專利名稱：植物組學(xué)涉及草藥組合物的基于基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草藥組合物。更具體地說，本發(fā)明提供了改善草藥組合物的選擇、測試、質(zhì)量控制和制造的工具和方法學(xué)，以幫助指導(dǎo)開發(fā)新穎的草藥組合物和鑒別現(xiàn)有草藥組合物的新用途。
背景技術(shù)：
本文中的所有出版物和專利申請都結(jié)合在此作為參考，就好象每一篇獨立的出版物或?qū)＠暾埗季唧w而獨立地被指示結(jié)合在此作為參考一樣。
草藥已被亞洲和歐洲人民使用了數(shù)百年。在美國(US)，草藥已在食品強化劑工業(yè)以及整體醫(yī)學(xué)中取得商業(yè)上的價值。大約有三分之一的美國人至少嘗試過一次某些形式的替代醫(yī)學(xué)(Eisenberg等.，1993，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志.328246-252).
植物性藥材，包括草藥，已成為用于鑒別新穎的治療疾病的活性藥劑的焦點。從植物提取物得到的活性化合物一直是制藥業(yè)的興趣所在。例如，紫杉醇是從西方紫杉樹的樹皮得到的一種抗腫瘤藥。據(jù)估計，在當(dāng)今所常用和指定的數(shù)千種藥物中，大約有50％是從植物來源得到的，或者含有植物化合物的化學(xué)仿制品(Mindell，E.R.，1992，Earl Mindell草藥圣經(jīng)，家庭生活圖書).
目前，有許多醫(yī)藥制劑、食物添加劑、食品強化劑等等都含有來自草藥的藥草成分或提取物。很長時期以來，草藥已在許多不同國家用于治療各種人類和動物的疾病(參見，例如I.A.Ross，1999，世界藥用植物，化學(xué)構(gòu)成，傳統(tǒng)與現(xiàn)代醫(yī)藥應(yīng)用，Humana Press；D.Molony，1998，美國東方醫(yī)學(xué)協(xié)會對中草藥的完全指南，BerkleyBooks；Kessle等，1996，恢復(fù)醫(yī)學(xué)的醫(yī)生完全指南，BerkleyHealth/Reference Books)；Mindell，同上).
草藥醫(yī)學(xué)。世界上有許多草藥醫(yī)學(xué)的分支，諸如印度草醫(yī)學(xué)、Unani、Sida和中醫(yī)(TCM)?，F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)一般由給藥能夠干預(yù)特定生化途徑的單一化學(xué)物質(zhì)組成，而每種TCM制劑通常含有來自若干種草藥的上百種化學(xué)物質(zhì)，它們經(jīng)過調(diào)配在體內(nèi)以協(xié)同方式與多個目標(biāo)相互作用。雖然實踐經(jīng)驗有效地促進了這些古老的草藥醫(yī)學(xué)的草藥組合物和處方的發(fā)展，但它們也在不同程度上得到一套理論的支持，這套理論在解剖學(xué)、藥理學(xué)、病理學(xué)、診斷處理等方面全然不同于現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)。在不同的草藥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，TCM已經(jīng)過數(shù)個世紀(jì)發(fā)展了一套更為完整的理論，它們有充分的文字記載，并且在大中華和東亞地區(qū)包括韓國和日本由當(dāng)?shù)蒯t(yī)師對廣大人群(＞13億人)加以實踐應(yīng)用。
西方醫(yī)學(xué)通常使用天然或合成的純化合物，大部分指向單一的生理學(xué)目標(biāo)。然而，TCM中所用的組合物常常由多種草藥和化合物組成，它們基于獨特而完整的概念，針對的是體內(nèi)的多個目標(biāo)。TCM主要使用炮制過的粗天然產(chǎn)物，經(jīng)過各種組合和制劑，用于治療不同的病態(tài)，同時使產(chǎn)生的副作用較小。TCM的巨大潛力已為世界上大多數(shù)人所認(rèn)識。
草藥在典型的TCM處方中可按作用分為主藥和從藥，包括輔藥、佐藥和使藥。主藥在對病因或疾病的主要癥狀的治療中起主導(dǎo)作用。輔藥幫助加強主藥的作用并在對兼證的治療中起主要作用。佐藥有三種類型1)增強主藥和輔藥的治療作用或治療次要癥狀的佐藥，2)減小或消除主藥和輔藥的毒性和其他副作用的佐藥和3)作用于不明確受到君藥影響的補充目標(biāo)組織的佐藥。使藥引其他諸藥的作用直達病所和/或調(diào)和處方或制劑中其他草藥的作用。與由一份或多份單一植物組成的大多數(shù)草藥或強化劑相比，TCM的預(yù)定作用針對的是多個組織。
例如，廣為人知的用于治療哮喘的TCM方劑“麻黃湯”由麻黃、桂枝、苦杏仁和甘草組成。麻黃是主藥，散寒、發(fā)汗并開宣肺氣而平喘，針對的是主證。桂枝作為輔藥，增強麻黃的發(fā)汗功能并溫經(jīng)通脈以確保肺氣通暢而除疼痛之癥?？嘈尤蕿樽羲帲苄捣螝?，佐助麻黃平喘。甘草為使藥，調(diào)和麻黃與桂枝的作用，以確保生氣的體內(nèi)平衡。盡管這四味藥各自清楚地顯示出各自的活性，但它們合用時彼此功效互補。實踐中，根據(jù)患者顯露出的癥狀，主藥可以伴有一味或多味從藥(中醫(yī)方劑學(xué)，第1章，10-16頁，E.Zhang，editor in Chief，Publishing House，上海中醫(yī)藥大學(xué)，1998)。
指導(dǎo)用草藥和其他方式如針灸治療疾病的主要TCM理論是1)陰陽學(xué)說，2)五行學(xué)說，3)臟腑學(xué)說，4)氣、血和津液學(xué)說，和5)經(jīng)絡(luò)學(xué)說。
在TCM中，作出正確診斷的首要方面是確定疾病的陰陽。例如，發(fā)燒的病人，若有口渴、便秘或脈急等癥狀，就是陽癥。畏寒的病人，若不渴、腹瀉且脈緩，就是陰癥。草藥的性、味和功能也可以按照陰陽理論加以分類。例如，寒性和涼性的草藥屬陰，而溫性和熱性的草藥屬陽。酸、苦和咸味的草藥屬陰，而辛、甜和淡味的草藥屬陽。收斂、沉降功能的草藥屬陰，而發(fā)散、升浮功能的草藥屬陽。在TCM中，治療原則是基于陰陽的勝衰。草藥按照它們的陰陽特性和功能組方，以恢復(fù)陰陽平衡，如此達到治療目的。
按照五行學(xué)說，有五種基本物質(zhì)構(gòu)成物質(zhì)世界(即木、火、土、金和水)。在TCM中，該學(xué)說用于解釋人體的生理和病理并指導(dǎo)臨床診斷和治療。草藥醫(yī)師已應(yīng)用五行的生、克、相乘和反克規(guī)則制定出了許多有效而特定的治療方案，諸如培土生金(加強脾的功能以利肺)，滋水涵木(滋腎養(yǎng)肝)，扶土抑木(補充脾的功能以治療肝機能亢進)，和補水瀉火(滋養(yǎng)腎精而治療心機能亢進)。具體地說，有些草藥的性與五行相對應(yīng)，目的是指導(dǎo)TCM的方劑配伍。
在TCM中，將人體的內(nèi)部器官分為三組五臟(心、肝、脾、肺、腎)，六腑(膽、胃、大腸、小腸、膀胱、三焦)，奇恒之府(腦、髓、骨、脈、膽、女子胞)。在TCM中，臟腑不僅是解剖單位，而且是關(guān)于不同器官之間相互作用的生理和病理學(xué)概念。例如，心也指某些精神活動，并影響血、發(fā)、舌和皮膚的功能。陰陽五行會影響這些臟、腑和器官之間的相互作用。理論學(xué)說的互相影響的復(fù)雜性被用于解釋草藥所針對的疾病的病理，如下文中所討論的。
TCM中開藥方是從診斷開始的，診斷主要包括四項問診、望診、聽診和聞診、切診。問診過程中，搜集大量信息，包括主證的特征。例如，如果主證的特征是上腹部鈍痛，并可通過熱、壓減輕，就提示為脾陽不足。腰膝酸軟、怕冷且手腳涼，顯示為腎陽虛。望診過程中，對活力、皮膚的顏色和全身的外觀以及舌象進行觀察。例如，面色蒼白在內(nèi)部與秋天的肺對應(yīng)，其氣躁。這可出現(xiàn)在陽氣不足且氣血阻滯的時候，或者出現(xiàn)在經(jīng)絡(luò)受寒而收縮的時候。
在TCM中，正是從氣血津液生成臟腑、經(jīng)絡(luò)、組織和其他器官完成它們的生理學(xué)功能所需的能量；且取決于氣血津液的形成與代謝。TCM處方考慮草藥對氣血的作用而進行治療。
TCM認(rèn)為，經(jīng)脈、絡(luò)脈以及它們的輔助部分遍布全身。正是通過它們，草藥得以發(fā)揮對病理學(xué)目標(biāo)的影響，達到改善疾病的效果。例如，麻黃作用于肺和膀胱經(jīng)，故能發(fā)汗平喘和利尿。如上所述，針灸的臨床應(yīng)用也受經(jīng)絡(luò)學(xué)說的指導(dǎo)。
總之，在TCM中每種草藥的性質(zhì)可指定陰陽并與五行之一相配，它們通過經(jīng)絡(luò)發(fā)揮作用并經(jīng)由氣血津液介導(dǎo)而對目標(biāo)諸如臟腑產(chǎn)生治療作用。致病因子可能通過完全相同的經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)而被佯裝為圈套，從而對臟腑功能產(chǎn)生不利影響，并由此導(dǎo)致疾病。
從前面的討論可以清楚地看出TCM術(shù)語既是解剖學(xué)上的概念，也是哲學(xué)上的概念。例如，心代表體內(nèi)組織、器官或系統(tǒng)的主體，發(fā)揮TCM中所述的功能。因此，心的概念需要一個多維的數(shù)據(jù)集來描述TCM的每個概念。一旦實現(xiàn)這點，就可發(fā)展分子整體醫(yī)學(xué)。
美國的管理方法。在美國，食品強化劑(諸如植物產(chǎn)物、維生素和礦物質(zhì)、氨基酸和組織提取物)由1994年的《食品強化劑衛(wèi)生與教育條例》(DSHE條例)管理。該條例將食品強化劑成分與受《聯(lián)邦食品、藥物和化妝品條例》管理的食品添加劑區(qū)別開來。此外，DSHE條例要求，若上市銷售的食品強化劑在標(biāo)簽上顯示的或通常的使用條件下出現(xiàn)嚴(yán)重或不合理的危險時，食品和藥物管理局(FDA)負(fù)責(zé)檢驗。因此，目前沒有確立食品強化劑的純度、鑒別和制備規(guī)程的具體標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)邦規(guī)章。另外，1992年經(jīng)國會替代醫(yī)學(xué)辦公室制定，公布了有關(guān)草藥質(zhì)量的不多的幾個文件(Angell等，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339839-841)。
目前，F(xiàn)DA必須批準(zhǔn)藥物組合物或合劑中的每一種化學(xué)物質(zhì)，然后必須進行臨床試驗，以便獲得有關(guān)銷售藥物的分開的FDA批準(zhǔn)。該過程極其冗長而昂貴。由于前述的使用特定草藥組合物作為植物性藥物允許一開始就用多個化學(xué)物質(zhì)進行臨床試驗(即使用草藥組合物或草藥組合物的特定成分進行臨床試驗)，因此分子整體醫(yī)學(xué)需要進行的評估較為容易。最近，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)一些草藥作為植物性藥物進行臨床測試(FDA關(guān)于植物性藥物的指導(dǎo)，1997年4月)。盡管這些事件表明了全身保健的積極發(fā)展，但也提出了有關(guān)草藥和食品強化劑包括中藥的制劑、制備和質(zhì)量控制等重要問題。
由草藥中多種化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的大量相關(guān)生物應(yīng)答目前是無法獲得的，為了支持FDA的上市批準(zhǔn)，這將逐漸變得重要。
在不斷增加的提高草藥的實際應(yīng)用的壓力下，出現(xiàn)了以草藥為基礎(chǔ)的產(chǎn)業(yè)(參見例如Angell等，同上)。將科學(xué)測試應(yīng)用于草藥和食品強化劑的制備和給藥的需要已非常突出，因為有一些攝取了基于草藥的制劑后出現(xiàn)毒性的最新報道。例如，有一名患者吃了以草藥為基礎(chǔ)的食品強化劑后出現(xiàn)了洋地黃毒性(Slifman等，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339806-811)。后來經(jīng)過測定，在該強化劑中標(biāo)記為車前草的草藥成分實際上受到了毛地黃的污染，而毛地黃是一種已知含有至少60種強心甙的草藥。在另一個例子中，草藥制劑被發(fā)現(xiàn)引起了患者的慢性鉛中毒(Beigel等，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339827-830)。由于傳統(tǒng)的亞洲草藥被鉛和其他重金屬污染已有充分的記載，因此出現(xiàn)這種情況并不完全是意外(Woolf等，1994，內(nèi)科學(xué)紀(jì)事121729-735)。
植物性藥材的特性描述。眾所周知，遺傳特性(例如屬、種、栽培、變種、克隆)、草藥的生長年限、收獲時間、所用的特定植物部位、加工方法、地理起源、土壤類型、氣候模式、肥料的類型和比率、以及其他生長因素都對從任何特定區(qū)域“收獲”的任何特定草藥的特定化學(xué)組成具有重要影響。
已制定了越來越多數(shù)量的各種類型的試驗以確保在藥品中所用的和作為食品強化劑的草藥有恒定的質(zhì)量；包括在宏觀和微觀水平進行檢驗以及用各種各樣的化學(xué)分析進行檢驗。最近，草藥提取物中標(biāo)志分子的高效液相色譜(HPLC)圖形已成為一個參照標(biāo)準(zhǔn)。但是，這種方法存在一些問題，包括有一些生物活性分子可能不吸收用于HPLC檢測的紫外線或可見光，和化學(xué)物質(zhì)的量不必然與其生物學(xué)效能成比例。出于這些原因，草藥制造商采取將不同來源的原料混合的手段來減小化學(xué)變異。
質(zhì)譜法(MS)是一種測定從高真空中的樣品產(chǎn)生的一束電離分子或分子片段的各成分的相對質(zhì)量和相對豐度的分析方法。MS與HPLC不同，它不依賴于光密度。實踐中，其與HPLC或毛細管電泳(CE)聯(lián)合使用HPLC將化學(xué)物質(zhì)分離開，然后可以用MS鑒別它們是什么。將MS和HPLC結(jié)合成整體用于生物學(xué)用途的系統(tǒng)可以從商業(yè)上獲得。質(zhì)譜限于在低壓下為氣態(tài)或揮發(fā)性的樣品，或者可以通過衍生達到這一點的樣品。
這些步驟已經(jīng)不夠了。最近的一些出版物報道了某些特定供應(yīng)商提供的草藥質(zhì)量方面的更多的變化，要提供草藥提取物的生物等價化學(xué)是困難的。此外，安全與功效和草藥中化學(xué)物質(zhì)之間的相互關(guān)系在大多數(shù)情況下是不太確定的。最近，為響應(yīng)來自消費者和管理機構(gòu)的意見(聯(lián)邦登記簿，1997年2月6日，62卷，25號，摘要No.96M-0417，制造、包裝或保持食品強化劑中的cGMP，建議規(guī)則)，有些草藥制造商已開始執(zhí)行在各個方面要求嚴(yán)格的藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)。
化學(xué)和光譜學(xué)方法已用于描繪草藥和食品強化劑各組分的特性。例如，使用這兩種方法從墨西哥丁香(Gliricidia sepium)的果實中分離出了三種新的基于常春藤皂甙元的乙?；磉?Kojima等，1998，植物化學(xué)48(5)885-888)。大量商品樣本中的中草藥的植物學(xué)來源是通過對比用高效液相色譜(HPLC)或毛細管電泳(CE)分析出的某些特征組分推斷出的(Shuenn-Jyi Sheu，1997，食品和藥物分析雜志5(4)285-294)。例如，麻黃堿/偽麻黃堿的比例被用作區(qū)別中麻黃(Ephedra intermedia)與其他種麻黃的標(biāo)志；總生物堿含量可用于區(qū)分各種黃柏；而人參甙的含量可用于區(qū)別各種人參。但是，這些方法沒有直接測量各種草藥對病人用這些草藥進行了治療后的分子、生理學(xué)或形態(tài)學(xué)應(yīng)答的作用。
加利福尼亞衛(wèi)生學(xué)部門的食品和藥物分部最近使用氣相色譜-質(zhì)譜和原子吸收方法對從草藥庫房得到的亞洲藥品的污染物進行了測試(R.J.Ko，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339847)。在他們所檢測的260種產(chǎn)品中，至少有83種(32％)含有未申報的藥物或重金屬，23種有一種以上的摻雜物。使用高效液相色譜法、氣相色譜法和質(zhì)譜法，對從商業(yè)上購得的8種草藥的組合物(PC-SPES)進行了測定，發(fā)現(xiàn)含有雌激素類有機化合物(DiPaola等，1998，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志339785-791)。研究人員得出結(jié)論，PC-SPES有強雌激素活性，且服用PC-SPES的前列腺癌患者可能混淆標(biāo)準(zhǔn)治療的結(jié)果并可能出現(xiàn)臨床上顯著的副作用。還收集了中藥“威靈仙”不同樣品的氣相色譜數(shù)據(jù)以及與樣品抗炎活性的關(guān)系(Wei等，用于中藥“威靈仙”質(zhì)量評定的化學(xué)圖譜識別的研究，藥學(xué)通報26(10)772-772(1991))。該研究沒有提供相關(guān)的HBR陣列數(shù)據(jù)，諸如時間過程、劑量依賴性應(yīng)答、控制樣品以證實生物標(biāo)志的不同強度，也沒有利用重復(fù)類型的數(shù)據(jù)構(gòu)造方法以建立用于描繪該草藥組合物作用的特征的綜合數(shù)據(jù)庫。
蛋白質(zhì)濃度的變化也已用于表征草藥組合物或草藥的特定組分的作用。例如，來自外周血單核細胞的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的產(chǎn)生據(jù)發(fā)現(xiàn)根據(jù)加入到培養(yǎng)物中的特定中藥而發(fā)生變化(Yamashiki等，1992，臨床實驗免疫學(xué)雜志37(2)83-90)。白介素-1α受體的表達在用日本最常用的中藥小柴胡湯(Sho-saiko-to)處理過的培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)細胞中被顯著上調(diào)(Matsumoto等，1997，日本藥理學(xué)雜志73(4)333-336)。Fcγ11/111受體和巨噬細胞的補體受體3的表達通過用當(dāng)歸芍藥散(Toki-shakuyakusan)(TSS)處理而增加(J.C.Cyong，1997，日本藥理學(xué)雜志110(Suppl.1)87-92)。從天然中藥中分離得到的生物堿-漢防己甲素可抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導(dǎo)的NF-κB的活化(Chen等，1997，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊231(1)99-102)。草藥Sairei-to、澤瀉(日本名為“Takusha”)和茯苓(日本名為“Bukuryou”)在患抗腎小球基底膜性腎炎的大鼠體內(nèi)抑制內(nèi)皮肽-1的合成和表達(Hattori等，1997，日本心臟學(xué)會志39(2)121-128)。
mRNA濃度的增加或減少也被用作各種草藥和草藥組分作用的指示劑。腹膜內(nèi)注射具有抗癲癇性能的中藥青陽參(QYS)和苯妥因鈉減少了大鼠紅藻氨酸誘導(dǎo)的慢性癲癇發(fā)作期間α-和β-微管蛋白(tublin)mRNA和海馬c-fos mRNA的產(chǎn)生(Guo等，1993，中藥雜志13(4)281-286；Guo等，1995，中藥雜志15(4)292-296；Guo等，1996，中藥雜志16(1)48-51)。用從黃芪(Astragalus membranaceus)純化得到的成分-黃芪皂甙IV處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，結(jié)果減少了I型纖溶酶原活化劑抑制劑(PAI-1)特異性mRNA的表達，并增加了組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)特異性mRNA(Zhang等，1997，血管研究雜志34(4)273-280)。從人參(Panax ginseng)的根分離出的一種成分據(jù)發(fā)現(xiàn)是由人單核細胞和人單核細胞系THP-1生成的白介素-8(IL-8)的強誘導(dǎo)劑，這種誘導(dǎo)伴隨有增加的IL-8mRNA的表達(Sonoda等，1998，免疫藥理學(xué)38287-294)。
核酸微陣列技術(shù)的最新進展使得能夠大規(guī)模地平行采集有關(guān)基因表達的信息。這種方法已用于研究細胞循環(huán)、生化路徑、酵母中基因組范圍的表達、細胞生長、細胞分化、細胞對單一化合物的應(yīng)答、以及遺傳疾病，包括疾病的發(fā)生和進展(M.Schena等，1998，TIBTECH16301)。因為細胞通過改變特定基因的表達水平來響應(yīng)微環(huán)境的變化，所以對細胞中表達的基因的鑒定可確定細胞來自何處和牽涉到哪些生化與調(diào)節(jié)系統(tǒng)，等等(Brown等，1999，自然遺傳學(xué)，21(1)增刊33)。因此，細胞的基因表達圖形描繪了細胞的起源、現(xiàn)在的分化以及細胞對外部刺激物的應(yīng)答。迄今沒有研究人員，若有的話，曾嘗試將這些新技術(shù)用于研究全部草藥治療和強化劑的分子作用。
有一些研究人員曾嘗試表征從選定的草藥分離出的主要活性成分的作用。例如，用從三七(Panax notoginseng)純化得到的三七皂甙R1(NR1)處理HUVEC，導(dǎo)致了TPA合成的劑量和時間依賴性的增加(Zhang等，1994，動脈硬化與血栓形成14(7)1040-1046)。用NR1處理沒有改變尿激酶型纖溶酶原活化劑和PAI-1抗原的合成，也沒有影響PAI-1在胞外基質(zhì)中的沉積。當(dāng)HUVEC用NR1處理時，TPA mRNA增加了兩倍，而PAI-1特異性mRNA的表達沒有受到NR1的顯著影響。由于關(guān)于三七的大多數(shù)研究都涉及到其與其他草藥的混合物，因此研究人員注意到，當(dāng)用于治療人時，很難評定它們的體內(nèi)情況會是怎樣(同上，1045頁，第2列，第1段)。此外，由于研究人員僅研究了草藥的一種主要成分，因此從該研究不可能確定整個草藥的分子作用或草藥的各成分之間的相互作用。
Dobashi等(1995，神經(jīng)科學(xué)快報197235-238)研究了用于治療腎病綜合征、支氣管哮喘和慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥柴胡劑的兩種主要成分。給藥SS-d以劑量依賴方式增加了血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的濃度、垂體前葉中阿黑皮素原mRNA的濃度和大鼠下丘腦中CRF mRNA的濃度。相反，用SS-a治療沒有對這些分子標(biāo)志的濃度產(chǎn)生影響。盡管該研究指示給藥SS-d可能在柴胡劑誘導(dǎo)的CRF釋放和大鼠下丘腦中CRF基因的表達中具有重要作用，但沒有針對草藥治療總體上的分子作用。
Kojima等(1998，生物藥理學(xué)通報4426-428)描述了利用mRNA差別顯示來分離和鑒別在小鼠肝臟中由在日本用于治療各種炎性疾病的草藥小柴胡湯進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因。這些研究人員將他們的研究限于在調(diào)查研究草藥的分子機理中使用mRNA差別顯示技術(shù)。該研究同樣沒有針對受治療的動物的多個器官的作用，也沒有提供任何有關(guān)質(zhì)量控制、新用途和作用標(biāo)準(zhǔn)化的指導(dǎo)。另外，該研究沒有對草藥的單個成分進行分析并將獨立的結(jié)果與使用整個草藥混合物得到的結(jié)果進行比較。
Ma Ji等(1998，中醫(yī)雜志111(1)17-23)研究了草藥黃芪(Astragali membranaceus)對大鼠主動脈瘺引起的實驗性充血性心力衰竭的鈉水潴留的治療作用。對比用黃芪治療和不用黃芪治療的慢性心力衰竭的大鼠在各種形態(tài)學(xué)特征方面的變化(例如體重、血鈉濃度)；生理學(xué)特征方面的變化(例如平均動脈壓、心率、血細胞比容和血漿同滲重量摩爾濃度)；mRNA表達水平的變化(例如下丘腦精氨酸后葉加壓素(AVP)、AVP V1a受體、腎AVP V2受體、水通道蛋白-2(AXP2))和蛋白質(zhì)分泌的變化(例如血漿心房肽(ANP)和尿環(huán)鳥苷酸(cGMP))。研究人員發(fā)現(xiàn)，用黃芪治療改善了心臟和腎的功能，部分地糾正了AVP系統(tǒng)和AQP2的異常的mRNA表達，和改善了腎對ANP的反應(yīng)。該研究沒有解決使用收集的數(shù)據(jù)來指導(dǎo)開發(fā)新制劑或用于闡明制劑中各種草藥之間的協(xié)同或其他相互作用、或出于質(zhì)量控制的目的驗證各種作用的力量差異的問題。
如上文中所述的相關(guān)科學(xué)文獻顯示，基于分子的技術(shù)尚沒有用于研究和證實同時用多種化學(xué)物質(zhì)諸如草藥和TCM治療或刺激的生物系統(tǒng)中的細胞和分子應(yīng)答。而且，這些最新進展尚沒有與其他技術(shù)和方法統(tǒng)一起來而得到一種用于系統(tǒng)研究草藥和TCM的生物作用的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于生成、保持、改善和利用草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)的工具和方法學(xué)，其中HBR陣列構(gòu)成了與特定草藥組合物相聯(lián)的數(shù)據(jù)集。本發(fā)明的HBR陣列可包括關(guān)于草藥組分的與植物相關(guān)的參數(shù)信息、生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后收集的標(biāo)志信息以及生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后收集的生物應(yīng)答信息。
本發(fā)明提供了為建立特定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列所需的工具和方法學(xué)，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列用作基準(zhǔn)，通過它來評估成批的類似或不同草藥組合物。本發(fā)明還提供了更新和維持標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列所必需的工具和方法學(xué)。本發(fā)明的特定實施方案涉及迭代過程，由此將另外的草藥組合物的批量數(shù)據(jù)、另外的與植物相關(guān)的數(shù)據(jù)、另外的標(biāo)志信息、和/或另外的生物應(yīng)答信息定期加入到標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中。于是，本發(fā)明提供了在不斷前進的基礎(chǔ)上用于生成、保持、更新和使用HBR陣列的工具和方法學(xué)。
本發(fā)明提供了指導(dǎo)草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化所需的工具和方法學(xué)；以確定草藥組合物的哪些具體成分引起了特定的生物活性；以預(yù)測草藥組合物的生物活性；用于開發(fā)改進的草藥治療劑；用于調(diào)節(jié)或修飾草藥組合物；用于測定不同草藥組合物的關(guān)系；用于鑒別保留了所需生物活性的批量草藥組合物中的特定分子；用于確定已知草藥組合物的哪些草藥成分可以從該已知草藥組合物中去除但仍保持或改善了該已知草藥組合物的所需生物活性；用于鑒別批量草藥組合物的新用途和以前未知的生物活性；和用于使用批量草藥組合物的預(yù)測生物活性來幫助設(shè)計包括草藥成分和合成化學(xué)藥物的治療劑，包括使用組合化學(xué)的方法設(shè)計治療劑。
更具體地說，本發(fā)明提供了建立草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)的方法，其中該方法包括a)選出特征化的草藥組合物；b)使生物系統(tǒng)與一批特征化的草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；c)將步驟b)的標(biāo)志數(shù)據(jù)儲存起來作為標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
本發(fā)明還提供了這樣一些方法，其進一步包括使生物系統(tǒng)與一批或多批草藥組合物接觸、收集關(guān)于一個或多個生物應(yīng)答的數(shù)據(jù)和將所收集的生物應(yīng)答數(shù)據(jù)加入到該草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中。
本發(fā)明提供了評估草藥組合物的方法，其中該方法包括使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)；和將所收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列加以比較，選出與成批草藥組合物中的組分相同或基本相同的草藥組分。
本發(fā)明提供了用于預(yù)測草藥組合物的生物活性的系統(tǒng)，它包括1).包含一種或多種不同類型的細胞、組織、器官或體外測定的生物系統(tǒng)；2).一批草藥組合物；3).兩種或多種分子標(biāo)志；4).用于使生物系統(tǒng)與該批草藥組合物接觸并測量分子標(biāo)志的不同應(yīng)答的工具；5).一個計算機處理器，包括用于分析和儲存分子標(biāo)志的不同應(yīng)答量度的存儲器，以便生成該批草藥組合物的草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)數(shù)據(jù)集；6).一個計算機處理器，包括用于對比該批草藥組合物的HBR陣列和一個或多個先前儲存的HBR陣列的存儲器，以便預(yù)測該批草藥組合物的生物活性，其中用于產(chǎn)生一個或多個先前儲存的HBR陣列的草藥組合物的生物活性是已知的。
附圖的簡要描述

圖1。圖1提供了用于構(gòu)造任何選定的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用于指導(dǎo)有關(guān)采集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋回路。
圖2。圖2提供了用于構(gòu)造任何批量草藥組合物的草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)和用于對比該批HBR陣列與選定的來自標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的信息子集的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用于指導(dǎo)有關(guān)采集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋回路。
圖3。圖3提供了用于建立和使用主要數(shù)據(jù)集的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用于指導(dǎo)有關(guān)采集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋回路。
