甲基胞嘧啶殘基反應(yīng)。所述氧化劑或所述條件可被選擇為最小化或防止所述多核苷酸的任何降解。
[0105]氧化劑的使用可導(dǎo)致一些對(duì)應(yīng)的5-羧基胞嘧啶產(chǎn)物的形成。這類產(chǎn)物的形成對(duì)本文中描述的識(shí)別方法不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。在用于轉(zhuǎn)化5-甲?；奏槟蜞奏さ闹貋喠蛩猁}反應(yīng)條件下，還可以觀察到5-羧基胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。可以理解的是，通過(guò)氧化5-羥甲基胞嘧啶得到的5-甲酰基胞嘧啶的參考也可以是通過(guò)上述氧化得到的包括5-羧基胞嘧啶的產(chǎn)物的參考。
[0106]上述氧化劑可以是無(wú)酶氧化劑，例如，有機(jī)的或無(wú)機(jī)的化學(xué)化合物。
[0107]適合的氧化劑在本領(lǐng)域中是公知的，包括金屬氧化物，如KRu04、MnO2和ΚΜη04。尤其有用的氧化劑是在水性條件下可使用的那些，因?yàn)檫@樣操作所述多核苷酸是最為方便的。然而，適用于有機(jī)溶劑中的氧化劑也可以在可行時(shí)被使用。
[0108]在一些實(shí)施例中，所述氧化劑可包括過(guò)釕酸鹽陰離子(Ru04_)。適合的過(guò)釕酸鹽氧化劑包括有機(jī)的和無(wú)機(jī)的過(guò)釕酸鹽，如過(guò)釕酸鉀(KRuO4)和其它金屬過(guò)釕酸鹽；季銨陽(yáng)離子過(guò)釕酸鹽，如四丙基過(guò)釕酸銨(TPAP)和四丁基過(guò)釕酸銨(TBAP);聚合物負(fù)載的過(guò)釕酸鹽(PSP)和四苯基膦釕。
`[0109]有利地，所述氧化劑或氧化條件還可在變性狀態(tài)保存多核苷酸。
[0110]在用所述氧化劑處理之后，第一部分中的多核苷酸可被純化。
[0111]可使用任意適合的核酸純化技術(shù)進(jìn)行純化。適合的核酸純化技術(shù)包括離心柱層析。
[0112]所述多核苷酸可能經(jīng)受進(jìn)一步、重復(fù)的氧化步驟。采取這種步驟以最大程度的轉(zhuǎn)化5-羥甲基胞嘧啶為5-甲?；奏?。多核苷酸具有足夠的能夠二次退火的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是必要的。所述多核苷酸的任意退火部分可限制或防止氧化劑進(jìn)入到具有保護(hù)5-羥甲基胞嘧啶不受氧化效果的所述結(jié)構(gòu)的那個(gè)部分中。
[0113]在一些實(shí)施例中，多核苷酸群體的第一部分例如，可經(jīng)受用氧化劑處理的多個(gè)循環(huán)后再純化。例如，進(jìn)行一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或多于三個(gè)的循環(huán)。
[0114]在一些實(shí)施例中，包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體的第一部分可被還原。在其它實(shí)施例中，包括樣品核苷酸序列的多核苷酸群體的第三部分可被還原。還原的多核苷酸的第一或第三部分轉(zhuǎn)化樣品核苷酸序列中的5-甲?；奏埢鶠?-羥甲基胞嘧啶。
[0115]多核苷酸的第一或第三部分可通過(guò)用還原劑處理被還原。所述還原劑為任意適于使醛生成醇的試劑。所述還原劑或還原步驟采用的條件可被選擇為使得任意的5-甲酰基胞嘧啶被選擇性還原(即對(duì)于5-甲?；奏ぃ€原劑或還原條件是有選擇性的)。因此，在多核苷酸中實(shí)質(zhì)上沒(méi)有其它官能團(tuán)在還原步驟中被還原。所述還原劑或所述條件可被選擇以最小化或防止所述多核苷酸的任何降解。
[0116]適合的還原劑在本領(lǐng)域中是公知的，并包括NaBH4、NaCNBH4和LiBH4。尤其有用的還原劑是在水性條件下可使用的那些，因?yàn)檫@樣操作所述多核苷酸是最為方便的。然而，適用于有機(jī)溶劑中的還原劑也可以在可行時(shí)被使用。
[0117]在分別地氧化和還原之后，用重亞硫酸鹽處理所述群體的第一部分以及可選的第三部分。沒(méi)有被氧化或還原的所述群體的第二部分也用重亞硫酸鹽處理。
[0118]用重亞硫酸鹽處理將多核苷酸中的胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。如上面所看到的，在多核苷酸中存在有5-羧基胞嘧啶(如氧化步驟的產(chǎn)物)，這個(gè)5-羧基胞嘧啶在重亞硫酸鹽處理中轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。不希望受到理論的束縛，我們認(rèn)為，5-甲酰基胞嘧啶的反應(yīng)通過(guò)損失甲?；缘玫桨奏?，然后進(jìn)行后續(xù)的脫氨基以得到尿嘧啶。我們認(rèn)為，5-羧基胞嘧啶是通過(guò)后續(xù)的脫羧和脫氨步驟得到尿嘧啶的。在如本文中所描述的將多核苷酸中的胞嘧啶和5-甲?；奏ざ呋?-羧基胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的情況下，可以進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。
[0119]所述群體的部分可通過(guò)與重亞硫酸鹽陰離子(HS032_)培養(yǎng)來(lái)用重亞硫酸鹽進(jìn)行處理。
[0120]使用重亞硫酸鹽陰離子(HSO32O轉(zhuǎn)化核酸中未甲基化的胞嘧啶在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)操作，適合的試劑和條件對(duì)于技術(shù)人員是公知的(39_42)。許多適合的方案和試劑也可市售可得(例如 EpiTect?, Qiagen NL; EZ DNA Methylation? 酶研究公司(Zymo Research Corp)CA;Cp基因組超快重亞硫酸鹽修飾盒(CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit);密理博(Millipore))。
[0121]本文中所描述 的方法的特征是轉(zhuǎn)化未甲基化的胞嘧啶(可在5-甲?；奏せ?-羧基胞嘧啶的原位產(chǎn)生)為尿嘧啶。這一反應(yīng)典型的通過(guò)使用重亞硫酸鹽實(shí)現(xiàn)。然后，在本發(fā)明的總體方面中，任意試劑或反應(yīng)條件可被用于影響胞嘧啶到尿嘧啶的轉(zhuǎn)化。這類試劑盒條件可被選擇，以使5-甲基胞嘧啶很少反應(yīng)或不反應(yīng)，并且更具體的，以使5-甲基胞嘧啶很少反應(yīng)或不反應(yīng)以形成尿嘧啶。所述試劑、或可選的進(jìn)一步的試劑也可影響5-甲?；奏せ?-羧基胞嘧啶到胞嘧啶或尿嘧啶的轉(zhuǎn)化。
[0122]在培養(yǎng)之后，多核苷酸的所述部分可被固定、洗滌、變性、洗脫和/或進(jìn)行其它所
需的處理。
[0123]在一些實(shí)施例中，所述群體的多核苷酸的第一、第二和第三部分可在如本文中所描述的處理之后被擴(kuò)增。這可有助于進(jìn)一步的操作和/或測(cè)序。多核苷酸的第一、第二和第三部分的改變的序列可在擴(kuò)增后備保存。適合的多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，包括PCR。多核苷酸的第一、第二和第三部分中的位置上的尿嘧啶(U)殘基的存在可通過(guò)擴(kuò)增的多核苷酸相應(yīng)的那個(gè)位置上的胸腺嘧啶(T)殘基的存在被表明或識(shí)別。
[0124]如上面所描述的，多核苷酸在氧化、還原和/或重亞硫酸鹽處理之后修改為兼容于測(cè)序技術(shù)或平臺(tái)。修改的本質(zhì)取決于測(cè)序技術(shù)或平臺(tái)。例如，對(duì)于索來(lái)薩-啟迪(Solexa-1llumina)測(cè)序,處理的多核苷酸可以是碎片的,例如通過(guò)超聲法或限制性內(nèi)切核酸酶處理，根據(jù)需要修復(fù)了多核苷酸的自由端，并將引物連結(jié)到自由端上。
[0125]多核苷酸可使用任意適合的低或高通量測(cè)序技術(shù)或平臺(tái)測(cè)序，包括桑格(Sanger)測(cè)序(43)、索來(lái)薩-啟迪(Solexa-1llumina)測(cè)序(44)、以結(jié)合為基礎(chǔ)的(Ligation-based)測(cè)序(SOLiD?) (45)、焦磷酸測(cè)序(46);斯特羅布(strobe)測(cè)序(SMRT?)(47, 48);和半導(dǎo)體陣列(semiconductor array)測(cè)序(1n Torrent?) (49)。
