專利名稱：產(chǎn)生用于疾病修飾的抑制性rna的間充質(zhì)干細(xì)胞的制作方法
產(chǎn)生用于疾病修飾的抑制性RNA的間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年3月沈日提交的美國臨時申請序列號61/163，845依照35 U. S. C. § 119(e)的權(quán)益，所述臨時申請的內(nèi)容在此通過引用結(jié)合至本公開。
背景技術(shù)：
亨廷頓氏病(HD)的病理是由可變大小的亨廷頓蛋白(huntingtin) (htt)基因的蛋白產(chǎn)物的多聚谷氨酰胺(PG)的擴(kuò)展引起的。停止HD發(fā)展的最好希望是減少或消除感染的細(xì)胞中的突變htt蛋白。在動物模型中，小干擾RNA(SiRNA)的直接注射已顯示出對于降低htt水平和減輕疾病癥狀是有效的(DiFiglia等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A. 104 :17204-9 和 Wang 等.Q005) Neurosci Res. 53 :241-249)。最近的數(shù)據(jù)顯示，突變的 htt mRNA可被特定地靶向，同時保留正常等位基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本(ktiwarz等.Q006)PLoS Genet. 2 :el 40)。這項技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是以一種持續(xù)、安全且有效的方式將siRNA遞送至人腦。直接的siRNA遞送是對于問題有效的但稍縱即逝的答案。siRNA不會跨血腦屏障以治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病如亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALQ和其他疾病。治療治療神經(jīng)退行性疾病所需的長時間遞送siRNA以沉默突變基因，仍然是當(dāng)前阻礙有效治療用途的關(guān)鍵的尚未解決的問題。有必要開發(fā)克服siRNA遞送瓶頸的方法，并開發(fā)對于神經(jīng)退行性疾病的持續(xù)治療。發(fā)明_既述申請人:已發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞，又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，可以將siRNA和其他細(xì)胞組分直接注入到受損細(xì)胞中。申請人之前已通過十年之久的生物安全研究證明， 遺傳改造的人MSC是安全的。參見Bauer等.MoI Ther. 2008 ;16 :1308_1315。第三方的 MSC注入的I/II期臨床試驗現(xiàn)在已對數(shù)百名患者進(jìn)行實施，沒有不利事件(早期結(jié)果參 β Giordano (2007) J Cell Physiol. 211 :27-35 和 Salem 等，Stem Cells 2010，待出版)。 申請人:也已經(jīng)顯示，整合至免疫缺陷小鼠的組織中的MSC可以存活長達(dá)18個月，同時持續(xù)表達(dá)已被基因改造以產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(Dao等(1997)Mem Cells 15:443-453，Bauer 等· (2008)Mol Ther. 16 1308-1315，Meyerrose 等.(2008) Stem Cells 26:1713-22。提供的是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，它包含以下物質(zhì)或基本由以下物質(zhì)組成，或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成外源的siRNA、miRNA或dsRNA序列，或者與編碼siRNA、miRNA或dsRNA 序列的DNA序列組合。還提供的是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，它包含以下物質(zhì)或基本由以下物質(zhì)組成，或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成單獨的編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列或者編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列與該siRNA、miRNA或dsRNA序列的組合。另一方面，上文所述的MSC的每種都可以與靶細(xì)胞建立細(xì)胞突起(protrusion)，從而將所述多核苷酸和/或所述siRNA、miRNA或dsRNA遞送至靶細(xì)胞。另一方面，所述MSC 可以將所述多核苷酸和/或所述siRNA、miRNA或dsRNA或?qū)ζ渚幋a的多核苷酸通過微泡遞送至靶細(xì)胞。另一方面，所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。一方面，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，而另一方面，所述細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織 (Iipoaspirate)或骨髓樣品中。還提供的是一種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟或基本由以下步驟組成，或還進(jìn)一步由以下步驟組成將靶細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞。不被理論束縛時，該遞送可以通過或經(jīng)由細(xì)胞突起和/或通過微泡獨立發(fā)生或組合發(fā)生。另一方面，所述多核苷酸和/或 siRNA或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。 一方面，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，而另一方面，所述細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織或骨髓樣品中。還提供的是一種在受試者中治療由存在突變的等位基因介導(dǎo)的遺傳病癥(例如患者的亨廷頓氏病)的方法，所述方法通過給予患者以下物質(zhì)來進(jìn)行上述的MSC或包含間充質(zhì)干細(xì)胞，或基本上由間充質(zhì)干細(xì)胞組成或還進(jìn)一步由間充質(zhì)干細(xì)胞組成的組合物，其中所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA定向于突變的Htt基因，并且可將所述siRNA、 miRNA或dsRNA遞送至患者的靶神經(jīng)細(xì)胞。不被理論束縛時，一方面，本發(fā)明的MSC是其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被單獨地或共同地通過細(xì)胞突起和/或微泡遞送， 從而治療疾病的那種。另一方面，所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。一方面，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，而另一方面，所述細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織或骨髓樣本中。因此，本發(fā)明提供了以持續(xù)、安全且有效的方式將siRNA、miRNA或dsRNA遞送至如腦的靶器官的組合物和方法，所述方式使用本文描述的方法和組合物。附圖簡述

圖1顯示了從聯(lián)合培養(yǎng)Alexafluor 547標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染的MSC和GFP+MSC在培養(yǎng)96小時后的代表性的視野。所示eGFP-標(biāo)記的MSC，其已從鄰近的非GFP MSC將 alexa-flour-標(biāo)記的抗突變htt siRNA(如亮點周圍的圓圈所示)轉(zhuǎn)移至其中。顏色合并 ζ-投影(Color merged z-projection)。圖2顯示了 Alexafluor 547標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染的MSC(如亮點或亮區(qū)域周圍的圓圈所示)和GFP+MSC培養(yǎng)M小時后的共培養(yǎng)。圖2A顯示單獨GFP通道的極值(aximum)強(qiáng)度ζ-投影。圖2B顯示了單獨Alexafluor 547標(biāo)記的siRNA通道的最大強(qiáng)度ζ-投影。圖 2D是顏色合并的最大強(qiáng)度ζ-投影。圖2F是圖2D的放大(zoom)，以便更容易地看到遍及靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的siRNA的存在。圖3A顯示接種至輻射的小鼠不同組織的IV注入的人MSC。通過在染色周圍的圓圈指示⑶SB酶的內(nèi)生水平可視化，人細(xì)胞通過這些染色變得可視化，⑶SB酶在N0D/SCID/ MPSVII小鼠中不存在。圖;3B (組A至C)顯示在移植之后MSC產(chǎn)生的β-葡糖苷酸酶(⑶SB) 分布。在組A中，在沒有接受移植的4個月大的N0D/SCID/MPSVII小鼠的肝臟中沒有可證實的⑶SB活性。在組B中，低數(shù)量的⑶SB陽性細(xì)胞(紅染色)在接受表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的對照MSC(MSC-eGFP)移植的4個月大的MPSVII小鼠肝臟中被觀察到。