圖4。各種草藥組合物的蛋白質(zhì)印跡。
A.沒有草藥組合物。
B.黃連湯A(HQT A)(0.2mg/ml)。
C.HQT A(4mg/ml)。
D.HQT B(0.2mg/ml)。
E.HQT B(4mg/ml)。
F.黃芩(0.2mg/ml)。
G.黃芩(4mg/ml)。
圖5。芍藥(Paeonie lactiflora pallus)的HPLC。
圖6。大棗(Ziziphi fructus)的HPLC。
圖7。圖7提供了建立草藥組合物的生物應(yīng)答數(shù)據(jù)集的圖解。該數(shù)據(jù)集是基于在哺乳動物的細胞培養(yǎng)物中用三種以上不同濃度的草藥誘導(dǎo)的差別表達的基因。
圖8。圖8提供了建立草藥或復(fù)方草藥制劑的特征表達圖形數(shù)據(jù)庫或HBR陣列的圖解。
圖9。圖9提供了鑒別未知草藥組合物的圖解。將由未知草藥誘導(dǎo)的表達圖形與表達圖形數(shù)據(jù)庫相對應(yīng)，并利用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)庫中存檔的草藥的可能一致性打分。
圖10。圖10提供了提取草藥組合物或復(fù)方草藥制劑的標(biāo)記基因的圖解。
圖11。圖11提供了提取草藥或復(fù)方草藥制劑中單個化學(xué)成分的標(biāo)記基因的圖解。
圖12。用高和低濃度(分別用H和L指示)的三種類型的單一組分草藥提取物(冬蟲夏草菌絲體(CSM)，ST024，ST117)處理的細胞的基因表達數(shù)據(jù)的聚簇顯示。
(A)簇分析利用帶有492種選定基因(參見正文)的程序“聚簇”進行(Eisen等，1999)。
(B)用ST117處理而上調(diào)但用其他草藥提取物處理卻下調(diào)的基因的放大圖。指示了克隆ID和推定的基因名。
(C)簇算法將CSM、ST024和ST117分到3個不同的聚簇中。按照分級樹狀圖的顯示，各聚簇之間的距離可以看作是三種草藥提取物處理過的細胞的表達圖之間的差異。
圖13。
(A)在選定的492種基因的基礎(chǔ)上計算出的聚簇結(jié)果的假顏色編碼的顯示。(A)中的方框指示了上述三種基因聚簇的位置。
(B)被CSM下調(diào)但被其他物質(zhì)上調(diào)的基因的放大圖。
(C)被各種草藥處理上調(diào)的基因。
(D)被CSM下調(diào)和被其他物質(zhì)上調(diào)的基因。指示了IMAGE克隆ID和推定的基因名。
圖14。用高和低濃度(分別指示為H和L)的2批多成分草藥制劑黃芩湯(PHY906-303503(#11)和PHY906-284003(#12))處理的細胞的表達數(shù)據(jù)的聚簇顯示。數(shù)據(jù)是在三個不同日期的三次重復(fù)實驗基礎(chǔ)上的平均值。簇分析在選定的500種基因(參見正文)的基礎(chǔ)上進行。(B)簇算法將#11-L、#11H和(#12-H和#12-L)分到3個不同的聚簇中。聚簇間的距離或相似系數(shù)由分級聚簇樹狀圖指示。
圖15。利用三個獨立的實驗測量的(A)平均的和(B)單個的基因表達水平的放大圖。方框1中包括在#11-L處理的細胞中被下調(diào)但在其他細胞中被上調(diào)的基因，方框2中包括被所有的草藥處理上調(diào)的基因。方框3中包括對#11-L處理顯示沒有應(yīng)答但被其他物質(zhì)下調(diào)的基因。方框4中包括被低濃度的草藥處理大大下調(diào)但在高濃度的草藥處理下只顯示輕微應(yīng)答的基因。各基因旁指示了克隆ID和推定的基因名。
圖16。用草藥處理的細胞中的基因表達圖形的分類。(A)用未經(jīng)處理的對照細胞的表達數(shù)據(jù)正?；臄?shù)據(jù)集和(B)標(biāo)準(zhǔn)化為具有0均值和單位變數(shù)的數(shù)據(jù)集的分級聚簇。(C)用自組織圖型算法得到的非分級聚簇的結(jié)果。
圖17。用于在由草藥誘導(dǎo)的基因表達圖形的基礎(chǔ)上對草藥分類的候選種類預(yù)測物。該圖中顯示了帶有它們的對差別#11和#12草藥制劑的表達圖形的50類預(yù)測物。各基因旁指示了IMAGE克隆ID和推定的基因名。
圖18。由一批5種不同濃度的復(fù)方草藥制劑誘導(dǎo)的基因表達圖。(A)中顯示了表達圖形的6×4聚簇，(B)中顯示了選定聚簇的基因表達圖形的詳細情況。
圖19。圖19說明了圖18中的表達圖形怎樣歸類到用于隨后的漢明間距計算的三個不同組中。
圖20。圖20顯示了對由5批復(fù)方草藥制劑誘導(dǎo)的基因表達圖形的分析結(jié)果。表中的數(shù)字是漢明間距。間距越小，表達圖形越相似。
圖21。(A)中顯示的是5批復(fù)方草藥制劑的HPLC分析中4種化學(xué)成分的綜合最大強度的列表。將另外兩種參數(shù)BG+B和BG/B加入到該表中，并在(B)中顯示了6種參數(shù)的放射狀圖，以說明通過HPLC分析，與和其他各批的相似性比較，一批更類似于第2批#18。
圖22。在Jurkat T細胞中，由復(fù)方草藥制劑黃芩湯誘導(dǎo)的標(biāo)記基因的顯示。
圖23。圖23說明了鑒別由草藥混合物中的單個化學(xué)成分誘導(dǎo)的標(biāo)記基因的原理。標(biāo)記基因是表達水平與草藥中的化學(xué)成分的量相關(guān)且相關(guān)系數(shù)大于0.99或小于-0.99的那些基因。(A)顯示了基因和甘草甜素之間的R值為0.998，(B)顯示表達水平隨著漢黃芩素的減少而增加的基因的R值為-0.997。
圖24。Jurkat T細胞中，由復(fù)方草藥制劑黃芩湯中的化學(xué)成分白花素誘導(dǎo)的標(biāo)記基因。(A)顯示了與白花素正相關(guān)的基因，(B)顯示了與白花素負(fù)相關(guān)的基因。
圖25。基因表達圖形與對照組的相互關(guān)系。(A)是對照組的基因表達圖，(B)是樣品組的基因表達圖。(C)顯示了隨草藥處理濃度而變化的具有增加2倍以上的差別表達率的基因數(shù)。
圖26。利用非分級分析程序分類歸并的表達圖形的聚簇，其中該程序是基于自組織圖型(SOM)原理。X軸表示從低到高的草藥濃度，Y軸是基因表達率。
圖27。圖27顯示了在2批黃芩湯中常見的誘導(dǎo)和受抑基因。
圖28。有關(guān)2批黃芩湯的SOM聚簇結(jié)果。(A)顯示了有關(guān)2批黃芩湯的表達圖形的SOM聚簇結(jié)果。(B)顯示10種基因?qū)@兩批黃芩湯具有類似應(yīng)答，(C)顯示了當(dāng)聚簇I和聚簇j變得更加不同時稱量因子怎樣減少。
圖29。簇分析中成對草藥制劑間的S得分的計算。(A)是分值的列表，(B)示范了5批類似的草藥制劑的關(guān)聯(lián)情況。
發(fā)明詳述除非另有定義，否則本文中使用的所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員通常理解的含義。雖然在實施或檢驗本發(fā)明中可以使用與本文中描述的那些類似或等價的任何方法和材料，但下面描述了優(yōu)選的方法和材料。
發(fā)明概述如上所述，本發(fā)明涉及用于預(yù)測草藥組合物的生物應(yīng)答的工具和方法。更具體地說，本發(fā)明提供了生成草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)數(shù)據(jù)庫的方法以及使用這類數(shù)據(jù)庫來提高有效的以草藥為基礎(chǔ)的治療劑的設(shè)計應(yīng)用的方法。本發(fā)明的目標(biāo)是對用于草藥組合物的制備、測試和給藥的HBR陣列的全面設(shè)計、生成、改善和使用，并用于指導(dǎo)開發(fā)新的草藥組合物和現(xiàn)有采用組合物的新用途。
植物組學(xué)(Phytomics)。根據(jù)其使用的上下文，在本文中所用的“植物組學(xué)”是指使用生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法來解決草藥組合物各成分的定性和定量問題，或者是指為解決這些問題而開發(fā)的實際數(shù)據(jù)庫。
草藥生物應(yīng)答陣列。本文中所用的HBR陣列構(gòu)成了與草藥組合物有關(guān)的兩個或多個觀測或測量結(jié)果的數(shù)據(jù)集。HBR陣列可包括有關(guān)組合物中各植物的定性和定量數(shù)據(jù)(與植物有關(guān)的數(shù)據(jù))，生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后得到的標(biāo)志信息包括劑量依賴性研究，和生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后得到的生物應(yīng)答數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。任何特定HBR陣列中的數(shù)據(jù)都可在二維或三維空間中進行統(tǒng)計學(xué)分析。
HBR陣列可以指定為批量HBR陣列和標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。批量HBR陣列是與具體某批草藥組合物有關(guān)的數(shù)據(jù)的陣列。標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列是與標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物有關(guān)的數(shù)據(jù)的陣列。
主數(shù)據(jù)集。本文中所用的術(shù)語“主數(shù)據(jù)集”是指用作基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)集，其他各種數(shù)據(jù)集與它進行比較，或者用它分析是否為相同或不同的草藥組合物。一般說來，主數(shù)據(jù)集使用生物工程技術(shù)建立，以確定草藥組合物的某些遺傳或蛋白質(zhì)情況。因此，主數(shù)據(jù)集將通常但并不總是以基因組或蛋白組(proteomic)數(shù)據(jù)集為基礎(chǔ)。例如，核酸微陣列結(jié)果可以是用于比較其他相關(guān)或次要數(shù)據(jù)集的主數(shù)據(jù)集。
次要或相關(guān)數(shù)據(jù)集。本文中所用的“次要數(shù)據(jù)集”或“相關(guān)數(shù)據(jù)集”指的是用于比較主數(shù)據(jù)集的一個或多個數(shù)據(jù)集。通常，但并不總是，次要數(shù)據(jù)集將由利用更傳統(tǒng)的方法收集的草藥組合物的信息組成。例如，次要或相關(guān)數(shù)據(jù)集可由利用更常規(guī)的方法得到的與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)集合組成。與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)的實例包括但不限于草藥組合物中各草藥的屬/種，組合物中各草藥的特定植物部分和草藥所種植的地理位置。次要數(shù)據(jù)集的另一個例子可由用一種或多種不同量的草藥組合物治療后的細胞、組織、器官或生物體的一組生物應(yīng)答組成。這種生物學(xué)數(shù)據(jù)或整個生物體的實例可包括但不限于細胞毒性研究，酶處理研究，生長速率，重量的增或減，運動技能的變化和心智能力的變化。
草藥。從技術(shù)上來說，草藥是小的、非木質(zhì)(即肉質(zhì)莖)的、一年生或多年生的種子植物，其中在空氣中的所有部分在每個生長季末期死亡再復(fù)生。草藥的價值在于它們的藥用、風(fēng)味可口或芳香特性。這個詞的使用更為普遍，在本文中使用的這個詞“草藥”是指具有食物補充劑、醫(yī)學(xué)、藥物、治療或強身用途的任何植物或植物部分。因此，本文中使用的草藥不限于對草藥的植物學(xué)定義，而是包括用于這類目的的任何植物性藥材、植物或植物部分，包括后生植物王國的任何植物種或亞種的任何植物或植物部分，包括草、灌木、半灌木和喬木。用于草藥組合物中的植物部分包括但不限于種子、葉、莖、小枝、分支、芽、花、鱗莖、球莖、塊莖、根莖、長匐莖、根、果實、球果、漿果、形成層和樹皮。
草藥組合物。本文中所用的“草藥組合物”指的是包括藥草、草藥植物或草藥植物部分的任何組合物。因此，正如本文中所用的，草藥組合物是任何草藥制劑，包括草藥食物補充劑、草藥藥品、草藥和藥用食品。草藥組合物的實例包括但不限于以下組分單植物種的全植物或植物部分；多植物種的全植物或植物部分；從單植物種得到的多種成分；從多植物種得到的多種成分；或這些不同成分的任意組合。為了充分回顧各種草藥組合物，參見例如Kee Chang Huang，中草藥藥理學(xué)，CRC Press(1993)，其完整地結(jié)合在此作為參考。各種草藥組合物的代表性實例見以下段落。
英國從十八世紀(jì)中期開始就已使用包括柳樹皮的草藥組合物來治療熱病。柳樹皮中的活性成分是一種叫做水楊苷的苦味苷，它水解后得到葡萄糖和水楊醇。常統(tǒng)稱為非類固醇性抗炎藥(NSAID)的阿斯匹林(乙酰水楊酸)和阿斯匹林樣藥物(例如布洛芬)經(jīng)常用于治療疼痛、發(fā)熱和炎癥。繡線菊屬植物是另一類含有水楊酸鹽的草藥。用柳樹皮或繡線菊屬植物治療關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)炎樣癥狀需要消耗由這些植物制成的大量草藥茶劑。整個楊種植物(即楊屬喬木和灌木)還含有水楊酸鹽前體，楊樹芽已用于抗炎、退熱和鎮(zhèn)痛藥物治療。
美國已批準(zhǔn)了一些關(guān)于用于治療各種疾病和處理影響人和動物的其他與健康相關(guān)的問題的草藥組合物的專利。例如，美國專利No.5,417,979公開了一種組合物，它包含包括千金藤和甘草種屬植物的草藥以及它們的提取物的混合物，可用作食欲刺激劑并用于治療疼痛。包括甘草(Glycyrrhiza uralensis)的草藥組合物已發(fā)現(xiàn)可用于治療皮膚濕疹、牛皮癬、瘙癢和炎癥反應(yīng)(美國專利No.5,466,452)。美國專利No.5,595,743公開了多種草藥組合物，它包括甘草提取物(甘草屬)和豨薟屬、槐屬、百部屬和四雄蕊植物(tetrandra)草藥，可用于治療各種哺乳動物疾病，包括炎癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。眼炎可以用含有植物生物堿漢防己甲素的藥物組合物治療(美國專利No.5,627,195)。
美國專利No.5,683,697公開了一種具有抗炎、退熱、祛痰或止咳作用的藥物組合物，其中該組合物包括來自楝屬、Angepica、石斛屬、鳳仙花屬、柑橘屬、桑寄生屬、青葙屬、白前屬和珊瑚菜屬的各種植物部分。包括良姜(Alphinia)、菝葜、心葉青牛膽莖、刺蒺藜、睡茄和姜的根、根莖和/或植物的提取物的草藥組合物已發(fā)現(xiàn)可減少或減輕與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的癥狀和用于減少促炎細胞因子的產(chǎn)生(美國專利No.5,683,698)。
草藥組合物可制成多種形式，包括膠囊、片劑或包衣片劑；顆粒劑；浸膏劑或酊劑；散劑；新鮮或干燥的植物或植物部分；特制茶劑；汁液；膏霜和軟膏；揮發(fā)油；或制成這些形式的任意組合。草藥可利用任何一種方法給藥，包括口服、直腸、胃腸外、腸內(nèi)、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、經(jīng)由飼管和局部途徑。
本發(fā)明所包含的草藥組合物包括還含有非草藥成分的草藥組合物。這類非草藥成分的實例包括但不限于全蟲和昆蟲的某部分，蠕蟲，動物或昆蟲的糞便，天然油或石油，氨的碳酸鹽，酒石酸鹽，酒，水，甘油，類固醇，藥物，維生素，營養(yǎng)液，乳清，鹽和明膠。
關(guān)于口服給藥，所公開的草藥組合物可以采用例如片劑或膠囊劑的形式，利用常規(guī)方法與常用的賦形劑混合制備，所述賦形劑是諸如粘合劑(例如預(yù)凝膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)；滑動劑；人工和天然調(diào)味劑和甜味劑；人工或天然著色劑和染料；以及加溶劑。草藥組合物還可配制成以緩釋方式釋放活性成分，如本領(lǐng)域中公知的，和如美國專利Nos.4,690,825和5,055,300中所討論的。片劑可以用本領(lǐng)域中熟知的方法包衣。
用于口服給藥的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿、懸浮液或漿液等形式(諸如Mulchandani等1992的美國專利No.5,108,767中描述的液體營養(yǎng)補充劑)，或者它們可以制成干燥產(chǎn)物，使用前用水或其他適宜賦形劑重新構(gòu)成。葉酸以及其他維生素和礦物質(zhì)的液體制劑可以加入到專為ESRD病人設(shè)計的液體營養(yǎng)補充劑型中。這類液體制劑可以用常規(guī)方法制備，使用藥學(xué)上可接受的添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非含水賦形劑(例如杏仁油、油性酯或乙醇)；防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)；以及人工或天然著色劑和/或甜味劑。
關(guān)于局部給藥，草藥成分可以與構(gòu)成可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的至少一種其他成分混合在一起而制成組合物，諸如最適于局部應(yīng)用的膏霜、凝膠、固體、糊劑、油膏、粉末、洗劑、液體、氣溶膠或類似形式。單獨的無菌蒸餾水和簡單的膏霜、油膏和凝膠基質(zhì)可以用作草藥成分的載體。也可以加入防腐劑和緩沖劑。該制劑可以用于無菌敷料、可生物降解的、可吸收的局部用貼片或敷料，或用于一開始快速釋放、逐漸降至緩慢釋放的緩釋植入系統(tǒng)。
為了更全面地回顧和討論以草藥為基礎(chǔ)的組合物，參見EarlMindell，Earl Mindel草藥圣經(jīng)，Simon & Schuster(1992)；Culpeper草藥大全，W.Foulsham & Co.，Ltd.(十七世紀(jì)中期首次出版)；和Rodale草藥圖解百科全書，Rodale Press(1987)。
標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物。本文中所用的“標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物”或“特征化草藥組合物”是指選定作為用于評估與標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物的成分具有相同、相似或不同成分的批量草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物的特定草藥組合物。有時在本文中也稱作“主要草藥組合物”。標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物通常是已充分表征并在特定生物系統(tǒng)中顯示所需生物應(yīng)答的草藥組合物。標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物一般利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)試驗加以標(biāo)準(zhǔn)化并適當(dāng)?shù)貎Υ嬗糜陂L期使用和參照。用標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物在有關(guān)植物(即與植物相關(guān)的數(shù)據(jù))、標(biāo)志和生物應(yīng)答的觀測和測量結(jié)果的基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列，以便描繪草藥組合物的特性。
批量草藥組合物。本文中所用的“批量草藥組合物”是指用于在有關(guān)植物和標(biāo)志的觀測和測量結(jié)果的基礎(chǔ)上建立HBR陣列以便描繪草藥組合物的特性的任何測試草藥組合物。有時在本文中也稱作“測試”或“批量”草藥組合物。可以包括或不包括生物應(yīng)答的觀測和測量數(shù)據(jù)。用于確定標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物的那些草藥組合物也可以稱作“批量草藥組合物”直到其被指定為“標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物”為止。
批量。本文中所用的“批量”是指可以鑒別出具有一些特定屬性的特定數(shù)量的草藥組合物，以便將其與其他任何特定數(shù)量的相同草藥組合物區(qū)別開。例如，一批草藥組合物與另一批相同草藥組合物的差別可能在于這兩批草藥組合物的收獲時間不同或地理位置不同。將特定批次區(qū)別開的其他差異可包括但不限于以下這些1)所用的特定植物部分(例如在一批中用的是草藥的根，而在不同的另一批中用的是相同草藥的葉子)；2)對單個草藥或草藥組合物在采集后的處理情況(例如一批可以用蒸餾水加工，而不同的另一批可以用氯化氫加工以模擬人胃中的酸度；和3)草藥組合物中當(dāng)草藥的相對比例(例如一批的三種不同草藥可以具有相等的重量份或體積份，而另一批中的一種草藥具有比另兩種草藥更高的比例)。
生物系統(tǒng)。本文中所用的“生物系統(tǒng)”是指可以觀察或測量生物應(yīng)答的任何生物學(xué)實體。因此，生物系統(tǒng)包括但不限于任何細胞、組織、器官、全生物體或體外測定。
生物活性。本文中所用的草藥的“生物活性”是指草藥組合物所特有的對所給生物系統(tǒng)的特定生物學(xué)作用。
與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)。本文中所用的“與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)”是指所收集的關(guān)于草藥組合物的數(shù)據(jù)，包括但不限于有關(guān)植物的數(shù)據(jù)，它們的生長條件以及采集過程中和采集后對植物的處理。與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)還包括草藥組合物中各組分的相對比例，其中各組分可以是不同的植物部分，不同的植物種，其他非植物成分(例如昆蟲部分?；瘜W(xué)藥物)或這些變數(shù)的任意組合。
可以搜集的有關(guān)草藥組合物的與植物相關(guān)的數(shù)據(jù)包括但不限于以下這些1)植物種屬情況(以及可能時，特定的植物變種、栽培、克隆、家系等情況)和在組合物中所用的特定植物部分；2)草藥的地理來源，包括經(jīng)度/緯度和海拔；3)草藥的生長條件，包括肥料類型和用量，降雨量和灌溉量和次數(shù)，每天所接受的平均微愛因斯坦，農(nóng)藥用法，包括除草劑、殺蟲劑、殺螨藥和殺真菌劑，以及耕種方法；4)用于加工草藥的方法和條件，包括草藥的年齡/成熟期，浸泡時間，干燥時間，提取方法和研磨方法；和5)草藥組分和最終的草藥組合物的儲存方法和條件。
另外，標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物可以進行化學(xué)分析?；瘜W(xué)特性描述可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何化學(xué)分析方法完成。可以采用的化學(xué)分析的實例包括但不限于HPLC、TLC、化學(xué)指紋法、質(zhì)量分光光度計分析和氣相色譜法。
細胞庫系統(tǒng)。本文中所用的“細胞庫系統(tǒng)”包括細胞的主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)。使用細胞庫系統(tǒng)可以將草藥測試的細胞變異性減至最小，并可用于核酸微陣列研究中的所有細胞類型。
生物信息學(xué)。本文中所用的“生物信息學(xué)”指的是生物學(xué)方面的信息的使用和組織。除了別的以外，生物信息學(xué)還包括以下這些內(nèi)容(1)數(shù)據(jù)的獲得和分析；(2)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展；(3)綜合與聯(lián)系；和(4)對所得數(shù)據(jù)庫作進一步分析。到二十世紀(jì)九十年代早期幾乎所有生物信息學(xué)資源都被開發(fā)成公共域自由軟件，且大多數(shù)仍可自由地從因特網(wǎng)上獲得。有些公司已開發(fā)了專有數(shù)據(jù)庫或分析軟件。
基因組或基因組學(xué)。本文中所用的術(shù)語“基因組學(xué)”指的是對基因及其功能的研究?；蚪M學(xué)強調(diào)比較基因定位、分子克隆、大規(guī)模限制酶切作圖以及DNA測序和計算分析中的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的綜合。遺傳信息使用基礎(chǔ)技術(shù)諸如DNA測序、蛋白質(zhì)測序和PCR加以提取。
基因功能(1)通過分析基因中DNA突變對細胞、組織、器官或生物體的正常發(fā)育和健康的作用來確定；(2)通過分析DNA序列中編碼的各種信號來確定；和(3)通過研究利用基因或相關(guān)基因系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)來確定。
蛋白組或蛋白組學(xué)(Proteomic或Proteomics)。本文中所用的術(shù)語“蛋白組學(xué)”也叫做“蛋白組研究”或“非增殖部”，指的是在規(guī)定條件下基因組的定量蛋白質(zhì)表達模式。普遍使用的蛋白組學(xué)是指使用蛋白質(zhì)生物化學(xué)的高流通量、自動分析方法。
除了進行基因組研究外，還必需進行蛋白組研究的原因有很多。首先，基因表達水平不必然表示細胞中活性蛋白質(zhì)的量。其次，基因序列不描述蛋白質(zhì)功能與活性所必需的翻譯后修飾。再次，基因組本身不描述上下改變蛋白質(zhì)濃度的動態(tài)細胞過程。
蛋白組程序?qū)で蟮氖潜碚骷毎械乃械鞍踪|(zhì)，鑒別分離蛋白質(zhì)的至少部分氨基酸序列。一般而言，蛋白質(zhì)首先使用2D凝膠或HPLC分離，然后使用高流通量質(zhì)譜法對肽或蛋白質(zhì)測序。使用計算機可以對質(zhì)譜的輸出加以分析，以便將基因和其編碼的特定蛋白質(zhì)聯(lián)系起來。這整個過程有時稱作“功能基因組學(xué)”。現(xiàn)在有許多商業(yè)風(fēng)險提供蛋白組服務(wù)(例如Pharmaceutical ProteomicsTM，TheProteinChipTM系統(tǒng)，來自Ciphergen Biosystem；PerSeptiveBiosystems)。
有關(guān)蛋白組研究的一般信息，參見例如J.S.Fruton，1999，蛋白質(zhì)、酶、基因化學(xué)與生物學(xué)的互相影響，Yale Univ.Pr.；Wilkins等，1997，蛋白組研究功能基因組學(xué)中的新邊界(原理與實踐)，Springer Verlag；A.J.Link，1999，2-D蛋白組分析方案(分子生物學(xué)方法，112，Humana Pr.；Kamp等，1999，蛋白組和蛋白質(zhì)分析，Springer Verlag。
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文中所用的“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”，也稱作細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是指細胞通過它接受外部信號并在內(nèi)部傳遞、放大和指導(dǎo)它們的途徑。信號途徑需要以分步方式傳遞信號的蛋白質(zhì)的內(nèi)部通信鏈。蛋白激酶常常參與這種反應(yīng)級聯(lián)，因為許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及接受細胞外化學(xué)信號，由此引發(fā)胞質(zhì)蛋白的磷酸化作用而放大信號。
翻譯后修飾。本文中所用的“翻譯后修飾”是一個籠統(tǒng)的術(shù)語，它包括了蛋白質(zhì)已作為初級多肽合成后所發(fā)生的各種改變。這類翻譯后修飾包括但不限于糖基化，N末端甲硫氨酸(或N-甲?；琢虬彼?的除去，信號肽的去除，乙酰化，甲酰化，氨基酸修飾，肽鏈內(nèi)部裂解而釋放出更小的蛋白質(zhì)或肽，磷酸化和甲硫氨酸的修飾。
陣列或微陣列。本文中所用的“陣列”或“微陣列”是指一種網(wǎng)格系統(tǒng)，它具有由規(guī)定核酸片段占據(jù)的各個位置或探針細胞。陣列本身有時稱作“晶片”、“生物晶片”、“DNA晶片”或“基因晶片”。高密度核酸微陣列常常有在各種各樣的網(wǎng)格中的上千個探針細胞。
一旦制成了陣列，就加入從生物系統(tǒng)得到的DNA或蛋白質(zhì)分子，且在DNA或蛋白質(zhì)分子與陣列間發(fā)生某些形式的化學(xué)作用而產(chǎn)生一些該陣列和生物系統(tǒng)所特有的識別圖型。放射性標(biāo)記的批次的自體放射照相術(shù)是一種傳統(tǒng)檢測策略，但也可選擇其他方法，包括熒光、比色法和電子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
標(biāo)志。本文中所用的術(shù)語“標(biāo)志”是指為與特定某批草藥組合物接觸的特定生物系統(tǒng)所特有的特定草藥組合物的任何基于生物學(xué)的測量或觀測結(jié)果。術(shù)語“標(biāo)志”包括生物系統(tǒng)的定性和定量測量和觀測結(jié)果。標(biāo)志數(shù)據(jù)庫構(gòu)成了表征響應(yīng)草藥治療的基因表達模式的數(shù)據(jù)集，其中這些模式顯示了哪些基因響應(yīng)特定草藥組合物而興奮、轉(zhuǎn)變、上升或下降。因此，“標(biāo)志”指的是任何基于生物學(xué)的測量或觀測結(jié)果，其在生物系統(tǒng)中的表達水平的向上和向下或暫時調(diào)整、或定性或定量變化可用于表征生物系統(tǒng)對草藥組合物的不同生物應(yīng)答。
生物系統(tǒng)所接觸的特定批次的草藥組合物可以是未知的草藥組合物、已知的草藥組合物或標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物。可用于完成本發(fā)明的標(biāo)志的實例包括但不限于分子標(biāo)志、細胞遺傳標(biāo)志、生化標(biāo)志或大分子標(biāo)志。大分子標(biāo)志包括但不限于酶、多肽、肽、糖、抗體、DNA、RNA、蛋白質(zhì)(翻譯蛋白質(zhì)和翻譯后蛋白質(zhì))、核酸、多糖。
滿足本文“標(biāo)志”定義的任何標(biāo)志都可適當(dāng)?shù)赜糜趯嵤┍景l(fā)明。術(shù)語“標(biāo)志”包括相關(guān)的可替代選擇的術(shù)語，諸如“生物標(biāo)志”或“遺傳標(biāo)志”或“基因標(biāo)志”。為達到增加HBR陣列的區(qū)別力的目的，可能有一種或多種主要標(biāo)志以及次要標(biāo)志，或一套分級結(jié)構(gòu)的標(biāo)志。因此，選定的分子標(biāo)志可以與各種其他分子、細胞遺傳、生化或大分子標(biāo)志結(jié)合，以得到甚至更精確、擴大的HBR陣列。
分子標(biāo)志包含來自一類或多類分子化合物的一種或多種微觀分子，諸如DNA、RNA、cDNA、核酸片段、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、脂質(zhì)、脂肪酸、糖類和糖蛋白。