[0126]適用于多核苷酸測(cè)序的方案、試劑和裝置在本領(lǐng)域是公知的，并且是市售可得的。
[0127]對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列中胞嘧啶的第一、第二和/或第三核苷酸序列中位置上的殘基可以被識(shí)別。
[0128]樣品核苷酸序列中位置上的胞嘧啶殘基的修飾可從如本文中所描述的第一、第二以及可選的第三核苷酸序列中對(duì)應(yīng)位置上的殘基的識(shí)別來(lái)確定。
[0129]樣品核苷酸序列中胞嘧啶修飾的程度和數(shù)量可被確定。例如，與未甲基化的胞嘧啶相比，樣品核苷酸序列中的5-羥甲基胞嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶的比例或數(shù)量可被確定。
[0130]如本文所描述的多核苷酸，例如，多核苷酸群體或所述群體的第一、第二、第三和第四的1、2、3或全部的4個(gè)部分可被固定在載體上。
[0131]實(shí)心載體是不可溶的、非凝膠狀的呈現(xiàn)表面的主體，所述多核苷酸被固定在所述表面上。適合的載體的實(shí)例包括載玻片、微孔板、膜或微球。所述載體可以是顆粒或固體形式，包括例如盤(pán)、試管、珠、球、過(guò)濾器、織物、聚合物或膜。多核苷酸可以，例如，被固定到惰性聚合物、96孔板、其它在核酸測(cè)序中或在其它研究環(huán)境中使用的裝置、設(shè)備或材料。固定多核苷酸到實(shí)心載體表面在本領(lǐng)域中是公知的。在一些實(shí)施例中，所述載體本身可以被固定。例如，微球可以固定在第二固體表面上。 [0132]在一些實(shí)施例中，多核苷酸群體的第一、第二、第三和/或第四部分在測(cè)序之前可被擴(kuò)增。優(yōu)選的，多核苷酸的部分在用重亞硫酸鹽處理后被擴(kuò)增。
[0133]適用于多核苷酸擴(kuò)增的方法在本領(lǐng)域是公知的。
[0134]在擴(kuò)增后，多核苷酸群體的擴(kuò)增部分可被測(cè)序。
[0135]利用基于計(jì)算機(jī)的序列分析，核苷酸序列可被比較，并且第一、第二和/或第三核苷酸序列中位置上的、對(duì)應(yīng)于樣品核苷酸序列胞嘧啶的殘基可被識(shí)別。
[0136]胞嘧啶修飾大于閾值的核苷酸序列(如CpG島)可以被識(shí)別。例如，其中大于1%、大于2%、大于3%、大于4%、大于5%的胞嘧啶為羥甲基化的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列可以被識(shí)別。
[0137]利用任意適合的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件可進(jìn)行基于計(jì)算機(jī)的序列分析。典型的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括中央處理單元(CPU)、輸入方式、輸出方式和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方式(如RAM)。優(yōu)選的提供顯示屏或其它圖像顯示。所述計(jì)算機(jī)可操作地連接到DNA和/或RNA測(cè)序儀。
[0138]例如，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括與本文所述的第一、第二和/或第三核苷酸序列相比，適合于識(shí)別樣品核苷酸序列中修飾的胞嘧啶的處理器。例如，所述處理器可適合于；
[0139](a)識(shí)別樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的位置，
[0140](b)識(shí)別樣品核苷酸序列中該胞嘧啶殘基位置上的第一、第二和/或第三核苷酸序列中的殘基，
[0141](C)根據(jù)對(duì)所述殘基的識(shí)別，確定樣品核苷酸序列中該位置上存在或不存在修飾的胞嘧啶殘基。
[0142]所述樣品核苷酸序列和第一、第二和第三核苷酸序列可從DNA和/或RNA測(cè)序儀送入處理器。所述序列可被顯示，例如在顯示器上。[0143]所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可進(jìn)一步包括用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)設(shè)備。核苷酸序列如基因組序列，和5fC、5hmC和其它修飾的胞嘧啶殘基的位置可被存儲(chǔ)于另一或相同存儲(chǔ)設(shè)備上，和/或被發(fā)送至輸出設(shè)備或在顯示器上顯示。這可有助于修飾的胞嘧啶(如基因組DNA中的5hmC和5fC)的映射。
[0144]識(shí)別和映射胞嘧啶修飾(如基因組中的5fC和5hmC)可用于神經(jīng)發(fā)育和功能及細(xì)胞分化、分裂和增殖的研究，以及疾病(如癌)的預(yù)知和診斷。
[0145]因此，利用本文所描述的方法來(lái)識(shí)別和/或映射修飾的胞嘧啶(如5fC和5hmC)也
可用于疾病中。
[0146]本發(fā)明的另一方面提供了用于如上所述的識(shí)別樣品核苷酸序列中修飾的胞嘧啶殘基的方法的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0147]a.氧化劑和/或還原劑；和
[0148]b.重亞硫酸鹽試劑。
[0149]適合的氧化劑、還原劑和重亞硫酸鹽試劑已在前面進(jìn)行了描述。
[0150]試劑盒可進(jìn)一步包括對(duì)照多核苷酸群體，所述對(duì)照多核苷酸群體包括一個(gè)或多個(gè)修飾的胞嘧啶殘基，例如胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)或5-甲?；奏?5fC)。在一些實(shí)施例中，對(duì)照多核苷酸群體可被分裂為一個(gè)或多個(gè)部分，每個(gè)部分都包括不同的修飾的胞嘧啶殘基。
[0151]試劑盒可包括用于`如上所描述的識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法的說(shuō)明。
[0152]試劑盒可包括本方法所需的一個(gè)或多個(gè)其它試劑，如緩沖液、測(cè)序或其它試劑。用于識(shí)別修飾的胞嘧啶的試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)用于執(zhí)行本方法的物品和/或試劑，如提供測(cè)試樣品本身的、包括DNA和/或RNA分離和純化試劑的裝置，以及樣品操作容器，這些部件通常是無(wú)菌的。
[0153]考慮到本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，本發(fā)明的多個(gè)進(jìn)一步的方面和實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。
[0154]說(shuō)明書(shū)提到的所有文件出于所有的目的通過(guò)引用它們的全部合并在此。
[0155]本文中使用的“和/或”被認(rèn)為是具體公開(kāi)了兩個(gè)具體特征的每一個(gè)，或帶有或不帶有其它部件的部件。例如(A和/或B)被認(rèn)為是具體公開(kāi)了⑴A，(ii)B和(iii)A和B的每一個(gè)，正如在文中單獨(dú)的列出每一個(gè)。
[0156]除非文中另有說(shuō)明，上文列出的特征的描述和定義不應(yīng)被限制為本發(fā)明的任何特殊方面或?qū)嵤├⑶业韧诒幻枋龅乃蟹矫婧蛯?shí)施例而應(yīng)用。
[0157]本發(fā)明的某些方面和實(shí)施例現(xiàn)將參照如下描述的附圖以舉例方式說(shuō)明。
