用于基因治療載體的表達(dá)的桿狀病毒系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用單次感染即可用于表達(dá)基因治療載體的重組桿狀病毒基因組。
【專利說明】用于基因治療載體的表達(dá)的桿狀病毒系統(tǒng)
[0001]重組腺相關(guān)病毒(或rAAV)目前被認(rèn)為是基因治療中最有希望的病毒載體。然而，它們的大規(guī)模生產(chǎn)仍然是開發(fā)這一類型療法的限制因素。因此，為了克服這一難題并出于生物安全的原因，已開發(fā)了利用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞的能力的生產(chǎn)系統(tǒng)(Urabe等，2002，Hum.Gene Ther.13:1935-1943 ;US20030148506 ;US20040197895)。根據(jù)最初提出的方案，為了提供rep和cap輔助基因和包含含有形成重組病毒粒子所需的轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體的構(gòu)建物，需要用3種不同的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞。這一系統(tǒng)的簡化形式由將rep和cap基因整合到單種桿狀病毒中構(gòu)成，產(chǎn)生使用2種桿狀病毒的生產(chǎn)系統(tǒng)(rep/cap bac和轉(zhuǎn)基因-bac) (Smith 等，2009,Mol.Ther.17:1888-1896)。此外，Sergei Zolotukhin 的研究組(Aslanidi 等，2009, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA206:5059-5064 和 W02010/114948)最近開發(fā)了用rep和cap基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Sf9細(xì)胞系。使用這樣的細(xì)胞系，單種桿狀病毒(在其基因組中包含側(cè)翼帶有AAV的ITR的治療性目的基因)的感染將使獲得重組AAV成為可能。然而，這種系統(tǒng)具有幾個缺點。首先，細(xì)胞克隆的產(chǎn)生要求苛刻，并且獲得的克隆通常表現(xiàn)出遺傳不穩(wěn)定的特征，導(dǎo)致可利用的時間窗口受限。另外，已觀察到不對應(yīng)于目的載體的外來DNA (rep和cap以及抗生素抗性基因的序列)的高頻率包裝，從而在生物安全性方面產(chǎn)生相當(dāng)大的問題。因此，這樣的克隆不適合于批量生產(chǎn)用于臨床應(yīng)用目的的載體。
[0002]在上面提到的研究中使用的所有桿狀病毒都包含插入到桿狀病毒基因組的多角體蛋白克隆位點中的目的基因(不論它是rep和/或cap基因還是治療性目的基因)。通常選擇這一位點的原因是可以從這個基因座獲得高的表達(dá)水平。在由Luckow等開發(fā)的系統(tǒng)(1993，J.Virol.67:4566 - 4579)中也使用這一位點，在所述系統(tǒng)中插入了細(xì)菌復(fù)制原點、卡那霉素抗性基因和“Tn7”重組克隆位點。這種系統(tǒng)被稱為桿粒。然而，這種單一基因座的使用構(gòu)成了限制因素，特別是如果希望能夠從單種桿狀病毒表達(dá)幾種異源序列的話。正是在這種情況下，Noad等(2009)將常規(guī)基因座——多角體蛋白(桿粒的Τη7，存在于多角體蛋白位點處)——與幾種 潛在的克隆位點進(jìn)行比較，并在AcMNPV基因組中鑒定到允許異源基因強烈表達(dá)的其他 7 個基因座(ctx、egt、39k、orf51、pg37、iap2、odv_e56) (Noad 等,2009，BMC Molecular BiologylO:87 ;W02010/055292)。還已顯示，在這些基因座的幾個中克隆的各個基因可以從同一基因組同時表達(dá)。然而，Noad等沒有顯示這些可選替的基因座是否對重組AAV或任何其他重組病毒載體的生產(chǎn)有效，由于這些病毒載體的復(fù)雜性及其生產(chǎn)期間通常遇到的重要困難，這一點并不是顯而易見的。
[0003]發(fā)明概述
[0004]令人吃驚的是，本發(fā)明可以顯示能夠利用單種桿狀病毒來生產(chǎn)重組AAV。
[0005]因此，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含編碼生產(chǎn)異源病毒載體所需的所有組分(即載體的蛋白質(zhì)組分及其基因組)的異源序列，所述異源序列插入到基因座中，所述基因座選自可以被目的序列替換而不改變桿狀病毒功能的桿狀病毒非必需基因。
[0006]具體來說，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含一個或多個用于異源病毒載體生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)組分的表達(dá)盒，以及異源病毒載體的重組基因組(在后文中也稱為異源基因組)，所述表達(dá)盒和所述異源基因組被插入到選自egt、多角體蛋白、ctx、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56、plO和p94基因座的一個或多個基因座中。具體來說，所述桿狀病毒基因組可以包含插入到所述一個或多個基因座中的至少一個用于AAV rep和/或cap基因的表達(dá)盒。根據(jù)一種變化形式，所述rep和cap基因尤其是采取反向取向，被包含在單種表達(dá)盒中，更具體來說所述表達(dá)盒被插入到egt基因座中。在一種特定實施方式中，所述異源病毒載體的重組基因組是AAV重組基因組，其插入到與用于AAV rep和cap基因的一個或多個基因座不同的基因座中，具體來說所述異源基因組在所述多角體蛋白基因座的水平上插入。