⑶SB陽性細(xì)胞的數(shù)量與定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測的人細(xì)胞的數(shù)量在相同的范圍。在組C中，在接受改造以分泌⑶SB的MSC移植的4個月大MPSVII小鼠的肝臟中幾乎每個細(xì)胞相對于載體產(chǎn)物都是陽性的。發(fā)明詳述在本公開中，各種出版物、專利和公布的專利說明書通過識別引用而被引用。這些出版物、專利和公布的專利說明書的公開，在此通過引用以全文形式結(jié)合到本公開中。在描述組合物和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于描述的特定方法學(xué)、方案、細(xì)胞系、分析以及試劑，因為它們可以變化。也應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語學(xué)將用于描述本發(fā)明的特定實施方案，并且絕不用于限制如所附的權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。除非另外指出，否則本發(fā)明的實踐將使用組織培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見，例如， Sambrook 禾口尺ussell 編· (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 3 版；Ausubel 等編.Q007) Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)當(dāng)前實驗方案)系列；Methods in Enzymology (酶學(xué)的方法)系列(Academic Press, Inc., N. Y.) ；MacPherson 等.(1991)PCR 1 :A Practical Approach(PCR 1 一禾中 $ ffl 的力 fe)(IRL Press at Oxford University Press) ；MacPherson 等.(1995) PCR 2 :A Practical Approach (PCR 2 : —種實用的方法)；Harlow 和 Lane 編· (1999) Antibodies, A Laboratory Manual ( Jfi $ ^ ^ φ ) ；Freshney (2005) Culture of Animal Cells :A Manual of Basic ^Technique (動物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊)，第5版； Gait 編· (1984) Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)；美國專利號 4，683，195 ； Hames 和 Higgins 編.(1984) Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)；Hames 禾口 Higgins 編· (1984) Transcription and Translation (轉(zhuǎn)錄和翻譯)；Immobilized Cells and Enzymes (固定化的細(xì)胞和 Sl ) (IRL Press (1986)) ；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆實用指南)；Miller 和 Calos 編·(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體)(Cold Spring Harbor Laboratory) ；Makrides He . (2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (哺乳動物細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移和表達(dá))；Mayer 和 Walker 編.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (細(xì)胞和分子生物學(xué)中免疫化學(xué)方法)(Academic Press, London)； Herzenberg 等·編(1996)Weir ‘ s Handbook of Experimental Immunology (實驗免疫學(xué) Weir 手冊)；Manipulating the Mouse Embryo :A Laboratory Manual (操作小鼠胚胎實驗室手冊)，第 3 版(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)) ；Current Protocols In Molecular Biology (分子生物學(xué)當(dāng)前實驗方案)(F. M. Ausubel，等.編.， (1987)) ；Methods in Enzymology ( 61'^ ' ) (Academic Press, Inc.) :PCR 2 :A Practical Approach (PCR 2 一種實用的方法)(MJ. MacPherson，B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 編· (1995)) ；Harlow 禾口 Lane，編· (1988) Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實驗室手冊)；Harlow禾口 Lane，編· (1999) Using Antibodies, A Laboratory Manual (使用抗體，實驗室手冊)；Animal Cell Culture (動物細(xì)胞培養(yǎng))(R. I. Freshney，ed. (1987)) ；Zigova, Sanberg 禾口 Sanchez-Ramos,編· (2002) Neural Stem Cells (神經(jīng)干細(xì)胞)。如pH、溫度、時間、濃度和分子量的所有數(shù)值的名稱(包括范圍)是近似的，適當(dāng)情況下它們是以0. 1或1的增量(+)或(_)變化。這應(yīng)被理解，雖然不總是明確地表述，但所有數(shù)值名稱前面都有術(shù)語“約”。適當(dāng)情況下，術(shù)語“約”除了 “X”的較小增量如“X+0. 1或 1”或“X-0. 1或1”，還包括準(zhǔn)確值“X”。還應(yīng)理解，雖然不總是明確地表述，但本文所述試劑只是示例性的且這些試劑的等價物在本領(lǐng)域是已知的。定義在用于說明書和權(quán)利要求書時，單數(shù)形式“a”，“an”和“the”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文明確地指示。例如，術(shù)語“a cell”包括復(fù)數(shù)個細(xì)胞，包括其混合物。本文所用術(shù)語“包括”意指所述組合物和方法包括所列舉的元素，但不排除其他元素。“基本由...組成”當(dāng)用于限定組合物和方法時，將意指不含出于所述目的的組合的任何基本顯著的其他元素。因此，此處定義的基本由某些元素組成的組合物將不排除痕量污染物，所述污染物來自分離和純化方法和藥學(xué)可接受的載體，如磷酸鹽緩沖液，防腐劑等。 “由...組成”意指不包括多于痕量元素的其他成分和用于給予本發(fā)明的組合物的基本方法步驟或生產(chǎn)組合物或達(dá)到預(yù)期結(jié)果的程序步驟。這些過渡術(shù)語(transition terms)的每一種限定的實施方案都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此處關(guān)于細(xì)胞、如DNA或RNA的核酸使用的術(shù)語“分離的”，是指分別與存在于大分子的天然來源中的其他DNA或RNA分離的分子。此處使用的術(shù)語“分離的”也指在通過重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)時基本不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽，或在化學(xué)合成時基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。此外，“分離的核酸”是指包括非自然生成為片段且不會在自然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。術(shù)語“分離的”在此也用于指從其他細(xì)胞蛋白或組織分離的細(xì)胞或多肽。分離的多肽是指包括純化的和重組的多肽兩者。關(guān)于細(xì)胞(特別是干細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞)使用的術(shù)語“分離的”，是指與存在于身體中的天然組織中的其他細(xì)胞或組織分離的細(xì)胞?！笆茉囌摺保皞€體”或“患者”在此可替換使用，此處是指脊椎動物，例如靈長類動物，哺乳動物或優(yōu)選人。哺乳動物包括但不限于馬、犬、牛、綿羊、鼠、大鼠、猿、人、家畜、體育動物(sport animal)禾口寵物。術(shù)語“等位基因”在此與“等位基因變體”可替換使用，是指基因或其一些部分的可選擇的形式。等位基因占據(jù)同源染色體上相同的位點或位置。當(dāng)受試者有基因的兩個相同的等位基因時，該受試者被認(rèn)為對于該基因或等位基因是純合的。當(dāng)受試者有某基因的兩個不同的等位基因時，該受試者被認(rèn)為對于該基因是雜合的。特定基因的等位基因可以在單核苷酸或幾個核苷酸上彼此不同，并可以包括核苷酸的替換、缺失和插入。基因的等位基因也可以為包含突變的基因形式。“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”在此可替換使用。應(yīng)理解，這些術(shù)語不僅指特定受試者細(xì)胞，而且也指此細(xì)胞的后代或潛在的后代。由于在隨后的代中可能會出現(xiàn)某些由于是突變或環(huán)境影響的修飾，事實上此種代可能與母細(xì)胞不同，但仍列入此處使用的術(shù)語范圍內(nèi)。