適宜分子標(biāo)志的建立、產(chǎn)生和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。特別有用的表征分子標(biāo)志的技術(shù)的實例包括差別顯示、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、表達的序列標(biāo)記物(EST)的大規(guī)模測序、基因表達的系列分析(SAGE)、蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)免疫印跡或2D、3D研究、以及微陣列技術(shù)。分子標(biāo)志技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉這些技術(shù)的方法和應(yīng)用(參見，例如Bernard R.Glick和Jack J.Pasternak，重組DNA的分子生物技術(shù)、原理與應(yīng)用，第二版，ASM Press(1998)；MathewR.Walker和Ralph Rapley，基因技術(shù)中的路線圖，BlackwellScience(1997)；Roe等，DNA的分離與測序，John Wiley & Sons(1996)；James D.Watson等，重組DNA，第二版，ScientificAmerican Books(1992))。
DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分離與測序方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這類公知技術(shù)的實例可以見分子克隆實驗室指南，第二版，Sambrook等，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Hanspeter Saluz和J.P.Jost，基因組測序的實驗室指南天然非克隆DNA的同向測序(生物方法第1卷)，Birkhauser(1988)；和B.Roe等，DNA的分離和測序，Wiley(1996)。常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的實例包括但不限于體外連接，限制內(nèi)切酶消化，PCR，細胞轉(zhuǎn)化，雜交，電泳，DNA測序，細胞培養(yǎng)，等等?？蓮纳虡I(yè)上購得的用于本發(fā)明的特定試劑盒和工具包括但不限于用于RNA分離、PCR cDNA文庫構(gòu)建、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達文庫、載體、基因表達分析、蛋白質(zhì)抗體純化、細胞毒性測定、蛋白質(zhì)表達和純化以及高流通量質(zhì)粒純化的那些(參見，例如CLONTECHniques產(chǎn)品目錄，XIII(3)，1-32(1998)或www.clontech.com；AtlasTMcDNA表達測定產(chǎn)品目錄(1998)；SIGMA_產(chǎn)品目錄(1997))。
有關(guān)寡核苷酸陣列、微陣列、DNA晶片或生物晶片的討論、方法學(xué)和應(yīng)用，參見例如美國專利5,445,934、5,605,662、5,631,134、5,736,257、5,741,644、5,744,305、5,795,714；Schena等，人基因組平行分析對1000個基因的基于微陣列的表達監(jiān)測，美國國家科學(xué)院院報93，10614-10619(1996)；DeRisi等，研究在基因組規(guī)模上對基因表達的代謝和遺傳控制，科學(xué)278，680-686(1997)；Wodicka等，釀酒酵母中基因組范圍的表達監(jiān)測，自然生物技術(shù)15，1359-1367(1997)；Pardee，完全基因組表達監(jiān)測人種，自然生物技術(shù)15，1343-1344(1997)；Schafer等，DNA變異與人類遺傳學(xué)的未來，自然生物技術(shù)16，33-39(1998)；DeRisi等，使用cDNA微陣列分析人類癌癥中基因表達模式，自然遺傳學(xué)14，457-460(1996)；Heller等，使用cDNA微陣列發(fā)現(xiàn)和分析與炎性疾病有關(guān)的基因，美國國家科學(xué)院院報94，2150-2155(1997)；Marshall等，DNA晶片可能性的陣列，自然生物技術(shù)16，27-31(1998)；Schena等，微陣列用于功能基因組學(xué)的生物技術(shù)的發(fā)現(xiàn)平臺，Tibtech16，301-306(1998)；Ramsay，DNA晶片最新技術(shù)，自然生物技術(shù)16，40-44(1998)；Chee等，用高密度DNA陣列獲得遺傳信息，科學(xué)274，610-614(1996)；和Chen等，利用帶有比色法檢測的cDNA微陣列系統(tǒng)描繪表達圖型和分離不同表達的基因，基因組學(xué)50，1-12(1998)；P.AndrewOutinen等，高半胱氨酸的應(yīng)力誘導(dǎo)的作用的特性描繪，生物化學(xué)雜志332，213-221(1998)；和Gelbert等，遺傳學(xué)將真正變革藥物發(fā)現(xiàn)過程，生物技術(shù)流行觀點8(6)，669-674(1997)。
適用于本發(fā)明的其他更具體的參考文獻包括但不限于針對表達技術(shù)的那些，諸如EST(參見，例如Michael R.Fannon，正常和疾病狀態(tài)下的基因表達-治療目標(biāo)的鑒別，TIBTECH14，294-298(1996))；蛋白質(zhì)圖的產(chǎn)生(參見，例如Robinson等，前列腺癌的酪氨酸激酶圖，美國國家科學(xué)院院報93，5958-5962(1996))；用于草藥組合物成分鑒定的化學(xué)和光譜學(xué)方法(Kojima等，墨西哥丁香的皂甙，植物化學(xué)48(5)，885-888(1998))；功能抗原的測定(參見，例如Aris Persidis，功能抗原，自然生物技術(shù)16，305-307(1998))；HPLC(參見，例如Milton T.W.Hearn(編輯)，蛋白質(zhì)、肽和多核苷酸的HPLC現(xiàn)代話題與應(yīng)用(臨化化學(xué)分析技術(shù)與實驗室指南)，VCH Pub.(1991)；電泳(參見，例如Westermeier等，電泳實踐DNA和蛋白質(zhì)分離的方法與應(yīng)用指南，John Wiley &Sons(1997))；和交叉反應(yīng)性標(biāo)志測定(參見，例如Irving Millman等，土撥鼠肝炎病毒實驗感染與自然發(fā)生，肝臟學(xué)4(5)817-823(1984))。解決完全基因組中被編碼的所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)問題的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的使用，其中方法包括高流通量同向結(jié)構(gòu)測定和計算方法，由Terry Gaasterland在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)駕駛員座位中的生物信息學(xué)，自然生物技術(shù)16，625-627中作了論述。關(guān)于生物信息學(xué)方法，參見，例如Andreas Baxevanis(編輯)，生物信息學(xué)基因和蛋白質(zhì)分析實踐指南，John Wiley & Sons(1998)和Luke Alphey，DNA測序從實驗方法到生物信息學(xué)(生物技術(shù)介紹叢書)，SpringerVerlag(1997)。
細胞遺傳學(xué)參數(shù)包括但不限于染色質(zhì)組型分析(例如，相對染色體長度，著絲點位置，有沒有次生狹窄)，表意文字(例如，有機體染色質(zhì)組型的圖解表示)，有絲分裂和減數(shù)分裂期間的染色體行為，染色體染色和帶型，DNA-蛋白質(zhì)相互作用(也稱作核酸酶保護測定)，中子散射研究，滾環(huán)(A.M.Diegelman和E.T.Kool，核酸研究26(13)3235-3241(1998)；Backert等，分子細胞生物學(xué)16(11)6285-6294(1996)；Skaliter等，病毒學(xué)雜志70(2)1132-1136(1996)；A.Fire和S.Q.Xu，美國國家科學(xué)院院報92(10)4641-4645(1995))，和用放射性標(biāo)記的核糖核苷酸培養(yǎng)后整個核的放射自顯影。
生化參數(shù)包括但不限于具體路徑分析，諸如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運，RNA轉(zhuǎn)錄，膽固醇合成與降解，糖生成以及糖酵解。
指紋法。本文中所用的術(shù)語“指紋法”是指為了鑒別物質(zhì)、特別是草藥而制作它的特征圖形的方法。本文中所用的術(shù)語“指紋”指的是指紋法所采用的特定方法的結(jié)果顯示。
各種類型的指紋法的實例包括但不限于DNA指紋法、蛋白質(zhì)指紋法、化學(xué)指紋法和足跡法。
DNA指紋法，或圖，是指從特定生物學(xué)來源(例如特定植物、植物種、植物屬、植物部分或植物組織)的DNA制作獨特的圖型的方式。DNA指紋，或圖，可以用于將該特定生物學(xué)來源與不同的生物學(xué)來源區(qū)別開來。使用微陣列、寡核苷酸陣列、DNA晶片或生物晶片分析某批草藥所得到的圖型也稱作“指紋”。
蛋白質(zhì)指紋法是指產(chǎn)生細胞、組織、器官或生物體諸如植物中的蛋白質(zhì)的圖型，這提供了該細胞、組織、器官或生物體在那時的完全特有的“指紋”。
化學(xué)指紋法是指對細胞中低分子量化學(xué)物質(zhì)的分析，所得圖型用于鑒別細胞、組織、器官或生物體，諸如植物。分析通常使用氣相色譜法(GC)、HPLC或質(zhì)譜法進行。
足跡法指的是找到兩種分子怎樣粘著在一起的方法。在DNA的情況下，蛋白質(zhì)與DNA的標(biāo)記部分結(jié)合，然后該DNA利用酶或化學(xué)刺激使分解。該方法產(chǎn)生了各種大小的片段的“梯”。DNA被結(jié)合蛋白保護時，它降解得少，于是“梯”顯得較模糊。足跡法是針對調(diào)節(jié)基因活性的蛋白質(zhì)真正結(jié)合DNA時的一種常用技術(shù)。
本文中的其他地方詳細地描述了用于完成各種類型的指紋法的方式，或方法。
生物應(yīng)答。本文中所用的“生物應(yīng)答”是指生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后的生物應(yīng)答的任何觀測或測量結(jié)果。有時在本文中也稱作“生物作用”。生物應(yīng)答是特定草藥組合物的生物活性的定性或定量數(shù)據(jù)點。生物應(yīng)答數(shù)據(jù)包括劑量信息和暫時信息，其中這類信息是測量生物系統(tǒng)對各種處理的應(yīng)答領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的。因此，生物應(yīng)答數(shù)據(jù)包括有關(guān)特定生物系統(tǒng)對以特定方式給藥特定時間的特定劑量的草藥組合物的特定生物應(yīng)答的信息。
生物應(yīng)答包括但不限于生理學(xué)應(yīng)答、形態(tài)學(xué)應(yīng)答、認(rèn)知應(yīng)答、激發(fā)性應(yīng)答、自主應(yīng)答和翻譯后修飾，諸如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測量。許多草藥組合物顯示了不止一種生物應(yīng)答(參見例如Kee Chang Huang，中草藥藥理學(xué)，CRC Press(1993))。有些特定生物應(yīng)答可能包含在不止一個所描繪的組中，或者具有包括不止一個組的應(yīng)答的多個方面或組分。適用于本發(fā)明的生物應(yīng)答是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。以下參考文獻是該領(lǐng)域中技術(shù)狀況的代表Kee Chang Huang，中草藥藥理學(xué)，CRC Press(1993)；Earl Mindell，Earl Mindell草藥圣經(jīng)，Simon& Schuster(1992)；Goodman & Gilman’s治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)，第九版，Joel G.Hardman等(編)，McGraw Hill，衛(wèi)生職業(yè)處(1996)；P.J.Bentley，藥理學(xué)基礎(chǔ)，藥物作用入門，Cambridge UniversityPress(1981)；P.T.Marshall和G.M.Hughes，哺乳動物與其他脊椎動物的生理學(xué)，第二版，Cambridge University Press(1980)；委員會關(guān)于傳染病的報告，American Academy of Pediatrics(1991)；Knut Schmidt-Nielsen，動物生理學(xué)適應(yīng)與環(huán)境，第五版，Cambridge University Press(1997)；Elain N.Marieb，人類解剖生理學(xué)，Addison-Wessley Pub.Co.(1997)；William F.Ganong，醫(yī)學(xué)生理學(xué)評論(第18版)，Appleton & Lange(1997)；Arthur C.Guyton and John E.Hall，醫(yī)學(xué)生理學(xué)課本，W.B.Saunders Co.(1995)。
“生理學(xué)應(yīng)答”是指與生物系統(tǒng)的生理學(xué)、或功能有關(guān)的任何特征。細胞、組織或器官水平上的生理學(xué)應(yīng)答包括但不限于溫度、血流速度、脈搏率、氧濃度、生物電勢、pH值、膽固醇濃度、感染狀況(例如病毒、細菌)和離子通量。整個生物體基礎(chǔ)上的生理學(xué)應(yīng)答包括胃腸功能(例如潰瘍、肚子痛、消化不良、胃灼熱)、生殖道功能(例如基于生理學(xué)的陽痿、子宮痙攣、痛經(jīng))、排泄功能(例如泌尿道問題、腎病、腹瀉、便秘)、血液循環(huán)(例如高血壓、心臟病)、氧消耗量、骨胳健康情況(例如骨質(zhì)疏松)、軟骨和結(jié)締組織病況(例如關(guān)節(jié)痛和炎癥)、運動、視力(例如近視、失明)、肌肉緊張(例如消耗綜合征、肌肉勞損)、有沒有疼痛、表皮和皮膚健康狀況(例如皮膚刺激、瘙癢、皮膚創(chuàng)傷)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能、心功能、神經(jīng)協(xié)調(diào)、與頭有關(guān)的健康狀況(例如頭痛、頭暈)、年齡(例如生命跨度、壽命)和呼吸(例如充血、呼吸疾病)。
“形態(tài)學(xué)應(yīng)答”是指涉及生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后的形態(tài)學(xué)、或形式和結(jié)構(gòu)的任何特征。不管生物系統(tǒng)的類型如何，形態(tài)學(xué)應(yīng)答包括但不限于大小、重量、高度、寬度、顏色、炎癥程度、一般性外觀表現(xiàn)(例如不透明性、透明性、淡薄)、濕潤或干燥程度、有沒有癌生長、以及有沒有寄生蟲或瘟疫(例如鼠、虱、跳蚤)。整個生物體基礎(chǔ)上的形態(tài)學(xué)應(yīng)答包括但不限于毛發(fā)生長的量和位置(例如多毛癥、禿發(fā))、有沒有皺紋、指甲和皮膚生長的類型與程度、印跡凝固的程度、有沒有潰瘍或傷口、以及有沒有痔瘡。
“認(rèn)知應(yīng)答”是指與生物系統(tǒng)接觸草藥組合物后的認(rèn)知或精神狀態(tài)有關(guān)的任何特征。認(rèn)知應(yīng)答包括但不限于理解、識別、構(gòu)思、判斷、記憶、推理和想像。
“激發(fā)性應(yīng)答”是指與生物系統(tǒng)接觸草藥組合物的促動或誘導(dǎo)作用有關(guān)的任何特征。激發(fā)性應(yīng)答包括但不限于情緒(例如高興)、欲望、需要學(xué)習(xí)的動力、特定生理學(xué)需要(例如食欲、性欲)或起行為刺激劑作用的類似沖動(例如精力、性沖動)。
“自主應(yīng)答”是指與生物系統(tǒng)接觸草藥組合物后的自主應(yīng)答有關(guān)的任何特征。自主應(yīng)答涉及生物系統(tǒng)的自主神經(jīng)系統(tǒng)。自主應(yīng)答的實例包括但不限于不隨意功能(例如神經(jīng)過敏、恐慌發(fā)作)，或生理學(xué)需要(例如呼吸、心律、激素釋放、免疫應(yīng)答、失眠、發(fā)作性睡眠)。
用各種草藥組合物或草藥成分治療的細胞、組織、器官和整個生物體的生物應(yīng)答是草藥領(lǐng)域中眾所周知的。例如，草藥組合物Sairei-to(TJ-114)、澤瀉(日本名為“Takusha”)和茯苓(日本名為“Bukuryou”)各自發(fā)現(xiàn)能抑制大鼠體內(nèi)內(nèi)皮肽-1的合成與表達(Hattori等，Sairei-to可抑制內(nèi)皮肽-1在腎小球中的合成，日本心臟學(xué)會志39(2)，121-128(1997))。白介素(IL)-1α的產(chǎn)生通過用草藥小柴胡湯處理培養(yǎng)的人表皮角質(zhì)細胞而得以顯著促進(Matsumoto等，小柴胡湯對培養(yǎng)的人角質(zhì)細胞的白介素-1α介導(dǎo)的自泌生長的增強，日本藥理學(xué)雜志73(4)，333-336(1997)。向從健康志愿者得到的外周血單核細胞的培養(yǎng)物中加入小柴胡湯導(dǎo)致粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的產(chǎn)生出現(xiàn)劑量依賴性的增加(Yamashiki等，草藥“小柴胡湯”在體外誘導(dǎo)外周血單核細胞中粒細胞集落刺激因子產(chǎn)生，臨床實驗免疫學(xué)雜志37(2)，83-90(1992))。這些研究人員得出結(jié)論給藥小柴胡湯可用于治療慢性肝病、惡性疾病和其中G-CSF有效的急性傳染病。用從中藥黃芪(Astragalus membranaceus)純化得到的黃芪皂甙IV(AS-IV)處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)后，減少了I型纖溶酶原活化劑抑制劑(PAI-1)特異性mRNA的表達，并增加了組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)特異性mRNA(Zhang等，培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的纖維蛋白分解潛力的調(diào)節(jié)黃芪皂甙IV向下調(diào)節(jié)纖溶酶原活化劑抑制劑-1并向上調(diào)節(jié)組織型纖溶酶原活化劑的表達，血管研究雜志34(4)273-280(1997))。從人參(Panax ginseng)的根分離出的四種成分中的一種成分據(jù)發(fā)現(xiàn)是由人單核細胞和THP-1細胞生成的IL-8的強誘導(dǎo)劑，這種誘導(dǎo)伴隨有增加的IL-8 mRNA的表達(Sonoda等，從人參的根得到的酸性多糖對白介素-8產(chǎn)生的刺激，免疫藥理學(xué)38287-294(1998))。利用流動血細胞計數(shù)分析，F(xiàn)cγ 11/111受體和巨噬細胞上的補體受體3(CR3)的表達據(jù)發(fā)現(xiàn)通過用Kampo-草藥當(dāng)歸芍藥散(Toki-shakuyakusan)(TSS)處理而增加(Cyong，來自kampo-草藥的新BRM，日本藥理學(xué)雜志110(增刊1)87P-92P(1997))。使用計算機圖像分析，Chen等(MRI/lpr小鼠體內(nèi)細胞間粘著分子-1表達的圖像分析中草藥的作用，中華醫(yī)學(xué)雜志75(4)，204-206(1995))發(fā)現(xiàn)，用中藥stragalin處理后，MRL/lpr小鼠體內(nèi)細胞間粘著分子-1(ICAM-1)、免疫球蛋白和C3的分布強度顯著減小。蛋白質(zhì)印跡分析顯示從天然中藥分離得到的漢防己甲素可抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導(dǎo)的NF-κB的活化(Chen等，漢防己甲素抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導(dǎo)的NF-κB的活化，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊231(1)99-102(1997))。
算法。本文中所用的“算法”是指分步解決問題的步驟，尤其是步驟數(shù)有限的確定的遞歸計算步驟。對與植物有關(guān)的標(biāo)志和生物應(yīng)答數(shù)據(jù)集的二維和三維分析的適宜算法是計算領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知的。這些算法在構(gòu)建本發(fā)明的草藥生物應(yīng)答陣列中是有用的。關(guān)于算法的一般信息參見例如Jerrod H.Zar，生物統(tǒng)計學(xué)分析，第二版，Prentice Hall(1984)；Robert A.Schowengerdt，遠程測定中的影像加工和分類技術(shù)，Academic Press(1983)；Steven Gold等，2D和3D點匹配的新算法姿態(tài)估計與對應(yīng)，圖型識別31(8)1019-1031(1998)；Berc Rustem，用于非線性編程與多目標(biāo)判定的算法，Wiley-Interscience Series in Systems and Optimization，JohnWiley & Sons(1998)；Jeffrey H.Kingston，算法與數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計、正確性、分析、國際計算機科學(xué)叢書，Addison-Wesley Pub.Co.(1997)；Steven S.Skiena，算法設(shè)計指南，Springer Verlag(1997)；和Marcel F.Neuts，算法概率問題的收集(隨機建模)，Chapman & Hall(1995)。關(guān)于將算法用于基于遺傳的數(shù)據(jù)的更具體的信息參見例如Dan Gusfield，關(guān)于附帶條件、樹和序列的算法電子計算機科學(xué)與計算生物學(xué)，Cambridge University Press(1997)；Melanie Mitchell，遺傳算法簡介(復(fù)雜適應(yīng)系統(tǒng))，MITPress(1996)；David E.Goldberg，研究、優(yōu)化和機器學(xué)習(xí)中的遺傳學(xué)算法，Addison-Wessley Pub.Co.(1989)；ZbigniewMichalewicz，遺傳學(xué)算法+數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)＝進化程序，SpringerVerlag(1996)；Andre G.Uitterlinden和Jan Vijg，二維DNA分型平行基因組分析方法，Ellis Horwood分子生物學(xué)叢書，EllisHorwood Ltd.(1994)；和Pierre Baldi和Soren Brunak，生物信息學(xué)機器學(xué)習(xí)方法(適應(yīng)計算和機器學(xué)習(xí))，MIT Press(1998)。
組合化學(xué)。本文中所用的“組合化學(xué)”是指用于創(chuàng)造數(shù)百或數(shù)千個化合物的許多技術(shù)，其中每個化合物有一個或多個特征彼此不同，諸如它們的形狀、電荷和/或疏水特性。組合化學(xué)可以用于產(chǎn)生草藥或草藥成分的化學(xué)變種化合物。這些化合物可以用本發(fā)明的方法加以評估。
基本組合化學(xué)概念是化學(xué)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員熟知的，也可見于Nicholas K.Terrett，組合化學(xué)(牛津化學(xué)，碩士)，Oxford Univ.Press(1998)；Anthony W.Czarnik和Sheila Hobbs Dewitt(Editors)，組合化學(xué)實踐指南，Amer.Chemical society(1997)；Stephen R.Wilson(編輯)和Anthony W.Czarnik(投搞人)，組合化學(xué)合成與應(yīng)用，John Wiley & Sons(1997)；Eric M.Gordon和James F.Kerwin(編輯)，藥物發(fā)現(xiàn)中的組合化學(xué)與分子多樣性，Wiley-Liss(1998)；Shmuel Cabilly(編輯)，組合肽文庫方案(分子生物學(xué)方法)，Human Press(1997)；John P.Devlin，高流通量篩選，Marcel Dekker(1998)；Larry Gold和Joseph Alper，通過組合物化學(xué)與基因組學(xué)并駕齊驅(qū)，自然生物技術(shù)15，297(1997)；Aris Persidis，組合化學(xué)，自然生物技術(shù)16，691-693(1998)。
實施例實施例1.建立選定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列圖1中給出了建立標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。
選擇了感興趣的草藥組合物后，收集與草藥組合物有關(guān)的各種特征的數(shù)據(jù)，包括但不限于與植物有關(guān)的特征和標(biāo)志與生物應(yīng)答信息。
與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)包括但不限于植物種、特定植物部分、草藥組合物中植物的地理來源、植物的生長條件、用于制備草藥成分的加工方法、儲存方法和條件、以及對草藥組合物的各種化學(xué)分析。標(biāo)志信息包括生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后收集的標(biāo)志的定性和定量數(shù)據(jù)。適宜的標(biāo)志包括但不限于分子標(biāo)志、細胞遺傳標(biāo)志、生化標(biāo)志和大分子標(biāo)志。生物應(yīng)答信息包括生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸后收集的生物應(yīng)答的定性和定量數(shù)據(jù)。
使用一種或多種測定法可以得到相同、類似、基本類似或不同批次的感興趣的草藥組合物的各種類型的數(shù)據(jù)(例如化學(xué)、標(biāo)志、生物應(yīng)答數(shù)據(jù))。這些不同的測定可以同時或不同時進行。另外，可以同時或不同時收集相同或不同標(biāo)志的數(shù)據(jù)。與此類似，可以同時或不同時收集相同或不同生物應(yīng)答的生物應(yīng)答數(shù)據(jù)。因此，HBR陣列的數(shù)據(jù)的收集可以是同時收集的，也可以是逐漸收集的。當(dāng)生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸以便收集數(shù)據(jù)時，記錄有關(guān)草藥組合物的給藥劑量以及處理次數(shù)的信息。生物應(yīng)答數(shù)據(jù)還可由翻譯后修飾組成，諸如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的測量。
收集了兩種或多種類型的數(shù)據(jù)后(例如，有關(guān)兩種或多種標(biāo)志和生物應(yīng)答的數(shù)據(jù)；有關(guān)與植物相關(guān)的特征的數(shù)據(jù)和生物應(yīng)答數(shù)據(jù))，使用算法分析數(shù)據(jù)以便制作2-和/或3-維草藥生物應(yīng)答陣列。
計算HBR陣列的各種統(tǒng)計學(xué)參數(shù)并可成為HBR陣列數(shù)據(jù)集的一部分。這些統(tǒng)計學(xué)參數(shù)可包括但不限于均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)或匹配(或不匹配)矩陣、比率、回歸系數(shù)和轉(zhuǎn)換值(例如原始數(shù)據(jù)的反正弦百分比變換)。于是，HBR陣列可以由原始數(shù)據(jù)以及某些計算結(jié)果、分布、圖解表示和與原始數(shù)據(jù)有關(guān)的其他數(shù)據(jù)處理結(jié)果組成。這類信息的特定實例包括但不限于數(shù)字影像、散射圖、簇分析和標(biāo)志數(shù)據(jù)的大規(guī)?；虮磉_圖。
所積累的所有數(shù)據(jù)和所得分析結(jié)果構(gòu)成了用于建立HBR陣列數(shù)據(jù)集的特定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。由于用于建立和保持草藥組合物的HBR陣列的方法的反復(fù)特性，使得這類陣列可以視為在任何一個時間點是靜止的，或者是隨時間而動態(tài)變化的。
所得分析結(jié)果可以鑒別與任何特定草藥組合物的一個或多個特定生物活性相關(guān)(正或負(fù)相關(guān))或相聯(lián)系(即顯示總的趨勢)的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的子集。
實施例2.建立批量草藥組合物的批量HBR陣列圖2中給出了建立一批草藥組合物的HBR陣列的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。建立這種陣列的步驟與上文中剛剛述及的建立標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的步驟相同。
通常，所收集的用于批量HBR陣列的數(shù)據(jù)的量將小于所收集的用于建立標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的數(shù)據(jù)量。不過，所收集的批量草藥組合物的數(shù)據(jù)可以加入到確定的HBR陣列中或者用于建立新的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
一般說來，所收集的批量草藥組合物的數(shù)據(jù)只是據(jù)發(fā)現(xiàn)與所測試的草藥組合物的所需生物活性高度相關(guān)或相聯(lián)的數(shù)據(jù)。例如，如果(根據(jù)上文中所討論的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列數(shù)據(jù)和分析)已確定與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)和標(biāo)志數(shù)據(jù)的特定子集與特定草藥組合物的所需生物活性高度相關(guān)的話，就只需要測試該批草藥組合物的該特征子集即可，以確定該批草藥是否具有所需生物活性。通過對比從某批草藥組合物得到的該特征子集的數(shù)據(jù)(即批量HBR陣列)與該特定草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定該批特定草藥組合物是否具有所需生物活性。
