使用跨膜孔進(jìn)行雙鏈多核苷酸測(cè)序的發(fā)夾環(huán)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于測(cè)序雙鏈靶多核苷酸的新方法。通過(guò)橋連部分連接所述雙鏈靶多核苷酸的兩條鏈。使用多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈，使用跨膜孔測(cè)序所述靶多核苷酸。
【專利說(shuō)明】使用跨膜孔進(jìn)行雙鏈多核苷酸測(cè)序的發(fā)夾環(huán)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新的對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法。靶多核苷酸的兩條鏈通過(guò)橋連部分連接。多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈。使用跨膜孔進(jìn)行所述靶多核苷酸的測(cè)序。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在，在多種應(yīng)用中需要快速且廉價(jià)的核酸(例如DNA或RNA)測(cè)序技術(shù)?，F(xiàn)有的技術(shù)速度慢且價(jià)格昂貴，這主要是由于其倚賴于擴(kuò)增技術(shù)來(lái)產(chǎn)生大量核酸并且需要大量專用的熒光化合物用于信號(hào)檢測(cè)。
[0003]跨膜孔(納米孔)具有巨大的潛力，作為用于聚合物和許多種小分子的直接的、電的生物傳感器。具體而言，最近一直在關(guān)注作為潛在DNA測(cè)序技術(shù)的納米孔。
[0004]當(dāng)跨越納米孔施加電勢(shì)時(shí)，當(dāng)分析物(例如核苷酸)短暫地在所述桶狀體中存在一段時(shí)間時(shí)電流下降。所述核苷酸的納米孔檢測(cè)給出了具有已知特征和持續(xù)時(shí)間的電流阻斷。然后可通過(guò)對(duì)單個(gè)孔的每單位時(shí)間阻斷事件的數(shù)目來(lái)確定核苷酸的濃度(其中事件是分析物通過(guò)所述納米孔的移位)。
[0005]在“鏈測(cè)序”方法中，使單個(gè)多核苷酸鏈通過(guò)所述孔，并直接鑒定所述核苷酸。鏈測(cè)序可包括使用核酸處理酶(例如Phi29DNA聚合酶)來(lái)控制多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述孔。過(guò)去使用酶來(lái)控制dsDNA移位通過(guò)納米孔的納米孔測(cè)序的重點(diǎn)僅在于僅讀取dsDNA構(gòu)建體的一條鏈。當(dāng)所述酶用作聚合酶時(shí)，待測(cè)序的部分是單鏈的。使所述單鏈部分穿入納米孔，并在所述鏈頂部的引物/模板連接處加入dNTP而以受控方式牽拉所述單鏈部分通過(guò)納米孔。大多數(shù)公布的文獻(xiàn)使用該方 法來(lái)控制鏈移動(dòng)(Lieberman et al.(2010) "ProcessiveReplication of Single DNAMolecules in a Nanopore Catalyzed by phi29DNAPolymerase〃J.Am.Chem.Soc.132(50): 17961-17972)。在聚合酶模式中，不能對(duì)互補(bǔ)鏈進(jìn)行測(cè)序。當(dāng)如所公開(kāi)的(Lieberman et al.(2010),上文)使用所述酶作為雙鏈核酸外切酶時(shí)，互補(bǔ)鏈的解開(kāi)伴隨著該互補(bǔ)鏈的消化。因此不可能用該方法對(duì)互補(bǔ)鏈進(jìn)行測(cè)序。因此不能通過(guò)納米孔來(lái)捕獲互補(bǔ)鏈并對(duì)其測(cè)序。因此，dsDNA中只有一半的DNA信息被測(cè)序。
[0006]更詳細(xì)地，當(dāng)聚合酶活性和核酸外切酶活性都被抑制(通過(guò)在沒(méi)有三磷酸堿基但有過(guò)量EDTA的情況下運(yùn)行)時(shí)，已經(jīng)表明當(dāng)被強(qiáng)的外加場(chǎng)牽拉通過(guò)納米孔時(shí)，酶(例如Phi29DNA聚合酶)解開(kāi)dsDNA (圖1) (Lieberman et al.(2010),上文)。這已經(jīng)被稱作解鏈模式。解鏈模式意味著在所述酶的上方或穿過(guò)所述酶的dsDNA解鏈，并且重要的是，破壞所述酶與兩條鏈之間的相互作用和打開(kāi)所述雜交的鏈之間的氫鍵的所需的必要力。過(guò)去認(rèn)為第二互補(bǔ)鏈?zhǔn)怯行У拿附Y(jié)合所必需的。此外，認(rèn)為在所述酶的上方或所述酶中解開(kāi)所述鏈所需的必要力是使DNA通過(guò)所述孔變慢的主要制動(dòng)效應(yīng)。在此我們描述了酶(例如Phi29DNA聚合酶)如何充當(dāng)ssDNA的分子制動(dòng)器，使得ssDNA能充分受控地穿過(guò)納米孔，以圍繞專門(mén)設(shè)計(jì)的dsDNA構(gòu)建體的發(fā)夾轉(zhuǎn)角進(jìn)行測(cè)序，從而對(duì)dsDNA的正義鏈和反義鏈進(jìn)行測(cè)序(圖2)。過(guò)去解鏈模式主要使用模板進(jìn)行，其中所述分析物的末端部分是平端的(圖I)。偶爾使用小的發(fā)夾，但包括所述小的發(fā)夾只是為了簡(jiǎn)化DNA設(shè)計(jì)。先前的工作沒(méi)有考慮過(guò)在長(zhǎng)dsDNA上使用發(fā)夾，以提供讀取兩條鏈的能力。這是由于所述解鏈移動(dòng)模式?jīng)]有考慮過(guò)Phi29DNA聚合酶或相關(guān)酶在進(jìn)入ssDNA區(qū)域時(shí)(即，當(dāng)圍繞發(fā)夾移動(dòng)和沿著反義鏈移動(dòng)時(shí)-圖2)能夠控制DNA的移動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明人已經(jīng)出乎意料地證明，當(dāng)雙鏈靶多核苷酸的兩條鏈通過(guò)橋連部分連接然后被分開(kāi)時(shí)，納米孔可對(duì)所述兩條鏈進(jìn)行測(cè)序。此外，本發(fā)明人還出乎意料地證明，酶，例如Phi29DNA聚合酶，能夠分開(kāi)通過(guò)橋連部分連接的雙鏈多核苷酸(例如DNA)的兩條鏈，并控制得到的單鏈多核苷酸移動(dòng)穿過(guò)所述跨膜孔。
[0008]通過(guò)用橋連部分連接雙鏈多核苷酸的兩條鏈而對(duì)所述兩條鏈進(jìn)行測(cè)序的能力，具有許多優(yōu)勢(shì)，尤其是可對(duì)所述多核苷酸的正義鏈和反義鏈進(jìn)行測(cè)序。這些優(yōu)勢(shì)在下文詳細(xì)詳述。
[0009]因此，本發(fā)明提供了一種對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，包括:
[0010](a)提供包括所述靶多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述靶多核苷酸的兩條鏈在所述靶多核苷酸的一個(gè)末端處或其附近通過(guò)橋連部分連接；
[0011](b)分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈以提供單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分連接至所述靶多核苷酸另一條鏈的所述靶多核苷酸的一條鏈；
[0012](c)移動(dòng)所 述單鏈多核苷酸通過(guò)跨膜孔，使得所述單鏈多核苷酸中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；和
[0013](d)測(cè)量每次相互作用期間通過(guò)所述孔的電流，從而確定或估計(jì)所述靶多核苷酸的序列，
[0014]其中步驟(b)中的分開(kāi)包括使所述構(gòu)建體與多核苷酸結(jié)合蛋白接觸，所述多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈。
[0015]本發(fā)明還提供了:
[0016]一一種用于制備用于測(cè)序的雙鏈靶多核苷酸的試劑盒，包括
[0017](a)能夠在一個(gè)末端處或其附近連接所述靶多核苷酸的兩條鏈的橋
[0018]連部分和(b)至少一種聚合物；
[0019]一一種制備用于測(cè)序的雙鏈靶多核苷酸的方法，包括:
[0020](a)在一個(gè)末端處或其附近用橋連部分連接所述靶多核苷酸的兩條鏈；和
[0021](b)在所述靶多核苷酸的另一個(gè)末端處使一個(gè)聚合物連接到一條鏈上，從而形成允許使用跨膜孔對(duì)所述靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的構(gòu)建體；