[0158]圖1顯示了 5hmC的單堿基分辨率測(cè)序方法。圖1A示出了由氫氧化鈉在不同時(shí)間點(diǎn)淬滅的2’ -脫氧-5-甲酰胞嘧啶核苷(d5fC)和NaHSO3的反應(yīng)，之后通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)分析。誤差線是重復(fù)三次的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖1B示出了重亞硫酸鹽的氧化反應(yīng)式:在5hmC氧化成5fC后，用重亞硫酸鹽處理和NaOH以將5fC轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)。R基團(tuán)為DNA。圖1C示出了概括BS-Seq (重亞硫酸鹽測(cè)序)和oxBS-Seq (氧化重亞硫酸鹽測(cè)序)技術(shù)的圖和表。BS-Seq包含了用重亞硫酸鹽處理輸入DNA，然后測(cè)序、緊隨其后進(jìn)行放大。oxBS-Seq包含了輸入DNA的氧化，之后用重亞硫酸鹽處理并放大，然后測(cè)序。通過(guò)比較輸入、BS-Seq和oxBS-Seq輸出，C、5mC和5hmC可被區(qū)分、映射和定量。[0159]圖2A示出的2’脫氧-5-甲酰基胞嘧啶的重亞硫酸鹽分布表明，整體的脫羰加上脫氨基為尿嘧啶。圖2B示出的2’脫氧-5-羧基胞嘧啶的重亞硫酸鹽分布表明，脫羧為胞嘧啶，之后脫氨基為尿嘧啶。
[0160]圖3示出了通過(guò)質(zhì)譜氧化作用的定量(圖3A、3B、3D)和通過(guò)啟迪(Illumina)測(cè)序氧化的重亞硫酸鹽處理的定量(圖3C)。圖3A示出了在KRuO4氧化之前和之后，在15mer單鏈DNA寡核苷酸中5hmC和5fC的水平(歸一化到T的峰面積)。圖3B示出了在兩個(gè)連續(xù)的KRuO4氧化的之前和之后，在135mer雙鏈DNA碎片中5hmC和5fC的水平(歸一化到引物序列中5mC的濃度)。圖3C示出了如通過(guò)包含單一 5hmCpG (122mer)或多個(gè)5hmCpG (135mer)的兩個(gè)雙鏈DNA碎片在氧化的重亞硫酸鹽處理后由Illumina(啟迪)測(cè)序確定的胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的轉(zhuǎn)化水平(每個(gè)堿基得到至少950，000次讀出片段(reads))。5mC還存在于比較轉(zhuǎn)化率的這些鏈中。圖3D示出了在KRuO4氧化之前和之后，測(cè)定的ES細(xì)胞DNA(Jl)中5hmC和5fC的水平(歸一化到引物序列中5mC的濃度)。所有的誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0161]圖4示出了通過(guò)用KRuO4氧化處理合成的含有胞嘧啶(C)的151^1"單鏈(88)0嫩(重復(fù)三次)(圖4A)、合成的包含5mC的15mer單鏈DNA (重復(fù)三次)(圖4B)和基因組ES細(xì)胞JlDNA (超聲重復(fù)2次和非超聲重復(fù)2次)(圖4C)后測(cè)量核苷酸比率的變化確定氧化后胞嘧啶降解的程度。通過(guò)HPLC分析的氧化后核苷酸的峰面積除以氧化前核苷酸的峰面積測(cè)得百分比變化。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0162]圖5示出了由包含5hmC的140bp DNA分子在氧化前(圖5A)和后(圖5B)消化得到的核苷酸的HPLC跡線。
[0163]圖6示出了由包含5fC的15bp DNA鏈在重亞硫酸鹽處理前(圖6A)和后(圖6B)消化得到的核苷酸的HPLC跡線。
[0164]圖7示出了由包含5fC的140bp DNA分子在還原前(圖7A)和后(圖7B)消化得到的核苷酸的HPLC跡線。
`[0165]圖8示出了在oxBS處理后包含C、5mC或5hmC的具有ClaI位點(diǎn)(ATCGAT)的122merDNA鏈的桑格(Sanger)測(cè)序。色譜圖示出了模板鏈的相對(duì)序列。在C DNA中，在相對(duì)鏈中C完全被轉(zhuǎn)化為U，如色譜圖中示出為A而不是G。5mC DNA不會(huì)被轉(zhuǎn)化，如在色譜圖中示出為G。5hmCDNA大部分被轉(zhuǎn)化，在色譜圖中示出為A，在該實(shí)驗(yàn)中具有少量的未轉(zhuǎn)化的G。
[0166]圖9示出了通過(guò)oxRRBS在CGI定量的5mC和5hmC的水平。圖9A示出了在RRBS和oxRRBS數(shù)據(jù)集之間每個(gè)CGI的未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的分?jǐn)?shù)(fraction)的比較；在oxRRBS數(shù)據(jù)集中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著較低分?jǐn)?shù)的CGI (紅色)為羥甲基化CGI ;利用相對(duì)模式使用CGI的數(shù)量(黑色)估計(jì)了 3.7%的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。圖9B示出了在具有各自修飾顯著水平的CGI中5mC和5hmC水平的分布。圖9C示出了基因組RRBS和oxRRBS分布與(h)MeDIP-Seq分布重合的實(shí)施例(6)。CGI由綠條表示；為了清楚起見(jiàn)，CGI外部數(shù)據(jù)被掩蔽(灰色區(qū)域)。oxRRBS跡線中的每個(gè)條代表了單一的CpG (在DNA的任一鏈中)。在面板下部的區(qū)域中放大突出了本方法的單核苷酸分辨率。圖9D示出了利用glucMS-qPCR驗(yàn)證的選定CGI的5mC和5hmC的水平。顯示了 oxRRBS在單個(gè)MspI位點(diǎn)的值，其中誤差線代表了 95%置信區(qū)間。重復(fù)進(jìn)行GlucMS-qPCR，其中條形代表了平均值，黑點(diǎn)代表了單個(gè)重復(fù)。這兩種技術(shù)顯示出良好的相關(guān)性。
[0167]圖10示出了在用KRuO4氧化前(圖10A)和后(圖10B)，RNA鏈(SEQ ID N0:7)消化為核苷酸的HPLC色譜圖。相同的條件被用于DNA氧化。核苷酸的保留時(shí)間如下:C-1.2分鐘、U-1.7分鐘、G-3.5分鐘、A-6.5分鐘。
[0168]圖11示出了包含5-甲?；奏?5fC)(部分序列所示_ACGGA5fCGTA)的合成的IOOmer DNA鏈在用NaBH4和重亞硫酸鹽處理(redBS_Seq)還原后的Sanger (桑格)測(cè)序跡線。色譜圖示出了部分序列(TACGTCCAT-其中黑體位置來(lái)自5fC或C)的反向互補(bǔ)序列。5fC和C的位置(括號(hào)中)示于圖11中的模板鏈上。在重亞硫酸鹽條件下5fC和C脫氨基。然而，5fC由還原步驟而不是脫氨基被轉(zhuǎn)化為5hmC，盡管C脫氨基不受影響。這允許以單堿基分辨率區(qū)分5fC和C。
[0169]表1示出了胞嘧啶和修飾的胞嘧啶在經(jīng)過(guò)各種處理后的測(cè)序結(jié)果。
[0170]表2示出了胞嘧啶(la)、5-甲基胞嘧啶(5mC ;lb)、5_羥甲基胞嘧啶(5hmC ;lc)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC ；ld)的結(jié)構(gòu)。
[0171]表3示出了一些水溶性氧化劑實(shí)例氧化DNA中5hmC的效率的概要。
[0172]表4和表5分別示出了 DNA (圖4，圖5和6)和RNA (圖10)的HPLC跡線中峰的保留時(shí)間。
[0173]試駘
[0174]1、方法
[0175]1.1 用 MnO2 將 d5hmCTP 氣化成 d5fCTP 和 d5cCTP
[0176]于497.5μ L 水中的 2.5 μ L d5hmCTP (lOOmM, Bioline)和 51.6mg MnO2 (對(duì)于d5fCTP)或 500mg MnO2 (對(duì)于 d5cCTP)(阿爾法埃莎(Alpha Aeser))在 50°C振搖 2 小時(shí) 30分鐘。然后，使用Amicon Ultra (超過(guò)濾器)0.5mL10kDa柱(密理博(Millipore))通過(guò)過(guò)濾除去MnO2，將樣品凍干。將三磷酸核苷酸懸浮(5禮)，并用堿性磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs))在37°C下過(guò)夜脫去磷酸。
[0177]1.2d5fC和d5cC核苷的重亞硫酸氫鹽時(shí)間過(guò)程
