專利名稱：轉(zhuǎn)化體和用其生成聚酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼合成共聚多酯的酶的基因，利用所述基因發(fā)酵合成聚酯的微生物，和以所述微生物輔助生成聚酯的方法。更具體說，本發(fā)明涉及在宿主微生物中起作用的基因；并涉及通過酶法合成的能在天然環(huán)境(土壤、河流或海洋)微生物的作用下降解的塑料樣聚合物，用所述基因通過轉(zhuǎn)化所述宿主微生物產(chǎn)生的具有改善的發(fā)酵合成塑料樣聚合物能力的轉(zhuǎn)化體，以及用所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)聚多酯的方法。
背景技術(shù)：
已知許多種類的微生物能集累聚酯作為細胞內(nèi)存儲能量的物質(zhì)。典型的例子為3-羥丁酸(本文以下簡稱為3HB)的均聚物，稱為聚-3-羥丁酸(本文以下簡稱為P(3HB))，這是1925年首先在巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)中發(fā)現(xiàn)的。由于P(3HB)是一種在天然環(huán)境中可生物降解的熱塑聚合物，作為有益于環(huán)境的塑料受到關(guān)注。但是由于它的高結(jié)晶度，P(3HB)非常堅硬和易脆使其迄今只能運用于極少的實際應用中，已進行了許多研究來克服它的缺陷。
作為這些研究的結(jié)果，日本公開出版物Sho-57-150393和日本公開出版物Sho-59-220192公開了生成3-羥丁酸(3HB)和3-羥戊酸(3HV)的共聚物(本文以后簡稱為P(3HB-co-3HV)的方法。與P(3HB)相比，此種P(3HB-co-3HV)相當柔韌最初預計可在更廣的使用范圍中得以應用。然而實際上，P(3HB-co-3HV)中3HV的摩爾成分數(shù)非常低，因此膜等材料所需的柔韌性沒能改進，從而其應用范圍限制于鋼性鑄膜(如洗發(fā)劑瓶)和丟棄型剃須刀手柄。
最近，對3HB和3-羥己酸(本文以下簡稱為3HH)的二元共聚物(本文以下將此共聚物簡稱為P(3HB-co-3HH)和其生產(chǎn)方法進行了研究。例如，日本公開出版物Hei-5-93049和日本公開出版物Hei-7-265065描述了這些研究。上述專利文獻描述了P(3HB-co-3HH)的產(chǎn)生方法，包括用從土壤分離出的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)自脂肪酸(如油酸)或油或脂肪(如橄欖油)發(fā)酵產(chǎn)生P(3HB-co-3HH)。還研究了P(3HB-co-3HH)的特性[Y.Doi，S.Kitamura，H.AbeMacromolecules 28，4822-4823(1995)]。在上述報道中，用12或更多碳原子的脂肪酸作為唯一的碳源來培育豚鼠氣單胞菌，以發(fā)酵產(chǎn)生P(3HB-co-3HH)(其中3HH的成分為11-19mol％)。此P(3HB-co-3HH)經(jīng)歷了從堅硬易脆到柔韌的逐漸轉(zhuǎn)化，伴有3HH的摩爾成分增加，且發(fā)現(xiàn)其柔韌性超過P(3HB-co-3HV)。然而，這種生產(chǎn)方法的產(chǎn)量低，細胞產(chǎn)量為4g/L，聚合物的含量為30％，因此探索了產(chǎn)量較高有商業(yè)利用價值的方法。
從能產(chǎn)生P(3HB-co-3HH)的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)菌株克隆了PHA(聚羥基鏈烷酸)-合成酶基因[T.Fukui，Y.Doi；J.Bacteriol，Vol.179，No.15，4821-4830(1997)，日本公開出版物Hei-10-108682]。當將該基因引入Ralstoniaeutropha(原先稱真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus))并用得到的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生P(3HB-co-3HH)時，細胞的產(chǎn)量為4g/L，聚合物的含量為30％。另外，用植物油作為碳源培育此轉(zhuǎn)化體，可以實現(xiàn)4g/L的細胞產(chǎn)量，聚合物的含量為80％[T.Fukui等人；Appl.Microbiol.Biotechnol.49，333(1998)]。還描述了用細菌如大腸桿菌或植物作為宿主生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)的方法(WO 00/43525)。但未公開過用這種生產(chǎn)方法達到的產(chǎn)量。
由于P(3HB-co-3HH)聚合物具有從堅硬聚合物到柔韌聚合物的廣泛可變特性(取決于3HH的摩爾成分)，預計其可廣泛地運用于需要硬度的電視機外殼等到需要柔韌性的紡線、薄膜等。但就這些生產(chǎn)方法而言，所述聚合物的產(chǎn)量仍然非常低，對此聚合物的實際生產(chǎn)方法而言沒有一種認為是完全滿意的。
最近，Leaf等人研究了用酵母(作為效率良好的生產(chǎn)性微生物)產(chǎn)生生物可降解的聚酯，認為其能產(chǎn)生乙酰CoA(3HB的前體)(Microbiology，Vol.142，第1169-1180頁(1996))。他們將Ralstonia eutropha聚酯合成酶基因引入釀酒酵母(一種酵母)中，以構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，并用葡萄糖作為碳源培育，從而證實了P(3HB)的累積(聚合物含量0.5％)。然而該研究產(chǎn)生的聚合物是P(3HB)，其堅硬易脆。
眾所周知，酵母生長快速(細胞產(chǎn)率高)。過去將酵母作為單細胞蛋白質(zhì)來關(guān)注，并研究用正-石蠟作為碳源將酵母細胞用作飼料，同時他們的核酸成分被用作調(diào)味劑。另外，由于認為酵母能高效地產(chǎn)生乙酰-CoA(該聚合物的前體)，預計聚合物的產(chǎn)量很高。另外，與細菌相比較易從培育肉湯分離得到酵母細胞，有可能簡化聚合物的提取和分離過程。因此，存在一種用酵母生產(chǎn)具有有益物理性能的P(3HB-co-3HH)方法的需求。
發(fā)明概述鑒于以上對本領(lǐng)域的描述可以看出，本發(fā)明的目的是提供一種聚酯合成相關(guān)的基因，其可在酵母中起作用并能以良好效率表達，一種用包含所述基因的基因表達盒轉(zhuǎn)化的酵母轉(zhuǎn)化體，和產(chǎn)生可生物降解并且具有優(yōu)良物理性能的聚酯如P(3HB-co-3HH)的方法，該方法包括培育得到的轉(zhuǎn)化體。
在許多調(diào)查研究后，本發(fā)明的發(fā)明者構(gòu)建了一種基因表達盒，方法是通過將一啟動子和一終止子(這兩者在酵母中都是起基本作用的)通過以下通式(1)的3-羥基鏈烷酸進行共聚化，連接于至少一種共聚多酯合成相關(guān)酶的基因，該基因表達會在酵母中實質(zhì)性表達，將所述的基因表達盒引入酵母中構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，并培育所述的轉(zhuǎn)化體，從而可以成功地從所得的培養(yǎng)物中收獲聚酯，它是以下通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚物。 式中，R代表烷基。
所以本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化體，其中已將含有聚酯合成相關(guān)酶基因的至少一種基因表達盒引入了酵母。