[0022]一一種對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，包括:
[0023](a)提供一種包含所述靶多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述靶多核苷酸的兩條鏈在所述靶多核苷酸的一個(gè)末端處或其附近通過(guò)橋連部分連接；
[0024](b)分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈以提供單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分連接至所述靶多核苷酸另一條鏈的所述靶多核苷酸的一條鏈；
[0025](c)合成所述單鏈多核苷酸的互補(bǔ)鏈(complement),使得所述單鏈多核苷酸和互補(bǔ)鏈形成雙鏈多核苷酸；[0026](d)在所述雙鏈多核苷酸的一個(gè)末端或其附近使用橋連部分連接所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈；
[0027](e)分開(kāi)所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈以提供另一單鏈多核苷酸，所述另一單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分連接至所述互補(bǔ)鏈的原始單鏈多核苷酸；
[0028](f)移動(dòng)所述互補(bǔ)鏈通過(guò)跨膜孔使得所述互補(bǔ)鏈中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；和
[0029](g)測(cè)量每次相互作用期間通過(guò)所述孔的電流，從而確定或估計(jì)所述靶多核苷酸的序列，
[0030]其中步驟(e)中的分開(kāi)包括使所述構(gòu)建體與多核苷酸結(jié)合蛋白接觸，所述多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈；
[0031]一一種用于對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置，包含:(a)膜；(b)所述膜中的多個(gè)跨膜孔；(C)多個(gè)能夠分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈的多核苷酸結(jié)合蛋白；和(d)用于實(shí)施本發(fā)明方法的說(shuō)明書(shū)。
[0032]一一種用于對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置，包含:(a)膜；(b)所述膜中的多個(gè)跨膜孔；(C)多個(gè)能夠分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈的多核苷酸結(jié)合蛋白，其中設(shè)置所述裝置以實(shí)施本發(fā)明的方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1示出了酶控制的dsDNA和ssDNA移位通過(guò)納米孔的示意圖。與具有ssDNA前導(dǎo)序列的dsDNA孵育的酶(例如Phi29DNA聚合酶)在sDNA_dsDNA的交界處結(jié)合。在外加場(chǎng)下DNA-酶復(fù)合體被納米孔捕獲。在所述場(chǎng)下，所述DNA的模板鏈以受控的一個(gè)堿基接一個(gè)堿基的方式，通過(guò)所述酶被緩慢`地剝離，在這個(gè)過(guò)程中在所述酶的內(nèi)部或上部解開(kāi)所述dsDNA的互補(bǔ)引物鏈。一旦所述酶到達(dá)所述dsDNA的末端，它就從所述DNA脫落，將所述DNA釋放通過(guò)所述納米孔。
[0034]圖2示出了酶控制的dsDNA和ssDNA移位穿過(guò)納米孔的另一示意圖。所述dsDNA具有連接所述dsDNA的正義鏈和反義鏈的發(fā)夾轉(zhuǎn)角。一旦所述酶到達(dá)所述發(fā)夾，它就保持結(jié)合所述DNA，圍繞所述發(fā)夾轉(zhuǎn)角前進(jìn)，然后沿著所述反義鏈前進(jìn)。在所述發(fā)夾和反義區(qū)域中，所述酶的功能是作為ssDNA分子制動(dòng)器，持續(xù)充分地控制所述DNA移位通過(guò)所述納米孔，以對(duì)所述DNA進(jìn)行測(cè)序。
[0035]圖3示出了利用所述酶在ssDNA區(qū)域中控制移動(dòng)的能力，圍繞dsDNA的發(fā)夾進(jìn)行讀取的概述示意圖。所述dsDNA具有5’ -ssDNA前導(dǎo)序列，以使得能夠被所述納米孔捕獲。這后面連接dsDNA部分，其中所述正義鏈和反義鏈被發(fā)夾連接。所述發(fā)夾可以任選地含有標(biāo)志物(例如脫堿基的殘基，在圖3中顯示為十字叉)，所述標(biāo)志物可在測(cè)序過(guò)程中被觀察到，這允許在測(cè)序過(guò)程中簡(jiǎn)單地鑒定所述正義鏈和反義鏈。所述反義鏈的3’ -末端還可任選地具有3’-ssDNA懸突,如果所述懸突多于約20個(gè)堿基,則允許全部讀出所述反義鏈(所述納米孔的讀取頭是在所述酶中從DNA頂端開(kāi)始下游約20個(gè)堿基)。
[0036]圖4示出了使用Phi29DNA聚合酶以解鏈方式通過(guò)MspA納米孔測(cè)序的所述DNA-酶-納米孔復(fù)合體(左)和從它們獲得的共有序列(右)的示意圖。部分I標(biāo)示DNA的所述正義部分，和部分2標(biāo)示所述反義部分。該圖顯示了短的dsDNA構(gòu)建體的DNA測(cè)序。在這個(gè)構(gòu)建體中，所述dsDNA部分未由發(fā)夾連接，因此所述酶從所述DNA的末端脫落，并且只有所述模板/正義鏈被測(cè)序(除了最后的約20個(gè)堿基之外)。
[0037]圖5示出了使用Phi29DNA聚合酶以解鏈的方式通過(guò)MspA納米孔測(cè)序的所述DNA-酶-納米孔復(fù)合體(左)和從它們獲得的共有序列(右)的示意圖。部分I標(biāo)示DNA的所述正義部分，和部分2標(biāo)示所述反義部分。對(duì)具有發(fā)夾的短dsDNA構(gòu)建體進(jìn)行DNA測(cè)序。在這個(gè)構(gòu)建體中，所述酶沿著所述正義鏈、圍繞著所述發(fā)夾環(huán)、沿著所述反義鏈下行移動(dòng)，使得能夠?qū)λ稣x鏈和所述反義鏈的開(kāi)始部分進(jìn)行測(cè)序。
[0038]圖6示出了使用Phi29DNA聚合酶以解鏈的方式通過(guò)MspA納米孔測(cè)序的所述DNA-酶-納米孔復(fù)合體(左)和從它們獲得的共有序列(右)的示意圖。部分I標(biāo)示DNA的所述正義部分，部分2標(biāo)示所述反義部分。與圖5相似，該構(gòu)建體允許對(duì)所述正義鏈和所述反義鏈進(jìn)行測(cè)序，但所述額外的3’ -ssDNA懸出允許在所述酶從所述DNA的末端脫落之前讀取所述反義鏈的全長(zhǎng)。
[0039]圖7示出了使用Phi29DNA聚合酶以解鏈的方式通過(guò)MspA納米孔測(cè)序的所述DNA-酶-納米孔復(fù)合體(左)和從它們獲得的共有序列(右)的示意圖。部分I標(biāo)示DNA的所述正義部分，部分2標(biāo)示所述反義部分。與圖5相似，該構(gòu)建體允許對(duì)所述正義鏈和所述反義鏈進(jìn)行測(cè)序，然而，該構(gòu)建體在所述發(fā)夾中具有單個(gè)的脫堿基殘基(顯示為十字叉)，其在所述DNA序列中提供了明確的標(biāo)志物，以識(shí)別所述正義部分和反義部分。
[0040]圖8示出了穿過(guò)MspA的UA02的共有DNA序列。部分I標(biāo)示最初在所述納米孔中的同聚物5’懸突。部分2標(biāo)示所述DNA鏈的正義部分。部分3標(biāo)示所述轉(zhuǎn)角。部分4標(biāo)示所述DNA鏈的反義區(qū)域。與每個(gè)部分相對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列在該部分編號(hào)的下面顯示。
[0041]圖9示出了 用于使用Phi29DNA聚合酶通過(guò)MspA納米孔解鏈基因組模板的示意圖。它示出了用于產(chǎn)生適用于圍繞發(fā)夾讀取的dsDNA的通用設(shè)計(jì)略圖。所述構(gòu)建體具有用于在所述納米孔中捕獲的帶任選標(biāo)志物(例如脫堿基DNA)的前導(dǎo)序列，和帶任選標(biāo)志物的發(fā)夾，以及用于將讀取擴(kuò)展到反義鏈的帶任選標(biāo)志物的尾部。
[0042]圖10示出了用于將ssDNA懸突(左)和發(fā)夾轉(zhuǎn)角(右)連接到基因組dsDNA上的銜接體設(shè)計(jì)的示意圖。X=脫堿基DNA。Chol=膽固醇-TEG DNA修飾。