[0007]此外，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含用于AAV rep和/或cap基因的一個或多個表達(dá)盒，所述一個或多個表達(dá)盒被插入到選自桿狀病毒基因組的egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv_e56、plO和p94基因座的基因座中。該重組桿狀病毒基因組優(yōu)選地還在選自桿狀病毒基因組的多角體蛋白、egt、ctx、39k、orf 51、gp37、iap2、odv_e56、plO和p94基因座的基因座中含有AAV重組基因組，所述AAV重組基因組被插入到與用于AAV rep和cap基因的一個或多個基因座不同的基因座中。
[0008]具體來說，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組可以源自于AcMNPV桿狀病毒。此外，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組還可以具有幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和PlO基因缺陷的特征。
[0009]當(dāng)本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組含有異源重組病毒基因組時，所述異源基因組可以包含異源基因，其編碼尤其是治療性(以便允許生產(chǎn)病毒基因治療載體)的，蛋白質(zhì)、干擾RNA或反義RNA。
[0010]根據(jù)一種特定實施方式，所述重組桿狀病毒基因組是重組桿粒。
[0011]本發(fā)明還涉及一種重組桿狀病毒，其基因組是本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組，尤其是桿粒。
[0012]此外，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，所述方法包括將含有本申請中定義的重組桿粒的原核細(xì)胞 ，在適合于生產(chǎn)桿狀病毒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0013]本發(fā)明還提供了含有所公開的重組桿狀病毒基因組或者用本發(fā)明的重組桿狀病毒感染的真核或原核細(xì)胞。所述細(xì)胞具體來說可以是哺乳動物細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞),或源自于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)株系的昆蟲細(xì)胞(例如 Sf21、Sf9、TN5Bl-4 或 High Five 細(xì)胞)。
[0014]本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)病毒載體、尤其是病毒基因治療載體的方法。更具體來說它涉及用于生產(chǎn)重組AAV的方法，所述方法包括將重組桿狀病毒與能夠被所述桿狀病毒感染的細(xì)胞、尤其是昆蟲細(xì)胞(例如Sf9、Sf2K TN5B1-4或High Five細(xì)胞)，在允許所述細(xì)胞被所述桿狀病毒感染并生產(chǎn)所述重組AAV的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所述重組桿狀病毒包含生產(chǎn)AAV的蛋白質(zhì)或遺傳組分所需的序列。
[0015]圖例說明
[0016]圖1.用于rAAV載體生產(chǎn)的Monobac系統(tǒng)
[0017]AcMNPV桿粒的幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因被失活。將用于AAV r印2和cap8基因的表達(dá)盒插入到桿?；蚪M中蛻化類固醇UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)基因座處，從而留下空余的桿粒tn7轉(zhuǎn)座位點用于rAAV基因組的插入。因此，單種桿狀病毒可以在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)rAAV粒子。
[0018]圖2.基因座對AAV r印2和cap8基因表達(dá)的影響的研究[0019]在Sf9細(xì)胞感染后3天，使用從插入在桿粒的Tn7位點處或egt基因座處的表達(dá)盒來表達(dá)AAV Rep和Cap8蛋白的桿狀病毒,通過Western印跡來監(jiān)測這些蛋白的表達(dá)。通過測量P35桿狀病毒蛋白的表達(dá)來監(jiān)測蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0020]Monobac C1&C2:Acbac Δ CC Δ pl0~rep2cap8 (EGT)。
[0021]Δ CCP-SR660C1&C2 =Acbac Δ CC Δ p10-rep2cap8 (Τη7)。
[0022]WT-SR660C1:AcbacWT。
[0023]T+AAV8原液:用于AAV8_mSeAP生產(chǎn)的陽性對照。
[0024]Λ CC Λ plO:其中組織蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和plO基因已缺失的桿粒。
[0025]Acbac:源自于 AcMNPV 的桿粒。
[0026]圖3.基因座對AAV rep2和cap8基因表達(dá)的影響的研究
[0027]在Sf9細(xì)胞感染后3天，使用從插入在桿粒的Tn7位點處或egt基因座處的表達(dá)盒來表達(dá)AAV Rep和Cap8蛋白的桿狀病毒,通過Western印跡來監(jiān)測這些蛋白的表達(dá)。通過測量P35桿狀病毒蛋白的表達(dá)來監(jiān)測蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0028]Monobac Cl和 C2:AcbacΔCCΔpl0_rep2cap8 (EGT)。
[0029]Monobac Seap C1&C2:Acbac Δ CC Δ pl0_rep2cap8 (EGT)-mSeAP (Tn7)。
[0030]T+AAV8原液:用于AAV8_mSeAP生產(chǎn)的陽性對照。
[0031]圖4.rAAV生產(chǎn)率
