專利名稱：含有攜帶剪接受體的基因工程細(xì)胞非編碼序列的高效逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于基因治療的高效安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它來(lái)源于鼠白血病病毒(MLV)，含有一個(gè)突變的異源剪接受體并且無(wú)MLV編碼序列。
本發(fā)明涉及對(duì)這種逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)一步改進(jìn)，即在剪接受體的周圍的區(qū)域中導(dǎo)入突變。導(dǎo)入這些突變使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生接近于對(duì)照水平的病毒滴度，而同時(shí)仍產(chǎn)生很高水平的基因表達(dá)。因此，該載體應(yīng)當(dāng)比在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療中應(yīng)用的其它載體要有效的多。
按照本發(fā)明的這一方面，來(lái)源于鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括1)一種插入多克隆位點(diǎn)上游的、作為來(lái)源于外源基因的非編碼序列的延伸因子EF1α的非編碼序列的區(qū)域，和2)一種導(dǎo)入EF1α非編碼序列中的剪接受體的下游的突變。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種基于MLV(鼠白血病病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其沒(méi)有任何病毒編碼序列，但的確包括一部分插入到多克隆位點(diǎn)的上游的延伸因子EF1α的非編碼序列，以便提供一個(gè)剪接受體，以及一種導(dǎo)入EF1α的非編碼序列中的剪接受體下游的突變。
在本發(fā)明中，“非編碼序列”指含有一種可以被轉(zhuǎn)錄但不能被翻譯的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域的基因組區(qū)域。
特別地說(shuō)，在本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的EF1α的非編碼序列來(lái)源于人細(xì)胞。它含有一部分內(nèi)含子和外顯子2序列，優(yōu)選地，剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子的前面的序列，更具體地說(shuō)，是SEQ ID NO.1的核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)人EF1α基因的3’末端到剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子前面的部分(如果EF1α基因的轉(zhuǎn)錄起始密碼子的位點(diǎn)定為+1，那么它對(duì)應(yīng)于+773到+1006的序列)。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還具有一個(gè)導(dǎo)入來(lái)源于外源基因的非編碼序列中的突變，以便在基因表達(dá)、剪接、和翻譯效率之間達(dá)到最優(yōu)化的平衡。
突變發(fā)生在剪接受體下游是理想的，具體地說(shuō)剛好在剪接受體之后是理想的。已經(jīng)確定了剪接受體周圍的序列，尤其是接近剪接受體的外顯子區(qū)域的序列在剪接中發(fā)揮重要作用。例如，一種優(yōu)選的突變是用CC(胞嘧啶-胞嘧啶)堿基對(duì)取代SEQ ID NO.1序列中的第205位和第206位(分別對(duì)應(yīng)于+977和+978)的GT(鳥嘌呤-胸腺嘧啶)堿基對(duì)。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可以進(jìn)一步地在多克隆位點(diǎn)的下游包括一種異源啟動(dòng)子或IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，internal ribosomal entrysite)，目的在于表達(dá)兩個(gè)或更多外源基因。
而且，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基于MLV的5’LTR中的U3，或其部分，可以用異源啟動(dòng)子取代，優(yōu)選地用HCMV IE(人巨細(xì)胞病毒立即早期(immediately-early))啟動(dòng)子。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以進(jìn)一步含有一個(gè)可篩選的標(biāo)記基因，例如NEO(新霉素抗性)基因，和MDR(多藥抗性，multidrug resistance)基因。人MDR基因用作可篩選的標(biāo)記的有利之處在于它容易地制備一種生產(chǎn)細(xì)胞系，并防止有害副作用，例如CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)反應(yīng)。
“野生型”或“野生型載體”用作對(duì)照，以便與本發(fā)明的具有突變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作比較。該野生型載體由多克隆位點(diǎn)上游的EF1α非編碼序列的未修飾的部分組成，其目的在于通過(guò)提供剪接能力增加基因表達(dá)水平。在本發(fā)明中用作對(duì)照的是野生型MT4，其具有

圖1顯示的下列序列。
本發(fā)明提供的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的理想實(shí)施例包含1)來(lái)源于起始的MLV載體的核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)于5’LTR，最小包裝序列，該最小包裝序列包括在起始的gag基因的上游的剪接受體，一種多嘌呤示蹤(track)，和一種3’LTR；2)多克隆位點(diǎn)；3)EF1α的核苷酸序列的區(qū)域，該區(qū)域是從內(nèi)含子3’末端開始到剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子之前，被插入到最小包裝序列和多克隆位點(diǎn)之間；和4)僅當(dāng)需要第二基因表達(dá)時(shí)，則在多克隆位點(diǎn)下游的一種SV40最小啟動(dòng)子或一種個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。
更優(yōu)選的是，本發(fā)明提供了一種包含以下元件的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MT51)來(lái)源于起始的MLV載體的核苷酸序列，它是5’LTR，最小包裝序列，該最小包裝序列含有在起始的gag基因的上游的剪接供體，多嘌呤示蹤，和3’LTR；2)一種多克隆位點(diǎn)；3)一部分的EF1α的核苷酸序列，它從內(nèi)含子的3’末端開始到剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子之前，被插入到最小包裝序列和多克隆位點(diǎn)之間；4)在多克隆位點(diǎn)下游的一種內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)；和5)在剪接受體下游，在+977～+978位點(diǎn)上有取代GT堿基對(duì)的GC堿基對(duì)。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
1.無(wú)病毒編碼序列但含有人EF1α的非編碼序列的基于MLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIN-EI的構(gòu)建在韓國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者金善榮, 柳承信, 李準(zhǔn)臺(tái) 申請(qǐng)人:百療醫(yī)株式會(huì)社