[0043]圖11示出了使用Phi29DNA聚合酶時(shí)，典型的聚合酶控制的400mer_發(fā)夾通過(guò)MspA的DNA移動(dòng)。正義區(qū)域=脫堿基1-脫堿基2。反義區(qū)域=脫堿基2-脫堿基3。
[0044]圖12示出了來(lái)自多次聚合酶控制的400mer_發(fā)夾受通過(guò)MspA的DNA移動(dòng)的共有DNA序列譜。正義區(qū)域=脫堿基1-脫堿基2。反義區(qū)域=脫堿基2-脫堿基3。
[0045]圖13示出了另一種用于測(cè)序的樣品制備的示意圖。舉例說(shuō)明了構(gòu)建體包含所述靶多核苷酸和連接所述靶多核苷酸兩條鏈的橋連部分(發(fā)夾)。所述構(gòu)建體還包含前導(dǎo)聚合物(單鏈序列)、尾部聚合物(也是單鏈序列)和在所述前導(dǎo)序列中的脫堿基標(biāo)志物區(qū)域。所述標(biāo)志物可防止所述酶將所述模板完全平末端化，即填充所需要的前導(dǎo)ssDNA的相反鏈。鏈置換聚合酶(核酸結(jié)合蛋白)將所述構(gòu)建體的兩條鏈分開(kāi)，通過(guò)互補(bǔ)引物開(kāi)始或者通過(guò)從所述尾部聚合物開(kāi)始的蛋白質(zhì)引發(fā)擴(kuò)增開(kāi)始。生成所得到的單鏈多核苷酸的互補(bǔ)鏈?？赏ㄟ^(guò)加入第二個(gè)橋連部分(發(fā)夾)進(jìn)一步修飾所述互補(bǔ)物以及所述原始的正義和反義單鏈多核苷酸分析物。
[0046]圖14示出了含所述靶多核苷酸的構(gòu)建體的具體制備。[0047]圖15示出了可加入擴(kuò)增作為所述樣品制備過(guò)程的一部分，以幫助檢測(cè)表觀遺傳信息。已經(jīng)構(gòu)建核苷酸，使得通過(guò)所述孔讀取以下信息:正義鏈(原始的)、反義鏈(原始的)、橋連部分、正義鏈(復(fù)制的)、反義鏈(復(fù)制的)。因此四次獲得關(guān)于甲基化堿基(mC)的信息。
[0048]圖16示出了可如何對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序。將橋連部分與RNA片段連接，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶將所述DNA反向互補(bǔ)鏈加至所述RNA。讀取所述RNA，然后讀取所述反向互補(bǔ)鏈DNA。
[0049]圖17示出了解螺旋酶控制的dsDNA和ssDNA移位通過(guò)納米孔的示意圖。所述dsDNA具有連接所述dsDNA的正義鏈和反義鏈的發(fā)夾轉(zhuǎn)角。一旦所述酶到達(dá)所述發(fā)夾，它保持與所述DNA結(jié)合，圍繞著所述發(fā)夾轉(zhuǎn)角前進(jìn)，再沿著所述反義鏈前進(jìn)。在所述發(fā)夾和反義區(qū)域內(nèi)，所述酶的功能是作為ssDNA分子制動(dòng)器，繼續(xù)充分地控制所述DNA移位通過(guò)所述納米孔，以對(duì)所述DNA進(jìn)行測(cè)序。
[0050]圖18示出了實(shí)施例4中使用的多核苷酸MONO發(fā)夾構(gòu)建體(SEQ ID NO:29-35)0
[0051]圖19示出了典型的解螺旋酶控制的400bp發(fā)夾(如圖18中所示相連的SEQ IDNO: 29-35)通過(guò) MspA 納米孔(MS (Bl-G75S-G77S_L88N-Q126R)8MspA (具有突變 G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO:2))的DNA移動(dòng)。正義=區(qū)域I。反義=區(qū)域2。
[0052]圖20示出了典型的解螺旋酶控制的400bp發(fā)夾(如圖18中所示相連的SEQ IDNO: 29-35)通過(guò) MspA 納米孔(MS (Bl-G75S-G77S_L88N-Q126R)8MspA (具有突變 G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO: 2))的DNA移動(dòng)的開(kāi)始。在所述序列的開(kāi)始區(qū)域的polyT區(qū)域用*突出顯示，和脫堿基DNA堿基用#突出顯示。
[0053]圖21示出了典型 的解螺旋酶控制的400bp_發(fā)夾(如圖18中所示相連的SEQ IDNO:29-35)通過(guò) MspA 納米孔(MS (Bl-G75S-G77S_L88N-Q126R)8MspA (具有突變 G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO: 2))的DNA移動(dòng)的所述正義區(qū)域和反義區(qū)域之間的過(guò)渡。所述序列的正義和反義區(qū)域之間的過(guò)渡區(qū)域用*突出顯示，所述正義區(qū)域標(biāo)記為I和所述反義區(qū)域標(biāo)記為2。
[0054]圖22示出了形成DUO發(fā)夾構(gòu)建體的示例性樣品制備方法。將所述雙鏈DNA分析物接觸并修飾以在雙鏈體的一個(gè)末端含有Y-型銜接體(該銜接體的正義鏈(通過(guò)4個(gè)脫堿基的DNA堿基連接至SEQ ID NO: 30的SEQ ID NO: 29)含有5’前導(dǎo)序列和4個(gè)脫堿基，所述5’前導(dǎo)序列是與系鏈(tether) (SEQ ID NO: 35，該序列在其3’末端具有與2個(gè)胸腺嘧啶殘基連接的6個(gè)iSpl8間隔區(qū)和3’膽固醇TEG)互補(bǔ)的序列，所述銜接體的反義一半含有3’發(fā)夾(SEQ ID NO:31))和在另一末端含有發(fā)夾(SEQ ID NO: 32)。所述Y-型銜接體本身還攜帶3’ -發(fā)夾(SEQID NO: 31)，這允許通過(guò)聚合酶或通過(guò)連接來(lái)進(jìn)行延伸。優(yōu)選地通過(guò)具有鏈置換活性的嗜溫聚合酶來(lái)進(jìn)行延伸。當(dāng)所述聚合酶從所述Y-型銜接體發(fā)夾的3’端(SEQ ID NO: 31)延伸時(shí)，它復(fù)制所述反義鏈(SEQID NO: 34)，并因此置換所述原始的正義鏈(SEQ ID N0:33)。當(dāng)所述聚合酶到達(dá)所述反義鏈(SEQ ID NO:34)的末端時(shí)，它填充所述發(fā)夾(SEQ ID N0:32)的相反鏈，然后開(kāi)始填充所述現(xiàn)在為單鏈的和原始的正義鏈(SEQ IDN0:33)的相反鏈。然后通過(guò)脫堿基或間隔區(qū)修飾(其他可能的能夠停止酶延伸的修飾包括RNA、PNA或嗎啉代堿基和iso-dC或iso_dG)部分來(lái)停止延伸，以使得所述Y-型銜接體的5，-區(qū)域(SEQ ID N0:29)為單鏈。
[0055]圖23示出了在實(shí)施例5中使用的用于制備DUO發(fā)夾構(gòu)建體(如圖25中所示相連的SEQ ID NO:29-36)的具體制備方法。PhiX174的約400bp的區(qū)域是使用含有Sac I和Kpn I限制性酶切位點(diǎn)的引物(分別是SEQ ID Nos:27和28) PCR擴(kuò)增的。然后Sac I和Kpn I消化純化的PCR產(chǎn)物，然后使用T4DNA連接酶，將Y-型銜接體(將正義鏈序列(通過(guò)4個(gè)脫堿基的DNA堿基連接至SEQ ID N0:30的SEQ ID N0:29)連接到SEQ ID N0:33的5’末端，將所述反義鏈(SEQ ID NO:31)連接到SEQ ID NO:34的3’末端)和發(fā)夾(SEQ ID NO:32，用于連接SEQ ID NO: 33和34)分別連接到任一端(最終的DNA構(gòu)建體見(jiàn)圖18)。PAGE純化所述雙重連接的產(chǎn)物，然后加入Klenow DNA聚合酶、SSB和核苷酸，以允許從所述Y-型銜接體發(fā)夾(SEQ ID N0:31)進(jìn)行延伸。為了篩選成功的DUO產(chǎn)物，將一系列錯(cuò)配的限制性酶切位點(diǎn)納入所述銜接體序列中，憑此只有當(dāng)所述限制性酶切位點(diǎn)已經(jīng)成功地被所述DUO延伸過(guò)程復(fù)制時(shí)，所述酶才會(huì)切斷所述分析物。
[0056]圖24示出了在不存在聚合酶的情況下，所述限制性酶(見(jiàn)左側(cè)的凝膠，圖解:M=MfeI, A=AgeU X=XmaI, N=NgoMIV, B=BspEI)不消化銜接體修飾的分析物(MONO，如圖 18所示相連的SEQ ID N0:29-35)，是因?yàn)樗鼈兓ハ嘀g是錯(cuò)配的這一事實(shí)。然而，用聚合酶孵育時(shí)，有顯著的大小遷移，并且現(xiàn)在所述遷移的產(chǎn)物(DU0，如圖25所示相連的SEQ IDNO: 29-36)如預(yù)期地被每種限制性酶所消化(見(jiàn)右側(cè)的凝膠，圖解:M=Mfe1、A=Age1、X=Xma1、N=NgoMIV,B=BspEI)ο
[0057]圖25示出了實(shí)施例6中使用的多核苷酸DUO發(fā)夾構(gòu)建體(SEQ IDNO:29-36)0