[0032]評估了 monobac系統(tǒng)中rAAV的生產(chǎn)率。結(jié)果作為rAAV滴度(vg/ml -載體基因組/ml)給出。每個實驗使用4份平行測定，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0033]圖5.通過免疫親和純化后的rAAV生產(chǎn)率
[0034]在純化后評估了 monobac系統(tǒng)中rAAV的生產(chǎn)率。結(jié)果作為rAAV滴度(vg/ml -載體基因組/ml)給出。
[0035]圖6.純化的rAAV載體的蛋白質(zhì)情況
[0036]在通過免疫親和純化后評估了 rAAV載體的蛋白質(zhì)情況。通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)凝膠染色，對5 X IO10Vg的rAAV進(jìn)行分析。
[0037](I)使用野生型桿狀病毒生產(chǎn)的AAV8_mSeAP。第一桿狀病毒bacWT-r印2/cap8(Tn7)，第二桿狀病毒bacWT-mSeAP。(2)使用幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因缺失的桿狀病毒生產(chǎn)的AAV8_mSeAP。第一桿狀病毒bac Δ CC Δ pl0_rep2/cap8 (Tn7),第二桿狀病毒bac Δ CCAplO-mSeAP。(3)使用幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因缺失的桿狀病毒生產(chǎn)的AAV8_mSeAP。第一桿狀病毒bac Δ CC Δ pl0_rep2/cap8 (EGT),第二桿狀病毒bac Λ CC Λ PI Ο-mSeAP。( 4 )使用幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和PIO基因缺失的桿狀病毒生產(chǎn)的AAV8-mSeAP。使用單種桿狀病毒 bac Λ CC Λ plO_r印2/cap8 (EGT) -mSeAP (Tn7)。
[0038]發(fā)明詳述
[0039]病毒載體、尤其是病毒基因治療載體的生產(chǎn)，需要在同一細(xì)胞中表達(dá)病毒載體的大量組分。例如,在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)重組AAV的情形中，必需在細(xì)胞中產(chǎn)生:
[0040]-AAV重組基因組，其包含5’ITR (末端反向重復(fù))，用于目的異源核苷酸序列(至少一個在啟動子控制下的目的異源核苷酸序列，所述啟動子在下面定義的靶細(xì)胞中對所述基因的表達(dá)有效)的表達(dá)盒，和3’ ITR ;以及
[0041]-AAV rep和cap基因的產(chǎn)物。[0042]已經(jīng)開發(fā)了一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，以便在使用單種桿狀病毒來感染生產(chǎn)病毒載體的宿主細(xì)胞的意義上，便于病毒載體的生產(chǎn)。
[0043]具體來說，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含用于生產(chǎn)異源病毒載體所需的蛋白質(zhì)組分的一個或多個表達(dá)盒，以及異源病毒載體的重組基因組(或異源基因組)，所述表達(dá)盒和所述異源基因組被插入到一個或多個基因座中，其選自可以被目的序列替換而不改變桿狀病毒功能的桿狀病毒非必需基因。
[0044]在本發(fā)明的情形中，“桿狀病毒非必需基因”被定義為可以從桿狀病毒的基因組進(jìn)行失活或移除而不改變其在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中生長的能力的基因。這些基因是特異性參與ODV (包涵體來源型病毒)生產(chǎn)的基因，或者是在環(huán)境中操縱宿主昆蟲所需但在培養(yǎng)物中的昆蟲細(xì)胞的尺度上不需要的基因(Cohen等，2009，Virologica Sinica24:359-414)。根據(jù)一種特定實施方式，所述一個或多個基因座選自多角體蛋白、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、p94、pl0和odv-e56基因座，所述基因座更具體來說是egt基因座。
[0045]在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“異源病毒載體”打算是指不是桿狀病毒的病毒載體。具體來說，異源病毒載體可以是腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、尤其是慢病毒或泡沫病毒等。更具體來說，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組能夠用來生產(chǎn)旨在用于將異源核苷酸序列導(dǎo)入到細(xì)胞、組織或生物體中的任意類型的病毒載體，尤其是在人類或動物中用于治療性目的的病毒載體(基因治療載體)。
[0046]在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“表達(dá)盒”打算是指一個或多個基因的表達(dá)所需的元件的組合。因此，表達(dá)盒包含適用于在宿主細(xì)胞、尤其是真核細(xì)胞、更具體地昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的啟動子，以及多腺苷化序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員擁有幾種用于在真核細(xì)胞(尤其是昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)的表達(dá)盒，供其任意使用。