本發(fā)明還涉及用所述的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生聚酯的方法，所述的方法包括培育所述的轉(zhuǎn)化體并從得到的培養(yǎng)物中收獲該聚酯。
本文所用的術(shù)語“基本地”指聚酯合成相關(guān)基因的序列和構(gòu)建基因表達盒所需的其他基因序列如啟動子和終止子，這些核苷酸序列可以經(jīng)歷突變?nèi)缛笔?、取代?或插入，只要保留了該基因的功能和基因表達所需的功能。
另外，本發(fā)明還涉及聚酯合成相關(guān)酶的基因，該基因至少一個基因密碼CTG修飾成TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
現(xiàn)詳細描述本發(fā)明。
附圖簡述

圖1顯示了實施例2(a)中用作載體的質(zhì)粒pSUT5的模式圖。
圖2顯示了實施例2(b)中用作載體的質(zhì)粒pUTA1的模式圖。
圖3顯示了實施例2(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒pSUT-phaJ的模式圖。
圖4顯示了實施例2(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒pSUT-PHA1的模式圖。
圖5顯示了實施例2(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒pSUT-PHA2的模式圖。
圖6顯示了實施例2(b)中構(gòu)建的質(zhì)粒pUAL1的模式圖。
圖7顯示了實施例2(b)中構(gòu)建的質(zhì)粒pUAL-ORF2的模式圖。
圖8顯示了實施例2(b)中構(gòu)建的質(zhì)粒pUAL-ORF3的模式圖。
圖9顯示了實施例2(b)中構(gòu)建的質(zhì)粒pUTA-ORF23的模式圖。
圖10是質(zhì)粒構(gòu)建流程圖，顯示了實施例2(a)中構(gòu)建質(zhì)粒的流程。
圖11是質(zhì)粒構(gòu)建流程圖，顯示了實施例2(b)中構(gòu)建質(zhì)粒的流程。
圖12顯示了用毛細管氣相色譜分析實施例3制備的聚酯的結(jié)果。
圖13是實施例3制備的聚酯的NMR分析圖。
圖14是實施例3制備的聚酯的IR分析圖。
圖15是實施例4制備的聚酯的NMR分析圖。
實施本發(fā)明的最佳模式(1)宿主所用的酵母并無特別限制，但可以是以下菌屬且保存于任一權(quán)威性培養(yǎng)物保藏中心(如IFO、ATCC等)的酵母Aciculoconidium、Ambrosiozyma、Arthroascus、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、酒香酵母(Brettanomyces)、布勒擲孢酵母(Bullera)、Bulleromyces、假絲酵母(Candida)、固囊酵母(Citeromyces)、Clavispora、隱球酵母(Cryptococcus)、Cystofilobasidium、德巴利酵母(Debaryomyces)、德克酵母(Dekkara)、Dipodascopsis、雙足囊菌(Dipodascus)、Eeniella、Endomycopsella、單囊菌(Eremascus)、假囊酵母(Eremothecium)、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、地霉(Geotrichum)、小季酵母(Guilliermondella)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、漢遜酵母(Hansenula)、Hasegawaea、亞側(cè)耳(Holtermannia)、Hormoascus、Hyphopichia、Issatchenkia、克勒克(Kloeckera)、克孢酵母(Kloeckeraspora)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、白冬孢酵母(Leucosporidium)、油脂酵母(Lipomyces)、洛德酵母(Lodderomyces)、鱗斑霉(Malassezia)、梅奇酵母(Metschnikowia)、Mrakia、Myxozyma、拿遜酵母(Nadsonia)、Nakazawaea、針孢酵母(Nematospora)、Ogataea、卵孢酵母(Oospordium)、管囊酵母(Pachysolen)、Phachytichospora、Phaffia、畢赤酵母(Pichia)、紅冬孢酵母(Rhodosporidium)、紅酵母(Rhodotorula)、酵母(Saccharomyces)、類酵母(Saccharomycodes)、復膜孢酵母(Saccharomycopsis)、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、裂芽酵母(Schizoblastosporion)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、許旺酵母(Schwanniomyces)、鎖擲酵母(Sporidiobolus)、擲孢酵母(Sporobolomyces)、Sporopachydermia、Stephanoascus、梗孢酵母(Sterigmatomyces)、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、Sympodiomyces、Sympodiomycopsis、有孢圓酵母(Torulaspora)、Trichosporiella、絲孢酵母(Trichosporon)、三角酵母(Trigonopsis)、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母(Wickerhamia)、擬威克酵母(Wickerhamiella)、Williopsis、Yamadazyma、Yarrowia、Zygoascus、接合酵母(Zygosaccharomyces)、Zygowilliopsis、Zygozyma。
作為用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的酵母而言，麥芽糖假絲酵母(Candida malosa)或脂裂蓍草酵母(Yarrowia lipolytica)是優(yōu)選的，且麥芽糖假絲酵母是特別優(yōu)選的。
(2)聚酯合成相關(guān)酶的基因聚酯合成相關(guān)酶的基因并無特別限定，但宜是編碼細菌衍生酶的基因。具體說，優(yōu)選的是與以上通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚多酯合成相關(guān)的酶的基因，更佳地是與P(3HB-co-3HH)[即下式(2)的3-羥丁酸與下式(3)的3-羥己酸)共聚形成的共聚多酯]合成相關(guān)酶的基因。
參與合成上述通式(1)的3-羥鏈烷酸的共聚多酯的酶的基因并無特別限定，但可以是日本公開出版物Hei-10-108682中描述的聚酯合成酶基因。作為這些聚酯合成酶基因的具體例子，可以提到的是PHA合成酶基因。另外，聚酯合成相關(guān)酶的基因可與本發(fā)明的聚酯合成酶基因聯(lián)用。這些酶基因包括(R)-特異性烯酰-CoA水合酶基因，其能轉(zhuǎn)化烯酰-CoA(β-氧化途徑中的中間體)，從而合成單體(R)-3-羥基?；?CoA[T.Fukui等人，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters，Vol.170，69-75(1999)]；β-酮硫解酶基因，其將乙酰基-CoA二聚化成單體3-羥基丁?；?CoA；和NADPH-依賴性乙酰乙?；?CoA還原酶基因[People OP等人，J.Biol.Chem.264(26)15298-15303(1989)]。