[0178]將9yL d5fC 或 d5cC (5mM),0.5μ L dA (0.1Μ，Roche)和 2.5 μ L 水混合，然后添加33 μ L4M NaHSO3 (MP生化制品)。將其分為三個(gè)15 μ L的反應(yīng)，在50°C的暗處放置。在不同時(shí)間點(diǎn)取出0.5yL的部份，并加入2.5yL水和2yL NaOH (IM)0在室溫下至少放置30分鐘后，將它們注入HPLC。測(cè)量了峰面積，將其與d5fC、d5cC、dC或dU的校正曲線相關(guān)聯(lián)，并標(biāo)準(zhǔn)化為色譜中dA的水平。
[0179]1.3用于HPLC分析的DNA消化
[0180]DNA如通過(guò)文獻(xiàn)方案(30)消化，用Amicon Ultra0.5mL10kDa柱純化，并利用AgilentllOO 在 Eclipse (伊克里斯)XDB_C183.5 μ m, 3.0x150mm 柱上以 lmL/min 通過(guò) HPLC分析。柱溫度保持在45 V。洗脫緩沖液為緩沖液A( 500mM醋酸銨(費(fèi)舍爾(Fi sher ) )，pH5 )，緩沖液B (乙腈(Acetonitrile))和緩沖液C (H20)。緩沖液A在整個(gè)運(yùn)行中保持為1%，對(duì)于剩余的緩沖液的梯度為O分鐘-0.5% B，2分鐘-1% B，8分鐘-4% B, 10分鐘-95% B。
[0181]2’ -脫氧核苷酸的保留時(shí)間如下:2’ -脫氧-5-羧基胞苷(1.0分鐘)，2’ -脫氧胞苷(1.8分鐘)，2’ -脫氧-5-羥甲基胞苷(2.1分鐘)，2’ -脫氧尿苷(2.7分鐘)，2’ -脫氧-5-甲基胞苷(4.0分鐘)，2’ -脫氧鳥(niǎo)苷(4.5分鐘)，2’ -脫氧-5-甲?；?5.4分鐘)，2’ -脫氧胸苷(5.7分鐘)，2’ -脫氧腺苷(7.4分鐘)。
[0182]使用相同的方案來(lái)消化用于HPLC分析的RNA。[0183]1.4單鏈和雙鏈PNA序列
[0184]15mer寡核苷酸購(gòu)于包含胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶的IBA15UZmer和135mer雙鏈DNA模板和引物購(gòu)于Biomers。引物中所有的C為5-甲基胞嘧啶。5-羥甲基胞嘧唳通過(guò)PCR利用d5hmCTP和Fermentas DreamTaq聚合酶加入到所有其他胞嘧唳位置的鏈中。
[0185]1.5 一般還原
[0186]DNA (約I μ g-10 μ L)與40 μ L NaBH4 (每微升10，000當(dāng)量)在冰上培育5分鐘。之后，將反應(yīng)物在暗處在25°C用開(kāi)口的蓋子振搖I小時(shí)。該反應(yīng)物用快速旋轉(zhuǎn)寡核苷酸柱(羅氏(Roche))純化。
[0187]1.6氣化反應(yīng)
[0188]一般氧化
[0189]DNA用NaOH (0.05M最終濃度)在冰上形成了 24 μ L，之后加入I μ LKRuO4溶液(阿爾法埃莎(Alpha Aeser)) (0.05M NaOH中15mM)，將該反應(yīng)置于冰上I小時(shí)，期間偶爾渦流。將反應(yīng)物用小型快速旋轉(zhuǎn)寡核苷酸柱(羅氏)純化(在4次600 μ L H2O洗滌后)。
[0190]這些條件也被用于RNA的氧化。
[0191]單鏈DNA氧化
[0192]按照一般氧化方法氧化I μ gl5mer合成的單鏈DNA。
[0193]合成的雙鏈DNA 雙氧化
[0194]雙鏈DNA用乙醇沉淀，然后通過(guò)小型快速旋轉(zhuǎn)寡核苷酸柱過(guò)濾(在4次600 μ L H2O洗滌后)。合成的雙鏈DNA需要雙氧化反應(yīng)，因?yàn)镹aOH變性并不是100%的對(duì)單一同源DNA碎片的溶液有效(不同于基因組DNA)。
[0195]Iyg DNA在0.05Μ NaOH (總體積19 μ L)中在37°C下變性30分鐘。然后將反應(yīng)物快速在冰上冷卻，并靜置5分鐘。隨后根據(jù)一般氧化方法來(lái)氧化該反應(yīng)物，但總體積為20 μ Lo該DNA在0.05Μ NaOH (總體積24 μ L)中在37°C下再次變性30分鐘。然后再次將反應(yīng)物快速在冰上冷卻，靜置5分鐘，并根據(jù)一般氧化氧化。
[0196]基因組DNA的一般氧化
[0197]DNA (lug或更少)在氧化之前先用乙醇沉淀，然后通過(guò)小型快速旋轉(zhuǎn)寡核苷酸柱過(guò)濾(在4次600 μ L水洗滌后)。DNA在0.05Μ NaOH (24 μ L或40 μ L總體積)中在37°C下變性30分鐘。然后將反應(yīng)物快速在冰上冷卻，靜置5分鐘，并根據(jù)一般氧化氧化。
[0198]1.7氧,IK的重亞硫酸鹽處理.的雙.鏈DNA的Sanger (桑格)矛口 11 Iumina (啟迪.)泖I座
[0199]對(duì)于Sanger測(cè)序，Iyg的包含C、5mC和5hmC的122mer DNA根據(jù)雙鏈DNA雙氧化被氧化，并根據(jù)制造商的FFPE樣品的說(shuō)明利用Qiagen Epitect試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，不同之處在于熱循環(huán)被反復(fù)執(zhí)行兩次。然后將這些樣品提供給桑格測(cè)序(源生物科學(xué)(Source BioScience))。
[0200]對(duì)于Illumina 測(cè)序，Iyg 的包含 5hmC 的 122mer 和 135mer DNA 用 DraI (2 μ L,新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs))和SspL (I μ L,新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化過(guò)夜。將消化的條帶用Fermentas GeneJET凝膠提取試劑盒凝膠純化,并利用NEBNext DNA樣品預(yù)控制混合設(shè)置I來(lái)結(jié)合甲基化的連接體(adaptor)(啟迪(Illumina))。在如上述氧化和重亞硫酸鹽處理后，利用Pfu Turbo Cx (安捷倫)和連接體特異性引物(Illumina)擴(kuò)增(18個(gè)循環(huán))連接的碎片，之后利用AMPure XP珠(Agencourt)純化。
[0201]1.8 質(zhì)譜
[0202]核苷來(lái)源于根據(jù)制造商的說(shuō)明通過(guò)用DNA降解加(酶研究)消化的DNA，并通過(guò)在配有納電噴霧離子源(Proxeon)的LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀(熱電科學(xué)(ThermoScientific))上的LC-MS/MS進(jìn)行分析。在聞分辨率全掃描模式下(對(duì)于質(zhì)子化準(zhǔn)分子尚子R>40，000，對(duì)于伴隨的質(zhì)子化堿基碎片離子R>50，000)及在選擇的反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式下獲得了 5hmC、5fC以及與5mC和T相關(guān)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，所述選擇的反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式監(jiān)測(cè)到了 258->142.0611 (5hmC)、256->140.0455 (5fC)、242_>126.0662 (5mC)和 243_>127.0502(T )的轉(zhuǎn)換。母體離子被選定用于具有4個(gè)質(zhì)量單位分離窗的SRM，并通過(guò)具有20 %的相對(duì)碰撞能量的HCD分裂，其中碎片離子的R>14，000。
[0203]從5hmC和5fC相關(guān)離子的離子色譜圖中提取的峰面積被歸一化為來(lái)自5mC(存在時(shí))或T中的那些，并相對(duì)于三磷酸核苷酸或寡核苷酸的消化獲得的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)外部校正定量。
[0204]1.9ES (杯胎)干細(xì)朐培養(yǎng)和DNA提取