[0047]正如上面提到的，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組可用于生產(chǎn)任意類型的病毒載體、尤其是病毒基因`治療載體的目的。例如，重組桿狀病毒基因組可以包含用于腺相關(guān)病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、尤其是慢病毒或泡沫病毒等的生產(chǎn)所需的病毒蛋白的一個或多個表達(dá)盒。生產(chǎn)這樣的病毒粒子所需的基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，他們將使本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組適合于他們希望生產(chǎn)的特定病毒載體(Bagnis, Merten, Mezzina (特邀編輯)2005, “用于基因載體的工業(yè)生產(chǎn)、純化和表征的先進(jìn)方法，，(Advanced methods for industrial production, purification, andcharacterization of gene vectors), Gene Therl2 (SI):1-177)。
[0048]根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組還包含病毒基因治療載體重組基因組，所述病毒基因治療載體重組基因組被插入到如上所述的桿狀病毒基因組的基因座中。插入到桿狀病毒基因組中的病毒基因治療載體重組基因組當(dāng)然取決于最終待生產(chǎn)的病毒基因治療載體。因此，為了生產(chǎn)AAV，病毒基因治療載體重組基因組將是AAV重組基因組，其包含5’ ITR、在啟動子控制之下的至少一個目的異源核苷酸序列和3’ ITR，所述啟動子在產(chǎn)生的重組AAV的靶細(xì)胞中有效。為了生產(chǎn)慢病毒，病毒基因治療載體重組基因組將是慢病毒重組基因組，其包含5’ LTR、主要剪接供體位點、覆蓋Gag基因的5’部分的包裝信號、Rev響應(yīng)元件(RRE)、包膜剪接受體、在啟動子控制之下的至少一個目的異源核苷酸序列和3’ LTR、尤其是為了產(chǎn)生SIN (自失活慢病毒)載體而修改的3’ LTR，所述啟動子在產(chǎn)生的重組慢病毒的靶細(xì)胞中有效。[0049]因此，根據(jù)本發(fā)明的第一種變化形式，所描述的重組桿狀病毒基因組是用于生產(chǎn)AAV載體的桿狀病毒基因組。
[0050]就此而言，本發(fā)明還涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含用于AAV rep和/或cap基因的一個或多個表達(dá)盒，所述一個或多個表達(dá)盒被插入到選自桿狀病毒基因組的egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv_e56、plO和p94基因座的基因座中。該重組桿狀病毒基因組優(yōu)選地還在選自桿狀病毒基因組的多角體蛋白、egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56、p 10和p94基因座的基因座中含有AAV重組基因組，所述AAV重組基因組被插入到與用于AAV rep和cap基因的一個或多個基因座不同的基因座中。
[0051]在第一種變化形式的一種特定實施方式中，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組在選自可以被目的序列替代而不改變桿狀病毒功能的桿狀病毒非必需基因的基因座中，包含至少一個用于AAV rep和/或cap基因的表達(dá)盒。具體來說,所述至少一個用于AAV rep和/或cap基因的表達(dá)盒可以被包含在選自多角體蛋白、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、p94、PlO和odv-e56基因座的基因座中，尤其是egt基因座中。
[0052]在第一種變化形式的另一種特定實施方式中，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組還包含AAV重組基因組。具體來說，用于插入AAV重組基因組的基因座選自多角體蛋白、egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、p94、plO和odv_e56基因座。根據(jù)一種特定實施方式，被選擇用于AAV重組基因組的基因座是與被選擇用于rep和/或cap的表達(dá)盒的一個或多個基因座不同的基因座。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，AAV重組基因組被插入到多角體蛋白基因座中(尤其是在Tn7重組位點的水平上)。
[0053]根據(jù)第一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組包含:
[0054]-多角體蛋白基因座中的AAV重組基因組，以及
[0055]-在選自ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、p94、plO 和 odv_e56 基因座的基因座、尤其是egt基因座中的用于AAV rep/`cap基因的表達(dá)盒。
[0056]根據(jù)第二優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組包含:
[0057]_p94基因座中的AAV重組基因組，
[0058]-在選自多角體蛋白、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、plO和 odv_e56 基因座的基因座、尤其是egt基因座中的用于AAV rep/cap基因的表達(dá)盒。
[0059]用于rep和cap基因的表達(dá)盒，具體來說根據(jù)從產(chǎn)生的重組AAV表達(dá)的目的基因和將要用所述AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型來選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在普通知識的基礎(chǔ)上選擇并產(chǎn)生適合的表達(dá)盒。對于具體的啟動子來說，如果打算用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，可以提到的是早期/晚期桿狀病毒啟動子例如gp64，或者極晚期桿狀病毒啟動子例如多角體蛋白(Pph)和plO (Ppltl)基因啟動子。立即早期啟動子例如IEl (立即早期I)也可用于本發(fā)明的情形中，并具有在例如哺乳動物細(xì)胞中起作用的可能性。對于多腺苷化序列來說，可以具體提到的是色氨酸羥化酶(Tph)多腺苷化序列或桿狀病毒基因的多腺苷化序列。