所述的一些宿主酵母菌種在翻譯遺傳密碼時表現(xiàn)異常。例如，Candidacylindracea[Y.Kawaguchi等人，Nature 341，164-166(1989)]和麥芽糖假絲酵母[H.Sugiyama等人，Yeast 11，43-52(1995)]是非常規(guī)性酵母，其遺傳密碼CTG未被翻譯成亮氨酸而是翻譯成絲氨酸。當期望在這種酵母中表達聚酯合成相關(guān)酶的基因時，就可能發(fā)生遺傳密碼的翻譯異常，從而此時就會產(chǎn)生具有與適當酶有所不同的氨基酸序列的酶。因此，該酶的功能就不能完全表現(xiàn)。
通過事先將基因中含有的遺傳密碼CTG修飾成與亮氨酸相應的不同遺傳密碼(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA)，可能用構(gòu)建的基因來避免上述現(xiàn)象。
對包括酵母在內(nèi)的微生物的遺傳密碼進行分析，表明不同生物利用遺傳密碼的頻率差異很大。所以，編碼同一氨基酸的多個遺傳密碼中，不同生物所用的遺傳密碼各不相同，并指出高使用頻率的遺傳密碼構(gòu)成的基因的翻譯效率高。例如，豚鼠氣單胞菌PHA合成酶基因和(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因的GC含量分別為67.16％和65.77％，而對麥芽糖假絲酵母而言，此類酶中迄今所報道的GC含量磷酸甘油酸激酶為39.55％，ALK2-A為35.67％。所以，為了在麥芽糖假絲酵母中有效地表達聚酯合成相關(guān)酶的基因，例如宜使用的基因是其中所述的遺傳密碼子CTG已變成編碼亮氨酸的其他遺傳密碼子，同時該遺傳密碼子已變成那些高頻率使用的密碼子。
可使用本發(fā)明的聚酯合成相關(guān)酶的基因，因為其在酵母中不會顯示遺傳密碼的翻譯異常。另外，也可使用修飾的基因，即通過將遺傳密碼改變成那些具有特定酵母高頻使用的遺傳密碼子(而不會改變氨基酸序列)的修飾基因。在表現(xiàn)出遺傳密碼翻譯異常的酵母中，可將所述酶基因的CTG密碼子改變?yōu)門TA、TTG、CTT、CTC或CTA，或者也可通過將遺傳密碼改變成那些具有特定酵母高頻使用的而不會改變氨基酸序列的遺傳密碼子的修飾的基因。例如，當宿主是麥芽糖假絲酵母時，可采用SEQ ID NO3或NO4所定的基因作為本發(fā)明的聚酯合成相關(guān)酶的基因。該基因的核苷酸序列可能經(jīng)歷過突變，如缺失、替代、插入等，只要得到的突變基因能產(chǎn)生所述的聚酯合成相關(guān)酶。
由上述PHA合成酶合成的聚酯是上述通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚物，可用以下的通式(4)表示。較佳地是通過上式(2)的3-羥丁酸與上式(3)的3-羥己酸共聚化得到的共聚多酯P(3HB-co-3HH)，并可用如下的通式(5)表示。 (3)基因表達盒的構(gòu)建對酵母中的基因表達而言，需要連接DNA序列如啟動子、UAS等(該基因5’-末端的上游)，并連接將DNA序列如聚-A附加信號、終止子等(該基因的3’-末端下游)。這些DNA序列可以是任何能在酵母中起作用的序列。當啟動子包含與組成性表達相關(guān)的序列和與誘導表達相關(guān)的序列時，可用任何種類的這種啟動子序列。
另外，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，上述啟動子和終止子宜為能在所用微生物中起作用而產(chǎn)生聚酯的那些。
現(xiàn)描述用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化體構(gòu)建的基因表達盒的構(gòu)建，涉及如(a)其中采用脂裂蓍草酵母作為宿主，和(b)其中采用麥芽糖假絲酵母作為宿主。
(a)當脂裂蓍草酵母用作宿主時當脂裂蓍草酵母用作宿主時，所用的啟動子和終止子較佳地是那些從脂裂蓍草酵母衍生的。更佳的是，采用自脂裂蓍草酵母ALK3衍生的啟動子和自脂裂蓍草酵母XRP2衍生的終止子。所述的啟動子和/或終止子的DNA序列可以是通過一個或多個核苷酸的缺失、替代和/或增加而衍生的DNA序列(只要其在脂裂蓍草酵母中能起作用)。
用于上述構(gòu)建的載體可以是任何載體，其是能在大腸桿菌中自動復制的質(zhì)粒且含有能在酵母中自動復制的區(qū)域。這種能在酵母中自動復制的載體可以包含在細胞內(nèi)。此外，然后可將該基因表達盒整合到染色體上。在脂裂蓍草酵母中，可采用自動復制的pSAT4和pSUT5(Toshiya Iida對酵母脂裂蓍草酵母的正-烷鏈-誘導的細胞色素P450基因型的研究，a doctorate dissertation thesis，TokyoUniversity Graduate School，1997)。
在上述酵母中，較佳的聚酯合成相關(guān)酶的基因是豚鼠氣單胞菌衍生的基因，如可以有益地使用豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶基因(本文以后簡稱為phaC)(SEQ ID NO1)或能將phaC和烯酰基-CoA(β-氧化途徑中的中間體)轉(zhuǎn)化成單體(R)-3-羥?；?CoA的(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因(本文以后簡稱為phaJ)[T.Fukui等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，Vol.170，69-75(1999)](SEQ IDNO2)。
可將Yarrowia lipolyica ALK3基因的啟動子ALK3p(SEQ ID NO5)(GenBank AB010390)連接到這些結(jié)構(gòu)性基因各自5’-端上游。
為了制備將該啟動子連接到結(jié)構(gòu)基因上所需的限制性酶位點，可以使用PCR方法。在SEQ ID NO8到SEQ ID NO14顯示了PCR中所用的引物序列。PCR條件可任意只要能擴增目的基因片斷。
對啟動子而言，可用SEQ ID NO5作為模板，自SEQ ID NO8和SEQ IDNO9與SEQ ID NO9和SEQ ID NO10分別構(gòu)建5’端含有XabI、3’端含有NedI的ALK3X和5’端含有SacII、3’-端含有NdeI的ALK35。對phaC而言，可用SEQ ID NO1作為模板，從SEQ ID NO11和NO12構(gòu)建5’端含有NdeI、3’端含有PstI的100-bp(近似值)的片斷。將此片斷連接于剩下的1700-bp(近似值)PstI-BamHI片斷，來構(gòu)建全長的phaC(5’端含NdeI，3’端含BamHI)。就phaJ而言，可采用SEQ ID NO2作為模板，從SEQ ID NO13和NO14構(gòu)建5’端含NdeI、3’端含KpnI的phaJ片斷。就載體而言，可用質(zhì)粒載體pSUT5(圖1，SEQID NO19)和載體pSUT6，其可用SEQ ID NO20所示的接頭DNA將pSUT5的NdeI位點變成XbaI位點得到?？蓪LK3S和phaJ連接到pSUT6的多克隆位點SacII、KpnI，來構(gòu)建質(zhì)粒pSUT-phaJ(圖3)。然后，可將ALK3X和phaC連接到pSUT5的多克隆位點XbaI、BamHI，來構(gòu)建質(zhì)粒pSUT-PHA1(圖4)。
另外，可用SacII和XbaI自質(zhì)粒pSUT-phaJ中切割下ALK3S、phaJ和下游終止子(元件)，并連接到質(zhì)粒pSUT-PHA1的SacII、XbaI位點構(gòu)建質(zhì)粒pSUT-PHA2(圖5)。用這種方式，可構(gòu)建用于重組的兩類質(zhì)粒。
通過上述流程，可構(gòu)建用于在酵母脂裂蓍草酵母中產(chǎn)生如上通式(a)的3-羥基鏈烷酸共聚多酯的基因表達盒。