[0205]JlES 細(xì)胞(129S4/SvJae)購(gòu)自 ATCC (目錄(Cat.) SCRC-1010)，并在 37 °C 和 5 %CO2的條件下在完整的ES培養(yǎng)基(DMEM4500mg/L葡萄糖、4mM L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸鈉、15%胎牛血清、100ml培養(yǎng)基中100U青霉素/IOOyg鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸、50μ M β-巰基乙醇、103U LIF ESGRO'?)中的Y -照射的pMEF培養(yǎng)層上培養(yǎng)?；蚪M
DNA利用Qiagen Allprep DN`A/RNA迷你試劑盒從傳代14或20次的ES細(xì)胞中制備。
[0206]1.1OoxRRBS
[0207]根據(jù)先前公開(kāi)的方案制備了氧化和非氧化的DNA的RRBS庫(kù)(31)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用MspI (Fermentas)消化2μ g的基因組DNA,然后用Klenow (Fermentas)進(jìn)行末端修復(fù)和加A尾，并用T4DNA連接酶(NEB)連接甲基化的連接體(IIIumina)。連接體-連接的MspI消化的DNA在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行并選擇大小(110-380bp),隨后用Qiagen QIAquick純化凝膠快速和乙醇沉淀進(jìn)行純化。
[0208]在氧化之前，選擇了大小的DNA通過(guò)小型快速旋轉(zhuǎn)寡核苷酸柱(在4次600 μ L水洗滌后)過(guò)濾，以去除任何最后殘留的緩沖液/鹽，并調(diào)整最終體積到25 μ L。保留5 μ L該溶液用于產(chǎn)生非氧化庫(kù)。根據(jù)基因組DNA的一般氧化方法氧化剩余的溶液。
[0209]根據(jù)制造商的FFPE樣品的說(shuō)明，使用Qiagen Epitect試劑盒對(duì)氧化和非氧化的DNA樣品進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，不同的是要運(yùn)行熱循環(huán)兩次以上。利用Pfu Turbo Cx (安捷倫)和連接體特異性引物(Illumina)擴(kuò)增(18個(gè)循環(huán))完成最終的庫(kù)擴(kuò)增(18次循環(huán))，在這之后用AMPure XP珠(Agencourt)純化該庫(kù)。
[0210]1.11測(cè)序和讀取柃準(zhǔn)
[0211]在Illumina GAIIx平臺(tái)上執(zhí)行測(cè)序(單端，40bp讀出片段)。在對(duì)前三個(gè)堿基對(duì)應(yīng)用無(wú)鞍處理之后，利用OLB版1.8通過(guò)再處理原始圖像命名的為堿基(32)。利用俾斯麥(Bismark) ν0.6.4 (33)、使用選項(xiàng)-nl-140 -序列(phred) 64-品質(zhì)(quals)—普通(vanilla)進(jìn)行小鼠基因組(第NCBM37版)的重亞硫酸鹽讀取校正。執(zhí)行單個(gè)的通道5’單體序列的俾斯麥校正更為嚴(yán)格(_n0);發(fā)布的用于讀取校正的共有序列為L(zhǎng)lA (34)、LlTf和LlGf (35)單體亞型。
[0212]根據(jù)3’ MspI位點(diǎn)的測(cè)序讀出片段中Klenow填充處的未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的數(shù)量估計(jì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率，其中3’ MspI位點(diǎn)的測(cè)序讀出片段足夠短使得能夠通過(guò)這些位點(diǎn)讀出。讀取序列的品質(zhì)在3’端依然很聞。預(yù)計(jì)重亞硫酸鹽的轉(zhuǎn)化率在99.8%和99.9%之間變化。
[0213]1.12oxRRBS 數(shù)據(jù)處理
[0214]在CGI (25)中轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的數(shù)量分別取自每個(gè)BS和oxBS數(shù)據(jù)集。對(duì)于每個(gè)CpG位置，將每個(gè)oxBS數(shù)據(jù)集中未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的百分比作為5mC的數(shù)量，并且從BS數(shù)據(jù)集中未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的百分比中減去這個(gè)值得到5hmC的數(shù)量。在每個(gè)CGI中通過(guò)來(lái)自所有的CpG涵蓋的匯集數(shù)據(jù)計(jì)算了每個(gè)CGI的整體值。少于10次讀取的CpG被排除在外，因?yàn)樗鼈兪菑恼wCGI5mC值中偏離超過(guò)20%的5mC估計(jì)值或從整體CGI5mC值中偏離超過(guò)10 %的5mC估計(jì)值的CpG。在這離群值篩選步驟之后，只有5個(gè)代表性的CpG或多個(gè)的CGI被分析。
[0215]為了測(cè)試包含5mC水平顯著高于oxBS數(shù)據(jù)集的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化錯(cuò)誤的CGI，利用Benjamin1-Kochberg的0.01校正p值截止進(jìn)行了二項(xiàng)式檢驗(yàn)。類似地,二項(xiàng)式檢驗(yàn)用于在BS數(shù)據(jù)集中選擇具有顯著未轉(zhuǎn)化胞嘧啶值的CGI ;在這些中，BS和oxBS數(shù)據(jù)集之間的差異通過(guò)應(yīng)用Fisher測(cè)試，并利用0.05的校正p值截止進(jìn)行了測(cè)試。在oxBS數(shù)據(jù)集中具有顯著較低的未轉(zhuǎn)化胞嘧啶碎片的CGI被認(rèn)為是羥甲基化的CGI。具有相反模式的CGI被假設(shè)為是偽像，并用于估計(jì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。
[0216]1.13GlucMS~aPCR
[0217]如先前所述(6)，通過(guò)glucMS-qPCR在MspI位點(diǎn)定量5mC和5hmC水平。
`[0218]2、結(jié)果
[0219]我們追求的策略是在DNA中通過(guò)采用對(duì)5hmC具有選擇性的化學(xué)反應(yīng)將5mC區(qū)別于5hmC，特別是通過(guò)化學(xué)方法除去羥甲基基團(tuán)，從而轉(zhuǎn)化5hmC為C，然后可通過(guò)重亞硫酸鹽介導(dǎo)的脫氨作用容易地將C轉(zhuǎn)化為U。在我們關(guān)于5-甲?；奏?5fC)的化學(xué)反應(yīng)研究過(guò)程中，我們?cè)谥貋喠蛩猁}的條件下觀察到5-fC脫羰和脫氨后轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，其中5mC保持不變(圖1A)。這個(gè)以前未報(bào)告的轉(zhuǎn)化表明，可通過(guò)選擇性地氧化5hmC為5fC，然后在兩步工藝中將5fC轉(zhuǎn)化為U來(lái)進(jìn)行5mC測(cè)序(圖1B)。在傳統(tǒng)的BS-Seq導(dǎo)致5mC和5hmC被檢測(cè)為C時(shí)，這種“氧化的重亞硫酸鹽”測(cè)序(oxBS-Seq)的方法僅在5mC位點(diǎn)上得到了 C，因此，允許我們通過(guò)比較BS-Seq和oxBS-Seq的讀數(shù)來(lái)確定5hmC在特定核苷酸位點(diǎn)的數(shù)量(圖 1C)。
[0220]確定了 2’脫氧-5-甲?；奏ず?’脫氧-5-羧基胞嘧啶的重亞硫酸鹽分布(圖2A和2B)。用2.9M NaHSO4培養(yǎng)2’脫氧-5-甲?；奏ず?’脫氧-5-羧基胞嘧啶。在不同的時(shí)間點(diǎn)取反應(yīng)的小樣，并與0.3M NaOH反應(yīng)。將這些直接注射到HPLC中用于分析。HPLC分布分別于與整體的脫羰或脫羧相一致，以使胞嘧啶在快速脫氨后轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