多核苷酸序列的“擴(kuò)增”(〃Amplify" “ amplifying" or" amplification 包括例如傳統(tǒng)克隆方法、PCR、連接擴(kuò)增(或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，LCR)或其他擴(kuò)增方法的方法。這些方法在本領(lǐng)域已知并被應(yīng)用。參見，例如，美國專利號4，683，195和4，683，202和Innis 等· (1990)Mol. Cell Biol. 10(11) :5977-5982 (for PCR)；和 Wu 等.(1989)Genomics4 560-569(對于LCR)。通常，該P(yáng)CR程序描述了基因擴(kuò)增的方法，所述方法包括(i)引物序列特異性雜交至在DNA樣本(或文庫)中的特定基因，(ii)隨后的擴(kuò)增，包括使用DNA聚合酶的多輪退火、延伸和變性，和(iii)篩選該P(yáng)CR產(chǎn)物至正確大小的帶。使用的引物為有足夠長度和合適序列以提供起始聚合的寡核苷酸，即，每個引物是專門設(shè)計對于待擴(kuò)增的基因組位點的每條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。進(jìn)行PCR的試劑和硬件設(shè)備為市售可得。用于擴(kuò)增來自特定區(qū)域的序列的引物優(yōu)選對于靶區(qū)域或其側(cè)翼區(qū)的序列互補(bǔ)或特異性雜交。擴(kuò)增產(chǎn)生的核酸序列可直接測序?；蛘咴摂U(kuò)增序列可在序列分析前被克隆。酶擴(kuò)增的基因組片段的直接克隆和序列分析的方法為本領(lǐng)域已知。術(shù)語“基因型”是指一個完整的細(xì)胞、基因組的特定基因或特定核苷酸區(qū)域的特定的等位基因組分，而術(shù)語“表型”是指特定基因型的可檢測的外在表現(xiàn)。此處使用的術(shù)語“基因”或“重組基因”是指包含開放閱讀框且包括至少一個外顯子和(任選)內(nèi)含子序列的核酸分子?；蛞部芍富虻亩鄳B(tài)形式或突變形式或等位基因?！巴础被颉巴恍浴被颉跋嗨菩浴笔侵冈趦蓚€肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可通過比較可出于比較的目的被比對的每個序列中的位置而被測定。如果在比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)，則這些分子在該位置上是同源的。序列之間的同源性程度是這些序列共有的配對或同源位置的數(shù)量的函數(shù)?！盁o關(guān)的”或“非同源的” 的序列與本發(fā)明的序列之一共享少于40%的同一性，但優(yōu)選少于25%同一性。多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或多肽或多肽區(qū)域)與另一序列有一定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99% )的“序列同一性”是指在比對時，在比較這兩個序列時該百分比的堿基(或氨基酸)是相同的。該比對和百分比同源性或序列同一性可使用本領(lǐng)域已知的軟件程序來測定，例如使用Ausubel等.編.Q007) Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)當(dāng)前實驗方案)描述的那些。優(yōu)選地，默認(rèn)的參數(shù)用于比對。一個比對程序是BLAST，使用默認(rèn)參數(shù)。特別是，程序為BLASTN 和 BLASTP 時，使用如下默認(rèn)參數(shù):Genetic code = standard ；filter = none ；strand = both ；cutoff = 60 ；expect = 10 ；Matrix = BL0SUM62 ；Descriptions = 50sequences ；sort by = HIGH SCORE ；Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS t ranslations+SwissftOtein+SPupdate+PIR。這些程序的詳情可在如下網(wǎng)站中找到http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，最近的訪問是在 2008 年 5 月 21 日。生物學(xué)等價的多核苷酸是有特定百分比同源性并編碼具有相同或相似的生物學(xué)活性的多肽的那些多核苷酸。術(shù)語“等價的核酸”指具有以下核苷酸序列的核酸該核苷酸序列與該核酸或其補(bǔ)體(complement)的核苷酸序列有一定程度的同源性。雙鏈核酸的同系物將包括有以下核苷酸序列的核酸所述核苷酸序列與其或其補(bǔ)體有一定程度的同源性。一方面，核酸的同系物(homolog)能夠與該核酸或其補(bǔ)體雜交。此處使用的術(shù)語“相互作用，，是指包括分子之間的可檢測的相互作用，如，可以使用例如雜交分析檢測。術(shù)語相互作用也意欲包括分子之間的“結(jié)合”相互作用。相互作用本質(zhì)上可為，例如蛋白-蛋白，蛋白-核酸或核酸-核酸的相互作用?！半s交”是指其中一個或多個多核苷酸反應(yīng)以形成雜交復(fù)合體的反應(yīng)，所述雜交復(fù)合體通過核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵合被穩(wěn)定化。所述氫鍵合可通過Watson-Crick堿基配對、Hoogstein鍵合或以任何其他的序列特異性方式形成。該復(fù)合體可包含形成二重結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復(fù)合體的三條或更多條鏈，單獨的自身雜交鏈或這些結(jié)構(gòu)的任意組合。雜交反應(yīng)可構(gòu)成在更廣泛的程序中的步驟，如PCR反應(yīng)的啟動，或通過核酶進(jìn)行的多核苷酸酶切。雜交反應(yīng)可以在不同的“嚴(yán)格”條件下進(jìn)行。通常，低嚴(yán)格的雜交反應(yīng)在約40°C 在約IOXSSC或等價離子強(qiáng)度/溫度的溶液中進(jìn)行。中等嚴(yán)格的雜交通常在約50°C，約 6XSSC中進(jìn)行，而高嚴(yán)格的雜交反應(yīng)通常在約60°C，在約IXSSC中進(jìn)行。雜交反應(yīng)也可在 “生理學(xué)條件”下進(jìn)行，該條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。生理學(xué)條件的非限制性實例是通常在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的溫度、離子強(qiáng)度、PH和Mg2+濃度。當(dāng)雜交發(fā)生在兩條單鏈多核苷酸之間的反平行結(jié)構(gòu)中時，該反應(yīng)被稱為“退火”且這些多核苷酸被稱為“互補(bǔ)的”。雙鏈多核苷酸可對于另一多核苷酸是“互補(bǔ)的”或“同源的” 一如果雜交可在該第一多核苷酸的鏈之一和第二多核苷酸之間發(fā)生?！盎パa(bǔ)”或“同源”(一種多核苷酸與另一種互補(bǔ)的程度)可按照以下方式量化在依照通?？山邮艿膲A基配對原則預(yù)期彼此形成氫鍵合的反向鏈中的堿基的比例來量化。術(shù)語"錯配"指不是100%同源的雜交的核酸二重結(jié)構(gòu)。缺乏完全同源性可能是由于缺失，插入，倒置，替換或移碼突變。在此使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指如脫氧核糖核酸(DNA)，且合適的時候指核糖核酸(RNA)的多核苷酸。該術(shù)語也應(yīng)該理解為包括，作為等價物時，包括由核苷酸類似物制成的RNA或DNA的衍生物、變體和類似物，并且在適用于所描述的實施方案時，包括單鏈(正義或反義的)和雙鏈多核苷酸。脫氧核糖核酸包括脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷和脫氧胸苷。出于清楚的目的，在此涉及核酸(其可為DNA或RNA)的核苷酸時，術(shù)語“腺苷”、“胞苷”、 “鳥苷”和“胸苷”被使用。應(yīng)理解，如果核酸是RNA，則具有尿嘧啶堿基的核苷酸是尿苷。術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”替可換使用且指任意長度的核苷酸(脫氧核苷酸或核苷酸或其類似物)的聚合體形式。多核苷酸可具有任意三維結(jié)構(gòu)且可執(zhí)行任意的已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段(例如，探針、引物、EST 或SAGE標(biāo)簽)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核酶RNA、核酶、cDNA、dsRNA、 siRNA、miRNA、重組體多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如存在，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在組裝該多核苷酸之前或之后賦予。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，例如通過與標(biāo)記組分結(jié)合。該術(shù)語也指雙鏈和單鏈分子。除非另有特別說明或要求，否則作為多核苷酸的本發(fā)明的任何實施方案都含有該雙鏈形式和已知或預(yù)測組成該雙鏈形式的的兩種互補(bǔ)單鏈形式的每一種。多核苷酸是由特定序列的四種核苷酸堿基組成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤 (G)；胸腺嘧啶(T)；且在該多核苷酸為RNA時用尿嘧啶(U)替換胸腺嘧啶。因此，術(shù)語“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的依字母順序的表示。