(b)當將麥芽糖假絲酵母用作宿主時當將麥芽糖假絲酵母用作宿主時，所用的啟動子和終止子較佳地是能在麥芽糖假絲酵母中起作用的那些，更佳的是那些自麥芽糖假絲酵母衍生的。更佳的是，采用自麥芽糖假絲酵母ALK1衍生的啟動子和終止子。所述的啟動子和/或終止子的DNA序列可以是由一個或多個堿基缺失、取代和/或增加而衍生得到的DNA序列，只要該序列能在麥芽糖假絲酵母中起作用。
用于構(gòu)建的載體可用是與上述(a)情況中相同的。在麥芽糖假絲酵母中，可使用自動復制性pUTU1[M.Ohkuma等人，J.Biol.Chem.，Vol.273，3948-3953(1998)]。
當用麥芽糖假絲酵母作為宿主時，聚酯合成相關(guān)酶的基因較佳地是編碼與豚鼠氣單胞菌衍生的酶相同氨基酸序列的基因。例如，可有益地使用在麥芽糖假絲酵母中編碼與豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶相同氨基酸序列的基因(本文以后將該基因簡稱為ORF2，如SEQ ID NO3所定義)，或在麥芽糖假絲酵母中編碼與ORF2相同氨基酸序列的基因，和(R)-特異性烯?；?CoA水合酶(其能將B-氧化途徑中的中間體烯?；?CoA轉(zhuǎn)變成單體(R)-3-羥乙?；?CoA)的基因(本文以后將其簡稱為ORF3，如SEQ ID NO4所定義)[T.Fukui等人，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters，Vol.170，69-75(1999)]。
可將麥芽糖假絲酵母Alk1基因的啟動子ALK1p(SEQ ID NO6)和終止子ALK1t(SEQ ID NO7)(GenBank D00481)[M.Takagi等人，Agric.Biol.Chem.，Vol.5，2217-2226(1989)]連接到這些結(jié)構(gòu)基因各自的5’端的上游和3’-端的下游。
為了制備用于將啟動子和終止子連接到結(jié)構(gòu)基因上的限制性酶位點，可使用PCR技術(shù)。SEQ ID NO15到SEQ ID NO18列出了用于PCR的引物序列。也可將上述(a)情況中所提到的條件用作PCR的條件。
就啟動子區(qū)域而言，可用SEQ ID NO6作為模板從SEQ ID NO15和NO16制備5’端含SalI、3’端含NdeI的ALK1p。就終止子區(qū)域而言，可用SEQ ID NO7作為模板，從SEQ ID NO17和NO18制備5’端含HindIII、3’端含EcoRV的ALK1t。就載體而言，可用pUTU1和麥芽糖假絲酵母Adel基因(SEQ ID NO21，GenBank D00855)將標記基因從Ura3修飾為Adel來制備載體pUTA1(圖2)[S.Kawai等人，Agric.Biol.Chem.，Vol.55，59-65(1991)]。通過將ALK1p連接到PvuII(pUCNT的NdeI位點)(WO 94/03613中所述)和將ALK1t連接到HindIII(pUCNT的SspI位點)，可構(gòu)建pUAL1(圖6)。然后，通過將ORF3連接到NdeI(構(gòu)建pUAL1過程中pUCNT-ALK1t的HindIII位點)并進一步連接ALK1p，可構(gòu)建pUAL-ORF3(圖8)。
然后，通過用EcoT22I從質(zhì)粒pUA1-ORF2切下ORF2、上游啟動子和下游終止子(作為一元件)，并將其連接到pUTA1的PstI位點，可構(gòu)建pUTA-ORF2。
另外，通過用SalI從pUAL-ORF3切下ORF3、上游啟動子和下游終止子(作為一元件)，并將其連接到pUTA-ORF2的SalI的位點，可構(gòu)建質(zhì)粒pUTA-ORF23(圖9)。
通過上述流程，可構(gòu)建用于在酵母麥芽糖假絲酵母中產(chǎn)生如上通式(1)的鏈烷酸共聚多酯的基因表達盒。
(4)轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建可用本身已知的方法將該聚合物合成相關(guān)基因表達盒克隆載體引入酵母。因此，例如可使用鈣法[Lederberg.E.M.等人，J.Bacteriol，119，1072(1974)]或電穿孔法[Current Protocols in Molecular Biology，1，1.8.4.，1994]。也可使用可購得的轉(zhuǎn)化試劑盒如Fast TrackTM-酵母轉(zhuǎn)化試劑盒SM(Geno Technology)。
例如，可將脂裂蓍草酵母CXAU1菌株[T.Iida等人，“酵母”，14，1387-1397(1998)]用作宿主。用該聚合物合成相關(guān)基因表達盒，通過上述轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化該菌株，可構(gòu)建含有pSUT-PHA1的脂裂蓍草酵母PHA1和含有pSUT-PHA2的脂裂蓍草酵母PHA2。
就宿主而言，也可將麥芽糖假絲酵母 CHA1[S.Kawai等人，Agric.Biol.Chem.Vol.55，59-65(1991)作為宿主。用該聚合物合成相關(guān)基因表達盒，通過上述轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化該菌株，可構(gòu)建含有pUTA-ORF23的麥芽糖假絲酵母CHA1。
(5)聚酯的產(chǎn)生在本發(fā)明的產(chǎn)生聚酯的方法中，從培養(yǎng)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體得到的培養(yǎng)物中收獲聚酯。
可用如下方法，通過培育本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體來生產(chǎn)聚酯。用于此培育的碳源可以是任何酵母能攝取的物質(zhì)。另外，當啟動子的表達是誘導性時，可按需要加入誘導物。有些情況中誘導物可作為主要碳源。對碳源以外的其他營養(yǎng)物而言，可用使用含有氮源、無機鹽和其他有機營養(yǎng)源的培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度可以是該菌株能生長的任何溫度，但較佳地為20℃到40℃。培養(yǎng)時間不受特別限制，但范圍可以為1到7天。此后，可從生長的細胞或如此得到的培養(yǎng)物肉湯收獲聚酯。
可以使用的碳源包括碳水化合物(如葡萄糖、甘油、蔗糖等)、油和脂肪、脂肪酸甚至正-石蠟等。就油和脂肪而言，可以使用菜籽油、椰油、棕櫚油和棕櫚堅果油等?？捎玫乃鲋舅峥梢允撬龅娘柡突虿伙柡椭舅崛缂核?、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸等，和這些脂肪酸的衍生物如他們的酯和鹽。就培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母或脂裂蓍草酵母而言，例如可用油或脂肪作為碳源進行。對根本不能吸收油和脂肪或吸收效率不好的酵母而言，通過在培養(yǎng)基中加入脂肪酶來改善效率。另外，通過轉(zhuǎn)化脂肪酶基因，可賦予吸收油的功能。
另外，通過將碳原子個數(shù)為奇數(shù)的脂肪酸或正-石蠟作為碳源，可增加上述通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚多酯中的碳鏈奇數(shù)成分的比例。
氮源包括氨、銨鹽(如氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等)、蛋白胨、肉浸液、酵母提取物等。對無機鹽而言，可以提到如磷酸鉀、二磷酸鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。