[0058]圖26示出了兩次典型的解螺旋酶控制的所述DUO發(fā)夾構(gòu)建體(如圖25所示相連的 SEQ ID NO:29-36)通過(guò) MspA 納米孔(MS (Bl-G75S-G77S_L88N-Q126R)8MspA (具有突變G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO:2))的DNA移動(dòng)。原始的正義鏈=區(qū)域I。原始的反義鏈=區(qū)域2。復(fù)制的正義鏈=區(qū)域3。復(fù)制的反義鏈=區(qū)域4。
[0059]圖27示出了典型的解螺旋酶控制的所述DUO發(fā)夾構(gòu)建體(如圖25所示相連的SEQID NO:29-36)通過(guò) MspA 納米孔(MS (B1-G75S-G77S-L88N-Q126R) 8MspA (具有突變 G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ `ID N0:2))的DNA移動(dòng)的展開(kāi)圖。原始的正義鏈=區(qū)域I。原始的反義鏈=區(qū)域2。復(fù)制的正義鏈=區(qū)域3。復(fù)制的反義鏈=區(qū)域4。
[0060]圖28示出了在解螺旋酶控制的通過(guò)MspA納米孔(MS(B1-G75S-G77S-L88N-Q126R)8MspA (具有突變 G75S/G77S/L88N/Q126R 的 SEQ ID NO: 2))的 DNA 移動(dòng)的情況下，所述 DUO發(fā)夾構(gòu)建體(如圖25所示相連的SEQ ID NO:29-36)的原始正義區(qū)域和原始反義區(qū)域之間的典型過(guò)渡的展開(kāi)圖。原始的正義鏈=區(qū)域I。原始的反義鏈=區(qū)域2。
[0061]序列表說(shuō)明
[0062]SEQ ID NO:1示出了編碼NNN-RRK突變型MspA單體的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO:2 (也稱作“BI”)示出了 MspA單體的NNN-RRK突變體的成熟形式的氨基酸序列。所述突變體沒(méi)有信號(hào)序列，并包括以下突變:D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。這些突變使得DNA能夠轉(zhuǎn)移通過(guò)MspA孔。
[0064]SEQ ID NO:3 示出了編碼 α -溶血素-E111N/K147N ( a-HL-NN ;Stoddart etal, PNAS, 2009; 106 (19):7702-7707)的一個(gè)亞基的多核苷酸序列。
[0065]SEQ ID N0:4示出了 a-HL-NN的一個(gè)亞基的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO: 5示出了編碼Phi29DNA聚合酶的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。
[0067]SEQ ID NO:6示出了 Phi29DNA聚合酶的氨基酸序列。[0068]SEQ ID NO: 7-9分別示出了成熟形式的MspB、C和D突變體的氨基酸序列。所述成熟形式?jīng)]有信號(hào)序列。
[0069]SEQ ID NO: 10-15示出了用于舉例說(shuō)明同聚物讀段(reads)的序列。
[0070]SEQ ID NO: 16-36示出了在實(shí)施例中使用的序列。
【具體實(shí)施方式】
[0071]應(yīng)理解，所公開(kāi)的產(chǎn)物和方法的不同應(yīng)用可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的具體需要進(jìn)行調(diào)整。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的目的，而非意圖進(jìn)行限制。
[0072]此外，除非上下文另有明確說(shuō)明，否則本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”也包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如，提及“一種孔”包括兩種或多種這樣的孔，提及“一種核酸序列”包括兩種或更多種這樣的序列，等等。
[0073]本文中——無(wú)論在上文還是下文——引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以引用的方式全文納入本文。
[0074]本發(fā)明的方法
[0075]本發(fā)明提供了一種對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法。所述方法包括通過(guò)橋連部分連接所述靶多核苷酸的兩條鏈。通過(guò)使含有所述靶多核苷酸的構(gòu)建體與多核苷酸結(jié)合蛋白接觸，來(lái)分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈以提供單鏈多核苷酸。所述單鏈多核苷酸移動(dòng)穿過(guò)跨膜孔。所述單鏈多核苷酸的一部分核苷酸與所述孔相互作用。測(cè)量每一次相互作用期間通過(guò)所述孔的電流，并估計(jì)或確定所述靶多核苷酸的序列。因此，使用鏈測(cè)序(StrandSequencing)對(duì)所述靶多核`苷酸進(jìn)行測(cè)序。這種方法在本文中可稱作“MONO”法。
[0076]如上所述，通過(guò)橋連部分連接所述靶多核苷酸的兩條鏈，使得所述靶多核苷酸的兩條鏈都被所述跨膜孔測(cè)序。這種方法是有利的，因?yàn)槠涫沟脧膯蝹€(gè)雙鏈靶多核苷酸構(gòu)建體獲得的信息量加倍。此外，因?yàn)榛パa(bǔ)的‘反義’鏈中的序列必然與‘正義’鏈的序列正交，所以可有效地結(jié)合來(lái)自所述兩條鏈的信息。因此，該機(jī)制提供了一種具有更高可靠性觀測(cè)的正交的校正讀取能力。
[0077]此外，本發(fā)明的方法的其他主要優(yōu)勢(shì)是:
[0078]I)覆蓋錯(cuò)過(guò)的核苷酸:所述方法基本上使任何錯(cuò)過(guò)的核苷酸或核苷酸組(例如由于移動(dòng)問(wèn)題，例如所述鏈滑過(guò)所述孔)的問(wèn)題最小化，因?yàn)槿魏慰赡茉谝粭l鏈中錯(cuò)過(guò)的狀態(tài)，很可能被獲得自它的互補(bǔ)區(qū)域的正交信息所覆蓋。
[0079]2)覆蓋有問(wèn)題的序列基序:序列基序的任何困難均可由所述互補(bǔ)鏈中的正交且相反的信息所覆蓋，所述具有不同序列的互補(bǔ)鏈不會(huì)具有相同的序列依賴性問(wèn)題。例如，這與以下序列基序特別相關(guān)，所述序列基序僅產(chǎn)生小的電流變化或具有相似的電流水平(即，移動(dòng)通過(guò)所述納米孔時(shí)產(chǎn)生相同電流阻斷的序列的連續(xù)堿基基序)并因此由于沒(méi)有電流的階躍變化而不能被觀察到。任何來(lái)自一個(gè)序列基序的相似電流水平均會(huì)被獲自其互補(bǔ)鏈中正交序列的完全不同的電流水平所覆蓋。
[0080]除了上述的優(yōu)勢(shì)之外，還有很多其他特定情況，其中讀取雙鏈多核苷酸的兩條鏈的概念可用于提供其他益處。
[0081]1.表觀遺傳的信息[0082]在許多應(yīng)用中，需要能夠鑒定天然DNA鏈中的表觀遺傳信息(例如5-羥甲基胞嘧啶核苷酸的5-甲基胞嘧啶)或損壞的堿基。目前，很難提取這種信息，因?yàn)榇蠖鄶?shù)DNA測(cè)序技術(shù)依賴于DNA擴(kuò)增作為它們的測(cè)序化學(xué)的一部分。可以提取這種信息，但是需要進(jìn)行化學(xué)處理，然后進(jìn)行擴(kuò)增，這兩者都可引入錯(cuò)誤。
[0083]納米孔測(cè)序也是一種單分子測(cè)序技術(shù)，因此不需要DNA擴(kuò)增就可以進(jìn)行。已經(jīng)表明，納米孔可以檢測(cè)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的四種DNA核苷酸的修飾。在修飾的堿基的表現(xiàn)方式與另一堿基類似(產(chǎn)生相似的電流信號(hào))的情形下，讀取所述多核苷酸的兩條鏈可以用于檢測(cè)DNA修飾。例如，如果甲基胞嘧啶(mC)的表現(xiàn)方式與胸腺嘧啶類似時(shí)，就會(huì)有與將mC指定為T(mén)相關(guān)的錯(cuò)誤。在正義鏈中，有可能所述堿基被稱為mC或T。然而，在反義鏈中，相應(yīng)的堿基可高概率地作為G出現(xiàn)。因此，通過(guò)對(duì)反義鏈進(jìn)行“校正讀取”，正義鏈中的所述堿基很可能是mC,而非T。
[0084]不需要擴(kuò)增或復(fù)制，就可讀取正義鏈和反義鏈。然而，擴(kuò)增或復(fù)制可作為樣品制備的一部分加入，以幫助檢測(cè)表觀遺傳信息?？蓸?gòu)建核苷酸鏈(在下文詳細(xì)描述)，其中以如下的順序通過(guò)所述納米孔讀取如下信息:(原始的)正義鏈、(原始的)反義鏈、-橋連部分_、(互補(bǔ)的)正義鏈、(互補(bǔ)的)反義鏈(圖15)。