[0060]rep和cap基因可以根據(jù)希望生產(chǎn)的重組AAV的類型來選擇。它們可以選自任意血清型的AAV的rep和cap基因。rep和cap基因可以包含在不同表達(dá)盒或單個表達(dá)盒中。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，使用單個表達(dá)盒來表達(dá)rep和cap基因。根據(jù)一種實施方式的變化形式，用于AAV rep/cap基因的表達(dá)盒包含采取反向取向的所述基因。具體來說，這些采取反向取向的基因可以各自在不同啟動子、尤其是不同桿狀病毒啟動子、特別是不同的極晚期啟動子的控制之下。例如，具體來說，所討論的極晚期啟動子可以對應(yīng)于Ppitl和Pph桿狀病毒啟動子。根據(jù)一種特別優(yōu)選的實施方式，用于rep和cap的表達(dá)盒按照Smith等，2009;Mol.Ther.17:1888-1896中描述的程序產(chǎn)生并插入到本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組中。根據(jù)一種特定模式，表達(dá)盒對應(yīng)于在下面的實施例中描述的表達(dá)盒，允許表達(dá)rep2和cap8基因產(chǎn)物并因此生產(chǎn)rAAV8類型的重組AAV載體，包含AAV8衣殼蛋白，并因此具有該特定血清型的趨性。該表達(dá)盒優(yōu)先地按照本領(lǐng)域中公知的程序，特別是使用由Invitrogen公司銷售的Bac-to-Bac系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)座導(dǎo)入到桿狀病毒基因組中。
[0061]根據(jù)一種特定實施方式，具體地按照實施例中描述的方法，將用于AAV i^p/cap基因的表達(dá)盒插入到egt基因座中。
[0062]AAV重組基因組包含5’ ITR (末端反向重復(fù))、在啟動子控制下的至少一個目的異源核苷酸序列和3’ ITR，所述啟動子在產(chǎn)生的重組AAV的靶細(xì)胞中有效。所述ITR可以源自于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意AAV血清型。
[0063]術(shù)語“目的異源核苷酸序列”打算是指不是桿狀病毒基因或AAV基因，并且當(dāng)其在目的細(xì)胞(也稱為“靶細(xì)胞”)中表達(dá)時，可以獲得所需效果的核苷酸序列。具體來說，異源核苷酸序列可以編碼蛋白質(zhì)、干擾RNA、反義RNA、微RNA或snRNA。所需效果具體來說可以對應(yīng)于異源核苷酸序列在患者細(xì)胞或組織中的表達(dá)。因此，具體來說，異源核苷酸序列可以被給藥以便獲得治療效果。就此而言，產(chǎn)生的重組AAV可用作基因治療載體。因此，異源核苷酸序列可以允許生產(chǎn)治療性蛋白例如在疾病中不足的蛋白，或者生產(chǎn)在需要降低異常蛋白的表達(dá)的細(xì)胞中的干擾RNA，或者生產(chǎn)snRNA (小核RNA)，其參與移除造成蛋白質(zhì)無功能的突變外顯子。 [0064]靶細(xì)胞對應(yīng)于異源核苷酸序列在其中的表達(dá)可能有益、尤其是治療性益處的任何細(xì)胞。因此，AAV基因組中存在的啟動子是允許異源核苷酸序列在靶細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。該啟動子可以是組成型、誘導(dǎo)型或特異性針對特定細(xì)胞或組織的。
[0065]當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基因治療的概念，并且可以使本發(fā)明的組成要素適用于其要求。
[0066]重組桿狀病毒基因組還可以包含能夠提高重組AAV的數(shù)量或質(zhì)量的任何AAV序列。就此而言，可以提到的是在上面提到的基因座之一中插入編碼AAP蛋白(或組裝激活蛋白-Sonntag 等，Proc Natl Acad Sci U S A.2010Junl; 107 (22): 10220-5)的基因。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的第二種變化形式，所描述的重組桿狀病毒基因組是用于生產(chǎn)慢病毒載體的桿狀病毒基因組。
[0068]就此而言，本發(fā)明還涉及一種重組桿狀病毒基因組，其包含用于來自于慢病毒(例如源自于HIV-1)的gag/pol和rev基因和/或根據(jù)所需趨性選擇的env基因、但優(yōu)選地為源自于水皰性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)的一個或多個表達(dá)盒，所述一個或多個表達(dá)盒被插入到選自桿狀病毒基因組的egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv_e56、plO和p94基因座的基因座中。該重組桿狀病毒基因組優(yōu)選地還在選自桿狀病毒基因組的多角體蛋白、egt、ctx,39k, orf5K gp37、iap2、odv_e56、plO和p94基因座的基因座中含有慢病毒重組基因組，所述慢病毒重組基因組被插入到與用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的一個或多個基因座不同的基因座中。
[0069]在第一種變化形式的一種特定實施方式中，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組在選自可以被目的序列替代而不改變桿狀病毒功能的桿狀病毒非必需基因的基因座中，包含用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的至少一個表達(dá)盒。具體來說，所述用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的至少一個表達(dá)盒,可以被包含在選自多角體蛋白、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、p94、plO 和 odv_e56 基因座的基因座中。