可以用的其他氮源例如氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等)和維生素(如維生素B1、維生素B12、生物素、煙酰胺、泛酸和維生素C)等。
在本發(fā)明的實施中，可用如下方法從生長的細胞收獲聚酯。因此，在完成培育后，用離心機離心培養(yǎng)肉湯來分離細胞，用蒸餾水、甲醇等洗滌細胞并干燥。將干細胞中的聚酯提取到有機溶劑(如氯仿)中。通過過濾等將此含有聚酯的有機溶劑溶液中的細胞成分除去，在濾液中加入不良溶劑(如甲醇、己烷等)來沉淀聚酯。過濾或離心除去上清液后，干燥沉淀的聚酯并回收。用氣相色譜或核磁共振光譜分析如此得到的聚酯。
如上述構(gòu)成的本發(fā)明的生產(chǎn)聚酯的方法，能產(chǎn)生如上通式(1)的3-羥鏈烷酸共聚多酯，且產(chǎn)率良好。
另外，通過上述方法，包括例如構(gòu)建含有質(zhì)粒pSUT-PHA1或pSUT-PHA2的重組脂裂蓍草酵母菌株或含有質(zhì)粒pUTA-ORF23的重組麥芽糖假絲酵母菌株并培育該菌株，能產(chǎn)生由如上通式(2)的3-羥丁酸和如上通式(3)的3-羥己酸共聚化獲得的所述共聚多酯P(3HB-co-3HH)。
實施例以下實施例進一步詳細說明了本發(fā)明。但應理解本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實施例的限制。
(實施例1)聚酯合成相關(guān)基因(a)當將脂裂蓍草酵母用作宿主時作為聚酯合成相關(guān)酶的基因，采用了豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶基因(phaC；SEQ ID NO1)和(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因(phaJ；SEQ IDNO2)，其能將烯?；?CoA(β-氧化途徑中的中間體)轉(zhuǎn)變成單體(R)-3-羥酰基-CoA[T.Fukui等人.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，Vol.170，69-75(1999)]。
(b)當將麥芽糖假絲酵母用作宿主時作為聚酯合成相關(guān)酶的基因，參照豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶和(R)-特異性烯酰基-CoA水合酶基因(次酶能將烯?；?CoA，β-氧化途徑的中間體轉(zhuǎn)變成單體(R)-3-羥?；?CoA)的氨基酸序列，構(gòu)建了該基因[T.Fukui等人.，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters，Vol.170，69-75(1999)]。
麥芽糖假絲酵母是能將CTG密碼子翻譯成蘇氨酸而非亮氨酸的一種酵母菌。所以，在麥芽糖假絲酵母的使用中，不將CTG指定為亮氨酸的特異性密碼子。就相應于各氨基酸的密碼子而言，較佳地選擇在麥芽糖假絲酵母中高頻使用的密碼子。從Klaus WolfNonconventional Yeast in Biotechnology(Springer出版)查閱了各密碼子利用率的資料。具體說，分別將ATG和TGG指定為甲硫氨酸的特定密碼子和色氨酸的特定密碼子。將TTT或TTC指定為代用的苯丙氨酸特定密碼子。作為亮氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌DNA序列中使用的CTC和CTG分別修飾成TTA和TTG(當TTA和TTG如此使用時)。作為異亮氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌DNA序列中使用的ATC和ATA分別修飾成ATT和ATC(當ATT如此使用時)。作為纈氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌DNA序列中使用的GTG和GTA修飾成GTT(當GTC和GTT如此使用時)。作為絲氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌DNA序列中使用的AGC、TCA和TCG修飾成TCT(當TCC和TCT如此使用時)。作為脯氨酸的特定密碼子，所有相應的密碼子都可修飾成CCA。作為蘇氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌的DNA序列中使用的ACC、ACG和ACA分別修飾成ACT、ACC和ACC(當ACC如此使用時)。作為丙氨酸的特定密碼子，將豚鼠氣單胞菌的DNA序列中使用的GCC、GCG和GCA分別修飾成GCT、GCC和GCT(當GCT如此使用時)。就酪氨酸氨酸的特定密碼子而言，可將TAT和TAC交替地指定成酪氨酸的特定密碼子(如在豚鼠氣單胞菌DNA序列中所用的那樣)。將TAA用作終止密碼子。就組氨酸的特定密碼子而言，可將CAT和CAC交替地指定成組氨酸的特定密碼子(如在豚鼠氣單胞菌DNA序列中所用的那樣)。就谷氨酰胺的特定密碼子而言，將所有相應的密碼子修飾成CAA。將AAT和AAC交替地指定為相應的天冬酰胺的特定密碼子。對賴氨酸的特定密碼子而言，將所有相應的密碼子都修飾成AAA。對天冬氨酸的特定密碼子而言，將所有相應的密碼子修飾成GAT。作為谷氨酸的特定密碼子，將所有相應的密碼子修飾成GAA。作為半胱氨酸的特定密碼子，將所有相應的密碼子修飾成TGT。作為精氨酸的特定密碼子，將所有相應的密碼子修飾成AGA。作為甘氨酸的特定密碼子，將所有相應的密碼子修飾成GGT。在豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶DNA序列中，將兩個T核苷酸(第969和第1449位)修飾成C，從而構(gòu)建兩個KpnI位點。這些取代不改變氨基酸的序列結(jié)構(gòu)。
因此，如此設(shè)計了PHA合成酶基因(ORF2；SEQ ID NO3)和(R)-特異性烯酰基-CoA水合酶基因(ORF3；SEQ ID NO4)，并基于這些序列通過總體合成構(gòu)建了ORF2和ORF3。
(實施例2)重組質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建(a)當用脂裂蓍草酵母作為宿主時為了能在脂裂蓍草酵母中表達上述基因，將脂裂蓍草酵母AlK3基因啟動子ALK3p(SEQ ID NO5)(GenBank AB010390)連接到各基因5’端的上游。通過PCR制備了將啟動子連接到結(jié)構(gòu)基因所需的限制性酶位點。SEQ ID NO8到SEQ ID NO14顯示了PCR中使用的引物序列。進行25輪PCR，94℃×1分鐘，55℃×2分鐘，72℃×3分鐘，來擴增特定的基因片斷。使用的聚合酶是TakaraShuzo的ExTaq。對啟動子區(qū)域而言，用SEQ ID NO5作為引物，分別從SEQ IDNO8和SEQ ID NO9或SEQ ID NO9和SEQ ID NO10制備了5’端為XbaI和3’端為NdeI的ALK3X和5’-端含SacII和3’端含NdeI的ALK3S。
對phaC而言，用SEQ ID NO1作為模板，從SEQ ID NO11和SEQ ID NO12制備了5’端含NdeI、3’端含PstI的100-bp的片斷。將此片斷連接于剩下的約1700-bp的PstI-BamHI片斷，來構(gòu)建全長的phaC(5’端為NdeI，3’端為BamHI)。就phaJ而言，用SEQ ID NO2作為模板，從SEQ ID NO13和NO14制備了pahJ片斷(5’端含NdeI和3’端含KpnI)。