[0085]在這個(gè)方案中，在所述甲基化堿基上的信息會(huì)被獲得四次。如果所述表觀遺傳的堿基在原始的正義鏈中(在這種情況下，mC)，那么會(huì)高概率地獲得以下信息:正義鏈(原始的)-mC、反義鏈(原始的)-G、正義鏈(互補(bǔ)的)-C，和反義鏈(互補(bǔ)的)-G。很顯然，所述原始的正義鏈讀取和復(fù)制的正義鏈讀取會(huì)給出不同的結(jié)果，而兩個(gè)反義鏈讀取會(huì)產(chǎn)生相同的堿基識(shí)別。該信息可用于指示所述原始正義鏈中所述表觀遺傳堿基的位置。
[0086]2.RNA-DNA 雙讀取
[0087]相似的方案可用于對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序?？蓪蜻B部分連接到一段RNA上，并且通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶將DNA反向互補(bǔ)鏈加入至所述RNA (獲得的構(gòu)建體示于圖16)。
[0088]在該方案中，讀取RNA后,繼而對(duì)所述反向互補(bǔ)鏈進(jìn)行DNA讀取?？山Y(jié)合來(lái)自RNA和DNA讀段的信息，來(lái)提高確定或評(píng)估RNA序列的準(zhǔn)確度。例如，如果RNA中的尿嘧啶堿基(U)的讀取結(jié)果與胞嘧啶相似，那么相應(yīng)的堿基可用于解決這個(gè)錯(cuò)誤。如果相應(yīng)的DNA堿基是G，那么所述RNA堿基很可能是C，而如果所述DNA堿基被識(shí)別為A，那么所述RNA堿基可能是U。
[0089]3.同聚物閱讀
[0090]對(duì)于單分子納米孔測(cè)序而言，同聚物讀取可能是個(gè)問(wèn)題。如果同聚物區(qū)域比所述孔的讀取部分長(zhǎng)，那么所述同聚物部分的長(zhǎng)度將難以確定。
[0091]早已證明，Phi29可用于圍繞發(fā)夾進(jìn)行讀取，使得能夠讀取正義鏈和反義鏈?？墒褂镁酆厦负鸵唤M常規(guī)的DNA三磷酸；dTTP、dGTP、dATP、dCTP，使用擴(kuò)增來(lái)生成反義鏈。為了克服同聚物讀取的問(wèn)題，可加入原始的dTTP、dGTP、dATP、dCTP和不同的堿基，來(lái)合成反義鏈。這可以是天然堿基類似物例如肌苷(I)。與正確的天然堿基相比，所述堿基會(huì)被隨機(jī)納入，并且可通過(guò)改變所述三磷酸物質(zhì)的濃度來(lái)控制插入率。
[0092]通過(guò)加入替代的堿基，將有可能將替代堿基插入到同聚物區(qū)域的反向互補(bǔ)鏈中。這樣的結(jié)果是，同聚物運(yùn)行的長(zhǎng)度將會(huì)縮短至同聚物中可被納米孔的讀取部分讀取的點(diǎn)。例如，同聚物組AAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 10)會(huì)有替代堿基的隨機(jī)插入，并可獲得TTTITTIITTTI (SEQ ID NO: 11)(其中 I 是肌苷)。
[0093]原始的DNA+ 發(fā)夾(SEQ ID NO: 12):
[0094]5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXXTGTACTGCCGTACGTAAAAAAATAGCTGATCGTACTT
[0095]ACTAGCATGTT
[0096](脫堿基=X)
[0097]常規(guī)轉(zhuǎn)變(SEQID NO: 13):
[0098]5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXXTGTACTGCCGTACGTAAAAAAATAGCTGATCGTACTT
[0099]ACATGACGGCATGCATTTTTTTATCGACTAGCATGTT
[0100](脫堿基=X)
[0101]提出的方案I (G、T、A、C被類似物I隨機(jī)地替換)(SEQ ID N014):
[0102]5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXXTGTACTGCCGTACGTAAAAAAATAGSTGATCGTACTT
[0103]AIATIACGICATGIATTITTITATIGACTAGCATGTT
[0104](脫喊基=X)
[0105]所述堿基類似物可 以是通用的(替換T、G、A或C)，或它可以對(duì)一個(gè)堿基有特異性(例如脫氧尿苷(U)只替代T)。
[0106]提出的方案2 (T被類似物U隨機(jī)地替換)(SEQ ID NO: 15):
[0107]5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXXTGTACTGCCGTACGTAAAAAAATAGCTGATCGTACTT
[0108]ACAUGACGGCATGCAUTTTUTTATCGACTAGCATCTT
[0109](脫堿基=X)
[0110]在方案I和方案2中，已經(jīng)減少了同聚物長(zhǎng)度(stretch)，以允許估計(jì)或確定單個(gè)核苷酸或核苷酸組。正義鏈?zhǔn)翘烊坏腄NA鏈，而反義鏈含有天然堿基和堿基類似物的混合物。來(lái)自于正義鏈讀段和反義鏈讀段的數(shù)據(jù)的結(jié)合，可用于估計(jì)在原始DNA部分中的同聚物運(yùn)行的長(zhǎng)度。
[0111]雙鏈靶多核苷酸
[0112]本發(fā)明的方法用于對(duì)雙鏈多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。多核苷酸(例如核酸)是包含兩個(gè)或兩個(gè)以上核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包含任何核苷酸的任意組合。核苷酸可為天然存在的或人工的。核苷酸可被氧化或甲基化。核苷酸通常含有核堿基、糖和至少一個(gè)磷酸基團(tuán)。核堿基通常是雜環(huán)的。核堿基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具體是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脫氧核糖。核苷酸通常為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有單磷酸基、二磷酸基或三磷酸基。磷酸基可連接在核苷酸的5’或3’偵U。
[0113]核苷酸包括但不限于單磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、單磷酸鳥(niǎo)苷酸(GMP)、二磷酸鳥(niǎo)苷(⑶P)、三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)、單磷酸胸苷酸(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、單磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、單磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(⑶P)、三磷酸胞苷(CTP)、單磷酸5-甲基胞苷、二磷酸5-甲基胞苷、三磷酸5-甲基胞苷、單磷酸5-羥甲基胞苷、二磷酸5-羥甲基胞苷、三磷酸5-羥甲基胞苷、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)單磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)、單磷酸脫氧腺苷(dAMP)、二磷酸脫氧腺苷(dADP )、三磷酸脫氧腺苷(dATP )、單磷酸脫氧鳥(niǎo)苷(dGMP )、二磷酸脫氧鳥(niǎo)苷(dGDP )、三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷(dGTP)、單磷酸脫氧胸苷(dTMP)、二磷酸脫氧胸苷(dTDP)、三磷酸脫氧胸苷(dTTP)、單磷酸脫氧尿苷(dUMP)、二磷酸脫氧尿苷(dUDP)、三磷酸脫氧尿苷(dUTP)、單磷酸脫氧胞苷(dCMP)、二磷酸脫氧胞苷((KDP)和三磷酸脫氧胞苷(dCTP)、單磷酸5-甲基-2’ -脫氧胞苷、二磷酸5-甲基-2’ -脫氧胞苷、三磷酸5-甲基-2’ -脫氧胞苷、單磷酸
5-羥甲基_2’ -脫氧胞苷、二磷酸5-羥甲基-2’ -脫氧胞苷和三磷酸5-羥甲基-2’ -脫氧胞苷。核苷酸優(yōu)選地選自 AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP 或 dCMP。
[0114]核苷酸可含有糖和至少一個(gè)磷酸基團(tuán)(即沒(méi)有核堿基)。