[0070]在第一種變化形式的另一種特定實施方式中，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組還包含慢病毒重組基因組。具體來說，用于插入慢病毒重組基因組的基因座選自多角體蛋白、egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、p94、pl0 和 odv_e56 基因座。根據(jù)一種特定實施方式，被選擇用于慢病毒重組基因組的基因座是與被選擇用于gag/pol、rev和/或env的表達(dá)盒的一個或多個基因座不同的基因座。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，慢病毒重組基因組被插入到多角體蛋白基因座中(尤其是在Tn7重組位點的水平上)。
[0071]根據(jù)第一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組包含:
[0072]-多角體蛋白基因座中的慢病毒重組基因組，以及
[0073]-在選自ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、p94、plO 和 odv_e56 基因座的基因座中的用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的表達(dá)盒。
[0074]根據(jù)第二優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組包含:
[0075]_p94基因座中的慢病毒重組基因組，
[0076]-在選自多角體蛋白、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、plO和 odv_e56 基因座的基因座中的用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的表達(dá)盒。
[0077]用于慢病毒gag/pol和rev基因以及env基因的表達(dá)盒,具體來說根據(jù)從產(chǎn)生的重組慢病毒表達(dá)的目的基因和將要用所述慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型來選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在普通知識的基礎(chǔ)上選 擇并產(chǎn)生適合的表達(dá)盒。對于具體的啟動子來說，如果打算用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，可以提到的是早期/晚期桿狀病毒啟動子例如gp64，或者極晚期桿狀病毒啟動子例如多角體蛋白(Pph)和PlO (Ppltl)基因啟動子。立即早期啟動子例如IEl(立即早期I)也可用于本發(fā)明的情形中，并具有在例如哺乳動物細(xì)胞中起作用的可能性。對于多腺苷化序列來說，可以具體提到的是色氨酸羥化酶(Tph)多腺苷化序列或桿狀病毒基因的多腺苷化序列。
[0078]術(shù)語“目的異源核苷酸序列”打算是指不是桿狀病毒基因或慢病毒基因，并且當(dāng)其在目的細(xì)胞(也稱為“靶細(xì)胞”)中表達(dá)時，可以獲得所需效果的核苷酸序列。具體來說，異源核苷酸序列可以編碼蛋白質(zhì)、干擾RNA、反義RNA、微RNA(Hiicr0RNA)或snRNA。所需效果具體來說可以對應(yīng)于異源核苷酸序列在患者細(xì)胞或組織中的表達(dá)。因此，具體來說，異源核苷酸序列可以被給藥以便獲得治療效果。就此而言，產(chǎn)生的重組慢病毒可用作基因治療載體。因此，異源核苷酸序列可以允許生產(chǎn)治療性蛋白例如在疾病中不足的蛋白，或者生產(chǎn)在需要降低異常蛋白的表達(dá)的細(xì)胞中的干擾RNA，或者生產(chǎn)snRNA (小核RNA)，其參與移除造成蛋白質(zhì)無功能的突變外顯子。
[0079]靶細(xì)胞對應(yīng)于異源核苷酸序列在其中的表達(dá)可能有益、尤其是治療性益處的任何細(xì)胞。因此，慢病毒基因組中存在的啟動子是允許異源核苷酸序列在靶細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。該啟動子可以是組成型、誘導(dǎo)型或特異性針對特定細(xì)胞或組織的。
[0080]當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基因治療的概念，并且可以使本發(fā)明的組成要素適用于其要求。[0081]重組桿狀病毒基因組可以源自于任意桿狀病毒，其包含多角體蛋白基因座(或等同物)以及上面提到的其他基因座中的至少一個或多個(或一個或多個等同基因座)。
[0082]根據(jù)一種特定實施方式，本發(fā)明的重組桿狀病毒基因組是桿粒。在本發(fā)明的情形中，“桿粒”是包含用于在原核細(xì)胞中維持和擴(kuò)增桿狀病毒基因組的遺傳元件的桿狀病毒基因組。具體來說，它可以包含細(xì)菌復(fù)制原點，可選擇基因、尤其是抗生素例如卡那霉素抗性基因，以及插入到桿狀病毒基因座例如多角體蛋白基因座中的重組克隆位點，例如“Tn7”。根據(jù)一種變化形式，本發(fā)明的重組桿粒包含復(fù)制原點、卡那霉素抗性基因和多角體蛋白基因座中的Τη7重組克隆位點(特別是在Luckow等，1993; J.Virol.67:4566 - 4579中描述的AcMNPV桿粒)。因此，重組桿狀病毒基因組可以對應(yīng)于能夠在昆蟲細(xì)胞和原核生物例如大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制的序列。具體來說，可以使用包含允許基因組在原核生物體中得以維持的DNA構(gòu)建物、尤其是BAC復(fù)制子的任何桿狀病毒基因組。根據(jù)一種優(yōu)選情況，本發(fā)明的桿狀病毒基因組源自于AcMNPV或SpIiNPV骨架。ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56遺傳基因座在AcMNPV參考序列(登記號NCOO1623)中的位置，具體地描述在國際申請TO2010/055292的表1中。對于p94和plO遺傳基因座來說，它們的位置示出在圖1中(AcMNPV參考序列-登記號NC001623)。