就載體而言，所用質(zhì)粒載體pSUT5(圖1，SEQ ID NO19)和質(zhì)粒pSUT6的準備，采用SEQ ID NO20所示的接頭DNA將pSUT5的NdeI位點變成XbaI位點得到。將ALK3S和phaJ連接到pSUT6的多克隆位點SacII、KpnI，構(gòu)建了質(zhì)粒pSUT-phaJ(圖3)。然后，將ALK3X和phaC連接到pSUT5的多克隆位點XbaI、BamHI，構(gòu)建了質(zhì)粒pSUT-PHA1(圖4)。
然后，用SacII和XbaI從質(zhì)粒pSUT-phaJ中切割下ALK3S、phaJ和下游終止子(元件)，并連接到質(zhì)粒pSUT-PHA1的SacII、XbaI位點構(gòu)建了質(zhì)粒pSUT-PHA2(圖5)。用這種方式，構(gòu)建了用于重組的兩類質(zhì)粒pSUT-PHA1和pSUT-PHA2。通過上述流程，構(gòu)建了用于在酵母脂裂蓍草酵母中產(chǎn)生如上通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚多酯的基因表達盒。圖10顯示了總體的構(gòu)建圖。
將脂裂蓍草酵母CXAU1菌株(T.Iida等人，Yeast，14，1387-1397(1998))作為宿主。為了將構(gòu)建的質(zhì)粒引入到宿主中，使用了Fast TrackTM-酵母轉(zhuǎn)化試劑盒SM(Geno Technology)。按照說明流程進行了轉(zhuǎn)化，用選擇平板(0.67w/v％無氨基酸的酵母氮堿，2w/v％葡萄糖，24mg/l鹽酸腺嘌呤，2w/v％瓊脂)得到重組菌株。
(b)當將麥芽糖假絲酵母用作宿主時為了在麥芽糖假絲酵母中表達所述的ORF2和ORF3，將麥芽糖假絲酵母AlK1基因啟動子ALK1p(SEQ ID NO6，GenBank D00481)連接到各基因的5’端上游，并將麥芽糖假絲酵母AlK1基因終止子ALK1t(SEQ ID NO7)連接到3’端的下游。進行PCR來制備將啟動子和終止子連接到結(jié)構(gòu)基因所需的限制性酶位點。SEQ ID NO15到SEQ ID NO18顯示了PCR所用的引物序列。進行25輪PCR，94℃×1分鐘，55℃×2分鐘，72℃×3分鐘，擴增了特定的基因片斷。使用的聚合酶是Takara Shuzo的ExTaq。對啟動子區(qū)域而言，用SEQ ID NO6作為引物，從SEQ ID NO15和NO16制備了5’端含SalI、3’端含NdeI的ALK1p。就終止子區(qū)域而言，用SEQ ID NO7作為模板，從SEQ ID NO17和NO18制備了5’端含HindIII、3’端含EcoRV的ALK1t。最后，就連接ORF2和ORF3的載體而言，采用了pUTU(M.Ohkuma等人，J.Biol.Chem.，Vol.273，3948-3953(1998))，它是通過將麥芽糖假絲酵母(GenBank D29758)的自動復制序列(ARS)和URA3基因(GenBank D12720)連接到pUC19和pUTA1(圖2)(其是用麥芽糖假絲酵母ADE1的基因(SEQ ID NO21；GenBank D00855)將標記基因從Ura3修飾成Adel而獲得的)得到的。通過用Xhol去除pUTU1的URA3基因，并連接ADE1基因片斷(用SalI切割的)構(gòu)建了pUTA1。
將ALK1p連接到pUCNT的PvuII、NdeI位點(WO 94/03613中所述)和將ALK1t連接到pUCNT的HindIII、SspI位點，可構(gòu)建pUAL1(圖6)。然后，通過將ORF2連接到pUAL1的NdeI、PstI位點來構(gòu)建質(zhì)粒pUAL-ORF2(圖7)。另外，在構(gòu)建pAUL1的過程中，將ORF3連接到pUCNT-ALK1的NdeI、HindIII位點，并將ALK1p連接到構(gòu)建物pUAL-ORF3(圖8)上。
然后，用EcoT22I從質(zhì)粒pUAl-ORF2切下ORF2、上游啟動子和下游終止子(元件)，并連接到pUTA1的PstI位點，構(gòu)建了pUTA-ORF2。另外，用SalI從pUAL-ORF3切割下ORF3、上游啟動子和下游終止子(作為一元件)，并連接到pUTA-ORF2的SalI的位點，構(gòu)建了質(zhì)粒pUTA-ORF23(圖9)。通過上述流程，構(gòu)建了用于在酵母麥芽糖假絲酵母中產(chǎn)生如上通式(1)的鏈烷酸共聚多酯的基因表達盒。圖11顯示了總構(gòu)建圖。
用麥芽糖假絲酵母CHA1(S.Kawai等人，Agric.Biol.Chem.，Vol.55，59-65(1991))作為宿主。為了將構(gòu)建的質(zhì)粒引入宿主，使用Fast TrackTM-酵母轉(zhuǎn)化試劑盒SM(Geno Technology)。按說明書進行轉(zhuǎn)化，并采用選擇平板(0.67w/v％無氨基酸的酵母氮堿，2w/v％葡萄糖，24mg/l鹽酸腺嘌呤，2w/v％瓊脂)得到重組菌株。
(實施例3)用脂裂蓍草酵母的重組菌株生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)按如下方法培育含有質(zhì)粒pSUT5、pSUT-PHA1和pSUT-PHA2的脂裂蓍草酵母的重組菌株。將YPD培養(yǎng)基(1w/v％酵母提取物，2w/v％Bacto-蛋白胨，2w/v％葡萄糖)用作預培育培養(yǎng)基。使用了1/4YP培養(yǎng)基(0.25w/v％酵母提取物，0.5w/v％Bacto-蛋白胨)和補充有2w/v％棕櫚油的礦物培養(yǎng)基(0.7w/v％KH2PO4、1.3w/v％(NH4)2HPO4、0.5w/v％Pro-Ex Ap-12(Banshu Condiment)、0.04w/v％腺嘌呤、1ppm鹽酸硫胺、1v/v％痕量金屬鹽溶液(如溶解于0.1N HCl的8w/v％MgSO4·7H2O、0.6w/v％ZnSO4·7H2O、0.9w/v％FeSO4·7H2O、0.05w/v％CuSO4·5H2O、0.1w/v％MnSO4·6-7H2O、1w/v％NaCl))。
在裝有100ml預培育基的500ml Sakaguchi燒瓶中接種各重組菌株的100μl甘油原液，培育20小時后，以1v/v％預培育物水平接種裝有500ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的2L Sakaguchi燒瓶。在30℃的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)接種的燒瓶，并以120rpm速度振蕩。YPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間為24小時，礦物培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間為72小時。高壓滅菌后，離心培養(yǎng)肉湯收獲細胞，然后用甲醇洗滌這些細胞并冷凍干燥。干細胞稱重。
粉碎得到的干細胞，加入100ml甲醇(邊攪拌邊加入)抽提攪拌過夜。過濾提取液除去細胞，用蒸發(fā)器將濾液濃縮至1-2ml。在該濃液中加入10ml己烷以沉淀己烷不溶性成分。
在如此得到的約2mg己烷不溶性成分中加入500μl硫酸-甲醇混合液(15∶85)和500μl氯仿，密封后100℃加熱140分鐘得到聚酯分解產(chǎn)物甲酯。冷卻后，加入0.3g碳酸氫鈉中和。在其中加入1ml二異丙醚，用攪拌器攪拌此混合物。然后離心，分開有機溶劑層，用毛細管氣相色譜分析此組合物。所用的氣相色譜是Shimadzu GC-17A，所用的毛細管柱是GL Science的NEUTRA BOND-1(柱長25m，柱徑0.25mm，液體膜厚度0.4μm)。溫度條件為在起始溫度100℃以8℃/分鐘的速度增加。表1示出了分析得到的結(jié)果，圖12給出了樣品(3)的圖。還進行了獲得的己烷難溶成分的NMR分析(JEOL，JNM-EX400)和IR分析(Shimadzu Corporation，DR-800)。例如，圖13和14分別示出了樣品(6)的結(jié)果。