該依字母順序的表示可被輸入至具有中央處理器的計算機(jī)的數(shù)據(jù)庫中，并且可用于生物信息學(xué)應(yīng)用例如功能基因組學(xué)和同源性搜索。術(shù)語“多態(tài)性”指共存在多于一種形式的基因或其一部分。具有至少兩種不同形式，即兩種不同的核苷酸序列的基因的一部分被稱為“基因的多態(tài)區(qū)域”。多態(tài)區(qū)域可為單核苷酸，在不同的等位基因中其同一性不同。在此使用的術(shù)語“載體”包含任何標(biāo)準(zhǔn)載體，例如磷酸鹽緩沖液、緩沖劑、水和乳液，例如油/水或水/油乳液和各種形式的濕潤劑。該組合物也可包含穩(wěn)定劑和防腐劑。對于載體、穩(wěn)定劑和助劑的實例，參見前述的Sambrook和Russell (2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道許多其他用于構(gòu)建多核苷酸的合適載體，或能通過常規(guī)的實驗確定同樣的情況。本發(fā)明的一方面，該載體是緩沖溶液例如，但不限于，PCR緩沖溶液。“基因遞送工具”被定義為可攜帶插入的多核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何分子。基因遞送工具的實例為脂質(zhì)體、生物可相容的聚合物，包括天然的聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒外殼；金屬顆粒和細(xì)菌，或病毒，如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和其他重組工具通常用于我們已經(jīng)描述的用于在多種真核和原核宿主中表達(dá)的領(lǐng)域，并可用于基因治療以及用于單純蛋白表達(dá)。在此使用的“基因遞送”、基因轉(zhuǎn)移”等，是涉及將外源多核苷酸(有時稱作“轉(zhuǎn)基因”)引入至宿主細(xì)胞的術(shù)語，不考慮用于引入的方法。這樣的方法包括多種已知的技術(shù)， 例如載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過，例如病毒轉(zhuǎn)染，有時稱作轉(zhuǎn)導(dǎo))、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)變或多種其他基于蛋白的或基于脂質(zhì)的基因遞送復(fù)合體)以及促進(jìn)“裸體的”多核苷酸遞送的技術(shù)(例如電穿孔、“基因槍”遞送和多種其他用于多核苷酸引入的技術(shù))。除非另有說明，否則術(shù)語轉(zhuǎn)染的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的或轉(zhuǎn)變的可在此替換使用以指示在細(xì)胞中外源多核苷酸或由其表達(dá)的多肽的存在。引入的多核苷酸可穩(wěn)定地或短暫地保持在宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定地保持通常要求該引入的多核苷酸或者包含與宿主細(xì)胞兼容的復(fù)制的起源或者整合至宿主細(xì)胞的復(fù)制子例如染色體外的復(fù)制子(例如，質(zhì)粒)或核的或線粒體的染色體。已知許多載體能夠介導(dǎo)基因至哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這是本領(lǐng)域已知的并在此描述。術(shù)語“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。在一些實施方案中，基因產(chǎn)物是多肽或蛋白。 在一些實施方案中，基因產(chǎn)物是mRNA、tRNA、rRNA、miRNA, dsRNA或siRNA?！胺€(wěn)定表達(dá)”外源多肽的細(xì)胞是連續(xù)表達(dá)引入至該細(xì)胞的外源基因編碼的多肽的那種，該表達(dá)在復(fù)制之后(如果該細(xì)胞正在分裂)或者持續(xù)多于一天，高至約一周、高至約兩周、高至三周、高至四周、持續(xù)數(shù)周、高至一個月、高至兩個月、高至三個月、持續(xù)數(shù)個月、 高至一年或更多?！安《据d體”被定義為重組產(chǎn)生的包含待遞送至宿主細(xì)胞的病毒或病毒顆粒，體內(nèi)、間接體內(nèi)或體外遞送。毒載體的實例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒(Ientiviral)載體、 腺病毒載體、腺相關(guān)的(adeno-associated)病毒載體、甲病毒(alphavirus)載體等。甲病毒載體，如基于kmliki Forest病毒的載體和基于Sindbis病毒的載體，已經(jīng)被開發(fā)用于基因治療和免疫治療。參見，Schlesinger 和 Dubensky (1999)Curr. Opin. Biotechnol. 5 434-439 和 Ying,等· (1999 ；Nat. Med. 5(7) :823_827。在基因轉(zhuǎn)移是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方面，載體構(gòu)建是指包含該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或其部分和治療基因的多核苷酸。此使用時，“逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”或“逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)”具有相同的意思，是指利用進(jìn)入細(xì)胞并將其基因組整合至宿主細(xì)胞的病毒將基因或核酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的程序。所述病毒可通過其正常的傳染機(jī)制進(jìn)入宿主細(xì)胞或被修飾以使其結(jié)合至不同的宿主細(xì)胞表面受體或配體以進(jìn)入細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒以RNA的形式攜帶遺傳信息；然而，一旦該病毒感染細(xì)胞，則其RNA被反轉(zhuǎn)錄為DNA形式，該DNA整合至被感染的細(xì)胞的基因組DNA。整合的DNA形式被稱作前病毒。在此使用時，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是指能通過病毒或病毒類進(jìn)入機(jī)制將外源核酸引入細(xì)胞的病毒顆粒?！奥《据d體”是一類在本領(lǐng)域公知的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它相對于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)未分裂的細(xì)胞方面具有確定的優(yōu)勢。參見，Trono D. (2002)Lentiviral vectors,New York =Sphng-Verlag Berlin Heidelberg。在基因轉(zhuǎn)移是通過DNA病毒載體，例如腺病毒(Ad)或腺相關(guān)的病毒(AAV)介導(dǎo)的方面，載體構(gòu)建是指包含該病毒基因組或其部分或轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。腺病毒(Ads)為相對良好特征化的病毒的同源組，包括超過50種血清型。參見，例如，國際PCT申請?zhí)朩O 95/27071. Ads不需要整合至宿主細(xì)胞基因組。重組Ad衍生的載體，特別是減少野生型病毒的重組和產(chǎn)生的潛能的那些，也已經(jīng)被構(gòu)建。參見，國際PCT申請?zhí)朩O 95/00655 and WO 95/11984。野生型AAV在整合至宿主細(xì)胞基因組方面有高度的傳染性和特異性。參見，Hermonat 禾口 Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6466-6470 禾口 Lebkowski， 等· (1988)MoI. Cell. Biol. 8 :3988_3996。包含啟動子和多核苷酸可被有效連接至其中的克隆位點的載體在本領(lǐng)域是公知的。這類載體能夠體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄RNA，并且可商業(yè)得自例如Mratagene (La JoIIa, CA)和 Promega Biotech (Madison, Wl)的來源。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能需要去除、添加或改變克隆的5'和/或3'未翻譯部分，以消除額外的、潛在的不合適的選擇性翻譯起始密碼子或其他可能會在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平干擾或減少表達(dá)的序列?；蛘?，一致的核酶結(jié)合位點可被立即插入至起始密碼子的5'端以增強(qiáng)表達(dá)。“在轉(zhuǎn)錄條控制下”是本領(lǐng)域公知的術(shù)語，是指多核苷酸序列，通常為DNA序列的轉(zhuǎn)錄，依賴于其有效地連接至對起始或增強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄有貢獻(xiàn)的元素。“有效連接的”指該多核苷酸以使它們在細(xì)胞中發(fā)揮功能的方式被準(zhǔn)備?；蜻f送工具也包括幾種非病毒的載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體、和靶向的病毒蛋白-DNA復(fù)合體。也包含靶向抗體或其片段的脂質(zhì)體可用于本發(fā)明的方法中。增強(qiáng)遞送至細(xì)胞，本發(fā)明的核酸或蛋白可被結(jié)合至結(jié)合細(xì)胞表面抗原的抗體或其結(jié)合片段，所述抗原例如干細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)記物。