[0115]多核苷酸可為核酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。靶多核苷酸可包含與一條DNA鏈雜交的一條RNA鏈。多核苷酸可為本領(lǐng)域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸(LNA)或其他具有核苷酸側(cè)鏈的合成聚合物。
[0116]靶多核苷酸可為任意長(zhǎng)度。例如，多核苷酸可為至少10個(gè)，至少50個(gè)，至少100個(gè)，至少150個(gè)，至少200個(gè)，至少250個(gè)，至少300個(gè)，至少400個(gè)或至少500個(gè)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。多核苷酸可為1000或更多個(gè)核苷酸對(duì)，5000或更多個(gè)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度或100000或更多個(gè)核苷酸對(duì)的長(zhǎng)度。
[0117]靶多核苷酸可以存在于任何合適的樣品中。本發(fā)明通常對(duì)已知含有或懷疑含有靶多核苷酸的樣品進(jìn)行?；蛘?，本發(fā)明可對(duì)樣品進(jìn)行，以確定一種或多種已知或預(yù)期存在于樣品中的靶多核苷酸的種類。
[0118]所述樣品可為生物樣品。本發(fā)明可在體外對(duì)從任何生物或微生物體獲得或提取的樣品進(jìn)行。所述生物或微生物體通常為古生物、原核生物或真核生物并通常屬于以下五界之一:植物界、動(dòng)物界 、真菌界、原核生物界和原生生物界。本發(fā)明可在體外對(duì)從任何病毒獲得或提取的樣品進(jìn)行。所述樣品優(yōu)選地為液體樣品。所述樣品通常包含患者的體液。所述樣品可為尿液、淋巴液、唾液、黏液或羊膜液，但優(yōu)選地為血液、血衆(zhòng)或血清。通常，所述樣品是人來(lái)源的，但可選地它可來(lái)自另外的哺乳動(dòng)物，例如來(lái)自商業(yè)養(yǎng)殖的動(dòng)物，例如馬、牛、綿羊或豬，或者可為寵物例如貓或狗?？蛇x擇地，植物來(lái)源的樣品通常獲得自商業(yè)作物，例如谷類、豆類、水果或蔬菜，例如小麥、大麥、燕麥、蕓苔、玉米、大豆、水稻、香蕉、蘋(píng)果、番茄、馬鈴薯、葡萄、煙草、豆類(beans)、小扁豆、甘蔗、可可、棉花、茶、咖啡。
[0119]所述樣品可為非生物樣品。所述非生物樣品優(yōu)選地為液體樣品。非生物樣品的實(shí)例包括外科用液體、水例如飲用水、海水或河水，和用于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的試劑。
[0120]通常在測(cè)定之前對(duì)所述樣品進(jìn)行處理，例如通過(guò)離心或通過(guò)穿過(guò)膜，所述膜濾出不想要的分子或細(xì)胞，例如紅血細(xì)胞。所述樣品可在采集后立即測(cè)量。所述樣品通常還可在測(cè)定之前進(jìn)行保存，優(yōu)選低于_70°C。
[0121]如果如下文所更詳細(xì)討論的將所述靶多核苷酸與膜偶聯(lián)，那么本發(fā)明的方法對(duì)于人DNA測(cè)序特別有益，因?yàn)閮H可從人血液中獲得少量的純化的DNA。所述方法優(yōu)選地能夠?qū)σ约s0.1pM-約InM (例如少于ΙρΜ，少于IOpM或少于IOOpM)的濃度存在的靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。
[0122]構(gòu)律體
[0123]本發(fā)明的方法包括提供一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含待測(cè)序的雙鏈靶多核苷酸。所述構(gòu)建體通常允許通過(guò)跨膜孔對(duì)靶多核苷酸的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序。
[0124]所述構(gòu)建體包含橋連部分，所述橋連部分能夠連接靶多核苷酸的兩條鏈。所述橋連部分通常共價(jià)連接所述靶多核苷酸的兩條鏈。所述橋連部分可為能夠連接所述靶多核苷酸的兩條鏈的任何物質(zhì)，條件是橋連部分不干擾所述單鏈多核苷酸通過(guò)所述跨膜孔的移動(dòng)。適合的橋連部分包括但不限于聚合的接頭(linker)、化學(xué)接頭、多核苷酸或多肽。優(yōu)選地，所述橋連部分包含DNA、RNA、修飾的DNA (例如脫堿基DNA)、RNA、PNA、LNA或PEG。所述橋連部分更優(yōu)選地為DNA或RNA。
[0125]所述橋連部分最優(yōu)選地為發(fā)夾環(huán)。所述發(fā)夾環(huán)通常為4-100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，優(yōu)選4-8個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
[0126]通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法，將所述橋連部分連接至所述靶多核苷酸構(gòu)建體。所述橋連部分可單獨(dú)合成，然后化學(xué)連接或酶連接到所述靶多核苷酸上?；蛘?，所述橋連部分在處理所述靶多核苷酸的過(guò)程中產(chǎn)生。
[0127]所述橋連部分在所述靶多核苷酸的一個(gè)末端或其附近連接至所述靶多核苷酸上。所述橋連部分優(yōu)選地在所述靶多核苷酸末端的10個(gè)氨基酸內(nèi)連接至所述靶多核苷酸上。
[0128]包含所述靶多核苷酸的構(gòu)建體還優(yōu)選地在所述靶多核苷酸中與所述橋連部分相對(duì)的末端處包含至少一個(gè)聚合物。如下文所更詳細(xì)討論的，這類聚合物有利于本發(fā)明的測(cè)序方法。合適的聚合物包括多核苷酸(DNA/RNA)、修飾的多核苷酸例如修飾的DNA、PNA、LNA、PEG或多肽。
[0129]所述構(gòu)建體優(yōu)選地包含前導(dǎo)聚合物。所述前導(dǎo)聚合物在與所述橋連部分相對(duì)的末端處連接至所述靶多核苷酸。所述前導(dǎo)聚合物幫助所述雙鏈靶多核苷酸與所述跨膜孔結(jié)合或與多核苷酸結(jié)合蛋白(例如Phi29DNA聚合酶)結(jié)合，所述多核苷酸結(jié)合蛋白幫助分開(kāi)所述兩條鏈和/或控制所述單鏈多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述孔。下文更詳細(xì)討論跨膜孔和多核苷酸結(jié)合蛋白。
[0130]所述前導(dǎo)聚合物`可為多核苷酸(例如DNA或RNA)、修飾的多核苷酸(例如脫堿基DNA), PNA、LNA、PEG或多肽。所述前導(dǎo)聚合物優(yōu)選地為多核苷酸，更優(yōu)選地為單鏈多核苷酸。所述前導(dǎo)聚合物可為任一上述多核苷酸。所述單鏈前導(dǎo)聚合物最優(yōu)選地為DNA單鏈。所述前導(dǎo)聚合物可為任意長(zhǎng)度，但通常為27-150個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如50-150個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
[0131]可以以多種方式將單鏈多核苷酸的部分加入到雙鏈多核苷酸上?？蛇M(jìn)行化學(xué)連接或酶連接。此外，Epicentre的Nextera方法是合適的。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)展出了一種使用正義引物的PCR方法，所述正義引物同往常一樣含有與基因組DNA中靶區(qū)域的起始部分的互補(bǔ)部分，但是又額外在前面加上50polyT部分。為了防止聚合酶延伸polyT對(duì)面的互補(bǔ)鏈，從而產(chǎn)生平端的PCR產(chǎn)物(如通常的產(chǎn)物)，將四個(gè)脫堿基位點(diǎn)加入至所述polyT部分和所述互補(bǔ)引發(fā)部分之間。這些脫堿基位點(diǎn)會(huì)防止聚合酶越過(guò)該區(qū)域延伸，因此在每個(gè)擴(kuò)增的拷貝上PolyT部分會(huì)仍為5’單鏈DNA形式。也能終止聚合酶延伸的其他可能修飾包括RNA、PNA或嗎啉代堿基、iso-dC或iso-dG。