表1培養(yǎng)和分析結(jié)果樣品 培養(yǎng)基 菌株細胞重量積聚的聚合物量3HH組合物(g/l) (wt％) (mol％)(1) 1/4 YP 對照 3.568.9×10-2(2) PHA1 3.651.9×10-1(3) PHA2 3.432.6×10-115(GC)(4) 礦物對照 0.156.7×10-2(5) PHA1 0.191.4×10-1(6) PHA2 0.17 1.8 27(NMR)由上述結(jié)果可以看出可用酵母脂裂蓍草酵母生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)共聚多酯。
還可以看出雖然量少但酵母中也有此聚合物。
(實施例4)用麥芽糖假絲酵母的重組菌株生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)按以下方法培育含有質(zhì)粒pUTA1或pUTA-ORF23的麥芽糖假絲酵母的重組菌株。使用補充有1w/v％酪蛋白氨基酸和2w/v％棕櫚油的YNB培養(yǎng)基(0.67w/v％無氨基酸的酵母氮堿)作為預培育的培養(yǎng)基。將補充有1w/v％的酪蛋白氨基酸的YNB培養(yǎng)基作為生產(chǎn)聚酯的培養(yǎng)基，其含①2w/v％棕櫚油、②2w/v％椰油、③2w/v％十四烷或④2w/v％十六烷作為碳源。
在裝有50ml預培育基的500ml Sakaguchi燒瓶中接種各菌株的100μl甘油原液，培育20小時。然后以1v/v％預培育物水平接種裝有500ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的2L Sakaguchi燒瓶。30℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，并以120rpm速度振蕩，培養(yǎng)72小時。高壓滅菌得到的培養(yǎng)物肉湯，離心收獲細胞，然后用甲醇洗滌獲得的細胞并冷凍干燥。干細胞稱重。
然后粉碎得到的干細胞，加入100ml氯仿(邊攪拌邊加入)抽提攪拌過夜。過濾提取液除去細胞，用蒸發(fā)器將濾液濃縮至1-2ml。在該濃液中加入10ml己烷以沉淀己烷不溶性成分。
結(jié)果，在用椰油、十四烷和十六烷培養(yǎng)的含有質(zhì)粒pUTA-ORF23的重組菌株培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了白色沉淀(表2)。表2和圖15列出了采用椰油培養(yǎng)物中得到的難溶于己烷的成分的NMR分析(JEOL，JNM-EX400)結(jié)果。
表2重組菌株的培養(yǎng)碳源 細胞重量(g/l)積聚的聚合物棕櫚油 12.5 -椰油10.3 ++十四烷 4.4++十六烷 3.6+由上述結(jié)果可以看出可用酵母麥芽糖假絲酵母生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)共聚多酯。
工業(yè)應用由此按照本發(fā)明可用酵母生產(chǎn)出生物可降解的具有良好物理性能的上式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚多酯。
序列表<110>鐘淵化學工業(yè)株式會社(KANEKA CORPORATION)<120>轉(zhuǎn)化體和用其生成聚酯的方法<130>T-618<160>21<210>1<211>1785<212>DNA<213>豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)<220><221>CDS<222>1..1785<400>1atgagccaac catcttatgg cccgctgttc gaggccctgg cccactacaa tgacaagctg 60ctggccatgg ccaaggccca gacagagcgc accgcccagg cgctgctgca gaccaatctg 120gacgatctgg gccaggtgct ggagcagggc agccagcaac cctggcagct gatccaggcc 180cagatgaact ggtggcagga tcagctcaag ctgatgcagc acaccctgct caaaagcgca 240ggccagccga gcgagccggt gatcaccccg gagcgcagcg atcgccgctt caaggccgag 300gcctggagcg aacaacccat ctatgactac ctcaagcagt cctacctgct caccgccagg 360cacctgctgg cctcggtgga tgccctggag ggcgtccccc agaagagccg ggagcggctg 420cgtttcttca cccgccagta cgtcaacgcc atggccccca gcaacttcct ggccaccaac 480cccgagctgc tcaagctgac cctggagtcc gacggccaga acctggtgcg cggactggcc 540ctcttggccg aggatctgga gcgcagcgcc gatcagctca acatccgcct gaccgacgaa 600tccgccttcg agctcgggcg ggatctggcc ctgaccccgg gccgggtggt gcagcgcacc 660gagctctatg agctcattca gtacagcccg actaccgaga cggtgggcaa gacacctgtg 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權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其中將至少一種包含聚酯合成相關(guān)酶基因的基因表達盒引入到酵母中。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的聚酯是以下通式(1)的3-羥基鏈烷酸共聚化產(chǎn)生的共聚物 式中R代表烷基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的聚酯是下式(2)的3-羥丁酸與下式(3)3-羥己酸共聚化產(chǎn)生的共聚多酯3(3HB-co-3HH)
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的酵母屬于以下菌屬的任何一種酵母Aciculoconidium、Ambrosiozyma、Arthroascus、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、酒香酵母(Brettanomyces)、布勒擲孢酵母(Bullera)、Bulleromyces、假絲酵母(Candida)、固囊酵母(Citeromyces)、Clavispora、隱球酵母(Cryptococcus)、Cystofilobasidium、德巴利酵母(Debaryomyces)、德克酵母(Dekkara)、Dipodascopsis、雙足囊菌(Dipodascus)、Eeniella、Endomycopsella、單囊菌(Eremascus)、假囊酵母(Eremothecium)、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、地霉(Geotrichum)、小季酵母(Guilliermondella)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、漢遜酵母(Hansenula)、Hasegawaea、亞側(cè)耳(Holtermannia)、Hormoascus、Hyphopichia、Issatchenkia、克勒克(Kloeckera