實施例3.建立和使用主數(shù)據(jù)集圖3中給出了建立和使用草藥組合物的主數(shù)據(jù)集的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。
第一步是建立選定的草藥組合物或批量草藥組合物的主數(shù)據(jù)集。這通過使生物系統(tǒng)與草藥組合物接觸并收集將構(gòu)成主數(shù)據(jù)集的所得標(biāo)志信息而完成。在大多數(shù)但不是所有情況下，主數(shù)據(jù)集將由陣列形式的基因組和/或蛋白組數(shù)據(jù)構(gòu)成，諸如用DNA生物晶片得到的陣列。
接著，對主數(shù)據(jù)集進行分析，看是否已得到了所測試草藥組合物的不同的表達/結(jié)果。不同的表達/結(jié)果是必需的，以在下一個步驟中產(chǎn)生有意義的算法。這類不同的表達/結(jié)果的實例包括但不限于其中某些基因為響應(yīng)與草藥組合物的接觸而被上調(diào)或下調(diào)或者某些蛋白質(zhì)的濃度為響應(yīng)這種接觸而增加或減少的適應(yīng)癥。
若沒有獲得有意義或有用的不同表達/結(jié)果，則需要重復(fù)接觸和標(biāo)志收集步驟。若據(jù)信第一次是由實驗誤差導(dǎo)致了缺乏足夠的結(jié)果，則可以用與第一次相同的所有變量(例如相同的生物系統(tǒng)、相同的標(biāo)志集、相同的實驗方案等)來重復(fù)接觸/數(shù)據(jù)收集步驟。但是，有可能需要改變生物系統(tǒng)的取樣(例如所利用的細胞的類型、細胞生長階段)、使用不同的標(biāo)志集和/或改變實驗方案以便得到不同的表達/結(jié)果。
實施例4.使用HBR陣列信息本文中所討論的HBR陣列信息可以用于許多不同目的，包括但不限于以下這些1)評估草藥組合物的成分；2)預(yù)測草藥組合物的生物應(yīng)答；3)確定哪個標(biāo)志信息是與草藥組合物的特定生物應(yīng)答最高度相關(guān)的；3)確定什么信息數(shù)據(jù)集(即與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)、標(biāo)志數(shù)據(jù)和生物應(yīng)答數(shù)據(jù))是與草藥組合物的特定生物應(yīng)答最相關(guān)的；4)確定哪種類型的生物系統(tǒng)最適用于評估草藥組合物的生物活性；5)調(diào)節(jié)或改變草藥組合物的成分，使該草藥組合物的HBR陣列與相同或基本相同的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列相一致；6)調(diào)節(jié)或改變草藥組合物的成分，使該草藥組合物具有所需的生物活性；7)測定不同草藥組合物的關(guān)系；8)生成和更新標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列；9)鑒別保持草藥組合物的所需生物活性的具體成分(例如植物部分、蛋白質(zhì)、分子)；10)確定可以將草藥組合物的哪些成分消除但同時仍保持或改善了草藥組合物的所需生物活性；11)鑒定草藥組合物的一種或多種先前未知的生物活性；12)幫助設(shè)計包括草藥和非草藥成分如化學(xué)合成藥物或藥劑的治療劑，和13)利用HBR陣列信息來補充設(shè)計治療劑的組合化學(xué)方法。本發(fā)明的這些實施方案中的每一個都可以由適當(dāng)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員用本文中提供的方法和工具完成。
實施例5.質(zhì)量控制使用本發(fā)明的HBR陣列技術(shù)來使得或確定具體某批草藥組合物(單一草藥或多種草藥的配方)與相同或基本類似的某批標(biāo)準(zhǔn)化或主要草藥組合物實質(zhì)等價。該方法中所用的HBR陣列包括每種生物作用(即生物應(yīng)答)的數(shù)量差異的可接受的范圍，以及由賦予每種生物作用的稱量值組成的可能的綜合得分，所述生物作用可由從生物系統(tǒng)的多個生化途徑得到的標(biāo)志組成。
“數(shù)據(jù)迷你化”是指用于確定或選擇在任何特定HBR陣列中哪個生物作用子集是所需最小數(shù)目的生物作用的方法。用于數(shù)據(jù)迷你化的信息是通過使生物系統(tǒng)(例如細胞系)以劑量依賴性方式與標(biāo)準(zhǔn)化草藥組合物接觸來建立標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列而得到的。這種標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列然后可以與建立的測試草藥組合物的各種HBR陣列進行比較。這些測試草藥組合物包括但不限于在不同日期制備的不同批次；用在不同時間收集的原藥材制備的不同批次；以及用在不同地點收集的原藥材制備的不同批次。
實施例6.改善草藥組合物或鑒定草藥組合物的新用途使生物系統(tǒng)與配方中單個草藥的提取物接觸或者與整個配方的提取物接觸，并檢驗提取物的生物作用，從而生成HBR陣列。觀察到的生物作用可以來自生物系統(tǒng)的多個生化途徑和/或來自動物的多個組織，其中對各種標(biāo)志相應(yīng)的定性和/或定量變化加以評估。所得HBR陣列可以與從不同草藥組合物或用不同方法制備的草藥組合物得到的新的HBR陣列或類似HBR陣列比較。該步驟可用于選出給定的一組生物作用和要預(yù)測給定的某批草藥組合物具有給定的該組生物作用所需的最小數(shù)量的標(biāo)志。
為了構(gòu)建HBR陣列，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用了各種數(shù)據(jù)迷你化工具，包括但不限于統(tǒng)計學(xué)分析、人工智能和對神經(jīng)活動的數(shù)據(jù)庫研究。所選擇的統(tǒng)計學(xué)方法包括但不限于基本探索性數(shù)據(jù)分析(EDA)、圖形EDA(諸如管襯)和多元探查技術(shù)(例如簇分析、識別因素分析、非線性回歸上的階梯線型、分類樹)(參見例如STATISTICATM軟件包，來自StatSoft，Tulsa，OK 74104；Tel918-749-1119；Fax918-749-2217；www.statsoft.com)。
在構(gòu)建HBR陣列的研究中使用數(shù)據(jù)迷你化工具來探查大量HBR陣列數(shù)據(jù)和各種HBR陣列其中、之間或當(dāng)中的一致圖形。步驟包括探查、構(gòu)建HBR陣列以及證實。該步驟一般進行迭代重復(fù)，直到鑒別了穩(wěn)健HBR陣列或標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
實施例7.建立人參配方的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列為進行該實施例，選擇的標(biāo)準(zhǔn)人參是在東北或韓國生長的PanaxGinseng C.A.Meyer G115。生長的氣候是-10-+10℃，年降雨量50-100cm(參見Huang，中藥藥理學(xué)(1993)pp21-45，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L，完整結(jié)合在此作為參考)。對人參批次將首先確定以下特征地理來源、種類、植物部分(例如根莖、根、葉片、種子、芽和花)；生長條件，加工方法和加工前后的儲存條件。對這些批次的化學(xué)內(nèi)容的檢驗將通過測定人參皂甙(例如Ro，Ra1，Ra2，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rg1，Rg2，Rd，Re，Rf，Rh1，Rh2，NG-R2和Z-R1)的定性HPLC分析進行，包括對親脂性成分的TLC定性分析(參見Elkin等，中國藥理學(xué)報(1993)1497-100和Yoshikawa等，藥學(xué)雜志(1993)113460-467)。根據(jù)不同的種類，不同草藥的皂甙含量應(yīng)當(dāng)在2.1和20.6％(重量)之間(參見表1)。然后將這些數(shù)據(jù)優(yōu)選存儲在計算機處理器的存儲器中，用于進一步處理。
表1.不同人參的皂甙含量*
標(biāo)準(zhǔn)人參(即G115)的表達生物標(biāo)志包括以下這些IL-8、IL-2、GM-CSF、NfκB、ICAM-1、干擾素γ、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、、trk A、神經(jīng)生長因子(Kim等，植物醫(yī)學(xué)(1998)64110-115；Sonoda等，免疫藥理學(xué)(1998)38287-294；Baum等，歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志(1997)76165-169；Iwangawa等，自由基生物醫(yī)學(xué)(1998)241256-1268；Rhind等，歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志(1996)74348-360)。另一方面，對于更廣的批次大小，可使用400,000寡核苷酸組/1.6cm2Affymetrix晶片(美國專利No.5,556,752)。標(biāo)準(zhǔn)人參的表達生物標(biāo)志將用光刻法、機械微斑點試驗或噴墨應(yīng)用程序通過核酸微陣列技術(shù)制備(參見Schena等，TIBTECH(1998)16301-306)。選定的幾組細胞將在不同條件下與標(biāo)準(zhǔn)人參接觸不同時間以生成多個微陣列集。這些微陣列集然后將通過對生化提取物的基于雜交的表達監(jiān)控經(jīng)由來自微陣列上的各個位置的熒光強度的穩(wěn)態(tài)mRNA濃度的減除來進行分析(Schena等，科學(xué)(1995)270467-470；Schena等，美國國家科學(xué)院院報(1996)9310614-10619；Lockhart等，自然生物技術(shù)(1996)141675-1680；DeRisi等，自然遺傳學(xué)(1996)14457-460；Heller等，美國國家科學(xué)院院報(1997)942150-2155)。然后將陣列數(shù)據(jù)集輸入到算法中產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)人參的表達生物標(biāo)志統(tǒng)計值。標(biāo)準(zhǔn)人參的生化生物標(biāo)志包括對與蛋白質(zhì)合成按比例加入的放線菌酮敏感性[3H]-亮氨酸和有絲分裂的[3H]-胸苷結(jié)合反射的增加的定量分析。(參見Yamamoto等，Arzneimittelforschung(1977)271169-1173)。對于生化生物標(biāo)志，將使骨髓細胞與標(biāo)準(zhǔn)人參在[3H]-胸苷的存在下(對于DNA合成)或在放線菌酮和[3H]-亮氨酸的存在和不存在下(對于蛋白質(zhì)合成)在不同條件下接觸不同時間，以進行對生化生物標(biāo)志(即BBM集)的多個定量分析。然后將BBM集輸入到算法中產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)人參的生化生物標(biāo)志統(tǒng)計值。然后將統(tǒng)計數(shù)據(jù)優(yōu)選存儲在計算機處理器的存儲器中用于進一步操作。
生物系統(tǒng)的生物應(yīng)答(即生物應(yīng)答)將用細胞和完整動物測定。對于細胞，使人參批次在0.5mg/ml至100mg/m1的濃度下與特定細胞類型接觸，所述細胞類型包括但不限于成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞、PMNL、LAK細胞、B16-F10黑瘤細胞、THP-1細胞和海馬神經(jīng)元。對于動物處理，將0.5-100mg/kg的人參提取物對動物口服給藥、通過腹膜內(nèi)注射或皮下注射給藥。
為了測定生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)化人參的生物應(yīng)答，將人卵巢癌細胞接種到裸鼠體內(nèi)，使得形成可觸知的腫瘤。腫瘤形成后，小鼠同時給藥順式二氯·二氨合鉑和標(biāo)準(zhǔn)人參進行治療。檢驗小鼠的腫瘤生長抑制、存活時間的增加以及降低的有關(guān)血細胞比容值和體重的副作用等情況(Nakata等，日本癌癥研究雜志(1998)89733-740)。用各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)人參重復(fù)進行測定，生成各變量的集中趨勢、分散和變異性的測量結(jié)果。
然后對收集的數(shù)據(jù)進行多維分析，以產(chǎn)生多變體正常分布集，作為測定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)人參之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式(參見Zar，J.H，載于生物統(tǒng)計分析，第二版(1984)，328-360頁，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ)。生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)人參的生物應(yīng)答的第二次獨立測定將是標(biāo)準(zhǔn)人參對運動期間生理表現(xiàn)的作用。大鼠用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)人參處理4天(0.5-100mg/kg/天)，檢驗動物的增加的血漿游離脂肪酸濃度和在大約70％ VO2max下運動期間葡萄糖濃度的維持(參見Wang等，植物醫(yī)學(xué)(1998)64130-133)。收集所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，然后進行多維分析以產(chǎn)生多變體正常分布集，作為測定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)人參之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式(參見Zar，J.H，載于生物統(tǒng)計分析，第二版(1984)，328-360頁，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ，完整結(jié)合在此作為參考)。然后將各生物應(yīng)答的分布集輸入到算法中得到標(biāo)準(zhǔn)人參的統(tǒng)計值。然后將統(tǒng)計數(shù)據(jù)優(yōu)選存儲在計算機處理器的存儲器中用于進一步操作。
反復(fù)地進行這些步驟(即化學(xué)分析、產(chǎn)生生物標(biāo)志信息和測定生物系統(tǒng)的應(yīng)答)，以生成統(tǒng)計值大數(shù)據(jù)庫。將這些值進行編輯并輸入到算法中以生成標(biāo)準(zhǔn)化人參的2-和3-維草藥應(yīng)答陣列(HBR陣列)。通過反復(fù)操作，所得陣列(即標(biāo)準(zhǔn)化陣列)顯示出標(biāo)準(zhǔn)化人參的成分(包括生長條件)、生物標(biāo)志信息和生物應(yīng)答之間最密切的相互關(guān)系。通過測定兩個或多個成分和生物標(biāo)志信息值的已知相關(guān)變量，經(jīng)由在測試批次的HBR陣列上的顯示，通過比較測試值和標(biāo)準(zhǔn)化人參的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列值，可以預(yù)測測試批次的生物應(yīng)答變量的值。所得預(yù)測結(jié)果將用于評估所給人參批次的質(zhì)量，而不需要使用生物系統(tǒng)的觀測的生物應(yīng)答(參見實施例2)。
實施例8.使用與特定生物應(yīng)答相關(guān)的變量子集評估選定的人參草藥組合物為了評估測試批量草藥組合物的質(zhì)量，首先收集選定的草藥組合物中的草藥的與植物有關(guān)的參數(shù)數(shù)據(jù)(例如植物種類、植物部分、地理來源、生長條件、加工方法和儲存條件)。然后對選定的草藥組合物進行處理，使其可以進行化學(xué)分析以確定草藥的化學(xué)含量(參見Elkin等，中國藥理學(xué)報(1993)1497-100和Yoshikawa等，藥學(xué)雜志(1993)113460-467)。以前得到的人參數(shù)據(jù)已顯示需氧運動過程中的耗氧量與存在皂甙成分、尤其是Rg1和Rb1之間關(guān)系非常密切(Wang等，植物醫(yī)學(xué)(1998)64130-133)。
然后使測試批次與試驗細胞接觸，試驗細胞包括但不限于濃度為0.5mg/ml至100mg/ml的成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞、PMNL、LAK細胞、B16-F10黑瘤細胞、THP-1細胞和海馬神經(jīng)元，以測定表達生物標(biāo)志值。從接觸后的細胞分離得到mRNA，隨后進行處理以用作使用包含IL-8、IL-2和干擾素γcDNA的微陣列進行的對生化提取物的基于雜交的表達監(jiān)控的底物(Schena等，科學(xué)(1995)270467-470；Schena等，美國國家科學(xué)院院報(1996)9310614-10619；Lockhart等，自然生物技術(shù)(1996)141675-1680；DeRisi等，自然遺傳學(xué)(1996)14457-460；Heller等，美國國家科學(xué)院院報(1997)942150-2155)。以前得到的人參數(shù)據(jù)已證明在需氧運動過程中的耗氧量和試驗細胞中表達生物標(biāo)志IL-8、IL-2和干擾素γ的誘導(dǎo)之間有密切關(guān)系(Venkatraman等，醫(yī)藥科學(xué)體育運動(1997)29333-344和Wang等，植物醫(yī)學(xué)(1998)64130-133)。對于生化生物標(biāo)志，使大鼠骨髓細胞與測試批次接觸并測定有絲分裂的[3H]-胸苷結(jié)合反射。以前得到的人參數(shù)據(jù)已證明了Rb1和Rg1顯示出與大鼠骨髓細胞中的DNA合成有密切關(guān)系(Yamamoto等，Arzneimittelforschung(1978)282238-2241)。
反復(fù)分析后，將從各個測定得到的數(shù)據(jù)輸入到算法中，以在列舉的與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)包括化學(xué)分析和與某些生物標(biāo)志有關(guān)的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生選定草藥組合物的試驗HBR陣列。通過比較試驗HBR和指向上述觀測結(jié)果和子集的分析的標(biāo)準(zhǔn)人參的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列變量來確定測試批次的質(zhì)量，其中IL-2、IL-8和INFγmRNA在體外的誘導(dǎo)和大鼠骨髓細胞中[3H]-胸苷結(jié)合的增加的證明表現(xiàn)(包括收集的有關(guān)生長條件、來源和皂甙Rg1和Rb1的檢驗的數(shù)據(jù))是測試批次對耗氧量的等價生物應(yīng)答作用的預(yù)兆，正如標(biāo)準(zhǔn)人參所顯示的那樣。在該操作的基礎(chǔ)上，可以確定測試批次與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在所給生物應(yīng)答或所感興趣的生物應(yīng)答方面是否有類似或不同的質(zhì)量。
實施例9.建立黃連(HL)配方的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列為了進行該實施例，選擇的標(biāo)準(zhǔn)黃連(HL)是來自西南亞的Coptis chinesis France，其中生長條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見Huang，中草藥藥理學(xué)(1993)，69和287-288頁，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L)。通過定量化學(xué)分析檢驗干燥黃連根莖的化學(xué)含量，測定砷、小檗堿、暗酸(caeruleic acid)、非洲防己堿、copsine、黃連次堿、黃連甙I(coptiside-I)、黃連甙-II、黃連堿、考雷明、表小檗堿、阿魏酸、greenlandicine、異黃連堿、光暗酸、木蘭花堿、氧化小檗堿、唐松草分定、傘花堿、urbenine、甲基黃連堿、巴馬汀、藥根堿和非洲防己堿(還參見Zhu M.，中藥通報(1984)963-64)。不同草藥的生物堿小檗堿的含量應(yīng)當(dāng)在7-9％(重量)之間。這些數(shù)據(jù)將優(yōu)選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用于進一步操作。
標(biāo)準(zhǔn)HL的表達生物標(biāo)志包括以下這些NfκB；bc1-2類似物，A1；鋅指蛋白，A20；IL-2受體；細胞周期探針；c-Ki-ras2；生長調(diào)節(jié)劑探針和糖皮質(zhì)激素受體依賴性細胞凋亡探針(參見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107；Yang等，瑙約-施密特貝爾格藥物學(xué)文獻(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(xué)(1997)53；ChangK.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。另一方面，對于更廣的批次大小，可使用400,000寡核苷酸組/1.6cm2Affymetrix晶片(美國專利No.5,556,752)。標(biāo)準(zhǔn)HL的表達生物標(biāo)志如實施例1中所述利用微陣列技術(shù)制備，包括分析和統(tǒng)計數(shù)據(jù)產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)HL的生化生物標(biāo)志包括糖皮質(zhì)激素受體的增加和與HL接觸的HepG2細胞中甲種胎兒球蛋白分泌的抑制(參見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107)。如實施例1所述產(chǎn)生BBM集并進行分析。然后將統(tǒng)計數(shù)據(jù)優(yōu)選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用于進一步操作。
生物系統(tǒng)的生物應(yīng)答將用細胞和完整動物進行測定。各批選定的草藥組合物將與特定細胞類型接觸，包括但不限于人HepG2肝細胞瘤細胞、人胚胎癌細胞和胸腺細胞，濃度為0.1-100mg/ml。對于動物處理，將0.1mg-2g/kg的黃連草藥組合物(即HL)口服給藥、通過腹膜內(nèi)注射或皮下注射給藥。為了確定生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)化HL的生物應(yīng)答，使人胚胎癌克隆NT2/D1與各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)HL接觸，并檢驗其分化到細胞中的情況，此時有神經(jīng)元樣細胞形態(tài)(Chang K.S.，JFormos Med Assoc(1991)9010-14)。測定反復(fù)進行以產(chǎn)生測量值并如實施例1中對人參所述進行分析。生物系統(tǒng)對標(biāo)準(zhǔn)HL的生物應(yīng)答的第二個獨立測定將是標(biāo)準(zhǔn)HL對因腸毒素大腸桿菌(Escherichiacoli(ETEC))引起的腹瀉的作用。因ETEC而出現(xiàn)腹瀉的病人用不同濃度的HL(例如2g/kg)進行治療，并測定大便體積(參見例如Rabbani G.H.，Dan Med Bull(1996)43173-185)。測定反復(fù)進行以產(chǎn)生測量值并如實施例1中對人參所述進行分析。然后將每個生物系統(tǒng)的分布集輸入到算法中以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)HL的統(tǒng)計值。然后將統(tǒng)計數(shù)據(jù)優(yōu)選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用于進一步操作。
最后，如實施例1中所述，重復(fù)各步驟以得到標(biāo)準(zhǔn)化HL的HBR陣列，其中所得HBR陣列將隨后用于預(yù)測生物活性和評估批次質(zhì)量。用這種方法，可以產(chǎn)生并定期更新標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
實施例10.用與特定生物應(yīng)答相關(guān)的變量子集評估選定的黃連草藥組合物為了評估選定的測試批次的黃連草藥組合物的質(zhì)量，首先收集關(guān)于與植物有關(guān)的特征的數(shù)據(jù)(例如植物種類、植物部分、地理來源、生長條件、加工方法和儲存條件)。然后處理草藥組合物使其可進行化學(xué)分析以確定組合物的化學(xué)含量(也參見Zhu M.，中藥通報(1984)963-64)。
以前得到的HL數(shù)據(jù)已證明人胚胎癌克隆向神經(jīng)元樣細胞中的終末分化與小檗堿的存在密切相關(guān)(參見Chang K.S.，J Formos MedAssoc(1991)9010-14)。然后使測試批次與試驗細胞接觸，試驗細胞包括人胚胎癌克隆NT2/D1，起始濃度為無毒濃度(其確定在普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi))。從接觸后的細胞分離得到mRNA，隨后對其進行處理以用作使用包含IL-2受體和NfκB的微陣列進行的對生化提取物的基于雜交的表達監(jiān)控的底物(參見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107；Yang等，瑙約-施密特貝爾格藥物學(xué)文獻(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(xué)(1997)53；Chang K.S.，J FormosMed Assoc(1991)9010-14；美國專利No.5,556,752)，這可用于測定所述細胞中c-Ki-ras2基因表達的向下調(diào)節(jié)。以前得到的HL數(shù)據(jù)已證明人胚胎癌克隆向神經(jīng)元樣細胞中的終末分化與促細胞分裂原探針的誘導(dǎo)以及c-Ki-ras2基因表達的下調(diào)密切相關(guān)(參見ChangK.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。
對于生化標(biāo)志，使HepG2細胞與測試組合物接觸，并測定細胞的糖皮質(zhì)激素受體增加和甲種胎兒球蛋白分泌抑制的情況(參見Chi等，生命科學(xué)(1994)542099-2107)。以前得到的HL數(shù)據(jù)已顯示糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制與小檗堿型生物堿密切關(guān)聯(lián)(參見Miura等，生化藥理學(xué)(1997)531315-1322)。反復(fù)分析后，將從各個測定得到的數(shù)據(jù)輸入到算法中，以在列舉的觀測數(shù)據(jù)、化學(xué)數(shù)據(jù)和關(guān)于某些生物標(biāo)志的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生試驗HBR陣列。
通過比較試驗HBR和指向上述觀測結(jié)果和子集的分析的標(biāo)準(zhǔn)HL的HBR陣列變量來確定測試批次的質(zhì)量，其中HepG2細胞的IL-2受體和NfκB的誘導(dǎo)、c-Ki-ras2基因表達的下調(diào)、糖皮質(zhì)激素受體的增加以及甲種胎兒球蛋白分泌的抑制的證明表現(xiàn)(包括收集的有關(guān)生長條件、來源和小檗堿生物堿的檢驗的數(shù)據(jù))是測試批次對人胚胎癌克隆向神經(jīng)元樣細胞中的終末分化和地塞米松誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制的等價生物應(yīng)答作用的預(yù)兆，正如標(biāo)準(zhǔn)HL所顯示的那樣。在該操作的基礎(chǔ)上，可以確定測試批次與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否有類似或不同的質(zhì)量。
實施例11.用兩個生物測定評估小柴胡湯(sho-saiko-to)為了評估三種來源的小柴胡湯的質(zhì)量，使用兩個生物測定1)細胞生長抑制和2)乙型肝炎病毒從受感染細胞的分泌。小柴胡湯組合物由6-7種草藥植物的混合物制成(柴胡(Radix Bupeuri)，半夏(Rhizoma Pinelliae)，生姜(Rhizoma Zingiberis)，黃芩(RadixScutellariae)，大棗(Fructus Ziziphi)，黨參(CodonopsisPilosula)，人參(Radix Ginseng)和甘草(Radix Glycyrrhizae)，參見表2的相對量，以重量計)。
表2.小柴胡湯的組成
三個“配方”來源于新加坡、韓國或臺灣。評估各批次的毒性和抑制乙型肝炎病毒的能力，利用DNA定量或?qū)σ倚透窝妆砻婵乖?HbsAg)的檢測來測定(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。
簡言之，1克制劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。使用兩種細胞類型a)分泌乙型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)和b)HepG2細胞(ATCCcat # HB-8065)。1比50倍稀釋后用于各項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。用三個批次得到的測定結(jié)果顯示在表3中。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，選定臺灣來源的那份作為標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物，因為其毒性低，且其有效地將HbsAG分泌(這與病毒的釋放成比例)減少了一半以上。
表3.小柴胡湯(Sho-saiko-to)的生物測定