[0221]因此，我們需要利用溫和的、與水介質(zhì)兼容的、選擇性的通過(guò)其他堿基和DNA骨架的氧化劑來(lái)具體氧化5hmC到5fC。測(cè)試了一系列的可能適合的水溶性氧化劑(表3),我們發(fā)現(xiàn)過(guò)釕酸鉀(KRuO4)擁有我們所尋求的性能和轉(zhuǎn)換效率。KRuO4基本上可以氧化醇類和碳-碳雙鍵(23)。然而，在我們的反應(yīng)中研究了包含5hmC的合成的15rner單鏈DNA(ssDNA)，我們?cè)贙RuO4反應(yīng)下建立的條件對(duì)于5hmC的伯醇具有高度特異性(通過(guò)質(zhì)譜定量轉(zhuǎn)化5hmC到5fC，圖3A)。包含C或5mC，而不是5hmC的15mer單鏈DNA并沒(méi)有顯示出與KRuO4的任何堿基特異性反應(yīng)(圖4A、B)。我們還意識(shí)到，KRuO4氧化劑可以繼續(xù)反應(yīng)為羧酸
(23)，但在DNA中5hmC在的情況下，我們僅觀察到了醛(5fC)，即使用適度過(guò)量的氧化劑。在添加氧化劑之前的初始變性步驟中，KRuO4氧化劑還能夠氧化樣品中的5hmC為雙鏈DNA(dsDNA);這導(dǎo)致了 5hmC到5fC的定量產(chǎn)率和通過(guò)質(zhì)譜判斷的一樣(圖3B)。
[0222]制備了 140bp DNA分子(SEQ ID NO:1)，所述DNA分子中通過(guò)PCR利用5_甲基胞嘧啶引物和hmCTP并入了 45個(gè)5hmC核苷。利用KRuO4氧化DNA。在氧化之前和之后，用核酸酶、磷酸二酯酶I和堿性磷酸酶將DNA消化為核苷。然后將該混合物注入到HPLC中以得到示于圖5A (氧化前)和5B (氧化后)中的跡線。觀察到了 5hmC到5fC幾乎完整的轉(zhuǎn)化，而未對(duì)其它核苷有活性。
[0223]含有3個(gè)5fC殘基的單鏈15bp DNA分子(SEQ ID NO:2)用如上所描述的重亞硫酸鹽處理。在用重亞硫酸鹽處理之前和之后，用核酸酶、磷酸二酯酶I和堿性磷酸酶將DNA消化為核苷。然后將該混合物注入到HPLC中以得到示于圖6A和6B中的跡線。
[0224]在重亞硫酸鹽處理之后，只有5fC殘留的非常小的峰，以及存在的可忽略不計(jì)的胞嘧啶。圖6B中的尿嘧啶峰來(lái)源于5fC，以及未修飾的C的脫氨基。
[0225]制備了 140bp DNA分子(SEQ ID NO: 1)，所述DNA分子中通過(guò)PCR并入了 45個(gè)5hmC核苷。利用如上所描述的NaBH4還原DNA。在還原之前和之后，用核酸酶、磷酸二酯酶I和堿性磷酸酶將DNA樣品消化為核苷。然后將核苷的混合物注入到HPLC中以得到示于圖7A(還原前)和7B (還原后) 中的跡線。觀察到了 5fC到5hmC完整的轉(zhuǎn)化。
[0226]對(duì)122個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA (SEQ ID NO: 3)中ClaI位點(diǎn)(ATCGAT)氧化的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了研究，以測(cè)試氧化重亞硫酸鹽方法的效率和選擇性。在中央具有單CpG的雙鏈122個(gè)堿基對(duì)的DNA碎片(在ClaIATCGAT限制位點(diǎn)的情況下，SEQ ID N0:3)通過(guò)PCR利用5-甲基胞嘧啶引物和CTP、5mCTP或5hmCTP的任——種進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物在引物區(qū)域中含有5-甲基胞嘧啶，在CpG中央含有CpG、5mCpG或5hmCpG。
[0227]如上所述，含有C、5mC或5hmC任——種的三個(gè)合成的122mer雙鏈DNA的每一個(gè)用KRuO4氧化,然后進(jìn)行常規(guī)的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方案。對(duì)每三個(gè)鏈的每一個(gè)進(jìn)行Sanger測(cè)序(圖8)。
[0228]含有C的鏈完全轉(zhuǎn)化為U (圖8左面板)，含有5mC的鏈并沒(méi)有轉(zhuǎn)化(圖8中間面板)，含有5hmC的鏈大部分定量轉(zhuǎn)化為U,并帶著未轉(zhuǎn)化的C的跡線(圖8右面板)。這顯示出主要的腺嘌呤峰來(lái)自轉(zhuǎn)化的材料，殘留的鳥(niǎo)嘌呤峰來(lái)自少數(shù)未轉(zhuǎn)化的材料。
[0229]為了獲得精確測(cè)量的5hmC到U的轉(zhuǎn)化效率，在氧化重亞硫酸鹽處理后對(duì)含有5hmC的合成鏈進(jìn)行了 Illumina測(cè)序。觀察到了 94.5%的整體5hmC到U的轉(zhuǎn)化水平(圖3C)。氧化重亞硫酸鹽方案還被應(yīng)用于在一系列不同情況下包含多個(gè)5hmC殘基的第二鏈，并示出了類似的5hmC到U的高轉(zhuǎn)化效率(94.7%)(圖3C)。最后，對(duì)基因組DNA進(jìn)行了 KRuO4氧化，并示出了通過(guò)質(zhì)譜定量獲得的5hmC到5fC的轉(zhuǎn)化(圖3D)，沒(méi)有明顯的C降解(圖4C)。這些原理實(shí)驗(yàn)的證據(jù)表明，氧化重亞硫酸鹽方案將具體地轉(zhuǎn)化DNA中的5hmC到U，保持C和5mC不變，允許在寬泛使用的平臺(tái)(oxBS-Seq)上進(jìn)行定量、單核苷酸分辨率的測(cè)序。
[0230]之后，我們使用了氧化重亞硫酸鹽原理以在小鼠ES細(xì)胞的基因組DNA中以高分辨率定量地映射5hmC。我們選擇結(jié)合氧化重亞硫酸鹽和還原表示的重亞硫酸鹽測(cè)序(RRBS)
(24)，這允許用于高度富集CpG島(CGI)的基因組的一部分的選擇性序列，從而保證足夠的測(cè)序深度以檢測(cè)這種低豐度的標(biāo)記。因此，我們創(chuàng)立了實(shí)現(xiàn)每CpG~120個(gè)讀出片段的平均測(cè)序深度的RRBS和oxRRBS數(shù)據(jù)集，其中，當(dāng)匯集時(shí)產(chǎn)生了每CpG平均約3，300個(gè)甲基呼口H。在應(yīng)用深度和廣度截止后(見(jiàn)材料和方法)，55% (12，660)的所有的CGI (25)被覆蓋在我們的數(shù)據(jù)集中。我們的RRBS (即非氧化的)數(shù)據(jù)與已發(fā)布的RRBS和BS-Seq數(shù)據(jù)集有良好的相關(guān)性(24，26)。
[0231 ] 為了識(shí)別含有5hmC的CGI，我們利用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)RRBS和oxRRBS數(shù)據(jù)集之間的差異進(jìn)行了測(cè)試(見(jiàn)材料和方法)。據(jù)預(yù)計(jì)，最顯著的差異起源于在與RRBS設(shè)置相比時(shí)，在oxRRBS設(shè)置中具有較低比例的未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶的CGI。具有逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)的CGI被用來(lái)估計(jì)
3.7%的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(圖9A)。我們識(shí)別了 800個(gè)含有5hmC的CGI，其中平均3.3% (范圍
0.2-18.5%)的CpG羥甲基化(圖9A和B)。我們還識(shí)別了 4577個(gè)平均8.1%的CpG甲基化的含有5mC的CGI (圖9B)。我們?cè)谙嗤腅S干細(xì)胞系、但通道數(shù)目不同的獨(dú)立重復(fù)的生物樣品中進(jìn)行了測(cè)序，其中通過(guò)質(zhì)譜法具有5hmC的還原水平(0.10%對(duì)所有C的0.16%),并一致發(fā)現(xiàn)更少的含有5hmC的CGI。重要的是，存在于兩個(gè)樣品中的含有5hmC的CGI表現(xiàn)出良好的定量重現(xiàn)性。
[0232]為了證實(shí)我們的方法，我們選擇了 21個(gè)包含MspI限制位點(diǎn)的CGI，并通過(guò)glucMS-qPCR在這些CpG上量化了 5hmC和5mC水平(28 )(圖9D )。我們?cè)趏xRRBS和glucMS-qPCR定量之間發(fā)現(xiàn)了良好的相關(guān)性(對(duì)于5mC和5hmC分別為r=0.86，p=5E_7和r=0.52, p=0.01 )。 [0233]研究了含有5-甲?；奏?5fC)的DNA鏈的還原重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率(reBS-Seq)。