)、克孢酵母(Kloeckeraspora)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、白冬孢酵母(Leucosporidium)、油脂酵母(Lipomyces)、洛德酵母(Lodderomyces)、鱗斑霉(Malassezia)、梅奇酵母(Metschnikowia)、Mrakia、Myxozyma、拿遜酵母(Nadsonia)、Nakazawaea、針孢酵母(Nematospora)、Ogataea、卵孢酵母(Oospordium)、管囊酵母(Pachysolen)、Phachytichospora、Phaffia、畢赤酵母(Pichia)、紅冬孢酵母(Rhodosporidium)、紅酵母(Rhodotorula)、酵母(Saccharomyces)、類酵母(Saccharomycodes)、復膜孢酵母(Saccharomycopsis)、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、裂芽酵母(Schizoblastosporion)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、許旺酵母(Schwanniomyces)、鎖擲酵母(Sporidiobolus)、擲孢酵母(Sporobolomyces)、Sporopachydermia、Stephanoascus、梗孢酵母(Sterigmatomyces)、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、Sympodiomyces、Sympodiomycopsis、有孢圓酵母(Torulaspora)、Trichosporiella、絲孢酵母(Trichosporon)、三角酵母(Trigonopsis)、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母(Wickerhamia)、擬威克酵母(Wickerhamiella)、Williopsis、Yamadazyma、Yarrowia、Zygoascus、接合酵母(Zygosaccharomyces)、Zygowilliopsis、Zygozyma。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的酵母是脂裂蓍草酵母。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的酵母是麥芽糖假絲酵母。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的聚酯合成相關(guān)酶基因的表達盒包含有啟動子和終止子，所述的啟動子和終止子能在酵母中起作用。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的啟動子和終止子是從脂裂蓍草酵母衍生的。
9.如權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的啟動子是從脂裂蓍草酵母ALK3衍生的。
10.如權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的終止子是從脂裂蓍草酵母XPR2衍生的。
11.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的啟動子和終止子是從麥芽糖假絲酵母衍生的。
12.如權(quán)利要求7或11所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的啟動子是從麥芽糖假絲酵母ALK1衍生的。
13.如權(quán)利要求7或11所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的終止子是從麥芽糖假絲酵母ALK1衍生的。
14.如權(quán)利要求1-13任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的聚酯合成相關(guān)酶基因是從豚鼠氣單胞菌衍生的。
15.如權(quán)利要求1-13任一所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的聚酯合成相關(guān)酶基因是從豚鼠氣單胞菌衍生的PHA合成酶基因或PHA合成酶基因和(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述的PHA合成酶基因具有SEQ ID NO3所示的序列，且所述的(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因具有SEQID NO4所示的序列。
17.一種用權(quán)利要求1-16任一所述的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)聚酯的方法，其特征在于，所述的方法包括培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體，和自所得培養(yǎng)物收獲聚酯。
18.一種聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，所述的酶基因是從至少一個基因密碼子CTG修飾成TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
19.如權(quán)利要求18所述的聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，編碼所述酶的基因衍生自細菌。
20.如權(quán)利要求19所述的聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，所述的細菌是豚鼠氣單胞菌。
21.如權(quán)利要求20所述的聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，所述的自豚鼠氣單胞菌衍生的酶基因是PHA合成酶基因或(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因。
22.如權(quán)利要求21所述的聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，所述的PHA合成酶基因具有SEQ ID NO3所示的的序列。
23.如權(quán)利要求21所示的聚酯合成相關(guān)酶的基因，其特征在于，所示的(R)-特異性烯?；?CoA水合酶基因具有SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼合成共聚多酯的酶的基因,利用所述基因發(fā)酵合成聚酯的微生物,和以所述微生物輔助生成聚酯的方法。更具體說,本發(fā)明涉及在宿主微生物中起作用的基因;并涉及通過酶法合成的能在天然環(huán)境(土壤、河流或海洋)微生物的作用下降解的塑料樣聚合物,涉及用所述基因轉(zhuǎn)化所述宿主微生物產(chǎn)生的具有改善的發(fā)酵合成塑料樣聚合物能力的轉(zhuǎn)化體,以及用所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)聚多酯的方法。
文檔編號C12N15/52GK1380903SQ01801326
公開日2002年11月20日 申請日期2001年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月19日
發(fā)明者橫溝聡, 福地健, 小坂田史雄, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申請人:鐘淵化學工業(yè)株式會社