當(dāng)用于多核苷酸操作的內(nèi)容時“探針”指被用作通過與靶標(biāo)雜交來探測潛在存在于目的樣品中的靶標(biāo)的試劑的寡核苷酸。通常，探針包含標(biāo)記或方式，標(biāo)記可通過該方式在雜交反應(yīng)之前或之后被附著。合適的標(biāo)記在此被描述并例示?！耙铩笔嵌痰亩嗪塑账幔ǔ＞哂杏坞x的3' -OH基，該3' -OH基通過與靶標(biāo)雜交結(jié)合至可能存在于目的樣品中的靶標(biāo)或“模板”，由此促進(jìn)與該靶標(biāo)互補(bǔ)的多核苷酸的聚合?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)是一種復(fù)制拷貝的反應(yīng)，該拷貝使用由“上游”和“下游” 引物組成“引物對”或“引物組”，和聚合催化劑例如DNA聚合酶且通常為熱穩(wěn)定的聚合酶自靶多核苷酸制成。用于PCR的方法是本領(lǐng)域公知的，且在例如M. MacPherson等.(1991) PCR :A Practical Approach, IRL Press 于 Oxford University Press 中指導(dǎo)。所有生產(chǎn)多核苷酸的復(fù)制拷貝的方法，例如PCR或基因克隆，在此共同地被稱為"復(fù)制"。在雜交反應(yīng)中引物也可用作探針，例如Southern或Northern印記分析。Sambrook等.，見上文。引物也可任選包含可檢測的標(biāo)記，并在此例示和描述。
在此使用的術(shù)語“標(biāo)記”意指直接或間接地結(jié)合至待檢測的組合物，例如多核苷酸或蛋白例如抗體以產(chǎn)生“標(biāo)記的”組合物的可直接或間接檢測的化合物或組合物。該術(shù)語也包括結(jié)合至將通過表達(dá)插入的序列提供信號的多核苷酸的序列，例如綠色熒光蛋白(GFP) 等。該標(biāo)記可通過自身被檢測到(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)或，在酶的標(biāo)記情況下，可催化底物化合物或組合物的可檢測的化學(xué)轉(zhuǎn)變。該標(biāo)記可適合小規(guī)模的檢測或更適合高通量的篩選。同樣地，合適的標(biāo)記，包括但不限于，放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光的化合物、染料或包括酶的蛋白。該標(biāo)記可被簡單探測或其可被定量。簡單檢測的反應(yīng)通常包含其存在僅被加強(qiáng)的反應(yīng)，其中被定量的反應(yīng)通常包含具有可量化(例如可用數(shù)字報告的)值例如強(qiáng)度、極化和/或其它特性的反應(yīng)。在發(fā)光或熒光分析中，可檢測的反應(yīng)可直接使用與事實上包含于結(jié)合中的分析組分偶聯(lián)的發(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)產(chǎn)生，或者使用與另一 (例如報告子(reporter)或指示劑)組分偶聯(lián)的發(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)直接產(chǎn)生。產(chǎn)生信號的發(fā)光標(biāo)記的實例包括，但不限于生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光?？蓹z測的發(fā)光反應(yīng)通常包含發(fā)光信號的改變或發(fā)光信號的出現(xiàn)。合適的用于發(fā)光標(biāo)記分析組分的方法和發(fā)光團(tuán)為本領(lǐng)域已知的，描述于例如Haugland，Richard P. (1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (熒光探針和研究化學(xué)品手冊)(第 6 版)。 發(fā)光探針的實例包括但不限于，水母發(fā)光蛋白和熒光素酶。合適的熒光標(biāo)記的實例包括，但不限于，熒光素(fluorescein)、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、曙紅、藻紅(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀石綠(Malacite green)、均二苯乙烯、熒光黃、Cascade Blue. TM.、和德克薩斯紅(Texas Red)。其他合適的光學(xué)染料描述于Haugland，Richard P. (1996)(熒光探針和研究化學(xué)品手冊)(第6版)。另一方面，熒光標(biāo)記被功能化以促進(jìn)共價附著于存在于細(xì)胞或組織中或在細(xì)胞或組織表面的細(xì)胞組分，例如細(xì)胞表面標(biāo)記物。合適的官能團(tuán)，包括，但不限于，異硫氰酸脂基團(tuán)、氨基基團(tuán)、鹵代乙?；ⅠR來酰亞胺、琥珀酰亞胺基脂和磺酰基鹵化物，所有這些均可用于將熒光標(biāo)記附著于第二分子上。熒光標(biāo)記的官能團(tuán)的選擇將取決于附著于連接子、試劑、 標(biāo)記物或第二標(biāo)記試劑的位點。熒光標(biāo)記的附著可為直接附著至細(xì)胞組分或化合物或者，可通過連接子附著。 用于間接將熒光標(biāo)記連接至媒介物的結(jié)合對包括，但不限于，抗原/抗體，例如，玫瑰紅/ 抗-玫瑰紅，生物素/卵蛋白和生物素/抗生物素蛋白鏈菌素(sti^pavidin)。短語“固體載體”指非水性表面例如“培養(yǎng)盤基因芯片”或“微陣列”。此種基因芯片或微陣列可通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)用于診斷和治療的目的。在一種技術(shù)中，寡核苷酸在基因芯片上被附著并被分析用于通過雜交方法測定DNA序列，例如在美國專利號6，025，136和6，018，041中列出。本發(fā)明的多核苷酸可被修飾為探針，該探針反過來可用于檢測基因序列。這類技術(shù)已描述于例如，美國專利號5，968，740和5，858，659 中。探針也可被附著或附貼至電極表面用于電化學(xué)檢測核酸序列，例如描述于Kayem等.美國專利號 5，952，172 和通過 Kelley 等· (1999)Nucleic Acids Res. 27 :4830-4837 描述。多種“基因芯片”或“微陣列”和類似的技術(shù)在本領(lǐng)域已知。這樣的例子包括，但不限于，LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.) ；GeneChip (Affymethc, Inc)； LabChip (Caliper Technologies Corp)；具有電化學(xué)傳感的低密度陣列(臨床微傳感 器(Clinical Micro Sensors)) ；LabCD 系統(tǒng)(Gamera Bioscience Corp. ) ；OmniGrid (Gene Machines) ；Q Array (Genetix Ltd.)；具有液相表達(dá)技術(shù)高通量、自動化質(zhì)譜系統(tǒng)(Gene Trace Systems, Inc.)；熱噴身寸點系統(tǒng)(Hewlett Packard Company)； (Hewlett Packard Company) ；Hyseq HyChip(Hyseq, Inc.) ；BeadArray(11 lumina, Inc.) ；GEM(Incyte Microarray系統(tǒng))；可分配12至64個點(spot)至多個載玻 >t ± 白勺 1 it fi it P車歹U 胃■ (Intelligent Bio-Instruments) ；Molecular Biology Workstation and NanoChip (Nanogen, Inc.)；微流體玻璃芯片(Orchid Biosciences, Inc.)；具有四個PiezoTip壓電的根據(jù)需要滴加的(drop-on-demand)尖頭的BioChip Arrayer(Packard Instruments,Inc.) ；FlexJet(Rosetta Inpharmatic,Inc.) ；MALDI-TOF 質(zhì)譜儀(Sequnome) ；ChipMaker 2 禾口 ChipMaker 3(TeleChem International, Inc.)； 和 GenoSensor (Vysis, Inc.)如鑒定和描述于 Heller (2002)Annu. Rev. Biomed. Eng. 4 129-153. “基因芯片”的實例或“微陣列”也描述于美國專利公開號=2007/0111322 ； 2007/0099198 ；2007/0084997 ；2007/0059769 和 2007/0059765 和美國專利號7，138，506 ； 7，070，740 和 6，989，267 中。一方面，包含與在此描述的多核苷酸同源的探針或引物的“基因芯片”或“微陣列” 被制備。合適的樣品得自患者，進(jìn)行基因組DNA、RNA、蛋白或其任意組合的提取和擴(kuò)增(如有需要)。將該樣品在適合用于將目的基因或基因產(chǎn)物雜交至包含在基因芯片或微陣列上的探針或引物的條件下接觸至基因芯片或微陣列控制板。該探針或引物可被可檢測地標(biāo)記，由此辨認(rèn)目的序列。或者，可使用化學(xué)或生物學(xué)反應(yīng)來辨認(rèn)與目的基因的DNA或RNA雜交的探針或引物。然后在前述裝置和方法的協(xié)助下患者的基因型或表型被測定?！敖M合物”意指活性試劑和另外的化合物或組合物的組合，所述另外的化合物或組合物為惰性的(例如，可檢測的試劑或標(biāo)記)或活性的，例如助劑?！八幬锝M合物”將包括活性試劑與載體的組合，所述載體為惰性的或活性的，使該組合物適合用于體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)使用的診斷治療用途。