[0083]根據(jù)一種特定實施方式，重組桿狀病毒基因組源自于AcMNPV并包含幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和PlO基因的缺失。因此，根據(jù)這一實施方式，本發(fā)明涉及一種重組AcMNPV桿狀病毒基因組，其不含幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和PlO基因，并且在選自egt、多角體蛋白、ctx、39k、orf5K gp37、iap2和odv_e56、plO和p94基因座的基因座、尤其是egt基因座中包含用于AAV rep/cap基因的表達(dá)盒。
[0084]此外，在這種 實施方式的一種變化形式中，桿粒在多角體蛋白基因座(桿粒的Tn7)中包含AAV重組基因組。
[0085]此外，在這種實施方式的另一種變化形式中，桿狀病毒基因組在ρ94基因座中包含AAV重組基因組。
[0086]桿狀病毒骨架中幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因的缺失允許高效生產(chǎn)AAV載體，能夠減少尤其是VPl和VP2蛋白的蛋白水解性降解，從而提高體內(nèi)感染性和有效性。這些基因的缺失可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何程序來進(jìn)行。更具體來說，可以使用在實施例中描述的在含有待修飾桿粒(尤其是在Luckow等，1993; J.Virol.67:4566 - 4579中描述的AcMNPV桿粒)的大腸桿菌細(xì)菌中進(jìn)行同源重組過程的方法(Datsenko和Wanner，2000，Proc Natl Acad Sci U S A.97 (12):6640-6645)。
[0087]根據(jù)一種特定實施方式,將chi/v-cath基因(根據(jù)AcMNPV的遺傳圖譜(Ayres等，1994)，105282-107954 位核苷酸)和 plO (118839-119121 位核苷酸)缺失。
[0088]根據(jù)包含缺失幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因的實施方式的一種變化形式，PlO基因的缺失不伴有plO基因啟動子的缺失。換句話說，幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因缺陷的重組桿狀病毒基因組包含有功能的Ppici啟動子(對應(yīng)于AcMNPV的遺傳圖譜的118739-118836 位核苷酸)。
[0089]根據(jù)包含缺失幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和plO基因的實施方式的另一種變化形式，PlO基因的缺失伴有相鄰的p26和P74基因的缺失。根據(jù)這種實施方式的一種特定情況，p26、pl0和p74基因的缺失對應(yīng)于AcMNPV的遺傳圖譜(Ayres等，1994)的118044-121072位核苷酸。
[0090]根據(jù)第二種情況，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒，其包含對應(yīng)于上面描述的桿狀病毒基因組的基因組。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，重組桿狀病毒包含對應(yīng)于上面描述的重組桿粒的基因組。
[0091]根據(jù)第三種情況，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)本發(fā)明的桿狀病毒的方法，所述方法包括將含有上面定義的重組桿粒的原核細(xì)胞，在適合于桿狀病毒生產(chǎn)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這些條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(Smith等,2009,如上；Luckow等，1993,如上)。
[0092]根據(jù)第四種情況，本發(fā)明涉及含有上面定義的桿狀病毒基因組的真核或原核細(xì)胞。具體來說，細(xì)胞可以是已經(jīng)用上面定義的重組桿狀病毒感染的哺乳動物或昆蟲真核細(xì)胞，尤其是昆蟲細(xì)胞。
[0093]在昆蟲細(xì)胞中，優(yōu)選的是源自于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)株系的細(xì)胞，例如Sf21、Sf9、High Five或TN5B1-4細(xì)胞。在哺乳動物細(xì)胞中，可以具體提到的是HEK293株系，其已知能夠被桿狀病毒感染。在后一種情況下，在用于rep和cap基因的表達(dá)盒中存在的啟動子將適用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)?？梢跃唧w提到的是CMV啟動子和本領(lǐng)域中公知的其他啟動子。
[0094]根據(jù)第五種情況，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)病毒載體、尤其是病毒基因治療載體的方法，所述方法包括將如上定義的重組桿狀病毒與細(xì)胞、尤其是昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，在允許用桿狀病毒感染所述細(xì)胞并生產(chǎn)所述病毒載體的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0095]對于有包膜載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體)的生產(chǎn)來說，這涉及哺乳動物細(xì)胞(例如HEK293 細(xì)胞)。