表2和3中顯示的有關(guān)臺灣草藥組合物的數(shù)據(jù)構(gòu)成了這種草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的原始數(shù)據(jù)。因此，該數(shù)據(jù)集一開始將包括草藥組合物的來源、植物種類以及草藥組合物中各種草藥的相對用量，和兩種生物應(yīng)答(即細胞生長抑制和乙型肝炎病毒從受感染細胞的分泌)。
用圖1以及實施例1和3中列出的步驟，可以收集標(biāo)準(zhǔn)草藥組合物的與植物有關(guān)的數(shù)據(jù)、標(biāo)志和生物應(yīng)答等其他數(shù)據(jù)。將這些進一步數(shù)據(jù)加入到原始的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中，產(chǎn)生擴展的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。如詳細的說明部分和實施例中所述的那樣，可以對所得數(shù)據(jù)庫進行適當(dāng)?shù)姆治觯源_定與所感興趣的生物應(yīng)答最密切相關(guān)或相聯(lián)的變量子集。用圖2以及實施例2和4的操作中說明的方法可以確定批量HBR陣列。
所得批量HBR陣列可以與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列對比，以便預(yù)測該批量草藥組合物的生物應(yīng)答。
實施例12.草藥制劑草藥提取物制劑的標(biāo)準(zhǔn)化方案如下將適當(dāng)比例的原藥材組分置于夾套反應(yīng)鍋中，在抬高的恒定溫度下邊混合邊用水提取。用120目篩將固體與液體分離。收集所得濾液，通過在減壓下將水蒸發(fā)而濃縮。濃縮液在抬高的溫度下噴霧干燥得到顆粒狀粉末劑。然后將該散裝物質(zhì)配制成所需劑型。
實施例13.評估黃連湯黃連湯(HQT)是一個中藥古方，由四種不同草藥組成黃芩(scute)，甘草(licorice)，芍藥(白芍)和大棗(椰棗)。(表4)。這個草藥配方從300AD.起就在亞洲長期用于治療各種胃腸疾病。
表4.TCM配方HQT的草藥組分
生物和酶測定表5.批量性能(HQT)
簡單地說，每批黃連湯(HQT)1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表5中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。用兩種細胞類型來測試每批HQT的生物作用a)Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)和b)HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)。1比50倍稀釋后用于每項測定。將冷凍的細胞(107/ml)在37℃水浴中快速融解。然后細胞用10ml預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋(參見LifeTechnologies，Inc.，商品目錄與索引，1998-1999，細胞培養(yǎng)物部分)，接著以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，細胞在100ml培養(yǎng)基中在37°、5％ CO2下培養(yǎng)。2天后，對細胞計數(shù)(大約8×105/ml，總共100ml)。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制乙型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克制劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌乙型肝炎病毒的HepG2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋后用于每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。
測定β-葡萄糖醛酸酶，因為HQT因其抗腹瀉性能而眾所周知。將不同HQT提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自SigmaTM)，使終體積為80μl。37℃下培養(yǎng)2小時后，用含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應(yīng)終止，并用動力學(xué)微量平板讀數(shù)器在540nm下監(jiān)測OD。
用三個批次得到的測定結(jié)果顯示在表6中。在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，HQT來源A和B具有相對批次HQT C來說較低的毒性以及更高的抑制活性(即，與HQT A或B相比，對HepG2細胞的毒性約大5倍，而對β-葡萄糖醛酸酶的抑制活性小3.3倍，參見表6)。
表6.三種HQT制劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2 Jurkatβ-葡萄糖 DNA醛酸酶HQT A 0.6 1.50 0.76 無HQT B 0.7 1.60.81 NDHQT C 2.2 0.32 ND ND*數(shù)值表示 ％對照IC50值.
ND，未測定.
HQT對蛋白質(zhì)表達的作用的評估藥物加入前24小時，將HepG2細胞(1×106)種植于25cm2燒瓶中的3.0ml RPMI-1640培養(yǎng)基中(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養(yǎng)物部分)。細胞用或不同草藥處理，用草藥處理時分別以兩種終濃度0.2mg/ml或4mg/ml加入，并在37℃下培養(yǎng)24小時。去除培養(yǎng)基，細胞用冷的PBS洗滌兩次。將細胞收獲到1ml PBS中并以10,000rpm離心2分鐘，在冰上用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩沖液提取，接著進行三個冷凍-融解循環(huán)。以終濃度0.15M向細胞溶解產(chǎn)物中加入氯化鉀，之后離心。測定蛋白質(zhì)濃度，細胞提取物按照Laemmli的方法(自然(1970)227680-685)進行電泳。蛋白質(zhì)印跡利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行，參見例如Sambrook等(1989)。所用抗體指向以下蛋白質(zhì)Topo I；Stat(20707)；細胞周期蛋白B1；MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
圖4顯示了較高濃度的HQT A或HQT B對細胞周期蛋白B1多肽表達的差別作用。
HPLC分析用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析并用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監(jiān)控。流動相以1ml/分鐘傾注，并由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘里溶劑變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B。在這之后加入100％溶液A持續(xù)5分鐘。HPLC標(biāo)志是黃芩甙和黃芩甙元。
質(zhì)譜草藥提取物用從PE Biosystems購得的MarinerTMESI-TOF質(zhì)譜(MS)進行分析。對照示蹤物用HQT中的兩種已知活性成分黃芩甙元和黃芩甙產(chǎn)生。
用水和酸處理過的HQT批次樣品通過HPLC和質(zhì)譜法進行分析。水處理的HQT批次A和B具有不同的HPLC和MS示蹤物，但酸處理的批次得到了幾乎相同的圖形(數(shù)據(jù)未顯示)。
算法用從所用的多維分析部分收集的數(shù)據(jù)生成多變體正常分布集，作為測定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)HQT化學(xué)(HPLC和質(zhì)譜)以及來源/生長特征之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式。
實施例14.單個成分A.甘草對甘草(Glycrrhizae Radix)的評估甘草可用于潤肺止咳，幫助解除痙攣和疼痛。該實施例中所用的甘草批次的性能顯示在表7中。
表7.批次性能(甘草)
生物和酶測定為測定草藥來源的質(zhì)量，對每個草藥提取物上清液進行測定并重復(fù)分析三次。對于給出的要測定的樣品，將1克草藥粉末溶于聚丙烯試管中的10ml 80℃去離子水中(中性pH)。然后試管如表7中所述進行溫育，之后離心得到上清液。測試各批甘草對抗HepG2細胞(ATCCcat #HB-8065)或Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。細胞如上所述培養(yǎng)24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制乙型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克制劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌乙型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋后用于每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。
另外，測定β-葡萄糖醛酸酶。將不同甘草提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mMTris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl，并如上文所述進行測定。
用兩個批次得到的測定結(jié)果顯示在表8中。在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，甘草批次A比批次B對Jurkat細胞有大得多的毒性(約9倍)且是更有效的β-葡萄糖醛酸酶抑制劑(參見表8)。
表8.四個甘草制劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2Jurkat β-葡萄糖醛 DNA酸酶甘草A 1.1 1.070.41 無甘草B NDND 3.6ND甘草C 2.1 ND ND ND甘草D NDND ＞2.0 53.8*數(shù)值表示 ％對照IC50值.
ND，未測定.
表達測定為了測定基因表達，Jurkat T細胞如下所述用草藥提取物處理使Jurkat細胞(107/ml)在37℃水浴中快速融解。然后細胞用10ml預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養(yǎng)物部分)，接著以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，細胞在100ml培養(yǎng)基中在37°、5％ CO2下培養(yǎng)。2天后，對細胞計數(shù)(大約8×105/ml，總共100ml)。
如上所述制備草藥提取溶液(例如，用2g草藥粉末制得20ml無菌溶液(0.1g/ml)。將細胞以2.5×105/ml的密度分到3個燒瓶中，每個燒瓶100ml。測定用對照(沒有提取物)以及10ml 10mg/ml和1mg/ml提取物進行。另外，用毒性結(jié)果來確定所給任何提取物的“高”和“低”濃度。加入提取物后，細胞培養(yǎng)物在如上所述的條件下培養(yǎng)24小時。對細胞計數(shù)，隨后收集到50ml離心管中。所得細胞顆粒用RNA分離方法處理以提取mRNA(參見例如Sambrook等，1989，7.3-7.39頁)。
微陳列微陣列印刷如下進行通過其銷售者從IMAGE協(xié)會文庫得到人基因克隆，包括來自不同組織的基因。大多數(shù)克隆已部分定序，序列可作為GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫中的表達序列標(biāo)記得到。對克隆進行培養(yǎng)并用商業(yè)上可獲得的引物進行擴增，之后加到尼龍膜上(Chen等，基因組學(xué)(1998)51313-324)。用PC(個人電腦)控制陣列系統(tǒng)將約10ng每種擴增后的目標(biāo)物應(yīng)用于帶正電荷的尼龍膜上。陣列系統(tǒng)允許高密度斑點并能用24針排陣列工具在一片18-27mm的尼龍膜上沉積31,000個斑點。
CDNA探針和膜雜交各2微克mRNA樣品(mRNA如上所述分離得到)用無規(guī)則引物逆轉(zhuǎn)錄用生物素和/或地高辛配基標(biāo)記。標(biāo)記后的樣品用堿處理，所得標(biāo)記核酸沉淀后用于雜交。膜雜交和洗滌操作如Chen等(1998)公開的用標(biāo)記探針進行。為了以雙色模式(即生物素和地高辛配基)檢測膜上的斑點，使用β-半乳糖苷酶-綴合鏈霉抗生物素蛋白(Strept-Gal)和堿性磷酸酶-綴合地高辛配基抗體(抗-Dig-AP)。顯色后，采用成像方法進行圖象數(shù)字化(例如，平板掃描儀或數(shù)字照相機)。定量量度通過使用測量每個斑點的主要顏色成分的積分密度的程序的計算機分析進行測定，進行積分密度數(shù)據(jù)的回歸分析并找出統(tǒng)計異常值作為差別表達基因。
樣品1、2和甘草(ST117)的基因表達數(shù)據(jù)分別與冬蟲夏草提取物、茯苓(ST 027)和甘草相對應(yīng)的提取物1、2和6利用以下方法進行測定用Jurkat T細胞評估各批次的毒性。
提取物如實施例6中所述加以制備。通過以5×105/ml的密度加入1ml Jurkat細胞而將細胞分到24孔培養(yǎng)板中。測定用對照(沒有提取物)以及所述5個濃度的提取物(參見表9)進行。用于細胞培養(yǎng)物測定的高和低濃度根據(jù)提取物對細胞的毒性在10mg/ml和0.05mg/ml之間變化(即，mg草藥提取物干重/ml)。對于某些樣品，10mg/ml的毒性是這樣的將“高”和“低”濃度向下調(diào)節(jié)，但最大最小值之間至少保持一個數(shù)量級。例如，對于甘草(ST117)，“高”濃度是0.5mg/ml，“低”濃度是0.05mg/ml(參見表9)。加入提取物后，細胞培養(yǎng)物在如實施例6中所述的條件下培養(yǎng)24小時。對細胞計數(shù)，將所得數(shù)據(jù)制表以顯示提取物毒性。所得數(shù)據(jù)顯示在表9中。
表9.不同濃度的草藥提取溶液下的存活細胞數(shù)
注意初始細胞數(shù)是5×105/ml，培養(yǎng)24小時后變?yōu)?0×105/ml?！?″表示所有細胞死亡。方案1.將1ml 5×105/ml Jurkat細胞加入到24孔培養(yǎng)板中。2.制備12種草藥提取溶液并滅菌。3.測試5種濃度的每個樣品。10mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml4.將細胞在37℃下用5％ CO2恒溫箱培養(yǎng)24小時。
在每個分析中，對144×96個基因(即13,824個基因)進行分析(數(shù)據(jù)未顯示)，與對照相比有約100個基因顯示出顯著差異(表10)。有些基因被上調(diào)，而有些被下調(diào)。與對照差異的大小有時會根據(jù)與特定細胞接觸的草藥組合物的相對量而變化。C1欄下的數(shù)值(對照處理)和H或L(草藥)代表減去背景后的mRNA表達的強度(表10)?；蛑甘揪幋a在陣列AD中，其可追蹤到特定GenBank克隆。表達水平通過用H或L除以C來確定。在每種草藥處理過的樣品中13,824個基因中只有部分顯示出明顯變化，即上調(diào)、下調(diào)或無變化(參見表10)。rem K、L、M、N、O、P列中顯示的數(shù)值表示#1、#2、#6草藥處理的mRNA表達水平的比例名稱 C1 1H 1L 2h 2L陳列AD 轉(zhuǎn)導(dǎo)素樣增強子蛋白1Sg-Bk Sg-BkSg-BkSg-BkSg-Bk<94,030>腺苷琥珀酸裂解酶 55.29 8.55 7.15 46.7438.07<91,097>神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶，受體，1型 89.55 98.2970.2684.8393.83<89,083>MHC類I蛋白 HLA-A(HLA-A28，-B40，-Cw3) 80.68 61.9146.1359.8629.64<87,083> 85.33 50.9637.7553.2525.54<86,131>ESTs，高度類似于HELIX-LOOP-HELIX PROTEIN 99.48 109.46 105.62 56.6867.54<85,129>膜內(nèi)在蛋白質(zhì)E1690.64 72.1292.7537.9770.08<85,112> 35.23 60.8248.8744.0429.71<84,075> 89.56 77.5477.9 66.1 59.44<83,129> 118.83 108.15 118.05 75.8464.09<82,082>人類雄激素受體伴隨蛋白24(AI60.23 47.8734.9637.419.84<82,027> 65.11 90.0166.7466.3 64.44<80,129> 96.27 99.96109.381.8887.66<80,035>人小GTP結(jié)合蛋白Rab7 mRNA，完全 44.91 46.2325.1978.2140.75<74,108> 65.277.2568.0960.2 66.21<74,012> 34.68 60.9257.7324.6148.93<73,132>人KIAA0078基因的mRNA，完全編碼 109.86 103.38 82.3585.9769.15<72,101>人反-Golgi p230 mRNA，完全編碼 46.96 25.7618.3510.5417.87<72,014>開蓬還原酶 4.3715.0813.3142.8722.76<70,101> 60.86 13.5535.2333.3940.65<69,107> 37.92 31.4126.1282.8228.64<68,064>人KIAA0034基因的mRNA，完全編碼 2.241.27 5.31 0.21 2.5(H，L表示高濃度和低濃度)與未經(jīng)處理細胞(C1)對比
<62,117>106.71 94.6783.9881.3961.45<62,084>NA 1.13 0013.550.58<62,001>不均一核核糖核蛋白A197.1171.9273.1642.0178.94<61,118>NA 89.5259.9754.1166.8643.05<59,142>ATPase，Na+/K+轉(zhuǎn)運，α1多肽 13.0315.4847.7527.7127.86<59,135>60.8590.2339.8393.0138.17<58,087>ESTs，不太類似于KIAA0062[人類] 77.7246.8676.3364.4322.52<57,016>成神經(jīng)細胞瘤RAS病毒(v-ras)致癌基團相同物71.7116.4744.6139.5166.89<56,088>3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A 56.7752.6659.5359.6 16.89<56,060>翻譯延伸因子1-α-1 81.2692.2892.0836.8679.09<55,040>043.5839.4753.6746.42<54,134>碳酸酐酶III 004.38 43.478.23<53,048>人類干擾素調(diào)節(jié)因子3的mRNA 0.25 0033.470<53,023>人蛋白酶體亞單位HsC7-I的mRNA，完全c 67.7614.9842.3338.4866.52<52,135>49.2646.8144.4 72.9555.5<51,131>ATP檸檬酸裂合酶 2.02 052.0639.336.03<51,101>多腺苷酸結(jié)合蛋白8.65 0.17 0.45 38.9914.31<50,035>血清白蛋白前體 0.88 010.2144.140<47,055>ESTs38.5331.6919.4543.8 56.1<46,097>34.2635.9532.4939.8163.19<45,100>核糖體蛋白L526.1533.6 26.3 55.8648.59<44,103>NA 72.0154.3670.2775.4391.53<43,039>55.8618.0220.8311.6817.8<43,035>14-3-3 PROTEIN TAU 86.8623.1836.2318.1412.76<43,019>72.4810.4 23.3827.5912.83
<42,099> 30.25 33.73 36.8361 51.56<40,100>ESTs 0 0 0.2 38.3712.78<39,118>硫氧還蛋白4.260.342.83 37.288.03<39,007>前α(球蛋白)抑制劑，H3多肽9.4624.06 15.8226.0825.48<38,097>NA11.81 6.9423.8280.1416.65<38,081>人GP36b糖蛋白mRNA，完全編碼 101.51 82.61 89.8622.8871.4<35,096> 47.35 24.52 023.2 32.88<34,143> 61.23 2.9925.0530.6116.93<32,118>ESTs，微類似于酪蛋白激酶1相同物 21.98 8.9114.1153.5424.01<32,034>丙酮酸激酶，肌肉 78.41 54.15 79.3629.5640.5<30,102>成視網(wǎng)膜細胞瘤結(jié)合蛋白P48 27.323.116.0662.3534.39<30,033> 70.49 30.32 65.1317.1833.65<29,058>NA25.77 16.66 059.8533.24<29,035> 60.19 57.12 86.6646.4756.59<28,104>核糖體蛋白S13 0 0 037.191.37<28,035> 71.46 35.93 51.8611.2730.75<27,119> 0 0 048.271.66<27,097>ESTs，中等類似于Etr-3[人類] 16.06 24.53 9.26 76.0124.34<25,126>ESTs 42.93 22.03 29.8867.7640.39<25,106> 61.948.38 43.4191.2658.89<24,098>人剪接體蛋白(SAP61)mRNA，完全編碼 24.26 25.43 21.8 56.1837.28<24,071>熱激70KD蛋白1 63.92 58.19 61.1 50.8666.27<23,126> 5.181.1 10.0854.7112.11<23,099>核糖體蛋白S3A 5.131.931.25 38.9914.35<22,013>真核起始因子4B61.849.95 41.5222.9949.11
<22,006>3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A 83.1757.8439.8 40.0444.33<20,126>線粒體壓力-70蛋白前體 27.0222.1933.8656.8732.97<20,104>人真核翻譯起始因子(elF3)mRNA 22.0915.1717.3374.9819.17<20,103>層粘連蛋白受體(2H 5表位) 1.45 1.26 039.668.67<19,098>人 semaphorin(CD100)mRNA，完全編碼17.7914.3810.7952.9428.97<18,103>核糖體蛋白L5 31.4721.1330.0778.6 27.18<18,084>ESTs 54.6175.1746.1679.5 60.01<17,103>NA00033.962.87<17,097>NA1.52 2.1 1.21 37.7711.59<17,062> 92.7273.27103.64 69.7969.35<16,103>整聯(lián)蛋白，β1(纖連蛋白受體，β多肽， 00.92 041.3 1.84<16,100>人類E1B 19K/Bcl-2-結(jié)合蛋白Nip3 mRN0.79 00.7 38.068.28<15,112> 16.4711.6511.8746.5222.98<14,103>NA27.6134.2630.1855.6738.45<14,011>NA47.4234.8768.2838.7153.6<13,114>人類克隆24689 mRNA序列20.6413.8719.2 51.2632.34<12,144>人類NADH泛醌氧化還原酶NDUFS 76.7867.2 76.1164.5 50.04<12,111> 40.0455.0446.3477.7846.07<11,135> 90.34114.29 87.8880.4987.22<11,105>核糖體蛋白質(zhì)L38.27 14.4115.5936.8225.87<11,053>需鈣蛋白酶，大多肽L2 10.4823.5814.8 15.698.87<10,136>蘋果酸酶2，線粒體 74.3481.6390.9483.1874.85<10,101>ESTs 13.6516.3413.9747.5726.68<09,136>NA59.8295 87.1677.3483.51<09,110>ER腔蛋白質(zhì)維持受體1 17.3 41.7348.9255.3235.56
<09,085>人磷脂轉(zhuǎn)移蛋白mRNA，完全編碼80.1488.8396.2280.477.44<08,138>41.5760.4 69.5373.27 81.26<08,132>67.22102.84 103.65 90.56 88.43<08,122>人類DRAK1的mRNA，完全編碼 32.0123.2147.7463.02 35.64<08,105>69.5858.7 84.4990.568.91<08,055>19.5 20.0122.8327.87 34.66<07,111>30.8 44.6748.7573.84 51.31<07,107>ESTs4.57 3.23 9.01 41.32 8.83<06,135>71.42112.68 128.81 102.8 101.48<06,102>ESTs39.8236.0332.5767.74 46.04<06,101>胞間粘著分子2 4.43 2.95 4.21 38.95 16.6<06,034>核糖體蛋白L50000 33.93<06,006>人脆性X精神發(fā)育遲緩綜合征相關(guān)蛋白 031.7100 0<04,134>39.0354.6246.6171.858.82<04,106>鐵蛋白，輕多肽 15.7423.8121.9446.74 21.94<03,140>56.0888.3361.2993.174.04<03,099>ESTs22.9718.5712.1 52.83 23.48<02,111>ESTs，高度類似于HYPOTHETICAL 64.5 KD PRO34.8923.6325 77.41 28.84<01,136>人類5-氨基咪唑-4-甲酰胺的mRNA 21.3634.8423.9553.14 45.66<01,058>酰基輔酶A脫氫酶，C-4至C-12直鏈 60.6853.3573.2662.56 56.58總計116
以這種方式，我們能將特定基因表達與細胞和無、低(L)或高(L)用量的草藥組合物的接觸聯(lián)系起來。以這種方式鑒定的許多基因編碼已知的代謝或生化途徑中的重要蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中有許多對某些生理、形態(tài)和心理參數(shù)有直接和間接作用。因此，該方法可以將草藥組合物的特定遺傳指紋與其陣列生物作用關(guān)聯(lián)起來。這種關(guān)聯(lián)可以用于描繪或表征草藥組合物，目的是用于質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，和評估藥理學(xué)或毒理學(xué)性能。草藥配方中的主要和次要草藥的作用也可以利用該方法加以評定。
HPLC分用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析并用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監(jiān)控。流動相以1ml/分鐘傾注，并由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘里溶劑變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B。在這之后加入100％溶液A持續(xù)5分鐘。HPLC標(biāo)志是甘草甜素。
算法用從所用的多維分析部分收集的數(shù)據(jù)生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)甘草分子、化學(xué)(HPLC和質(zhì)譜)以及來源/生長特征之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式。
B.黃芩黃芩(Radix Scutellariae)的評估黃芩已發(fā)現(xiàn)可用于降低毛細管滲透性和炎癥。它也可用于治療腸炎和痢疾，增加膽汁的分泌以治療黃疸；減輕肌肉痙攣；治療咳嗽和驅(qū)蟲。該實施例中所用的黃芩批次的性能顯示在表11中。
表11.批次性能(黃芩)
生物和酶測定簡言之，每種黃芩提取物制劑1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表11中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。測試各批黃芩對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或JurkatT細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋后用于各項測定。細胞如上所述培養(yǎng)24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制乙型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克制劑加10ml水。該混合物如表11中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌乙型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋后用于每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。
至于β-葡萄糖醛酸酶，將不同的黃芩提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mMTris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養(yǎng)2小時后，用含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應(yīng)終止，并用動力學(xué)微量平板讀數(shù)器在540nm下監(jiān)測OD。
用三個批次得到的測定結(jié)果顯示在表12中。
表12.四個黃芩制劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2 Jurkat β-葡萄糖醛酸酶DNA黃芩A1.5 0.33 0.45 無黃芩B1.8 NDNDND黃芩C0.3 NDNDND黃芩DND0.65 ND27.5*數(shù)值表示 ％對照IC50值。
ND，未測定.