在此使用的術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”包含任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸鹽緩沖液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液和各種形式的濕潤劑。該組合物也可包含穩(wěn)定劑和防腐劑。載體、穩(wěn)定劑和助劑的實例參見Martin(1975)Remington' s Pharm. Sci. (Remington 藥物科學(xué))，第 15 版(Mack Publ. Co.，Easton)。對于局部使用，該藥學(xué)可接受的載體適合用于生產(chǎn)乳劑、軟膏、凝膠劑、膠、溶液、 懸液等。此種載體為本領(lǐng)域常規(guī)的，例如用于與聚乙二醇(PEG)的局部給予。這些配方可任選包含其他藥學(xué)可接受的成分例如稀釋劑、穩(wěn)定劑和/或助劑。。。?！盎就础泵枋隽似渲卸嘤诩s50%，或者多于約60%，或者多于70%，或者多于75%，或者多于80%，或者多于 85%，或者多于90%，或者多于95%的細(xì)胞有相同或相似的表型的細(xì)胞群體。表型可通過預(yù)選擇的細(xì)胞表面標(biāo)記物或其他標(biāo)記物，例如，肌球蛋白或肌動蛋白或基因或蛋白的表達(dá)， 例如鈣調(diào)控蛋白、t-微管蛋白或者，鈣泵蛋白測定。另外的方面，基本同源的群體比野生型的對應(yīng)的(counterpart)細(xì)胞或組織具有減少的(例如，少于約95%，或者少于約90%，或者少于約80%，或者少于約75%，或者少于約70%，或者少于約65%，或者少于約60%，或者少于約55%，或者少于約50%)正常水平的表達(dá)?！吧窠?jīng)退行性疾病”是其中大腦和脊髓的細(xì)胞丟失的病癥。神經(jīng)退行性疾病的實例包括但不限于，亨廷頓氏病、ALS和多發(fā)性硬化。大腦和脊髓由行使不同功能，例如控制運(yùn)動、處理感覺信息和做決定的神經(jīng)元組成。大腦和脊髓的細(xì)胞不是容易地全體再生，因此過度的損害可能是災(zāi)難性的。神經(jīng)退行性疾病得自神經(jīng)元或其髓鞘的劣化，隨時間的延長將導(dǎo)致由此產(chǎn)生的機(jī)能障礙和無能。診斷或治療的“受試者”為細(xì)胞或包括人的哺乳動物。接受診斷或治療的非人動物包括，例如，猿、鼠、豚鼠、犬(例如狗)、兔類(例如兔)、家畜(例如?；蜇i)、體育動物和寵物?！坝行Я俊笔亲阋赃_(dá)到有利的或想要的結(jié)果的量。有效量可以以一次或多次給予、 應(yīng)用或劑量給予，且可被本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)驗性地測定。“對照”是出于對比目的用于試驗的供選擇的受試者或樣品。對照可為“陽性”或 “陰性”。例如，其中試驗的目的是測定突變的等位基因與特定表型的相互關(guān)系，通常優(yōu)選使用陽性對照(得自攜帶此種突變并表現(xiàn)需要的表型的受試者的樣品)，和陰性對照(得自缺少該突變的等位基因并缺少該表型的受試者或樣品)。術(shù)語“癌”、“新生物(neoplasm)”和“腫瘤”可交替使用，并且以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式使用，指以下細(xì)胞已經(jīng)歷使其對于宿主生物體是病態(tài)的惡性轉(zhuǎn)化。原代癌細(xì)胞(即，得自惡性轉(zhuǎn)化的位點附近的細(xì)胞)可通過已建立的技術(shù)，特別是組織學(xué)檢查容易地與非癌細(xì)胞相區(qū)別。在此使用的癌細(xì)胞的定義，不僅包括原代癌細(xì)胞，也包括任何得自癌細(xì)胞祖先的細(xì)胞。這包括轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，和體外培養(yǎng)物和得自癌細(xì)胞的細(xì)胞系。當(dāng)涉及正常地顯示為實體瘤的癌的類型時，“臨床可檢測的”腫瘤是可基于腫瘤團(tuán)塊(tumor mass)檢測的那種；例如，通過例如CAT掃描、磁共振成像(MRI)、X-射線、超聲或觸診的程序。單獨的生化的或免疫學(xué)的發(fā)現(xiàn)可能不足以符合該定義。新生物是一種不正常的細(xì)胞的團(tuán)塊或群體，所述細(xì)胞通過相對獨立自主的組織的生長產(chǎn)生。大多數(shù)新生物源于已經(jīng)歷新生物轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞的克隆擴(kuò)展。正常細(xì)胞至新生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可由直接且不可逆地改變細(xì)胞基因組的化學(xué)的、物理的或生物學(xué)試劑(或事件)引起。新生物細(xì)胞通過失去一些專門的功能和獲得新的生物學(xué)特性，最重要的是相對獨立自主(不受控制的)生長的特性，來表征。新生物細(xì)胞將它們的可遺傳的生物學(xué)特性傳遞給后代細(xì)胞。新生物的過去的、在的和未來的預(yù)測的生物學(xué)行為，或臨床過程在此被進(jìn)一步分類為良性的或惡性的，這是在診斷、治療和預(yù)后方面的重要的區(qū)別。惡性的新生物顯示較大程度的自主性，能夠侵入和遷移擴(kuò)展，可抗治療，且可引起死亡。良性新生物具有較小程度的自主性，通常不入侵，不轉(zhuǎn)移，且如果充分治療通常不產(chǎn)生大的危害。癌是惡性新生物的通稱。退行(anaplasia)是癌細(xì)胞的獨特性質(zhì)，表示缺少正常結(jié)構(gòu)和功能性特性(未分化)。腫瘤字面上是任何類型的隆起，例如炎性或其它隆起，但調(diào)制器(modem)使用通常指新生物。后綴“-oma”是指腫瘤，且通常指良性新生物，如纖維瘤、脂肪瘤等，但有時意指惡性新生物，如所謂的黑素瘤、肝癌和精原細(xì)胞瘤，乃至非新生物的損傷，如血腫、肉芽腫或錯構(gòu)瘤。后綴"-blastoma"指胚胎細(xì)胞的新生物，例如腎上腺的成纖維細(xì)胞瘤或眼的視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤。組織發(fā)生是組織的起源，且為基于起源的組織細(xì)胞對新生物分類的方法。腺瘤是腺上皮的良性新生物。癌(Carcinomas)是上皮的惡性腫瘤。肉瘤是間充質(zhì)組織的惡性腫瘤。分類瘤形成(neoplasia)的系統(tǒng)利用通過生物學(xué)(臨床的)行為(無論良性的或惡性的)和組織發(fā)生，通過組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查測定的新生物的起源的起源的組織或細(xì)胞。新生物可在幾乎任何包含能有絲分裂的細(xì)胞的組織中開始。新生物的組織發(fā)生分類是基于通過組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查測定的起源的組織(或細(xì)胞)?！耙种啤蹦[瘤生長意指與沒有任何治療的增長相比的縮減的生長狀態(tài)。瘤細(xì)胞生長可通過本領(lǐng)域已知的任何方法評估，所述方法包括但不限于，測量腫瘤尺寸、確定使用 3H-胸苷合并的分析腫瘤細(xì)胞是否是多育的(proliferating)，或者對腫瘤細(xì)胞計數(shù)。“抑制”腫瘤細(xì)胞生長是指任意或全部以下狀態(tài)減慢、延遲，且“抑制”腫瘤生長是指當(dāng)停止腫瘤生長，以及腫瘤收縮時縮減的生長狀態(tài)。SiRNA, dsRNA, miRNA"RNA干擾”(RNAi)指由短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的序列特異性的或基因特異性的基因表達(dá)(蛋白合成)抑制?！岸谈蓴_RNA”(siRNA)指雙鏈RNA分子(dsRNA)，通常來自能介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的長度約10至約30個核苷酸，或長度為11個核苷酸，長度為12個核苷酸，長度為13個核苷酸，長度為14個核苷酸，長度為15個核苷酸，長度為16個核苷酸， 長度為17個核苷酸，長度為18個核苷酸，長度為19個核苷酸，長度為20個核苷酸，長度為 21個核苷酸，長度為22個核苷酸，長度為23個核苷酸，長度為M個核苷酸，長度為25個核苷酸，長度為26個核苷酸，長度為27個核苷酸，長度為觀個核苷酸或長度為四個核苷酸。 此處使用的術(shù)語siRNA包括短發(fā)夾RNA(shRNA)。定向于基因或基因的mRNA的siRNA可為識別基因的mRNA并將RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)引導(dǎo)至該mRNA導(dǎo)致該mRNA退化的 SiRNA0定向于基因或基因的mRNA的siRNA也可為識別mRNA并抑制該mRNA翻譯的siRNA?！半p鏈RNA” (dsRNA)指可為任意長度且可被細(xì)胞內(nèi)裂解為較小RNA分子，例如 siRNA的雙鏈RNA分子。在具有勝任的干擾素應(yīng)答的細(xì)胞中，較長的dsRNA，例如長于約 30個堿基對長度的那些，可觸發(fā)該干擾素應(yīng)答。在沒有勝任的干擾素應(yīng)答的其他細(xì)胞中， dsRNA可用于觸發(fā)特定的RNAi。siRNA可按照本領(lǐng)域已知的程序設(shè)計。參見，例如，Dykxhoorn, D. M.和 Lieberman, J. (2006) “ Running Interference Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs, " Annu. Rev. Biomed. Eng. 8 377-402 ；Dykxhoorn, D. Μ. φ . (2006) “ The silent treatment :siRNAs as small molecule drugs, “ Gene Therapy, 13 :541-52 ；Aagaard,L.