[0234]給含有序列ACGGA5fCGTA的合成的IOOmer DNA鏈(SEQ ID NO:8)通入NaBH4進(jìn)行還原，然后進(jìn)行常規(guī)的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方案。之后對(duì)該鏈進(jìn)行Sanger測(cè)序(圖11)。
[0235]圖11顯示的測(cè)序跡線代表了反向互補(bǔ)序列(TACGTCCAT)的一部分。5fC和C的位置為黑體，并在圖11中的括號(hào)內(nèi)示出了模板鏈。如前所示，5fC和C在重亞硫酸鹽條件下脫氨基以形成U，如圖11的反向互補(bǔ)序列中A所示的。然而，用似8比還原轉(zhuǎn)化5fC到5hmC，這并不是脫氨基成U，如圖11的反向互補(bǔ)序列中G所示的。因此，還原的重亞硫酸鹽測(cè)序(redBS-Seq)允許在單堿基分辨率區(qū)別5fC和C。
[0236]總之，我們已表明，oxBS-Seq方法在單核苷酸水平可靠地映射和量化5mC和5hmC。氧化的重亞硫酸鹽還可與非測(cè)序的下游方法(如在這里說(shuō)明的Sequenom)兼容。因此，通過(guò)與重亞硫酸鹽處理的和氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA的序列相比，確定5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶連同非修飾的胞嘧啶的存在是可能的。
[0237]例如，在重亞硫酸鹽處理的和氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列的相同位置上尿嘧啶殘基表明未修飾的胞嘧啶的存在。在重亞硫酸鹽處理的和氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列的相同位置上的胞嘧啶殘基表明5-甲基胞嘧啶的存在。在氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中的胞嘧啶殘基還表明5-甲基胞嘧啶的存在。在重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中的胞嘧啶殘基以及在氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中的相同位置上的尿嘧啶殘基表明5-羥甲基胞嘧啶的存在。[0238]5-甲酰基胞嘧啶也可測(cè)序至單核苷酸分辨率。5fC可利用NaBH4 (如通過(guò)HPLC示出的)在基因組DNA中定量的還原為hmC。通過(guò)比較未處理的、重亞硫酸鹽處理的、氧化和重亞硫酸鹽處理的以及還原和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA，所有三個(gè)已知的哺乳動(dòng)物胞嘧啶修飾物(5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶)的存在連同非修飾的胞嘧啶可被確定。例如，在i)重亞硫酸鹽處理的，ii)氧化的和重亞硫酸鹽處理的和iii)還原的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA (UUU)序列中的相同位置處的尿嘧啶殘基表明未修飾的胞嘧啶的存在。
[0239]在i)重亞硫酸鹽處理的，ii)氧化的和重亞硫酸鹽處理的和iii)還原的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA (CCC)序列中的相同位置處的胞嘧啶殘基表明5-甲基胞嘧啶的存在。
[0240]在重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中的胞嘧啶；在氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中相同位置處的尿嘧啶，可選的在還原的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA(CUC)序列中的相同位置處的胞嘧啶表明5-羥甲基胞嘧啶的存在。
[0241]在重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中的尿嘧啶；在還原的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA序列中相同位置處的胞嘧啶；以及可選的在氧化的和重亞硫酸鹽處理的基因組DNA (UCU)序列中的相同位置處的尿嘧啶表明5-甲?；奏さ拇嬖凇?br> [0242]當(dāng)未處理的基因組DNA被測(cè)序時(shí)，修飾的和未修飾的胞嘧啶被讀取為胞嘧啶。
[0243]在圖10中所示的HPLC色譜圖證實(shí)了在28核苷酸RNA鏈(SEQ ID N0:7)被氧化后沒(méi)有觀察到RNA的降解。這一結(jié)果意味著，氧化方法也可兼容的用于測(cè)序修飾的胞嘧啶殘基，如本文中所描述的RNA中的5hmC。
[0244]參考文獻(xiàn)`
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[0293]49.Rothberg et al (2011)Nature475348_352).[0294]樽型序列
[0295]修飾的核苷酸為黑斜體
[0296]140個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA模型(SEQ ID N0:1):
[0297]CACATCCCACACTATACACTCATACATACCTGCTCACGACGACGCTGTACACCTACGTACTCGTGCACGCTCGTCACGTGATCGACCATGACTCTGACGCACTGAGGTATGGGAAGTAGTGAGTAGATTGTAGTAAGGAG
[0298]15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈DNA模型(SEQ ID N0:2):
[0299]GAGACGACGTACAGG
[0300]122個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA模型(SEQ ID N0:3):[0301]CACATCCCACACTATACACTCATACATACCATTTAAATAAATTAAATAATATTAATATATCGATTAATAATAAATAATAATTAATTAATATTGGGAAGTAGTGAGTAGATTGTAGTAAGGAG
[0302]135個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA模型(SEQ ID N0:4):
[0303]CACATCCCACACTATACACTCATACATACCATTTAACGATAAATTACAATAACGTATCTAATCATATCGATTAACTAATCGAAATAATAATTACGCATTAATATTGGGAAGTAGTGAGTAGATTGTAGTAAGGAG
[0304]雙鏈DNA 正向引物(SEQ ID N0:5):
[0305]CACATCCCACACTATACACTCATACATACC
[0306]雙鏈DNA 反向引物(SEQ ID N0:6):
[0307]CTCCTTACTACAATCTACTCACTACTTCCC
[0308]28個(gè)核苷酸的RNA模型序列(SEQ ID NO: 7):
[0309]UGUGGGGAGGGCGGGGCGGGGUCUGGGG
[0310]含有序列的100個(gè)核苷酸5fC (SEQ ID N0:8)
[0311][5fC位置用黑斜體表明]
[0312]GACGGACGTACGATCGAGCGAGGTCTTGGGTCAGCAGGTGGCGACTGTTAGCTCAGATGGCTAGCAAGTGGGTATGTATGAGTGTATAGTGTGGGATGTG
[0313]
【權(quán)利要求】