[0096]根據(jù)一種特定實施方式，本發(fā)明的方法是用于生產(chǎn)重組AAV的方法，所述方法包括將如上定義的重組桿狀病毒與能夠被所述桿狀病毒感染的細(xì)胞、尤其是昆蟲細(xì)胞(例如Sf2K Sf9, High Five或TN5B1-4細(xì)胞)，在允許用桿狀病毒感染所述細(xì)胞并生產(chǎn)所述重組AAV的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。因此，可以從使用單種桿狀病毒的感染生產(chǎn)重組AAV。用于生產(chǎn)本發(fā)明的重組AAV的特定而非限制性的條件，具體描述在實施例中。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其普通知識(Smith等，如上)的基礎(chǔ)上調(diào)整這些生產(chǎn)條件。
[0097]通過這種方法，獲得了與使用需要用兩種桿狀病毒感染的系統(tǒng)、例如Smith等描述的系統(tǒng)所獲得的相比，高至少5倍的重組AAV生產(chǎn)。
[0098]根據(jù)另一種特定實施方式，本發(fā)明的方法是用于生產(chǎn)重組慢病毒的方法，所述方法包括將如上定義的重組桿狀病毒與能夠被所述桿狀病毒感染的哺乳動物細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞)，在允許用桿狀病毒感染所述細(xì)胞并生產(chǎn)所述重組慢病毒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0099]為了說明本發(fā)明，提供了下面的實施例。
實施例
[0100]材料和方法:
[0101]序列
[0102]表1:引物序列
[0103]
【權(quán)利要求】
1.一種重組桿狀病毒基因組，其包含產(chǎn)生異源病毒載體所需的蛋白質(zhì)組分的一個或多個表達(dá)盒以及異源病毒載體的重組基因組，所述表達(dá)盒和所述異源病毒載體的重組基因組被插入到選自egt、多角體蛋白、ctx、39k、orf51、gp37、iap2和odv_e56、pl0和p94基因座的一個或多個基因座中。
2.權(quán)利要求1的桿狀病毒基因組，其包含插入到所述一個或多個基因座中的至少一個用于AAV rep和/或cap基因的表達(dá)盒。
3.權(quán)利要求2的重組桿狀病毒基因組，其中所述rep和cap基因尤其是采取反向取向，被包含在單個表達(dá)盒中，更具體來說所述表達(dá)盒被插入到egt基因座中。
4.權(quán)利要求2或3的重組桿狀病毒基因組，其中所述異源病毒載體的重組基因組是AAV重組基因組，所述AAV重組基因組被插入到與用于AAV rep和cap基因的一個或多個基因座不同的基因座中，具體來說所述異源病毒載體的重組基因組在所述多角體蛋白基因座的水平上插入。
5.一種重組桿狀病毒基因組，其包含用于AAV rep和/或cap基因的一個或多個表達(dá)盒，所述一個或多個表達(dá)盒被插入到選自桿狀病毒基因組的egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv-e56、plO和p94基因座的基因座中。
6.權(quán)利要求5的重組桿狀病毒基因組，其中所述rep和cap基因尤其是采取反向取向，被包含在單個表達(dá)盒中，更具體來說所述表達(dá)盒被插入到egt基因座中。
7.權(quán)利要求5或6的重組桿狀病毒基因組，其在選自桿狀病毒基因組的多角體蛋白、egt、ctx、39k、orf51、gp37、iap2、odv_e56、plO 和 p94 基因座的基因座中還包含 AAV 重組基因組，所述AAV重組基因組被插入到與用于AAV rep和cap基因的一個或多個基因座不同的基因座中?！?br> 8.權(quán)利要求1至7任一項的重組桿狀病毒基因組，所述桿狀病毒基因組源自于AcMNPV。
9.權(quán)利要求1至8任一項的重組桿狀病毒基因組，所述重組桿狀病毒基因組中幾丁質(zhì)酶、組織蛋白酶和Pio基因缺失。
10.權(quán)利要求4和7至9任一項的重組桿狀病毒基因組，其中所述AAV重組基因組包含異源基因，所述異源基因編碼蛋白質(zhì)、干擾RNA或反義RNA，尤其是治療性的。
11.權(quán)利要求1至10任一項的重組桿狀病毒基因組，所述重組桿狀病毒基因組是桿粒。
12.—種重組桿狀病毒，其包含權(quán)利要求1至11任一項的重組桿狀病毒基因組作為基因組。
13.—種生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，所述方法包括將含有權(quán)利要求11中限定的重組桿粒的原核細(xì)胞，在適合于生產(chǎn)桿狀病毒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
14.一種真核或原核細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1至11任一項中的重組桿狀病毒基因組，或者被權(quán)利要求12的重組桿狀病毒感染。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞,所述細(xì)胞是源自于草地夜蛾或粉紋夜蛾株系的昆蟲細(xì)胞,例如 Sf2K Sf9, TN5B1-4 或 High Five 細(xì)胞。
16.一種用于生產(chǎn)重組病毒、尤其是重組AAV的方法，所述方法包括將權(quán)利要求12的一種或多種重組桿狀病毒與能夠被所述桿狀病毒感染的細(xì)胞、尤其是昆蟲細(xì)胞(例如Sf9、Sf2K TN5B1-4或High Five細(xì)胞)，在允許所述細(xì)胞被所述桿狀病毒感染并生產(chǎn)所述重組病毒的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
17.權(quán)利要求16的方法，其包括對單種桿狀病毒進(jìn)行培養(yǎng)，所述桿狀病毒在其基因組中包含生產(chǎn)所述重組病毒所需 的所有元件。
【文檔編號】C12N15/866GK103827306SQ201280046259
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月27日
【發(fā)明者】萊昂內(nèi)爾·加利貝爾, 奧托-維海姆·莫騰, 奧雷利安·雅各布 申請人:吉尼松公司