禾口 Rossi，J. J. (2007)" RNAi therapeutics :Principles,prospects and challenges, " Adv. Drug Delivery Rev. 59 75-86 ；de Fougerolles, Α.等.(2007) " Interfering with disease :a progress report on siRNA-based therapeutics, " Nature Reviews Drug Discovery 6 :443-53 ； Krueger, U.等.(2007) " Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNA validation screening, “ Oligonucleotides 17 :237-250 ；美國專利申請公開號 2008/0188430 ；和美國專利申請公開號2008/(^49055。將siRNA遞送至間充質(zhì)干細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞，該遞送可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。參見，例如，Dykxhoorn, D. Μ.和 Lieberman，J. (2006) ‘‘ Running Interference :Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs, " Annu. Rev. Biomed.Eng.8 :377-402 ；Dykxhoorn,D. M.等· (2006) “ The silent treatment :siRNAs as small molecule drugs, " Gene Therapy, 13 :541-52 ；Aagaard, L.禾口 Rossi， J. J. (2007) “ RNAi therapeutics Principles, prospects and challenges, " Adv. Drug Delivery Rev. 59 :75-86 ；de Fougerolles, Α.等.(2007) " Interfering with disease :a progress report on siRNA-based therapeutics, " Nature Reviews Drug Discovery 6 :443-53 ；Krueger, U.等.(2007) " Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNA validation screening, “ Oligonucleotides 17 :237-250 ；美國專利申請公開號 2008/0188430 ；和美國專利申請公開號2008/(^49055。siRNA可被化學(xué)修飾以增加其穩(wěn)定性和安全性。參見，例如Dykxhoorn，D.M.和 Lieberman, J. (2006) “ Running Interference Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs," Annu. Rev. Biomed. Eng. 8 :377-402 和美國專利申請公開號2008/0249055。microRNA或miRNA是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的長度為21_23個核苷酸的單鏈RNA分子。 miRNA通過以下基因編碼它們轉(zhuǎn)錄自其0嫩，但miRNA不被翻譯成蛋白(非編碼RNA)；相反每個初級轉(zhuǎn)錄本(ph-miRNA)被加工成稱為前miRNA的短莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并最終加工成功能 miRNA。成熟miRNA分子與一個或多個信使RNA (mRNA)分子部分互補(bǔ)，并且它們的主要功能是下游調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此處使用的siRNA載體、dsRNA載體或miRNA載體，指包含調(diào)節(jié)RNA表達(dá)的啟動子的質(zhì)?；虿《据d體。調(diào)節(jié)siRNA、dsRNA或miRNA表達(dá)的“siRNA啟動子”或啟動子為本領(lǐng)域已知，例如，描述于 Miyagishi 和 Taira Q002) Nature Biotech. 20 :497-500 中的 U6 啟動子，和描述于 Brummelkamp 等.OOOWkience 296 :550-3 中的 Hl 啟動子。干細(xì)胞此處使用的“干細(xì)胞”定義在培養(yǎng)時有能力分裂無限周期并產(chǎn)生分化的細(xì)胞的細(xì)胞。此時并為了方便，干細(xì)胞被分類為體(成年)或胚胎的干細(xì)胞。體干細(xì)胞是發(fā)現(xiàn)于分化的組織中的未分化的細(xì)胞，其可自身更新(克隆的)且(具有一定限制)可分化以獲得它所起源的組織的所有特化的細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞是原代的(未分化的)細(xì)胞，其得自具有成為很多種特化的細(xì)胞類型潛能的胚胎。胚胎干細(xì)胞是已在允許增殖但不分化達(dá)數(shù)月至數(shù)年的體外條件下培養(yǎng)的那種。胚胎干細(xì)胞的非限制性實例是得自ESI，Singapore的HES2 (也稱為ES02)的細(xì)胞系和得自WiCells，Madison, WI的Hl (也稱為WA01)細(xì)胞系。多能胚胎干細(xì)胞可通過使用標(biāo)記物區(qū)別于其他類型的細(xì)胞，所述標(biāo)記物包括，但不限于，Oct-4、堿性磷酸酶、CD30、TDGF-I、GCTM-2、GenesiS、生殖細(xì)胞核因子、SSEA1、SSEA3，和 SSEA4?！伴g充質(zhì)干細(xì)胞”或MSC，是可分化至多種細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞。名稱MSC也指術(shù)語“骨髓基質(zhì)細(xì)胞”。MSC已顯示出體外或體內(nèi)分化成的細(xì)胞類型包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。間充質(zhì)是胚胎結(jié)締組織，其得自中胚層并分化成造血組織和結(jié)締組織，其中MSC不分化成造血細(xì)胞。基質(zhì)細(xì)胞是形成支持結(jié)構(gòu)的結(jié)締組織細(xì)胞，其中該組織的功能細(xì)胞位于該支持結(jié)構(gòu)中。雖然這是對MSC的一個功能的準(zhǔn)確描述，但該術(shù)語不能傳遞相對最近發(fā)現(xiàn)的MSC在組織修復(fù)中的作用。申請人已描述了分離、繁殖和遺傳上改造骨髓基質(zhì)細(xì)胞/間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法超過二十年(參見Nolta，Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells, Springer 2006)。分離此類細(xì)胞、繁殖和分化此類細(xì)胞的方法為本技術(shù)和專利領(lǐng)域已知的，例如美國專利申請?zhí)?2007/0224171, 2007/0054399, 2009/0010895，其通過引用以其全文結(jié)合至至此。此處使用的“神經(jīng)或神經(jīng)元干細(xì)胞”指能夠自我復(fù)制并產(chǎn)生多重特化的神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞類型的細(xì)胞。一些方面，神經(jīng)干細(xì)胞為在前腦側(cè)腦室(LV)的亞室(subventricular) 區(qū)域(SVZ)中的多能神經(jīng)干細(xì)胞?？寺』颉翱寺∪后w”是遺傳上等同于起源細(xì)胞的細(xì)胞系；此種情況下，起源細(xì)胞為干細(xì)胞?！扒绑w”或“祖先細(xì)胞”意指能分化呈特定類型的細(xì)胞的細(xì)胞。祖先細(xì)胞可為干細(xì)胞。祖先細(xì)胞也可為比干細(xì)胞更特化的細(xì)胞。祖先細(xì)胞可為單能的或多能的。與成年干細(xì)胞比較，祖先細(xì)胞可為細(xì)胞分化的母階段。祖先細(xì)胞通常發(fā)現(xiàn)于成年生物鐘，它們作為對身體的修復(fù)系統(tǒng)。祖先細(xì)胞的實例包括但不限于，發(fā)現(xiàn)于肌肉中的衛(wèi)星細(xì)胞，在亞室區(qū)域中形成的中間祖先細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，骨膜祖先細(xì)胞，胰臟祖先細(xì)胞和成血管或內(nèi)皮祖先細(xì)胞。祖先細(xì)胞的實例也可包括但不限于，來自前腦側(cè)腦室(LV)的室管膜細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。術(shù)語“繁殖”指生長或改變細(xì)胞或細(xì)胞群體的表型。術(shù)語“生長”是指在支持培養(yǎng)基、營養(yǎng)素、生長因子、支持細(xì)胞或任何對于獲得所需數(shù)量的細(xì)胞或細(xì)胞類型必需的化學(xué)或生物學(xué)化合物存在下細(xì)胞的增殖。一個實施方案中，細(xì)胞的生長導(dǎo)致組織的再生。術(shù)語“培養(yǎng)”是指在多種培養(yǎng)基上或在多種培養(yǎng)基中體外繁殖細(xì)胞或組織。應(yīng)理解培養(yǎng)時生長的細(xì)胞的后代可能與母細(xì)胞不完全相同(即，形態(tài)學(xué)上、遺傳上或表型上)。 “擴(kuò)展的”是指細(xì)胞的任何增殖或分裂?！翱寺≡鲋场笔侵讣?xì)胞群體通過單細(xì)胞連續(xù)分裂成兩個相同的子細(xì)胞和/或相同細(xì)胞群體的生長。此處使用的細(xì)胞的“譜系”定義為細(xì)胞的遺傳，即其祖先和后代。