評估黃芩對蛋白質(zhì)表達的作用提取物加入前24小時，將HepG2細胞(1×106)種植于25cm2燒瓶中的3.0ml RPMI-1640培養(yǎng)基中(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養(yǎng)物部分)。細胞用或不同草藥處理，用草藥處理時分別以兩種終濃度0.2mg/ml或4mg/ml加入，并在37℃下培養(yǎng)24小時。去除培養(yǎng)基，細胞用冷的PBS洗滌兩次。將細胞收獲到1ml PBS中并以10,000rpm離心2分鐘，在冰上用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩沖液提取，接著進行三個冷凍-融解循環(huán)。以終濃度0.15M向細胞溶解產(chǎn)物中加入氯化鉀，之后離心。測定蛋白質(zhì)濃度，細胞提取物按照Laemmli U.K.的方法(自然(1970)227680-685)進行電泳。蛋白質(zhì)印跡利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行，參見例如Sambrook等(1989)。所用抗體指向以下蛋白質(zhì)Topo I；Stat(20707)；細胞周期蛋白B1；MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
圖4顯示黃芩批次A和B對蛋白質(zhì)印跡上分解的多肽的表達沒有不同影響。
HPLC分用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析并用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監(jiān)控。流動相以1ml/分鐘傾注，并由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘里溶劑變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B。在這之后加入100％溶液A持續(xù)5分鐘。HPLC標(biāo)志是黃芩甙和黃芩甙元。
用水和酸處理過的黃芩批次樣品通過HPLC進行分析。水和酸處理批次事實上無法區(qū)別開。
算法用從所用的多維分析部分收集的數(shù)據(jù)生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)黃芩化學(xué)(HPLC)以及來源/生長特征之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式。
C.白芍芍藥(Paeonie lactiflora pallus radix)的評估芍藥可用于緩急止痛。還已知它能緩和韌帶和純化血液。該實施例中所用的芍藥批次的性能顯示在表13中。
表13.批次性能(芍藥)
生物和酶測定簡言之，每種芍藥提取物制劑1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表13中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。測試各批芍藥對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或JurkatT細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋后用于各項測定。細胞如上所述培養(yǎng)24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制乙型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。
簡言之，1克制劑加10ml水。該混合物如表13中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌乙型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋后用于每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。
將不同的芍藥提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養(yǎng)2小時后，用含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應(yīng)終止，并用動力學(xué)微量平板讀數(shù)器在540nm下監(jiān)測OD。結(jié)果顯示在表14中。
表14.兩個芍藥制劑的生物測定*大腸桿菌HepG2Jurkat β-葡萄糖醛酸酶芍藥A 2.8 ＞1.51.1 無芍藥B ＞2.5ND NDND*數(shù)值表示 ％ of控制IC50值。
ND，未測定HPLC分析用Beckman ODS Ultrasphere柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析并用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監(jiān)控。流動相以1ml/分鐘傾注，并由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘里溶劑變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B。在這之后加入100％溶液A持續(xù)5分鐘。HPLC標(biāo)志是芍藥甙。
芍藥批次如圖5中所示利用HPLC進行分析。
算法用從所用的多維分析部分收集的數(shù)據(jù)生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)芍藥化學(xué)(HPLC)以及來源/生長特征之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式。
D.大棗大棗(Ziziphi Fructus)的評估大棗可用于利尿和強身。該實施例中所用的大棗批次的特性顯示在表15中。
表15.批次性能(大棗)
生物和酶測定簡言之，每批大棗提取物1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表15中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。測試各批大棗對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋后用于各項測定。細胞如上所述培養(yǎng)24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制乙型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克制劑加10ml水。該混合物如表15中所述進行處理。離心后收集上清液并通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌乙型肝炎病毒的HepG2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學(xué)院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋后用于每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學(xué)院院報(1991)888495-8499中所述進行。
將不同的大棗提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養(yǎng)2小時后，用含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應(yīng)終止，并用動力學(xué)微量平板讀數(shù)器在540nm下監(jiān)測OD。結(jié)果顯示在表16中。
表16.三個大棗制劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2Jurkat DNAβ-葡萄糖醛酸酶大棗A1.2 1.5 5.1 無大棗BND＞2.0 ND 52.3大棗C2.5 NDND ND*數(shù)值代表％對照IC50值。
ND，未測定HPLC分析用Beckman ODS Ultrasphere柱(5微米顆粒，4.6 mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析并用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監(jiān)控。流動相以1ml/分鐘傾注，并由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘里溶劑變?yōu)?0％溶劑A/90％溶劑B。在這之后加入100％溶液A持續(xù)5分鐘。大棗的HPLC標(biāo)志是白屈菜酸和cAMP。
大棗批次樣品如圖6中所示利用HPLC進行分析。
算法用從所用的多維分析部分收集的數(shù)據(jù)生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標(biāo)準(zhǔn)大棗化學(xué)(HPLC)以及來源/生長特征之間的相互關(guān)系基準(zhǔn)的方式。
實施例15.通過核酸微陣列分析來表征草藥介紹核酸微陣列技術(shù)的迅速發(fā)展已導(dǎo)致基因表達數(shù)據(jù)的激增(Lander，1999，Duggan等，1999)?；虮磉_的四個特征可解釋使用核酸微陣列來研究基因表達圖形的巨大價值。(i)核酸微陣列使得更容易立刻測量數(shù)千個基因的轉(zhuǎn)錄物。(ii)基因產(chǎn)物的功能與其表達型之間的緊密聯(lián)系使得基因的功能可以預(yù)測。(iii)通過改變特定基因的表達水平使得細胞對微環(huán)境變化有良好反應(yīng)。(iv)在細胞中表達的各組基因可確定細胞的起源是什么、涉及哪些生化和調(diào)節(jié)系統(tǒng)，等等(Brown和Botstein，1999)。通過使用微陣列系統(tǒng)，上述特征可以整體方式加以研究。
使用核酸微陣列技術(shù)可以檢測任何所需數(shù)量的基因的表達。例如，可以將最多約20,000個基因置于一個陣列上。我們已研制了一種帶有比色檢測系統(tǒng)的核酸微陣列(微陣列/CD)(Chen等，1998)。使用帶有呈現(xiàn)約10,000個不同人轉(zhuǎn)錄物的約10,000個cDNA的微陣列濾膜(2.7cm×1.8cm)來研究不同細胞系的基因表達圖形。已對微陣列/CD系統(tǒng)的靈敏度和檢出限作為表征，它比得上帶有放射性檢測的系統(tǒng)或帶有激光誘導(dǎo)的熒光檢測的系統(tǒng)(Bertucci等，1999)。
如前所述，細胞基因表達圖形描繪了細胞的來源、現(xiàn)時的分化以及對外部刺激物的細胞應(yīng)答。換句話說，基因表達圖形揭示了細胞的狀態(tài)，微陣列是實現(xiàn)這一目的的理想工具。在本研究中，我們使用微陣列/CD系統(tǒng)來表征細胞對外部刺激物的應(yīng)答，在這種情況下，外部刺激物是中藥。反過來，我們還在所激發(fā)的基因表達圖形的基礎(chǔ)上將不同的草藥分類。
圖7是一個流程圖，描述了可用于建立用草藥組合物處理的細胞的表達應(yīng)答數(shù)據(jù)集的通用方法。該方法包含以下步驟(a)通過在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)各種濃度的草藥來確定草藥組合物的IC50濃度，并鑒定在預(yù)定時間后留下了50％存活細胞的濃度。
(b)對加有不同IC50濃度部分的草藥提取物的哺乳動物細胞培養(yǎng)物進行培養(yǎng)。
(c)在預(yù)定培養(yǎng)時間后收獲所培養(yǎng)的細胞并計數(shù)。
(d)將細胞從孵化箱中取出后立即溶解細胞并從細胞溶解產(chǎn)物提取mRNA。
(e)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)標(biāo)記mRNA，使mRNA變成標(biāo)記的cDNA。
(f)將標(biāo)記的cDNA與植物來源的對照cDNA混合，與哺乳動物基因探針的微陣列進行雜交。
(g)通過分析微陣列雜交結(jié)果的數(shù)字化圖象來測量基因的表達水平。
(h)進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，選出用于統(tǒng)計學(xué)分析的數(shù)據(jù)。
(i)獲得利用不同濃度的草藥組合物的微陣列實驗產(chǎn)生的表達數(shù)據(jù)。
(j)對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，選出在用不同濃度的草藥處理的細胞中具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的基因。
(k)利用統(tǒng)計學(xué)方法諸如自組織圖型算法將表達圖形分到各聚簇中。
(l)在表達圖形聚簇的基礎(chǔ)上推斷草藥的特征表達圖形。
圖8是一個流程圖，顯示了不同批次的草藥組合物的表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集怎樣綜合后制作特定草藥組合物的表達圖形數(shù)據(jù)庫。然后使表達圖形數(shù)據(jù)庫成為HBR陣列的一部分。
含有表達圖形的HBR陣列還可用于鑒別未知的草藥組合物。圖9是一個流程圖，描述了用于鑒別未知草藥組合物的通用方法，該方法包括以下步驟(a)通過上述步驟構(gòu)建含有草藥的特征表達圖形或各種草藥的表達圖形的集合的HBR陣列。
(b)得到未知草藥組合物的特征表達圖形數(shù)據(jù)集。
(c)對比含有用所述未知草藥組合物產(chǎn)生的特征表達圖形的HBR陣列與含有用諸如Hamming間距算法等算法得到的表達數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
(d)對可能的對準(zhǔn)計分以鑒別出其特征表達圖形在所述HBR陣列中已存檔的最可能的草藥組合物。
對含有表達圖形的HBR陣列的可能的對準(zhǔn)計分這一步驟可以用Hamming距離矩陣的分級簇分析進行。Hamming距離矩陣的分級簇分析的使用是本領(lǐng)域中眾所周知的。
基因表達圖形也可加入到標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中。正如已討論過的那樣，含有由草藥組合物產(chǎn)生的這種基因表達圖形的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列可以用于研究草藥組合物的藥理學(xué)機理、用于發(fā)現(xiàn)草藥組合物的新應(yīng)用和用于設(shè)計復(fù)方草藥制劑的優(yōu)化配方。從圖10的流程圖可以看出，該方法一般可包括以下步驟(a)構(gòu)建含有草藥組合物的特征基因表達圖形的數(shù)據(jù)集。
(b)使用已知的統(tǒng)計學(xué)參數(shù)諸如變異系數(shù)，利用基因在數(shù)據(jù)集中的表達圖形的一致性對各個基因打分。
(c)在統(tǒng)計學(xué)計分的基礎(chǔ)上，對草藥的基因表達圖形進行選擇并加入到標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中。
含有基因表達圖形的HBR陣列還可用于鑒別由復(fù)合化學(xué)成分組成的草藥組合物中單個化學(xué)成分導(dǎo)致的標(biāo)記基因表達圖形，如圖11的流程圖所示。該方法包含以下步驟(a)通過上述步驟構(gòu)建含有草藥組合物的特征基因表達圖形的HBR陣列。
(b)利用高效液相色譜(HPLC)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MASS)確定草藥中化學(xué)成分的組成。
(c)對不同批次的草藥制劑重復(fù)步驟(b)。
(d)對各個基因的表達水平與草藥制劑中單個化學(xué)成分的量之間的相關(guān)系數(shù)打分。
(e)用超過0.99或小于-0.99的Pearson相關(guān)系數(shù)選擇單個化學(xué)成分的標(biāo)記基因表達圖形。
使用核酸微陣列產(chǎn)生基因表達圖形，任何草藥組合物然后可通過使用該基因表達圖形加以表征。另外，我們可以選擇不同表達的任何數(shù)量的基因包括在描繪基因表達圖形的數(shù)據(jù)集中。例如，可以選擇約10個基因、約100個基因、約500個基因、約1000個基因、約1500個基因、約2000個基因、約2500個基因或更多，或這之間的任何數(shù)目。
中藥黃芩和甘草組合的配方(黃芩湯)可止瀉、解痙和清熱。黃芩湯的組分是黃芩、芍藥、甘草和大棗。這個方子已用了1000多年，但對它的化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究直到最近幾十年才開始。在該研究中，我們使用核酸微陣列技術(shù)來研究草藥處理過的細胞的基因表達圖形。我們的目標(biāo)是證明使用微陣列/CD系統(tǒng)對不同草藥組合物或不同制劑分類的可行性，和找到黃芩湯處方的預(yù)示基因(標(biāo)志基因)。長期目標(biāo)是找到各草藥組合物中的生化成分與不同處理過的細胞的基因表達圖形的關(guān)系，和以合理的方式解釋中藥的分子藥理學(xué)機理。
材料與方法1.細胞庫系統(tǒng)的開發(fā)目的微陣列系統(tǒng)是一種靈敏的檢測方法，可監(jiān)測細胞的基因表達型。有必要建立一個具有主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)的細胞庫系統(tǒng)，以將草藥測試中的細胞變異性減至最小。
范圍該細胞庫系統(tǒng)可用于微陣列研究中的所有類型的細胞。
儀器CO2氣體夾套恒溫箱(NUAIRETMDH autoflow)離心機(KUBOTA 2100)冰凍瓶(Corning Costar，Cat.#430659)組織培養(yǎng)燒瓶750ml(Falcon，Cat.#3045)組織培養(yǎng)皿150×25mm(Falcon，Cat.#3025)細胞Jurkat T細胞，購自Dr.Alexandra Ho試劑RPMI培養(yǎng)基1640(GIBCO BRL，Cat.#31800-014)二甲亞砜(DMSO)(Sigma，Cat.#D-2650)胎牛血清(HyClone，Cat.#SH30070.03，Lot#AGL7258)2-巰基乙醇(GIBCO BRL，Cat.#21985-023，5×10-2M)培養(yǎng)基I.培養(yǎng)用培養(yǎng)基90％ RPMI+10％肽牛血清+2-巰基乙醇(5×10-5M)II.冷凍培養(yǎng)基90％ RPMI 1640+10％ DMSO步驟A.主細胞庫1.進行標(biāo)準(zhǔn)無菌細胞培養(yǎng)操作。
2.將Jurkat T細胞種植在37℃、5％ CO2恒溫箱中的燒瓶中的培養(yǎng)基中。
3.培養(yǎng)2天后，對細胞計數(shù)并將細胞展開到兩個燒瓶中。注意細胞密度保持約5×104-2×106/ml。
4.細胞培養(yǎng)并計數(shù)，直到細胞數(shù)達到2×107。
5.將細胞收集到50ml離心管中并以1300rpm(300×g)旋轉(zhuǎn)5分鐘。
6.棄去上清液，細胞顆粒再懸浮于冷凍培養(yǎng)基。每瓶中的細胞數(shù)約為1×106/ml。
7.按照以下溫度變化方式將細胞緩慢冷凍-20℃持續(xù)2小時，-80℃持續(xù)24小時，然后將細胞置于液氮貯運器中。MCB中儲存共20個冷凍瓶。
B.工作細胞庫1.從在液氮箱中的MCB中取出一瓶細胞并在37℃水浴中快速融解。
2.將細胞轉(zhuǎn)移到10ml溫培養(yǎng)基中。
3.細胞以1300rpm(300×g)旋轉(zhuǎn)5分鐘。棄去上清液。細胞在燒瓶中用20ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。
4.將細胞傳代培養(yǎng)到2個燒瓶中。
5.將在500ml培養(yǎng)基中的5×107個細胞種植到每個燒瓶中，同時攪拌，共2個燒瓶。細胞培養(yǎng)2天。
6.培養(yǎng)直到細胞密度達到1×106/ml，總體積為1L。
7.加入100ml胎牛血清和10ml DMSO制備冷凍培養(yǎng)基。
8.離心，棄去上清液，將細胞再懸浮于110ml冷凍培養(yǎng)基。
9.向每個冷凍瓶中分配1ml(1千萬個細胞/瓶)，共100瓶。按照上述溫度變化方式將細胞緩慢冷凍。
2.測定細胞培養(yǎng)物中草藥提取物的生長抑制濃度目的大多數(shù)藥物對細胞是有毒的。設(shè)計該實驗來檢驗草藥提取物在Jurkat T細胞中的毒性，并測定保持細胞存活的草藥提取物的生長抑制濃度。
范圍該測定可用于各種草藥提取物來檢驗毒性。
儀器CO2氣體夾套恒溫箱(NUAIRETMDH autoflow)計數(shù)室(Hemacytometer，Reichert，USA)顯微鏡(Zeiss，Axiovert 100)細胞Jurkat T細胞試劑RPMI培養(yǎng)基1640(GIBCO BRL，Cat.#31800-014)胎牛血清(HyClone，Cat.#SH30070.03，Lot #AGL7258)
2-巰基乙醇(GIBCO BRL，Cat.#21985-023，5×10-2M)培養(yǎng)基90％ RPMI+10％胎牛血清+2-巰基乙醇(5×10-5M)一次性無菌注射濾器(0.2μm，Corning，Cat.#21052-25)草藥提取物1.冬蟲夏草菌絲體2.ST 0243.ST 0444.ST 0515.ST 0936.ST 1177.ST 1238.ST 1289.ST 13410.ST 23711.PHY906-303503由4，6，7，10組成的復(fù)雜混合物12.PHY906-284003由4，6，7，10組成的復(fù)雜混合物步驟A.草藥提取物制劑1.將1克草藥粉末溶于聚丙烯試管中的10ml 80℃去離子水(中性pH)中。
2.試管在80℃水浴中培養(yǎng)30分鐘，同時輕微振搖，然后以4000rpm(1500×g)離心5分鐘，得到上清液。
3.以11000rpm(14000×g)離心10分鐘，收集上清液。
4.使用一次性無菌注射濾器過濾上清液。
B.細胞存活試驗t1.如上所述培養(yǎng)Jurkat T細胞。
2.以每孔1ml 5×105/ml細胞將細胞分配到24孔培養(yǎng)板中。
3.制備12種草藥提取溶液。這些提取溶液必須是新制備的且立即使用。
4.將100，50，20，10，5μl各草藥提取溶液加入到24孔培養(yǎng)板中，得到5種不同濃度10，5，2，1，0.5mg/ml。
5.細胞在充滿5％ CO2的恒溫箱中在37℃下培養(yǎng)24小時。
6.對每孔中的細胞計數(shù)。將10μl細胞溶液與10μl臺盼藍染料混合并裝載到細胞計數(shù)室中。
7.對四個主要正方面積計數(shù)，以計算細胞數(shù)。(4個面積中的細胞數(shù))/4×104×稀釋因子＝每ml中的細胞數(shù)3.描繪用草藥提取物處理的Jurkat T細胞的基因表達型目的描繪用草藥提取物處理的Jurkat T細胞的基因表達型。使用帶有比色檢測系統(tǒng)的高密度核酸微陣列。
儀器熱滑塊(Boekel，Model 110002)分光光度計(Beckman，DV640)離心機(KUBOTA 1910)水浴(SLM AMINCO，Model 800)雜交恒溫箱(YIH DER OH-800)熱封機(TISH-300，TEW)試劑RNAzolTMB(Tel-Test，Cat.#CS-104)Oligotex mRNA Midi試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)雜交袋(GIBCO BRL，Cat.#18278-010)EasiSeal(Hybaid，Cat.#HBOSSSEZ1E)玻璃載物片(Matsunami，S2214，Japan)氣溶膠抗性吸頭(ART吸頭)(分子BIO-Products，Cat.
#2139)無規(guī)則六聚體引物(GIBCO BRL，Cat.#48190-011)逆轉(zhuǎn)錄酶和5×緩沖液(GIBC0 BRL，Cat.#18064-014)核糖核酸酶抑制劑(GIBCO BRL，Cat.#10777-019)生物素-16-dUTP(Boehringer Mannheim，Cat.#1093070)Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim，Cat.#1558706，)用于雜交的封閉粉末(Boehringer Mannheim，Cat.
#1096176)牛血清白蛋白(Sigma，Cat.#A2153)20X SSC(Amresco，Cat.#0918S-2-20XPTM5L)SDS(Merck，Cat.#113760)硫酸葡聚糖(Sigma，Cat.#D6001)
鏈霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶(GIBCO BRL，Cat.