1.一種在樣品核苷酸序列中識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法，包括； (i)提供包括所述樣品核苷酸序列的多核苷酸群體， (ii)氧化或還原所述群體的第一部分， (iii)用重亞硫酸鹽處理氧化或還原的所述群體的第一部分和所述群體的第二部分， (iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體的所述第一和第二部分中的多核苷酸，以分別生成第一和第二核苷酸序列，以及； (v)識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述第一和第二核苷酸序列中的殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列中識(shí)別的殘基表明在所述樣品核苷酸序列中對(duì)應(yīng)位置上的修飾的胞嘧啶。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述修飾的胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)或5-甲?；奏?5fC)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述群體的所述第一部分在步驟ii)中被氧化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述氧化劑選擇性地氧化5-羥甲基胞嘧啶殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟ii)包括氧化和純化所述多核苷酸的第一部分的多個(gè)步驟。`
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一部分使用化學(xué)氧化劑被氧化。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一部分使用過(guò)釕酸鹽氧化劑被氧化。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一部分使用KRuO4被氧化。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的尿嘧啶和在所述第二核苷酸序列中相同位置上識(shí)別胞嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列兩者中的位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的胞嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的胞嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
13.根據(jù)權(quán)利要求4-12中任一項(xiàng)所述的方法，包括； (vi)還原包括所述樣品核苷酸序列的所述多核苷酸群體的第三部分， (vii)用重亞硫酸鹽處理所述群體的所述還原的第三部分， (Viii)在步驟Vi)和Vii)后，測(cè)序所述第三部分中的多核苷酸，以生成第三核苷酸序列，以及； (ix)識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述第三核苷酸序列中的殘基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在所述第一、第二和第三核酸序列中識(shí)別的殘基表明在所述樣品核苷酸序列中對(duì)應(yīng)位置上的修飾的胞嘧啶。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的方法，其中，在所述第一和第二核苷酸序列中的位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基的尿嘧啶和在所述第三核苷酸序列中同一位置上識(shí)別胞嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲酰基胞嘧啶。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述群體的所述第一部分在步驟ii)中被還原。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述群體的所述第一部分使用NaBH4被還原。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的方法，其中，在所述第一核苷酸序列中的位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的胞嘧啶和在所述第二核苷酸序列中相同位置上識(shí)別尿嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲酰基胞嘧啶。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的方法,其中,在所述第一和第二核苷酸序列中位置上識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶的尿嘧啶，表明所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為未修飾的胞嘧啶。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，包括； 提供包括樣品核苷酸序列的所述多核苷酸群體的第四部分；以及 測(cè)序所述第四部分中的所述多核苷酸以生成所述樣品核苷酸序列。
21.一種在樣品核 苷酸序列中識(shí)別5-甲基胞嘧啶的方法，包括； (i)提供包括所述樣品核苷酸序列的多核苷酸群體， (?)氧化所述群體， (iii)用重亞硫酸鹽處理所述氧化的群體， (iv)在步驟ii)和iii)后，測(cè)序所述群體中的多核苷酸，以生成處理的核苷酸序列，以及； (v)識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣品核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述處理的核苷酸序列中的殘基， 其中，在所述處理的核苷酸序列中存在胞嘧啶表明在所述樣品核苷酸序列中的胞嘧啶殘基為5-甲基胞嘧啶(5mC)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多核苷酸為基因組DNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述基因組DNA為哺乳動(dòng)物基因組DNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多核苷酸為RNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述RNA為基因組RNA、mRNA、tRNA、rRMA或非編碼RNA。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述基因組RNA為哺乳動(dòng)物、植物或病毒的基因組RNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多核苷酸群體或所述群體的所述第一、第二、第三和第四部分中的一個(gè)或多個(gè)被固定。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述群體的所述第一、第二、第三和第四部分中的一個(gè)或多個(gè)在測(cè)序之前被放大。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述群體的所述第一、第二、第三部分中的一個(gè)或多個(gè)在用重亞硫酸鹽處理后被放大。
30.一種在根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的識(shí)別修飾的胞嘧啶殘基的方法中使用的試劑盒，包括； (i)氧化劑和/或還原劑；以及， (ii)重亞硫酸鹽試劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述氧化劑為過(guò)釕酸鹽氧化劑。
32.根據(jù)權(quán)利 要求31所述的試劑盒，其中，所述氧化劑為過(guò)釕酸銨鉀(KRuO4)15
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103827321SQ201280046897
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】邁克爾·約翰·布思, 尚卡爾·巴拉蘇不拉曼尼安 申請(qǐng)人:劍橋表現(xiàn)遺傳學(xué)有限公司