[0132]所述構(gòu)建體優(yōu)選地還包含聚合物尾(也在與所述橋連部分相對(duì)的末端處連接至所述靶多核苷酸)。所述聚合物尾幫助所述跨膜孔對(duì)所述靶構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序。具體地，所述聚合物尾部通常確保所述雙鏈多核苷酸的全部(即兩條鏈的全部)能夠被所述跨膜孔讀取并測(cè)序。如下所述，多核苷酸結(jié)合蛋白(例如Phi29DNA聚合酶)可控制所述單鏈多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述跨膜孔。所述蛋白通常使所述多核苷酸通過(guò)所述孔的移動(dòng)減慢。例如，Phi29DNA聚合酶的作用像制動(dòng)器，使所述多核苷酸順著跨膜施加的電勢(shì)而通過(guò)所述孔的移動(dòng)減慢。一旦所述多核苷酸不再與所述結(jié)合蛋白接觸，它將以難以獲得序列信息的速度自由地移動(dòng)通過(guò)所述孔。因?yàn)橥ǔ乃龅鞍椎剿隹字g的距離較短，通常約20個(gè)核苷酸，可能會(huì)遺漏某些序列信息(約等于該距離)。尾部聚合物“延長(zhǎng)” 了所述單鏈多核苷酸的長(zhǎng)度，使得當(dāng)所述靶多核苷酸的兩條鏈全部通過(guò)所述孔并被測(cè)序時(shí)，它的移動(dòng)可以被所述核酸結(jié)合蛋白所控制。這類實(shí)施方案確保可從所述靶多核苷酸中全部?jī)蓷l鏈獲得序列信息。所述尾部聚合物還可提供用于引物結(jié)合的位點(diǎn)，所述位點(diǎn)使得所述核酸結(jié)合蛋白能夠分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈。
[0133]所述尾部聚合物可為多核苷酸(例如DNA或RNA)、修飾的多核苷酸(例如脫堿基DNA), PNA、LNA、PEG或多肽。所述尾部聚合物優(yōu)選地為多核苷酸，更優(yōu)選地為單鏈多核苷酸。所述尾部聚合物可為任一上述的多核苷酸。
[0134]所述構(gòu)建體優(yōu)選地還包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物，當(dāng)所述構(gòu)建體通過(guò)所述跨膜孔時(shí)，所述標(biāo)志物產(chǎn)生特征性電流(特征性的標(biāo)記電流)。通常使用所述標(biāo)志物以能夠估計(jì)或確定所述單鏈多核苷酸相對(duì)于所述孔的位置。例如，來(lái)自位于所述靶多核苷酸兩條鏈之間的標(biāo)志物的信號(hào)，表明一條鏈已經(jīng)被測(cè)序，另一條鏈即將進(jìn)入孔。因此，這類標(biāo)志物可用于區(qū)分靶DNA的正義鏈和反義鏈。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物還可用于鑒定所述靶多核苷酸的來(lái)源。合適的標(biāo)志物包括但不限于脫堿基區(qū)域、特定的核苷酸序列、非自然核苷酸、熒光團(tuán)或膽固醇。所述標(biāo)志物優(yōu)選地為脫堿基區(qū)域或特定的核苷酸序列。
[0135]一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物可位于所述構(gòu)建體中的任何位置。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物可位于所述橋連部分中。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物還可位于所述橋連部分附近。所述橋連部分的附近優(yōu)選地是指所述橋連部分的10-100個(gè)核苷酸內(nèi)。
[0136]所述標(biāo)志物還 可置于前導(dǎo)聚合物或尾部聚合物內(nèi)。
[0137]可使用任何已知的方法將所述構(gòu)建體偶聯(lián)到所述膜上。如果所述膜是兩親性層，例如脂雙層(如下文所詳細(xì)詳述的)，則所述構(gòu)建體優(yōu)選地是通過(guò)存在于膜中的多肽或存在于膜中的疏水性錨偶聯(lián)到所述膜上。所述疏水性錨優(yōu)選地為脂質(zhì)、脂肪酸、留醇、碳納米管
或氨基酸。
[0138]所述構(gòu)建體可直接偶聯(lián)到所述膜上。所述構(gòu)建體優(yōu)選地是通過(guò)接頭偶聯(lián)到所述膜上。優(yōu)選的接頭包括但不限于聚合物，例如多核苷酸、聚乙二醇(PEG)和多肽。如果多核苷酸直接偶聯(lián)到所述膜上，那么會(huì)丟失一些序列數(shù)據(jù)，因?yàn)橛捎谒瞿づc所述檢測(cè)器之間的距離而導(dǎo)致所述測(cè)序運(yùn)行不能持續(xù)到所述多核苷酸的末端。如果使用接頭，那么可處理所述多核苷酸直至結(jié)束。如果使用接頭，所述接頭可在任何位置連接至所述構(gòu)建體。所述接頭優(yōu)選地在所述尾部聚合物處連接至所述多核苷酸。
[0139]所述偶聯(lián)可為穩(wěn)定的或暫時(shí)的。對(duì)于某些應(yīng)用，優(yōu)選暫時(shí)性的偶聯(lián)。如果穩(wěn)定偶聯(lián)的分子直接連接多核苷酸的5’末端或3’末端，那么會(huì)丟失一些序列數(shù)據(jù)，因?yàn)橛捎谒鲭p層與所述酶活性位點(diǎn)之間的距離而導(dǎo)致測(cè)序運(yùn)行不能持續(xù)到所述多核苷酸的末端。如果所述偶聯(lián)是暫時(shí)的，那么當(dāng)所述偶聯(lián)的末端隨機(jī)地脫離雙層時(shí)，就可處理所述多核苷酸直至結(jié)束。下文更詳細(xì)地討論了與膜形成穩(wěn)定的或暫時(shí)的連接的化學(xué)基團(tuán)?？墒褂媚懝檀蓟蛑觉ｆ湆⑺鰳?gòu)建體暫時(shí)地偶聯(lián)到兩親性層或脂雙層上。可使用具有6-30個(gè)碳原子長(zhǎng)度的任何脂肪酰鏈，例如十六烷酸。[0140]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將構(gòu)建體偶聯(lián)到兩親性層(例如脂雙層)上。以前已經(jīng)使用多種不同的束縛策略實(shí)現(xiàn)了多核苷酸與合成脂雙層的偶聯(lián)。這些策略在下表1中概述。
[0141]表1
[0142]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，包括: (a)提供包括所述靶多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述靶多核苷酸的兩條鏈在所述靶多核苷酸的一個(gè)末端處或其附近通過(guò)橋連部分連接； (b)分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈以提供單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分連接至所述靶多核苷酸另一條鏈的所述靶多核苷酸的一條鏈； (c)移動(dòng)所述單鏈多核苷酸通過(guò)跨膜孔，使得所述單鏈多核苷酸中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；和 (d)測(cè)量每次相互作用期間通過(guò)所述孔的電流，從而確定所述靶多核苷酸的序列， 其中步驟(b)中的分離包括使所述構(gòu)建體與分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈的多核苷酸結(jié)合蛋白接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述橋連部分包含聚合物接頭、化學(xué)接頭、多核苷酸或多肽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述橋連部分包含DNA、RNA、修飾的DNA或RNA、PNA、LNA或PEG。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述橋連部分是發(fā)夾環(huán)。
5.前述權(quán)利要求任一·項(xiàng)的方法，其中所述整個(gè)單鏈多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述孔，并所述整個(gè)靶多核苷酸被測(cè)序。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中多核苷酸結(jié)合蛋白控制所述單鏈多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述跨膜孔。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈，并控制所述單鏈多核苷酸移動(dòng)通過(guò)所述孔。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白: (a)衍生自微病毒亞科(Picovirinaefamily)的病毒 (b)衍生自Phi29DNA聚合酶；或 (c)衍生自解螺旋酶。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述構(gòu)建體還在所述靶多核苷酸中與所述橋連部分相對(duì)的末端包含至少一個(gè)聚合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述構(gòu)建體在所述靶多核苷酸的一條鏈上包含前導(dǎo)聚合物，在所述靶多核苷酸的另一條鏈上包含尾部聚合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述單鏈多核苷酸采用以下的順序移動(dòng)通過(guò)所述孔:(I)所述前導(dǎo)聚合物，(2)所述靶多核苷酸的一條鏈，(3)所述橋連部分，(4)所述靶多核苷酸的另一條鏈，和(5)所述尾部聚合物。