#19536-010)抗-地高辛配基-AP Fab片段(Boehringer Mannheim，Cat.#1093274，)X-gal(GIBCO BRL，Cat.#15520-018)馬來酸(Sigma，Cat.#M1125)N-月桂酰肌氨酸(Sigma，Cat.#L5777)堅牢紅TR/AS-MX底物試劑盒(PIERCE，Cat.#34034)聚乙二醇(Sigma，Cat.#P2139)試劑制備1×雜交緩沖液(4X SSC，0.1％ N-月桂酰肌氨酸，0.02％ SDS，1％BM封閉試劑)20×SSC 16m1％ N-月桂酰肌氨酸8ml10％ SDS 160μlBM封閉粉末0.8gH2O 51ml共計 80ml加熱至65℃使粉末溶解，然后儲存在-20℃下。
50％ PEG-8000(聚乙二醇)PEG-8000 10gH2O加至 20ml加熱至65℃使溶解，然后高壓滅菌。等分試樣并儲存在-20℃下。
10×TBS(100mM Tris，1.5M NaCl，pH7.4)Tris堿 12.1gNaCl 87.6gH2O 加至 1000ml
120mM X-galX-gal 100mgDMF2ml-20℃下儲存。
X-gal底物緩沖液(1mM MgCl2，3mM K3Fe(CN)6，3mM K4Fe(CN)6溶于1X TBS緩沖液中)500ml10X TBS/pH7.4 50ml亞鐵氰化鉀 633.5mg高鐵氰化鉀 493.9mgMgCl2101.6mg過濾并在-20℃下儲存。
BM封閉稀釋緩沖液/pH7.5(0.1M馬來酸，0.15M NaCl)1M馬來酸 100ml5M NaCl30ml固體NaOH 7.5gH2O 加至 1000ml10％封閉試劑 10ml封閉粉末 10g封閉稀釋緩沖液(沒有吐溫20) 100ml加熱至70℃后高壓滅菌。4℃下儲存。
20％硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖 2gH2O加至 8ml高壓滅菌后儲存在-20℃下。
DEPC-處理過的水800ml二碳酸二乙酯(4℃下儲存)400μlH2O 800ml
置于37℃搖動水浴中4小時，然后在37℃溫室中過夜。溶液高壓滅菌兩次，各45分鐘或25分鐘。
步驟A.Jurkat T細胞的制備1.融解1瓶Jurkat T細胞。轉(zhuǎn)移到10ml生長培養(yǎng)基中。融解的瓶數(shù)取決于要進行的試驗數(shù)。一般說來，2個草藥提取物試驗需要1瓶細胞。
2.將細胞再懸浮于50ml培養(yǎng)基中。
3.細胞培養(yǎng)1天。加入150ml培養(yǎng)基并分到兩個燒瓶中，每瓶100ml。
4.細胞培養(yǎng)3天。
5.更換培養(yǎng)基并分到4個燒瓶中，每瓶100ml培養(yǎng)基。
6.細胞培養(yǎng)2天。
7.對細胞計數(shù)。收集細胞并旋轉(zhuǎn)沉淀。將帶有培養(yǎng)基的細胞顆粒再懸浮至5×105細胞/ml，每瓶100ml。
8.細胞培養(yǎng)3小時，然后加入草藥提取物。
B.草藥提取物處理1.制備草藥提取物(參見草藥提取物的制備)。
2.按照利用細胞存活實驗確定的草藥提取物的生長抑制濃度，計算每個草藥提取物的50％生長抑制濃度。
3.定義50％生長抑制濃度為H。用以下濃度的草藥提取物的系列稀釋液處理細胞H，H/2.5，H/5，H/10，H/20。
4.細胞培養(yǎng)24小時。
5.收集細胞并對細胞計數(shù)。離心得到細胞顆粒。
6.細胞顆粒用1×PBS洗滌一次。
7.棄去上清液。細胞顆粒準(zhǔn)備用于總RNA分離。
C.總RNA的分離1.每107個細胞加入1ml RNAzolTMB。將細胞顆粒勻化但不渦旋。
2.每毫升勻漿加入0.1ml氯仿，緊緊地蓋住樣品，用力搖動1分鐘(不渦旋)。置于冰上15分鐘。
3.在4℃下以12000rpm(13500×g)離心15分鐘。
4.離心后，勻漿分成兩相下層是藍色苯酚-氯仿相，上層是無色水相。DNA和蛋白質(zhì)在中間相和有機相中。將水相轉(zhuǎn)移到新的試管中，加入等體積的異丙醇，該樣品在-80℃下儲存。注意。加入的異丙醇的范圍是0.7至1體積的水相溶液。
5.樣品保持在-80℃下直至使用。離心前使樣品完全融解，并通過反轉(zhuǎn)試管混合2-3次。樣品以13000rpm(15000×g)離心15分鐘。
6.除去上清液，RNA顆粒用1ml 75％乙醇洗滌1次。以13000rpm(15000×g)在4℃下離心3分鐘。
7.棄去上清液。顆粒在真空下干燥1分鐘。注意。不要讓RNA顆粒完全干燥。這將大大降低其溶解度。
8.通過移液管將RNA顆粒溶于50-100μl二碳酸二乙酯(DEPC)-處理過的水。注意。如果顆粒難以溶解，將這些顆粒在60℃下溫育10-15分鐘會有幫助。
9.用分光光度計測量260nm(A260)和280nm(A280)下的吸光度。濃度分析OD260×40ng/μl×稀釋因子＝總RNA(ng/μl)。
D.從總RNA分離聚腺苷酸+mRNA1.按照表17確定起始RNA的量以及緩沖液OBB和要加入到RNA溶液中的Oligotex懸浮溶液的適宜體積。
表17.用于Oligotex mRNA旋轉(zhuǎn)-柱方案的緩沖液量
以下步驟是基于使用500μg總RNA為例。
2.向總RNA樣品中加入500μl 2×結(jié)合緩沖液和30μl Oligotex懸液。通過翻轉(zhuǎn)試管使內(nèi)容物充分混合。
3.樣品在70℃下培養(yǎng)10分鐘。
4.室溫下培養(yǎng)20分鐘。
5.以最大速度(14000-18000×g)離心2分鐘并吸出上清液。
6.將顆粒再懸浮于400μl洗滌緩沖液OW2并轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)柱上，該旋轉(zhuǎn)柱離心1分鐘。
7.用400μl OW2洗滌并如上所述離心。
8.將20μl預(yù)熱(70℃)的洗脫緩沖液加到柱上并將樹脂再懸浮。蓋上微量離心管。
9.帶有1.5ml微量離心管的旋轉(zhuǎn)柱在70℃下放置3分鐘。
10.柱子在室溫下以最大速度離心2分鐘。
11.再次洗脫。(重復(fù)步驟8-10以獲得更好的收率)E. cDNA標(biāo)記1. 將2μg mRNA、1μl用于單色標(biāo)記的對照植物mRNA(Hat221×109，Rbcl5×108，Ga41×108，Rca5×107，Asal1×107，Atps5×106個分子/μl)、6μl 50mM無規(guī)則六聚體和DEPC-H2O混合至28.88μl終體積。對于雙色模式，在生物素或Dig標(biāo)記中各自使用2μg mRNA并單獨加入對照植物mRNA1.生物素標(biāo)記Hat221×108，Rbcl5×107，Ga42×107，Rca1×107，Asal1×107，Atps1×107，Hat41×107/μl。2.Dig標(biāo)記Hat221×107，Rbcl1×107，Ga41×107，Rca1×107，Asal1×108，Atps5×107，Hat42×107/μl。
2. 70℃下改性10分鐘，然后在冰中快速冷凍5分鐘。
3. 加入10μl 5×第一鏈緩沖液、5μl 0.1M DTT、1μl 25mMdATP、dCTP、dGTP混合物、1μl 2mM dTTP、2μl 1mM生物素-16-dUTP、或Dig-11-dUTP(1mM)、0.63μl 40U/μl RNAsin和1.5μl Superscript II(逆轉(zhuǎn)錄酶，GIBCO BRL)(200U/μl)。
4. 充分混合并在25℃下培養(yǎng)10分鐘，然后在42℃下培養(yǎng)90分鐘。
5. 94℃下停止反應(yīng)5分鐘。
6. 50℃下加入5.5μl 3M NaOH持續(xù)30分鐘。
7. 50℃下加入5.5μl 3M CH3COOH保持30分鐘。
8. 通過加入34μl水、50μl 7.5M醋酸銨、10μg線性聚丙烯酰胺載體和380μl無水乙醇使標(biāo)記的cDNA沉淀。
9. 樣品在-80℃下培養(yǎng)30分鐘。以13000rpm離心15分鐘。
10. 顆粒用1ml 70％乙醇洗滌并以13000rpm離心5分鐘。
11. 將顆粒溶于36μl高壓滅菌過的水中。對于雙色，將兩種標(biāo)記的cDNA結(jié)合在一起。
F.陣列雜交1. 帶有9600 EST PCR產(chǎn)物的濾膜在5ml 1×雜交緩沖液(4XSSC，0.1％ N-月桂酰肌氨酸，0.02％ SDS，1％ BM封閉試劑(Boehringer Mannheim))和50μg/ml鮭精DNA(GIBCO BRL)中在63℃下預(yù)雜交1.5小時。注意?？梢灾苽?0ml 1×雜交緩沖液并將其儲存在-20℃下。使用前在60℃下將緩沖液融解。
2. 將粘著的EasiSeal_方塊的一面粘在干凈的玻片上，并將預(yù)雜交的膜置于該方塊的中心，斑點朝上。
3. 將探針與2μl聚-d(A)10(10μg/μl)和2μl人Cot-1 DNA(10μg/μl)(GIBCO BRL)和40μl 2×雜交緩沖液混合至終體積80μl。
4. 探針混合物在95℃下變性5分鐘，然后在冰上冷卻。
5. 濾膜在雜交袋中用探針溶液封閉。
6. 在95℃下培養(yǎng)5分鐘，然后在63℃下培養(yǎng)12-16小時(過夜)。
7. 濾膜在室溫下用5ml 2×SSC，0.1％ SDS洗滌2次，持續(xù)5分鐘。
8. 63℃下用5ml 0.1×SSC，0.1％ SDS洗滌三次，每次15分鐘。
9. 濾膜在室溫下用含有2％硫酸葡聚糖的5ml 1％BM封閉試劑封閉1小時。
10. 用5ml含有700×稀釋鏈霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶(1.38U/ml，酶活性)(GIBCO BRL)、10000×稀釋抗-地高辛配基-堿性磷酸酶(0.075U/ml，酶活性)(Boehringer Mannheim)、4％聚乙二醇8000(Sigma)和在1×TBS緩沖液中的0.3％ BSA的混合物在室溫下培養(yǎng)2小時。注意。該配方是用于雙色模式。對于單色模式，不需要抗-Dig-AP，且培養(yǎng)時間可減至1小時。
11. 用1×TBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。
12. 通過將50μl 120mM X-Gal和5ml X-Gal底物緩沖液混合來制備新鮮的X-gal底物溶液(1.2mM X-gal，1mM MgCl2，3mMK3Fe(CN)6，3mM K4Fe(CN)6在1×TBS緩沖液中)。將濾膜在37℃下浸入X-gal底物溶液中45分鐘，同時輕微搖動。
13. 用1×TBS洗滌。
14. 雙色顯色膜用5ml堅牢紅TR/萘酚AS-MX底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫下著色30分鐘，同時輕微搖動。
15. 用去離子水洗滌。用含有20mM EDTA的1×PBS終止反應(yīng)20分鐘。
16. 將濾膜空氣干燥。
結(jié)果1.測定細胞培養(yǎng)物中的草藥提取物的生長抑制濃度。
每種草藥提取物具有不同的細胞毒性，因此需要在用每種草藥處理細胞之前先測定它的生長抑制濃度。將草藥提取物的5個系列稀釋液(10，5，2，1，0.5mg/ml)加入到5×105/ml培養(yǎng)細胞中，并在37℃、5％ CO2下在恒溫箱中培養(yǎng)24小時。表18中顯示了不同濃度的草藥提取物下存活細胞的數(shù)目。
表18.不同濃度的草藥提取物下的存活細胞數(shù)
注意起始細胞數(shù)是5×105/ml。培養(yǎng)24小時后數(shù)量增加至10×105/ml。“-”指示所有細胞死亡。
沒有加入草藥提取物時的細胞數(shù)在培養(yǎng)24小時后加倍。另一方面，用不同的草藥處理，存活的細胞數(shù)也不同。我們選擇50％生長抑制濃度(IC50)作為高濃度，其十分之一作為低濃度。為了保持JurkatT細胞系的一致性，建立細胞庫系統(tǒng)。在細胞庫中，共將100瓶細胞(1千萬個細胞/瓶)冷凍在-150°冷凍庫中。
2.通過核酸微陣列分析對草藥進行分子分類對3種單一組分草藥的分析。將三種單一組分草藥冬蟲夏草(CSM)、ST024和ST117用于如方法部分中所述處理細胞培養(yǎng)物?；虮磉_測量通過使用各自呈現(xiàn)不同人轉(zhuǎn)錄物的13824個cDNA片段的微陣列進行。至于數(shù)據(jù)分析，選擇高數(shù)據(jù)質(zhì)量的基因斑點。選擇是在信號與背景的比值大于2.5或斑點面積的變異系數(shù)(CV)小于10％的基礎(chǔ)上進行。所有數(shù)據(jù)集用沒有接受草藥處理的對照細胞規(guī)格化。對于那些小于10的斑點強度都四舍五入到最多為10。在選擇標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，共選擇了492個具有大于1.5的差別表達率的基因用于簇分析。這些數(shù)據(jù)的預(yù)處理操作利用內(nèi)部開發(fā)的程序“DataExtract”和“Ratio2”進行。
這492個基因利用平均連接法進行簇分析?；蜷g的距離用作線性相關(guān)系數(shù)或相似系數(shù)。簇分析程序Cluster和TreeView是基于分級聚簇法，是由斯坦福大學(xué)的Dr.Michael Eisen編寫的(Eisen，1999，Eisen等，1998)。結(jié)果顯示在圖12中。從圖12C可以清楚地看出高和低濃度的三種不同草藥各自聚集在一起。例如，在聚簇樹中CSM-L更接近CSM-H而與ST024或ST117不怎么類似。基于非分級法的另一種不同的簇算法-自組織圖型算法得到的結(jié)果相同(數(shù)據(jù)未顯示)。從圖12A和13A中顯示的聚簇結(jié)果來看，有些特征是顯著的。(1)4個基因被ST117處理上調(diào)，但卻被其他草藥處理下調(diào)(圖12B)。(2)34個基因被CSM處理下調(diào)，但卻被其他草藥處理上調(diào)(圖13B)。(3)2個基因被所有三種草藥處理上調(diào)，一個是蘋果酸酶2，另一個是無名基因(克隆ID328351)(圖13C)。(4)12個基因大大受到所有三種草藥的高濃度處理的誘導(dǎo)，但幾乎未受低濃度處理的誘導(dǎo)(圖13D)。
對2種多組分草藥制劑的分析。將各自有低濃度和高濃度的兩批黃芩湯PHY906-303503(#11)和PHY906-284003(#12)用于三個獨立的實驗中來處理細胞培養(yǎng)物。用9600個非豐余cDNA的微陣列獲得基因表達圖形。如上所述完成了數(shù)據(jù)的預(yù)處理步驟后，選出了約5000個基因用于隨后的數(shù)據(jù)分析。每種草藥處理重復(fù)3次。對于數(shù)據(jù)分析，我們使用在Slonim等報道的一種方法(Slonim，1999)上的改進方法。以下算法就是設(shè)計用來尋找在三次重復(fù)實驗中具有高的差別表達率但偏差小的候選標(biāo)志基因。我們指定P(i)值來說明具有上述特征的基因i。
P(i)＝(∑(μm-μc)2)/(σc+∑σm)的平方根μ草藥處理的細胞(μm)或未經(jīng)處理的對照細胞(μc)在三次重復(fù)實驗中的平均表達水平。
σ草藥處理的細胞(σm)或未經(jīng)處理的對照細胞(σc)在三次重復(fù)實驗中的表達水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
我們計算了每種基因的P(i)值并選出500個得分最高的基因作為用于簇分析的候選基因(圖14)。每個基因的值都是三次重復(fù)實驗的平均值。如圖14B中所示，兩個不同濃度的#12聚集在一起(12-H和12-L)。較高濃度的#11制劑比較低濃度的#11制劑更接近#12制劑聚簇。但是，與圖12中顯示的樹相比，所有這些聚簇都有類似的相似系數(shù)(聚簇間的距離)。這些結(jié)果提示#11和#12黃芩湯制劑的基因表達圖形是類似的。這兩種制劑是基于相同的草藥混合物，因此結(jié)果是合乎情理的。
在圖14A和圖15所示的表達圖形中有一些特征是顯著的。圖15A中顯示了平均基因表達水平。方框1中包括在#11-L處理的細胞中被下調(diào)但在其他細胞中被上調(diào)的基因，這些基因包括2個tRNA合成酶(異亮氨酸和甲硫氨酸(methion))、RNA聚合酶II多肽B(克隆ID42020)、KIAA0212基因(克隆ID 310497，含有ATP/GTP-結(jié)合位點基元A)和KIAA0577(克隆ID 29263，ATP-依賴性RNA解旋酶)。我們感興趣地注意到6個基因中有3個涉及RNA復(fù)制。方框2中包括被所有的草藥處理上調(diào)的基因。方框3中包括對#11-L處理顯示沒有應(yīng)答但被其他物質(zhì)下調(diào)的基因。方框4中包括被低濃度的草藥處理大大抑制但在高濃度的草藥處理下只顯示輕微抑制的基因。最后，在方框1和方框3中，#11處理細胞的表達圖形不同于用其他3種處理產(chǎn)生的圖形。該結(jié)果與圖14B中顯示的一致。
將3種單組分草藥和2種多組分草藥制劑的基因表達圖形的數(shù)據(jù)集結(jié)合在一起，根據(jù)顯示有數(shù)個特征是顯著的。KIAA0212基因(克隆ID 310497，含有ATP/GTP-結(jié)合位點基元A)受到所有高濃度草藥處理的高度誘導(dǎo)，只除了受到#11-L和CSM處理的中度誘導(dǎo)。有兩個基因，無名基因(克隆ID 510908)和蛋白酶體鏈7前體(克隆ID70088)，被所有的處理高度上調(diào)，但被CSM處理下調(diào)。
接下來我們的關(guān)鍵是對5種不同類型的草藥處理的基因表達圖形進行簇分析。數(shù)據(jù)的預(yù)處理步驟如上所述進行，并選擇了500個基因用于簇分析。分級聚簇利用上述程序“Cluster”進行。從聚簇間的距離范圍最大處將分級樹切開(Romesburg，1989)，結(jié)果顯示在圖16A中。三種單一組分草藥CSM、ST024和ST117聚集在一起。2批不同的多組分草藥中，#12-H、#12-L和#11H聚集在一起，而#11-L獨立。結(jié)果提示與CSM、ST024和ST117之間的類似性相比，#11和#12之間存在更高的類似性。為了更好地將不同草藥分類，將所有數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)化，使不同數(shù)據(jù)集中每種基因的表達水平具有零-均值和單位-變異，由此改進數(shù)據(jù)分析算法(Tavazoie等，1999；Chen等，1999)。這得到了轉(zhuǎn)換變量χi＝(xI-μx)/σxμx數(shù)據(jù)集中的平均表達水平σx數(shù)據(jù)集中表達水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差xi未轉(zhuǎn)換的基因表達水平χi已轉(zhuǎn)換的基因表達水平將數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)化后，如圖16B中所示，#11和#12聚集在一起。ST024和ST117聚集在一起，而CSM在一個獨立的聚簇中。另外，聚簇還提示CSM與#11和#12的類似性大于與ST024和ST117的類似性。用相同的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集進行另一種簇算法-自組織圖型算法，得到了與分級簇算法相同的結(jié)果。(圖16C)。
用于區(qū)別#11和#12草藥處理表達圖形的類別預(yù)示變量。對#11和#12的上述簇分析顯示它們是類似的，用含有500個最高P(i)值的基因的數(shù)據(jù)集進行的分級聚簇或自組織圖型方法難以作進一步的分類。于是我們對算法作了改進，選出#11和#12草藥處理細胞之間的表達率差別較大、但在這兩種草藥處理細胞中具有較小的變異的基因。定義T(i)值來對這種特征計分，如下所示T(i)＝log(μ11)-log(μ12)/(σ11+σ12)μ#11處理細胞(μ11)或#12處理細胞(μ12)在三次實驗中的平均表達率σ#11處理細胞(σ11)或#12處理細胞(σ11)的表達率的標(biāo)準(zhǔn)偏差我們計算了每種基因的T(i)值，并選出50個具有最高得分的基因作為類別預(yù)示變量(圖17)。18個基因受#11處理而上調(diào)，但受#12處理卻下調(diào)。其余基因受#12處理而上調(diào)，但受#11處理而下調(diào)。于是我們使用這些類別預(yù)示變量在Golub等，1999所述的改進方法的基礎(chǔ)上對這兩種測試草藥制劑進行分類。
不同的兩批黃芩湯制劑PHY010401(#16)和PHY010402(#17)從Sun Ten制藥公司獲得，并用于類別預(yù)測試驗。#16和#17制劑的基因表達圖形用未經(jīng)處理的對照細胞的表達圖形規(guī)格化并用類別預(yù)示變量標(biāo)準(zhǔn)化。每個預(yù)示變量gi根據(jù)其表達水平xi是否更接近#11或#12而贊成#11或#12草藥制劑。贊成每種基因由vi＝|xI-(μm+μc)/2|給出，其中μ#11(μ11)或#12草藥處理細胞(μ12)在三次重復(fù)實驗中的平均表達率分別從與關(guān)于#11和#12的預(yù)示變量相關(guān)的預(yù)示變量基因收集平均得票數(shù)V11和V12。預(yù)測強度(PS)反映了勝利的界限，它定義為PS＝(V11-V12)/(V11+V12)。如果PS大于0，指示草藥制劑更類似于#11而與#12不太類似。從對#16和#17進行的分析得到的結(jié)果指示#16-H與#11(PS＝0.1)類似，而#16-L、#17-H和#17-L與#12類似(分別是PS＝-0.29、-0.21和-0.2)。在#16和#17制劑的信息的基礎(chǔ)上，該試驗未能準(zhǔn)確地鑒別出#16-L更類似于#11。
討論草藥處理細胞的特征基因表達圖形。從兩種草藥處理細胞中的不同表達的基因選擇預(yù)示變量基因。這些基因呈現(xiàn)了對草藥處理的細胞應(yīng)答。在該研究中，我們已在它們對不同草藥處理的應(yīng)答的基礎(chǔ)上鑒別了一些令人感興趣的基因(圖13、15和17)。這些基因在研究細胞響應(yīng)草藥刺激的信號路徑和在解釋草藥的分子藥理學(xué)機理方面是有價值的。
利用核酸微陣列分析對草藥分類。概括地說，我們提出了一種兩步分類方法。一開始進行的是在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集和簇算法基礎(chǔ)上的分類步驟，接著是用類別預(yù)示變量進行的最終分類步驟。所有步驟都可綜合在計算機程序中。在這些初步研究中，所有基因?qū)Ψ诸惗加邢嗤呢暙I。當(dāng)數(shù)據(jù)集足夠大時，可以從線性相關(guān)系數(shù)獲得每種基因(或預(yù)示變量)的重量(Golub等，1999，Chen等，1999)。
#11-L未能通過顯著關(guān)聯(lián)與#11-H聚集在一起。#11的類似制劑#16制劑產(chǎn)生了相同的結(jié)果。令人感興趣的是，我們發(fā)現(xiàn)無論使用的簇算法是什么，#11和#16制劑都沒有產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果。即使用獨立的實驗，結(jié)果仍然相同。失敗的原因?qū)⒂?11和#16制劑的詳細信息進行研究。
微陣列系統(tǒng)中的質(zhì)量控制和分析。所獲得的微陣列數(shù)據(jù)的質(zhì)量和統(tǒng)計學(xué)分析方法的選擇都是得到有意義的結(jié)果的重要因素。我們已認(rèn)識到陣列中的變異會引起基因表達水平的測量中的誤差。在該報告中的資料的基礎(chǔ)上，我們已發(fā)現(xiàn)對于每種草藥制劑，高濃度處理的表達圖形總是與其較低濃度的相應(yīng)物聚簇在一起(圖16B和16C)，我們可以用兩種不同的聚簇方法將ST117、ST024、CSM和黃芩湯分類。在過去的三個月里，陣列質(zhì)量已提高到小于7％ CV。我們還設(shè)定了用于評定在實驗室中建立的每批陣列的質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)方法。所有這些實驗結(jié)果和微陣列技術(shù)的改善都提示利用微陣列系統(tǒng)分類和表征中藥是可行的。
實施例15的參考文獻Bertucci-F；Bernard-K；Loriod-B；Chang-YC；Granjeaud-S；Birnbaum-D；Nguyen-C；Peck-K；Jordan-BR(1999)基于DNA陣列的表達測量和實施小樣品的尼龍微陣列中的靈敏度問題，人類分子遺傳學(xué)8(9)1715-1722。
Bittner-L，Trent-J，Meltzer-P(1999)間距和箭頭的數(shù)據(jù)分析與綜合。自然遺傳學(xué)22，213-215。
Brown-PO；Botstein-D(1999)利用DNA微陣列探查基因組的新世界。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，33-37。
Chen-JJ；Wu-R；Yang-PC；Huang-JY；Sher-YP；Han-MH；Kao-WC；Lee-PJ；Chiu-TF；Chang-F；Chu-YW；Wu-CW；Peck-K(1998)表達圖型和利用帶有比色法檢測的cDNA微陣列系統(tǒng)分離不同表達的基因?；蚪M學(xué)51313-24。
Chen-Y，Bittner-M，Dougherty-ER(1999)與微陣列數(shù)據(jù)分析和綜合有關(guān)的問題。Michael Bittner，Jeffrey Trent和PaulMeltzer對條款的補充信息(自然遺傳學(xué)22，213-215)。
Duggan-DJ；Bittner-M；Chen-Y；Meltzer-P Trent-JM(1999)使用cDNA微陣列描繪表達圖形。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，10-14。
Eisen-M(1999)聚簇和樹狀圖手冊(rana.stanford.edu/軟件)Eisen-M，Spellman-PT，Brown-PO，Botstein-D.(1998)簇分析和基因?qū)挾鹊谋磉_圖型的顯示。美國國家科學(xué)院院報9914863-14868Golub-TR，Slonim-DK，Tamayo-P，Huard-C，Gaasenbeek-M，Mesirov-JP，Coller-H，Loh-ML，Downing-JR，Caligiuri-MA，Bloomfield-CD和Lander-ES(1999)癌癥的分子分類利用基因表達監(jiān)控實現(xiàn)類別的發(fā)現(xiàn)和類別的預(yù)測。科學(xué)，10月15日531-537
Lander-ES(1999)希望的陣列。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，3-4.
Romesburg-HC(1989)研究人員的簇分析。第16章怎樣進行分類。203-216頁，Krieger Publishing Co.Malabar，F(xiàn)lorida，USASlonim-DK，Tamayo-P，Mesirov-JP，Golub-TR，Lander-ES(1999)使用基因表達數(shù)據(jù)實現(xiàn)類別的預(yù)測和發(fā)現(xiàn)。(www.genome.wi.mit.edu/MPR)Tavazole-S，Hughes-JD，Campbell-MJ，Cho-RJ，Church-GM.(1999)遺傳學(xué)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)測定。自然遺傳學(xué)22281-285實施例16.鑒別由草藥誘導(dǎo)的特征基因表達圖形如實施例15中所述，中藥黃芩和甘草組合的配方(黃芩湯)可止瀉、解痙和清熱。黃芩湯的組分是黃芩、芍藥、甘草和大棗。在該研究中，我們使用核酸微陣列技術(shù)來研究哺乳動物細胞中由草藥誘導(dǎo)的基因表達圖形。為了研究由黃芩湯誘導(dǎo)的特征表達圖形，Jurkat T細胞用5批黃芩湯處理(PHY01040；#16，PHY010402；#17，PHY03061；#18，PHY03062；#19和PHY02231；#20，從Sun Ten制藥公司購得)，采用5種濃度(IC50的1/2，1/2.5，1/5，1/10和1/20)。
采用帶有雙色檢測法的核酸微陣列來測量表達圖形。從草藥處理細胞提取的mRNA用地高辛配基標(biāo)記，而從未經(jīng)處理的細胞提取的mRNA用生物素標(biāo)記。采用9600個特征的陣列，并將Chen等描述的方法(基因組學(xué)51，313-324，1998)用于這些實驗。對于數(shù)據(jù)的預(yù)處理，只選擇高數(shù)據(jù)質(zhì)量的陣列斑點。選擇是基于信號與背景的比大于2.5和1.5X的差別表達率。利用這些標(biāo)準(zhǔn)，選出了1081個基因用于進一步的統(tǒng)計學(xué)分析。用非分級簇分析程序諸如在麻省理工學(xué)院開發(fā)的Genecluster程序(Tamayo等，1999)來將表達圖形分類。Genecluster程序是基于自組織圖型(SOM)原理。圖18A中顯示了表達圖形的6X4 SOM聚簇。圖18B中顯示了選定的聚簇的基因表達圖形的詳細情況。在這些聚簇中，聚簇3和20(標(biāo)記的c3和c20)被選出來，因為它們的基因表達水平在較高的草藥濃度下增加。類似地，聚簇5和9被選出來，因為它們的基因表達水平在較高的草藥濃度下降低。聚簇23收集了表達水平與在未經(jīng)處理的細胞中的相比被上調(diào)的基因，聚簇0收集了被下調(diào)的基因。這些表達圖形聚簇進一步集中成主要兩組，A和B。A組收集了被草藥處理上調(diào)的基因，而B組收集了被草藥處理下調(diào)的基因。A組和B組中的表達圖形構(gòu)成了草藥制劑的特征表達數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)。對于不同的5批黃芩湯重復(fù)相同的步驟，選出了952個基因來建立黃芩湯的特征表達圖形數(shù)據(jù)庫。
如圖19中所示，利用前述方法，可以將基因分為A組、B組或無(非A和非B)，且其表達圖形分別可由1、-1和0表示。A組中批次#1和批次#2之間的不同基因表達圖形數(shù)是3(基因6、7和8)，B組中是2(基因15和16)。利用同一原理，A和B組中批次#1和#3之間的不同表達圖形數(shù)是10，批次#2和批次#3之間是11。這些數(shù)指示批次#1和#2比批次#3更相似。用該原理將5批不同的草藥制劑分類。用以下算法來計算一對草藥制劑批次I和j之間的距離。
dij＝∑δ(Xi，Xj)(Hamming間距)i批制劑中的基因X被分配到A、B或“無”組若Xi<>Xj，δ(Xi，Xj)＝1若Xi＝Xj，δ(Xi，Xj)＝0.