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述構(gòu)建體還包含將所述構(gòu)建體偶聯(lián)到所述膜上的工具。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述跨膜孔是蛋白孔或固態(tài)孔。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述蛋白孔衍生自Msp或或α-溶血素(a -HL)。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述膜是兩親性層或固態(tài)層。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述膜是脂雙層。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述構(gòu)建體還包含一種或多種標(biāo)志物，當(dāng)所述標(biāo)志物與所述孔相互作用時(shí)，它們產(chǎn)生特征性的電流。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物是脫堿基或特定的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求17或19的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物在所述橋連部分中或其附近。
20.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物位于所述前導(dǎo)聚合物或所述尾部聚合物中。
21.權(quán)利要求19-20任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物鑒別所述靶多核苷酸的來(lái)源。
22.一種用于制備用于測(cè)序的雙鏈靶多核苷酸的試劑盒，包含: (a)能夠在一個(gè)末端或其附近連接所述靶多核苷酸的兩條鏈的橋連部分；和 (b)至少一種聚合物。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，包含前導(dǎo)聚合物和尾部聚合物
24.權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述前導(dǎo)聚合物和尾部聚合物是多核苷酸，并且所述前導(dǎo)聚合物的一部分和所述尾部聚合物的一部分形成雙鏈序列。
25.權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的試劑盒，還包含將所述靶多核苷酸偶聯(lián)到膜的工具。
26.權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的試劑盒,還包`含一種或多種標(biāo)志物， 當(dāng)所述標(biāo)志物與跨膜孔相互作用時(shí)，它們產(chǎn)生特征性的電流。
27.一種制備用于測(cè)序的雙鏈靶多核苷酸的方法，包括: (a)在一個(gè)末端或其附近用橋連部分連接所述靶多核苷酸的兩條鏈； 和 (b)在所述靶多核苷酸的另一個(gè)末端將一個(gè)聚合物連接到一條鏈上，從而形成允許使用跨膜孔測(cè)序所述靶多核苷酸的構(gòu)建體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述聚合物是前導(dǎo)聚合物，所述方法還包括在與所述前導(dǎo)聚合物相同的末端將尾部聚合物連接到所述靶多核苷酸的另一條鏈上。
29.權(quán)利要求28的方法，還包括將工具連接到所述構(gòu)建體，所述工具將所述構(gòu)建體偶聯(lián)到膜上。
30.權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)的方法，其中: (a)單獨(dú)合成所述橋連部分并將其以化學(xué)連接或酶連接到所述靶多核苷酸上；或 (b)在所述靶多核苷酸的加工過(guò)程中產(chǎn)生所述橋連部分。
31.一種對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，包括: (a)提供含有所述靶多核苷酸的構(gòu)建體，其中在所述靶多核苷酸的一個(gè)末端或其附近通過(guò)橋連部分連接所述靶多核苷酸的兩條鏈； (b)分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈以提供單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分連接至所述靶多核苷酸另一條鏈的所述靶多核苷酸的一條鏈； (c)合成所述單鏈多核苷酸的互補(bǔ)鏈，使得所述單鏈多核苷酸和互補(bǔ)鏈形成雙鏈多核苷酸； (d)在所述雙鏈多核苷酸的一個(gè)末端或其附近使用橋連部分連接所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈； (e)分開(kāi)所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈以提供另一單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分與所述互補(bǔ)鏈連接的所述原始單鏈多核苷酸； (f)移動(dòng)所述互補(bǔ)鏈通過(guò)跨膜孔使得所述互補(bǔ)鏈中的一部分核苷酸與所述孔相互作用；和 (g)測(cè)量每次相互作用期間通過(guò)所述孔的電流，并從而確定所述靶多核苷酸的序列， 其中步驟(e)中的分開(kāi)包括使所述構(gòu)建體與多核苷酸結(jié)合蛋白接觸，所述多核苷酸結(jié)合蛋白分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈。
32.一種用于對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置，包含:(a)膜；(b)所述膜中的多個(gè)跨膜孔；(C)多個(gè)能夠分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈的多核苷酸結(jié)合蛋白；和(d)用于實(shí)施權(quán)利要求I的方法的說(shuō)明書(shū)。
33.一種用于對(duì)雙鏈靶多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的裝置，包含:(a)膜；(b)所述膜中的多個(gè)跨膜孔；(C)多個(gè)能夠分開(kāi)所述靶多核苷酸的兩條鏈的多核苷酸結(jié)合蛋白，其中設(shè)置所述裝置以實(shí)施權(quán)利要求1的方法。
34.權(quán)利要求32或33的裝置，其中所述裝置包含: 能夠支持所述膜和多個(gè)孔并且能夠被操作以使用所述孔和蛋白進(jìn)行多核苷酸測(cè)序的傳感器設(shè)備； 至少一個(gè)用于容納 用于進(jìn)行所述測(cè)序的材料的容器； 被配制為可控地從所述至少一個(gè)容器向所述傳感器設(shè)備供應(yīng)材料的液流系統(tǒng)；和多個(gè)用于接收各個(gè)樣品的容器，所述液流系統(tǒng)被配置為選擇性地從所述容器向所述傳感器設(shè)備供應(yīng)所述樣品。
35.一種權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，還任選地包括在步驟(b)之后且在步驟(c)之N /.1IJ (m)合成所述單鏈多核苷酸的互補(bǔ)鏈，使得所述單鏈多核苷酸和互補(bǔ)鏈形成雙鏈多核苷酸； (η)在所述雙鏈多核苷酸的一個(gè)末端或其附近使用橋連部分連接所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈； (ο)分開(kāi)所述雙鏈多核苷酸的兩條鏈以提供另一單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸包含通過(guò)所述橋連部分與所述互補(bǔ)鏈連接的所述原始單鏈多核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103827320SQ201280046608
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月25日
【發(fā)明者】C·布朗, J·克拉克, G·哈爾, G·哈珀, A·赫倫, J·懷特 申請(qǐng)人:牛津納米孔技術(shù)有限公司