我們計算了每對草藥制劑之間的所有dij值用于簇分析。分析程序KitschCluster是基于分級聚簇原理，由華盛頓大學(xué)的Dr.Joseph Felsenstein編寫(http//evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)。從Hamming間距表(圖20)，可以清楚地鑒別出最短的間距位于批次#17和批次#18之間，批次#17與#18類似。批次#16也與批次#17和#18類似，但批次#19與其余批次不同。結(jié)果得到了如下所述的HPLC分析的證實。
利用HPLC分析了5批草藥制劑的化學(xué)組成。選擇了色譜圖中的四個主峰(BG，B，Gly和Pf)用于統(tǒng)計學(xué)分析。在標(biāo)繪圖21中所示的6-坐標(biāo)雷達圖時包括另兩個參數(shù)BG+B和BG/B。每個坐標(biāo)上的距離是該特定化學(xué)成分在色譜圖中的綜合強度。總的來說，#16、#17和#18在它們的黃芩的成分含量(黃芩甙和黃芩甙元)方面是類似的，均在33.55-36.08之間；而在#19和#20中相同成分的量更高(分別是42.49和44.96)。#16、#17和#18的類似可以從圖21B中的一致性雷達圖中看出。
為了在如上所述建立的特征表達圖形數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上鑒別未知的草藥，Jurkat T細胞用5種濃度的試驗樣品#17處理，以建立試驗品的特征表達數(shù)據(jù)集。計算試驗品和特征表達數(shù)據(jù)庫中的每個數(shù)據(jù)集(#16，#17，#18，#19和#20)之間的Hamming間距，得分為#16502，#17405，#18402，#19699和#20531。這些數(shù)據(jù)顯示試驗品與#17最相似，具有最低的Hamming間距得分405。該實施例證明，本發(fā)明提出了一種在利用哺乳動物細胞中由草藥誘導(dǎo)的基因表達圖形的基礎(chǔ)上鑒別未知草藥的方法。未知草藥的鑒別可通過將特征表達圖形與HBR陣列中草藥的特征表達圖形集對準(zhǔn)來推斷。
在特征表達數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，可以推出草藥的標(biāo)志基因和標(biāo)記表達圖形，以用于研究其藥理學(xué)機理和用于優(yōu)化復(fù)方草藥制劑的配制。對于這種實例，從Sun Ten制藥公司購得5批不同的黃芩湯制劑(#16，#17，#18，#19和#20)，在上述方法的基礎(chǔ)上構(gòu)建特征表達圖形數(shù)據(jù)庫。對于每個基因，利用變異系數(shù)(CV值)對數(shù)據(jù)庫中的表達圖形的一致性打分CV＝σ/(∑μi/n)μi#I處理細胞的平均表達率n數(shù)據(jù)集的數(shù)目，在本例中n＝5σ#16，#17，#18，#19和#20的表達率的標(biāo)準(zhǔn)偏差由于CV反映數(shù)據(jù)的變異，因此草藥的標(biāo)志基因在CV得分的基礎(chǔ)上進行選擇。選出具有最小CV得分的頭50個基因。圖22顯示了黃芩湯的具有上調(diào)的標(biāo)記圖形的25個標(biāo)志基因，和具有下調(diào)的標(biāo)記圖形的25個標(biāo)志基因。
特征表達圖形數(shù)據(jù)庫可以用于推斷與草藥同樣復(fù)雜的混合物中的單個化學(xué)成分的表達圖形，只要化學(xué)成分的量能被半定量地確定。在這樣的例子中，草藥的化學(xué)組成利用高效液相色譜法測定。5批黃芩湯制劑中4種化學(xué)成分的綜合強度通過HPLC分析定量測定。每批草藥制劑的基因表達率通過取由5種濃度的草藥制劑誘導(dǎo)的表達率的中值來計算。成分與基因表達圖形之間的相互關(guān)系利用Pearson相關(guān)系數(shù)來定量?；騲和成分y的Pearson相關(guān)系數(shù)是R＝(1/n)∑(xi-μx)(yi-μy)/σxσy，i＝1-nn草藥制劑的數(shù)，本例中n＝5μx5批草藥制劑中基因x的平均表達率μy5批草藥制劑中成分y的平均綜合強度xi#I草藥制劑中基因x的基因表達率
yi#I草藥制劑中成分y的綜合強度σ5批草藥制劑的表達率(σx)或綜合強度(σy)的標(biāo)準(zhǔn)偏差對于每種成分，鑒定了表達水平與黃芩湯中的化學(xué)成分的量高度相關(guān)(|R|＞0.99)的若干基因。例如，基因(克隆ID67185)和甘草甜素之間的R值為0.998(圖23A)。另一方面，表達水平隨漢黃芩黃素(WG)的減少而增加的基因(克隆ID344720)具有-0.997的R值(圖23B)。除了上面兩個例子以外，191和170基因與單個成分高度相關(guān)，R值分別＞0.9和＜-0.9。例如，17和18基因分別與白花素(Af)正相關(guān)和負(fù)相關(guān)(圖24)。這個實施例教導(dǎo)了不將混合物分離而描繪其中的單個成分的基因表達的方法，從而對每個成分進行表達分析。
實施例16的參考文獻美國專利文件Stoughton-Roland和Friend-SH.USP# 5965352鑒別藥物作用路徑的方法Brown-PO和Shalon-TD USP#5807522建造生物樣品微陣列的方法Lockhart-DJ，Brown-EL，Wong-GG，Chee-MS和Gingeras-TR.USP#6040138利用與高密度寡核苷酸陣列的雜交進行表達監(jiān)控Ladunga-I.USP#5987390用于蛋白質(zhì)類別鑒定的方法和系統(tǒng)Mahant-S，Shivaling-S，Vivek-G.USP#5951711用于測定兩個多比特數(shù)字字之間的hamming間距的方法和設(shè)備外國專利文件Brown-PO和Shalon-TD EP#913485A1用于制造生物樣品微陣列的方法和裝置其他出版物Bertucci-F；Bernard-K；Loriod-B；Chang-YC；Granjeaud-S；Birnbaum-D；Nguyen-C；Peck-K；Jordan-BR(1999)基于DNA陣列的表達測量和實施小樣品的尼龍微陣列中的靈敏度問題，人類分子遺傳學(xué)8(9)1715-1722。
Bittner-L，Trent-J，Meltzer-P(1999)間距和箭頭的數(shù)據(jù)分析與綜合。自然遺傳學(xué)22，213-215。
Brown-PO；Botstein-D(1999)利用DNA微陣列探查基因組的新世界。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，33-37。
Chen-JJ；Wu-R；Yang-PC；Huang-JY；Sher-YP；Han-MH；Kao-WC；Lee-PJ；Chiu-TF；Chang-F；Chu-YW；Wu-CW；Peck-K(1998)表達圖型和利用帶有比色法檢測的cDNA微陣列系統(tǒng)分離不同表達的基因?；蚪M學(xué)51313-24。
Chen-Y，Bittner-M，Dougherty-ER(1999)與微陣列數(shù)據(jù)分析和綜合有關(guān)的問題。Michael Bittner，Jeffrey Trent和PaulMeltzer對條款的補充信息。自然遺傳學(xué)22，213-215。
Duggan-DJ；Bittner-M；Chen-Y；Meltzer-P Trent-JM(1999)使用cDNA微陣列描繪表達圖形。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，10-14。
Eisen-M(1999)聚簇和樹狀圖手冊(rana.stanford.edu/軟件)Eisen-M，Spellman-PT，Brown-PO，Botstein-D.(1998)簇分析和基因?qū)挾鹊谋磉_圖型的顯示。美國國家科學(xué)院院報9914863-14868Golub-TR，Slonim-DK，Tamayo-P，Huard-C，Gaasenbeek-M，Mesirov-JP，Coller-H，Loh-ML，Downing-JR，Caligiuri-MA，Bloomfield-CD和Lander-ES(1999)癌癥的分子分類利用基因表達監(jiān)控實現(xiàn)類別的發(fā)現(xiàn)和類別的預(yù)測。科學(xué)，10月15日531-537Lander-ES(1999)希望的陣列。自然遺傳學(xué)21(1)增刊，3-4.
Tamayo-P，Slonim-D，Merirov-J，Zhu-Q，Kitareewan-S，Dmitrovsky-E，Lander-ES和Golub-TR(1999)用自組織圖解釋基因表達的圖型方法和對造血差異的應(yīng)用。美國國家科學(xué)院院報992907-2912Romesburg-HC(1989)研究人員的簇分析。第16章怎樣進行分類。203-216頁，Krieger Publishing Co.Malabar，F(xiàn)lorida，USAScherf-U，Ross-DT，Waltham-M，Smith-LH，Lee-JK，Tanabe-L，Kohn-KW，Reinhold-WC，Myers-TG，Andrews-DT，Scudiero-DA，Eisen-MB，Sausville-EA，Pommier-Y，Botstein-D，Brown-PO，Weinstein-JN(2000)用于癌癥的分子藥理學(xué)的基因表達數(shù)據(jù)庫。自然遺傳學(xué)24236-44Slonim-DK，Tamayo-P，Mesirov-JP，Golub-TR，Lander-ES(1999)使用基因表達數(shù)據(jù)實現(xiàn)類別的預(yù)測和發(fā)現(xiàn)。(www.genome.wi.mit.edu/MPR)Tavazole-S，Hughes-JD，Campbell-MJ，Cho-RJ，Church-GM.(1999)遺傳學(xué)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)測定。自然遺傳學(xué)22281-285實施例17.草藥組合物的生物應(yīng)答和標(biāo)記基因的鑒定為了進一步研究黃芩湯誘導(dǎo)的表達圖形，Jurkat T細胞用5種濃度(IC50的1/20，1/10，1/5，1/2.5，和1)的黃芩湯處理(PHY906#2從臺灣Sun Ten制藥公司得到)。用帶有雙色檢測的核酸微陣列來測量表達圖形。從草藥處理細胞和未經(jīng)處理的細胞提取的mRNA分別用生物素-16-dUTP和Dig-11-dUTP標(biāo)記。對照組使用從未經(jīng)處理的細胞提取的mRNA和分別以等比例的生物素和地高辛配基標(biāo)記的mRNA建立。利用Chen等(1998)描述的方法，稍作修改后，對用不同濃度的草藥處理的5個樣品組和1個對照組進行研究。對于數(shù)據(jù)的預(yù)處理，只選擇高數(shù)據(jù)質(zhì)量的陣列斑點。選擇標(biāo)準(zhǔn)是信號與背景比大于2.5倍和差別表達率在1.5倍以上的斑點。利用這些標(biāo)準(zhǔn)，選出了1044個基因用于進一步的統(tǒng)計學(xué)分析。對照組的基因表達圖形只與位于超過2倍差異表達范圍的48個列為統(tǒng)計異常值的基因密切相關(guān)(圖25A)。對于樣品組，如圖25B中所示，許多不同表達的基因是明顯的。差別表達率大于2倍的基因數(shù)隨草藥處理的濃度增加，如圖25C中所示。這些結(jié)果證明所鑒定的不同表達的基因確實是由黃芩湯的處理導(dǎo)致的。
為了鑒別由PHY906特異性誘導(dǎo)的基因(PHY906的標(biāo)記基因)，利用Tamayo等1999開發(fā)的非分級簇分析程序“GeneCluster”將表達圖形分類。該計算機程序是基于自組織圖(SOM)原理，表達圖形的聚簇顯示在圖26中。X軸表示從低到高的草藥濃度，Y軸是基因表達率。從顯示對PHY906#2的劑量應(yīng)答的表達圖形中選出標(biāo)記基因。分別從聚簇3和4以及聚簇18和19中選出誘導(dǎo)和抑制的基因。為了鑒別PHY906的標(biāo)記基因，具有相同配方和制造方法的另一批黃芩湯PHY906#3進行如對PHY906#2所述的相同操作。這兩批中常見的誘導(dǎo)和抑制基因顯示在圖27中。
利用自組織圖(SOM)對生物應(yīng)答的類似性打分為了區(qū)分類似組成的草藥，開發(fā)了一種計分方法，得分S表示生物系統(tǒng)對兩種不同的草藥組合物的生物應(yīng)答的差異。
S＝∑PijWij，其中Pij均是由聚簇i和聚簇j中的草藥制劑A和草藥制劑B誘導(dǎo)的常見基因的數(shù)目。例如，對兩批PHY906的表達圖形的SOM簇分析結(jié)果顯示在圖28A中。在聚簇C13和C14中，17和25基因分別享有兩批PHY906的相同表達圖形。此外，表達圖形由PHY906#2誘導(dǎo)的10個基因聚集在C13中，但由PHY906#3誘導(dǎo)的聚集在C14中。因此，P1313＝17，P1414＝25和P1314＝10。稱量因子Wij描述了聚簇i和j之間的距離，以指示兩個表達圖形聚簇的類似性。在C13和C14的情況下，這10個基因?qū)HY906#2和PHY906#3有類似的應(yīng)答(圖28B)。稱量因子定義為Wij＝1-Eij/Max(Eij)，其中Eij是聚簇i和聚簇j之間的歐幾里距離，該值通過Eij/Max(Eij)規(guī)格化。當(dāng)i＝j(luò)時，Wij為1。當(dāng)聚簇i和聚簇j變得更不同時，該數(shù)值減小(圖28C)。
對5批草藥的分類為了測試如何很好地在將5批類似的草藥制劑分類時運用上述方法，Jurkat T細胞用5種濃度(IC50的1，1/2.5，1/5，1/10和1/20)的5批黃芩湯處理(PHY01040；#16，PHY010402；#17，PHY03061；#18，PHY03062；#19和PHY02231；#20，從Sun Ten制藥公司獲得)。在簇分析中計算每對草藥制劑之間的Sij分?jǐn)?shù)(圖29)。分析程序Kitsch Cluster是基于分級聚簇原理，由華盛頓大學(xué)的Dr.Joseph Felsenstein編寫(http//evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)。將S得分(距離)制表(圖29A)，從中可清楚地鑒別出最短的距離位于批次#17和#18之間，批次#17與#18類似。批次#16也與批次#17和#18類似，但批次#19與其余批次都不同。結(jié)果利用HPLC分析證實。
在表達圖形的基礎(chǔ)上表征未知草藥為了在如上所述建立的特征表達圖形數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上鑒別未知的草藥，Jurkat T細胞用5種濃度的試驗樣品#17處理，以建立試驗品的特征表達數(shù)據(jù)集。計算試驗品和特征表達數(shù)據(jù)庫中的每個數(shù)據(jù)集(#16，#17，#18，#19和#20)之間的S分?jǐn)?shù)，S得分是#160.78，#170.85，#180.84，#190.77和#200.79。這些數(shù)據(jù)顯示試驗品與#17最相似，具有較高的S得分0.84。該實施例證明，可以采用該方法在利用哺乳動物細胞中由草藥誘導(dǎo)的基因表達圖形的基礎(chǔ)上鑒別未知草藥。未知草藥的鑒別可通過將特征表達圖形與HBR陣列中草藥的特征表達圖形集對準(zhǔn)來推斷。
草藥的性能可以用四性五味來描述(見中藥學(xué)，顏正華主編，人民衛(wèi)生出版社，北京，中國，1997；本草綱目，李時珍，明朝，中國)。PHY906中的四種草藥各自可涉及具有類似性能的另一組草藥(參見表19)?；蛘呔哂蓄愃菩阅艿牟菟幙娠@示相似的生物應(yīng)答。HBR陣列可用于測定或測量草藥性能的關(guān)聯(lián)。這些信息可以用于創(chuàng)制新的草藥配方。
表19具有PHY906性能的草藥
性能四氣-寒、熱、溫、涼五味-辛、苦、甘、酸、淡實施例18.利用HBR陣列評估草藥如實施例16中所述，黃芩湯的藥物組成是黃芩、芍藥、甘草和大棗。表征了哺乳動物細胞中由5批黃芩湯誘導(dǎo)的基因表達圖形。黃芩湯的標(biāo)準(zhǔn)制劑可以用動物研究或臨床研究來定義和表征。例如，在質(zhì)量控制和由Sun Ten制藥公司建立的其他標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，將#17用作黃芩湯標(biāo)準(zhǔn)制劑。用#17的生物應(yīng)答來建立黃芩湯的HBR陣列。選擇HBR陣列中的標(biāo)志基因來評估其他黃芩湯組合物制劑。黃芩湯試驗品可含有相同的草藥組合物，但草藥組分可以是在不同的環(huán)境特征下生長的。對于試驗品與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列中的標(biāo)志基因的生物應(yīng)答，評估試驗品的生物活性。
另外，選出表達水平與黃芩湯中的草藥組分的劑量高度相關(guān)(|R|＞0.99)的標(biāo)志基因(如實施例16和圖25中所述)用于評估目的。黃芩湯試驗品可以通過對比選定的那組標(biāo)志基因的特定生物應(yīng)答或表達水平與HBR陣列來進行評估。如果選定的標(biāo)志基因的表達水平或生物應(yīng)答超過了可接受的變異區(qū)，就調(diào)節(jié)或修飾草藥組分的量或特性，以便滿足可接受的變異要求。重復(fù)該過程，直到由校正后的草藥組合物誘導(dǎo)的生物應(yīng)答通過與標(biāo)準(zhǔn)HBR陣列對比在可接受的變異范圍內(nèi)。
實施例19.預(yù)測草藥組合物的生物活性和治療應(yīng)用按照已鑒別出的PHY 906的標(biāo)志基因(圖27)，這些基因可用于預(yù)測草藥組合物的生物活性。例如，據(jù)報道下列加下劃線的PHY906的標(biāo)志基因涉及以下生物活性和治療作用。唯一有效的對抗ALL的藥物該能抑制因細胞凋亡增加而導(dǎo)致的天冬酰胺合成酶(Nandy等，1998)。長效藥物促生長素抑制素類似物因有腫瘤生長抑制作用而被用于治療神經(jīng)纖維瘤，因為它們可誘導(dǎo)由G6PD、轉(zhuǎn)酮醇酶、或二者的抑制介導(dǎo)的抗增殖作用(Boros等，1998)。Ephrin-A1是一種新的黑瘤生長因子，在黑瘤進展過程中高度表達(Easty等，1999)。促分裂原活化蛋白邀酶(MAPK)家族成員最近報道對細胞凋亡有相反作用(Dabrowski等，2000)。天冬酰胺合成酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、ephrin-A1和MAPK的表達受到較高濃度的PHY906處理的抑制。這些基因的下調(diào)牽涉到細胞凋亡。精氨基琥珀酸合成酶、組織蛋白酶G和趨化因子RANTES的表達在炎癥歷程中被高度誘導(dǎo)。通過用PHY906處理，與炎癥相關(guān)的基因被抑制了。這些文獻報道為預(yù)測草藥組合物的生物活性或治療作用提供了基礎(chǔ)。
實施例19的參考文獻Nandy-P；Periclou-AP；Avramis-VI(1998)在人白血病細胞系(CCRF/CEM/O和CCRF/CEM/ara-C/7A)中6-巰基嘌呤加上阿糖胞苷再加上PEG-天冬酰胺酶的協(xié)同是由細胞凋亡增加引起的。抗癌劑研究18727-737Boros-LG；Brandes-JL；Yusuf-FI；Cascante-M；Williams-RD；Schirmer-WJ(1998)促生長素抑制素對氧化和非氧化戊糖磷酸途徑的抑制可能的抗腫瘤作用機理。醫(yī)學(xué)假說50501-506Easty-DJ；Hill-SP；Hsu-MY；Fallowfield-ME；Florenes-VA；Herlyn-M；Benett-DC(1999)黑瘤進展過程中ephrin-A1的上調(diào)。國際癌雜志84494-501Dabrowski-A；Tribillo-I；Dabrowska MI；Wereszczynska-SU；Gabryelewicz-A(2000)促分裂原活化蛋白激酶在不同胰腺腺泡細胞損害模型中的活化。Z-Gastroenterol.38469-481給出上面詳細的描述只是為了使理解清楚，而沒有不必要的限制，從這些描述，進行一些修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
雖然本發(fā)明已結(jié)合具體實施方案進行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解它能作進一步的修飾，且按照總的本發(fā)明的原理，這種應(yīng)用打算覆蓋本發(fā)明的任何變種、使用或適應(yīng)性應(yīng)用，包括雖背離了本文的公開，但仍是本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域內(nèi)的已知或慣常實踐，并且可以用于上文中列出的和如下所述在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的本質(zhì)特征。
權(quán)利要求
1.一種建立草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)的方法，該方法包括d)選出特征化的草藥組合物；e)使生物系統(tǒng)與一批特征化的草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的iv)生成一個細胞庫系統(tǒng)；v)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；vi)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；f)將步驟b)的標(biāo)志數(shù)據(jù)儲存起來作為標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
2.權(quán)利要求1的方法，它進一步包括g)使用兩種或多種與在步驟b)中用的相同或不同的標(biāo)志對更多批次的草藥組合物重復(fù)步驟b)和c)；h)將在步驟c)和d)中得到的HBR陣列結(jié)合在一起；和i)分析步驟e)的合并后的HBR陣列，生成特征化草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中特征化草藥組合物具有至少一種已知的生物應(yīng)答。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中對于特征化草藥組合物已知下列一項或多項化學(xué)測試、所用的植物部分、該特征化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的生長條件、該特征化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的收獲前處理情況、該特征化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的收獲后處理情況、該特征化草藥組合物的收獲后處理情況、以及該草藥組合物中單個草藥的相對比例。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中細胞庫系統(tǒng)包括一個主細胞庫和一個工作細胞庫。
6.權(quán)利要求5的方法，其中工作細胞庫的細胞從主細胞庫得到。
7.權(quán)利要求5的方法，其中使用來自工作細胞庫的細胞對來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形加以描繪。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中基因表達的變化用核酸微陣列測定。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的基因在以下標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進行選擇在核酸微陣列中的信噪比約為2.5或更高，和差別表達率的變化約為1.5或更高。
10.權(quán)利要求8的方法，其中儲存有關(guān)表達水平發(fā)生了變化的約10至約20000個基因的數(shù)據(jù)作為HBR陣列的一部分。
11.權(quán)利要求10的方法，其中儲存有關(guān)表達水平發(fā)生了變化的約10至約1500個基因的數(shù)據(jù)作為HBR陣列的一部分。
12.一種評估草藥組合物的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；b)將收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一。
13.確定草藥組合物是否滿足標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；b)將收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一；和c)確定在可接受的水平內(nèi)具有與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列類似的標(biāo)志數(shù)據(jù)的草藥組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述確定在可接受的水平內(nèi)具有與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列類似的標(biāo)志數(shù)據(jù)的草藥組合物的步驟是定量或定性的測定。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列包括每種標(biāo)志的可接受的變異范圍。
16.調(diào)節(jié)草藥組合物的組分使其符合相同或基本相同的草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；b)將收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一，且其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列還包括每種標(biāo)志的可接受的變異范圍；c)確定該草藥組合物是否具有在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)的標(biāo)志數(shù)據(jù)；和d)如果標(biāo)志數(shù)據(jù)不在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)，則調(diào)節(jié)該草藥組合物的組分。
17.權(quán)利要求16的方法，其中重復(fù)步驟(a)-(d)，直到草藥組合物的標(biāo)志數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)。
18.改變草藥組合物的組分使其滿足另一種草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并收集關(guān)于兩種或多種標(biāo)志的數(shù)據(jù)，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；b)將收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列對比，比較另一種草藥組合物與批量草藥組合物，其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一，且其中標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列還包括每種標(biāo)志的可接受的變異范圍；c)確定該草藥組合物是否具有在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)的標(biāo)志數(shù)據(jù)；和d)如果標(biāo)志數(shù)據(jù)不在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)，則改變該草藥組合物的組分。
19.權(quán)利要求18的方法，其中重復(fù)步驟(a)-(d)，直到草藥組合物的標(biāo)志數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列的可接受的變異水平內(nèi)。
20.預(yù)測草藥組合物的生物活性的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并測量兩種或多種標(biāo)志的不同應(yīng)答，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；其中那組不同應(yīng)答的測量結(jié)果構(gòu)成草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)數(shù)據(jù)集；b)將批量草藥組合物的HBR陣列與特征化草藥組合物的至少一種先前得到的HBR陣列對比，其中先前得到的HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一；和c)在步驟b)中進行的HBR陣列比較的基礎(chǔ)上預(yù)測批量草藥組合物的生物活性。
21.測量草藥組合物與特征化草藥組合物的關(guān)聯(lián)性的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并測量兩種或多種標(biāo)志的不同應(yīng)答，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；其中那組不同應(yīng)答的測量結(jié)果構(gòu)成草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)數(shù)據(jù)集；b)將批量草藥組合物的HBR陣列與特征化草藥組合物的至少一種先前得到的HBR陣列對比，其中先前得到的HBR陣列含有關(guān)于基因表達的標(biāo)志數(shù)據(jù)之一；和c)在步驟b)中進行的HBR陣列比較的基礎(chǔ)上確定草藥組合物與特征化草藥組合物的關(guān)聯(lián)性。
22.預(yù)測草藥的新的治療應(yīng)用的方法，該方法包括a)使生物系統(tǒng)與一批草藥組合物接觸并測量兩種或多種標(biāo)志的不同應(yīng)答，其中標(biāo)志之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產(chǎn)生的i)生成一個細胞庫系統(tǒng)；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；其中那組不同應(yīng)答的測量結(jié)果構(gòu)成草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)數(shù)據(jù)集；b)在預(yù)測的HBR陣列中的標(biāo)志的生物活性的基礎(chǔ)上預(yù)測新的治療應(yīng)用。
23.確定由草藥組合物中的單個化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的基因表達圖形的方法，該方法包括a)生成一個細胞庫系統(tǒng)；b)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；c)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志并將它們放到HBR陣列中；d)比較在步驟(c)中生成的HBR陣列與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列，找出類似或改進的草藥組合物；e)確定草藥組合物的單個化學(xué)物質(zhì)的相對量；和f)比較單個化學(xué)物質(zhì)的量與步驟(b)的結(jié)果，以鑒別表達水平因草藥組合物中單個化學(xué)物質(zhì)的量改變而發(fā)生變化的那些基因。
24.不從復(fù)雜混合物諸如草藥組合物中提取化學(xué)物質(zhì)而確定由復(fù)雜混合物中的單個化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的基因表達圖形的方法，該方法包括a)生成一個細胞庫系統(tǒng)；b)描繪來自與草藥組合物接觸前后的細胞庫系統(tǒng)的細胞的基因表達圖形；c)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發(fā)生變化的那些基因作為標(biāo)志；d)比較所收集的標(biāo)志數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)化HBR陣列，找出基本相同或改進的草藥組合物；e)表征所述草藥組合物的化學(xué)成分；f)比較鑒別出的化學(xué)組成，以鑒定草藥組合物中單個化學(xué)成分的不同濃度；g)將不同的化學(xué)成分量與HBR陣列中的不同生物應(yīng)答聯(lián)系起來，以確定每種化學(xué)物質(zhì)的特征生物應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明提供了指導(dǎo)草藥組合物的標(biāo)準(zhǔn)化所必需的工具和方法,以確定草藥組合物的引起任何特定生物活性的具體組分,預(yù)測特定草藥組合物的生物活性,確定各草藥組合物的關(guān)聯(lián)性,以及開發(fā)改善的草藥療法。本發(fā)明提供了用于生成、保持、改善和利用草藥生物應(yīng)答陣列(HBR陣列)的工具和方法,其中HBR陣列構(gòu)成了與特定草藥組合物相聯(lián)的數(shù)據(jù)集。本發(fā)明的HBR陣列含有基因表達圖形,還可包括有關(guān)草藥構(gòu)成物的與植物相關(guān)的參數(shù)的信息、生物系統(tǒng)接觸草藥組合物后所收集到的標(biāo)志信息、以及生物系統(tǒng)接觸草藥組合物后所收集到的生物應(yīng)答信息。
文檔編號C12N15/09GK1386135SQ01802006
公開日2002年12月18日 申請日期2001年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月9日
發(fā)明者龔忠恕, 白果能, 李御賢, 佘玉萍, 鄭永齊 申請人:耶魯大學(xué)