細(xì)胞的譜系將該細(xì)胞置于發(fā)育和分化的遺傳方案中。細(xì)胞或細(xì)胞的群體的衍生物是分離的細(xì)胞或細(xì)胞群體的子細(xì)胞。衍生物包括從分離的干細(xì)胞或干細(xì)胞群體培養(yǎng)和繁殖的擴(kuò)展的克隆細(xì)胞或分化的細(xì)胞。衍生物也包括已經(jīng)衍生的干細(xì)胞或干細(xì)胞的群體?！胺只泵枋龅氖瞧渲蟹翘鼗募?xì)胞獲得特化細(xì)胞例如心臟、肝臟或肌肉細(xì)胞的特征的過程?！岸ㄏ蚍只敝缚刂聘杉?xì)胞培養(yǎng)條件以誘導(dǎo)分化至特定細(xì)胞類型?！胺只摹倍x在細(xì)胞譜系中恢復(fù)至較少定型的位置的細(xì)胞。此處使用的術(shù)語“分化或分化的”定義在細(xì)胞譜系中使用較多定型的(“分化的”)位置的細(xì)胞。此處使用的“分化成中胚層(或外胚層或內(nèi)胚層)譜系的細(xì)胞”定義開始分別定型至特異的中胚層、外胚層或內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞。分化至中胚層譜系或產(chǎn)生特異的中胚層細(xì)胞的細(xì)胞實例包括，但不限于，成脂的，成平滑肌的 (Ieiomyogenic)，成軟骨的，心原的，皮原的，血細(xì)胞生成的，成血管的(hemangiogenic)，生肌的，生腎的，生殖器原的(urogenitogenic)，成骨的，成心包的(pericardiogenic)細(xì)胞。此處使用的“多能細(xì)胞”定義可產(chǎn)生至少兩種顯著(基因型和/或表型上)進(jìn)一步分化的后代細(xì)胞的較少分化的細(xì)胞。另一方面，“多能細(xì)胞”包括誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPSC)，其為人工衍生的來自非多能細(xì)胞的通過誘導(dǎo)表達(dá)一個或多個干細(xì)胞特異性基因產(chǎn)生的干細(xì)胞，該非多能細(xì)胞通常為成年體細(xì)胞。此類干細(xì)胞特異性基因包括，但不限于，八聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，即0ct-3/4 ；Sox基因家族，即Soxl，Sox2，Sox3，Soxl5和Soxl8 ；Kif基
1因家族，即KIfI，Klf2，Klf4和Klf5 ；Myc基因家族，即c_myc和L_myc ；Nanog基因家族，即 0CT4，NANOG 和 REXl ；或 LIN28. iPSC 的實例描述于 Takahashi K.等.O007)Cell advance online publication 20 November 2007 ；Takahashi K.&Yamanaka S. (2006)Cell 126 663-76 ；Okita K.等· (2007)Nature 448 :260-262 ；Yu, J.等· (2007)Science advance online publication 20November 2007 ；and Nakagawa, M.等· (2007)Nat. Biotechnol. Advance 2007年11月30日在線公布?！岸嘧V系干細(xì)胞”或“多能干細(xì)胞”指從顯著發(fā)育的譜系復(fù)制其自身和至少兩種進(jìn)一步分化的后代細(xì)胞的干細(xì)胞。該譜系可來自相同的胚層(即中胚層、外胚層或內(nèi)胚層)， 或來自不同的胚層。來自多譜系干細(xì)胞的分化的顯著發(fā)育的譜系的兩種后代細(xì)胞的實例為生肌細(xì)胞和成脂細(xì)胞(都來自中胚層，然而產(chǎn)生不同的組織)。另一實例是發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞 (外胚層起源的)和成脂細(xì)胞(中胚層起源的)。神經(jīng)干細(xì)胞是可從成年的哺乳動物(包括人)中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的細(xì)胞。它們已顯示出產(chǎn)生神經(jīng)元、遷移和長出軸突投射和樹突投射并遷移進(jìn)入預(yù)存在的神經(jīng)元回路并對正常的腦功能有貢獻(xiàn)。該領(lǐng)域的研究綜述參見MilleH2006)The Promise of Stem Cells for Neural Repair,Brain Res. Vol. 1091(1) :258-264 ；Pluchino φ . (2005)Neural Stem Cells and Their Use as Therapeutic Tool in Neurological Disorders, Brain Res. Brain Res. Rev. , Vol. 48(2) :211-219 ；and Goh,等·(2003)Adult Neural Stem Cells and Repair of the Adult Central Nervous System, J. Hematother. Stem Cell Res., Vol. 12(6) :671-679.細(xì)胞的群體意指多于一種在表型和/或基因型方面相同的(克隆的)或非相同的細(xì)胞的集合。此處使用的“細(xì)胞突起”是指不包含連接蛋白或間隙結(jié)合類型連接的細(xì)胞與細(xì)胞接觸。一方面，細(xì)胞突起為細(xì)胞質(zhì)延伸或廣泛區(qū)域的細(xì)胞接觸，如MSC和皮膚成纖維細(xì)胞之間觀察到的，描述于 Applicants in Spees 等.(2006) PNAS 103(5) =1283-8.另一方面， 細(xì)胞突起是在MSC和心原細(xì)胞共培養(yǎng)時觀察到的它們之間形成的通道微管，于Plofnikov 等.(2008) J. Cell. MoI. Med. 12 (5A) :1622_31。一些實施方案中，細(xì)胞突起是細(xì)的、伸長的、活性絲足和層形足板、細(xì)胞管狀構(gòu)造(cytoneme)、細(xì)胞管狀構(gòu)造類突起、頂端圍足部 (peripodial)延伸、肌足(myopodia)、肌足類突起、細(xì)胞延伸或頂端或側(cè)面細(xì)胞突起，描述于 Gurke 等· (2008)Histochem. Cell Biol. 129 :539_50?！拔⑴荨睘樵诨顒踊蚓幊趟劳鲞^程中從幾乎所有細(xì)胞類型流出的IOOnm至700nm范圍的質(zhì)膜的片段。它們直接源自細(xì)胞的質(zhì)膜并反映它們源自的細(xì)胞的抗原內(nèi)容。本發(fā)明的實施方式亨廷頓氏病(HD)的病理是由亨廷頓蛋白(htt)基因的蛋白產(chǎn)物的可變大小的多聚谷氨酰胺(PG)的擴(kuò)展引起的。Htt基因位于4號染色體短臂上。Htt包含三個DNA堿基-胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)重復(fù)多次的序列，稱作三核苷酸重復(fù)。通常地，人具有少于27個重復(fù)的谷氨酰胺。具有少于36個谷氨酰胺的Htt導(dǎo)致稱作亨廷頓蛋白的細(xì)胞質(zhì)蛋白的產(chǎn)生。然而，36個或更多的谷氨酰胺的序列導(dǎo)致具有不同特征的Htt形式的產(chǎn)生。 這種改變的形式，被稱為突變Htt或更通稱被稱為mHtt，其增加了確定類型的神經(jīng)元的神經(jīng)元衰退的比率和增加具有較高比例或從屬于該神經(jīng)元衰退的大腦區(qū)域。通常，CAG的數(shù)目與該程序被感染多少有關(guān)聯(lián)，并與起始的年齡和癥狀的發(fā)展程度有關(guān)。例如，36-39次重復(fù)導(dǎo)致比平均值晚得多的起始和更慢的癥狀的發(fā)展，由此一些個體可能在他們正好顯示亨廷頓病癥狀前死于其他原因；這被稱為“減小的外顯率”。具有非常大的重復(fù)數(shù)目，HD可在 20歲的年齡下發(fā)生，那時被稱為青少年HD，運(yùn)動不能-僵硬的，或Westphal變體HD ；這占 HD攜帶者的約7%。停止HD發(fā)展的最好的希望是減少或消除在感染的細(xì)胞中的突變htt蛋白。小干擾RNA(siRNA)已顯示出在動物模型中對減少htt水平和改進(jìn)疾病癥狀有效(DiFiglia 等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A. 104 :17204-17209 ；Wang 等.(2005)Neurosci Res. 53 :241-249).新的數(shù)據(jù)顯示，突變的htt mRNA可被特定地靶向，同時保留正常等位基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本Gchwarz (2006)PLoS Genet. 2 :el40)。這項技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是以一種持續(xù)、安全且有效的方式將siRNA遞送至人類大腦。直接的siRNA傳遞是對于問題的有效的、 但稍縱即逝的答案。siRNA不會跨越血腦屏障以治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病如亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏癥，ALS和其他疾病。治療神經(jīng)退行性疾病所需的長時間遞送siRNA 以沉默突變基因，仍然是當(dāng)前阻礙有效治療用途的關(guān)鍵的尚未解決的問題。本發(fā)明解決了該siRNA遞送瓶頸，并開發(fā)出持續(xù)的對神經(jīng)退行性疾病和其他通過基因或基因變異或基因突變介導(dǎo)的疾病的治療。本發(fā)明使用改造的(engineered)人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)以連續(xù)地將抗突變的 htt siRNA遞送至受損的或處于風(fēng)險中的大腦中的神經(jīng)元。申請人已在過去的21年里使用MSC，“身體的護(hù)理員”，以安全和有效地將許多分子系統(tǒng)地遞送，并體內(nèi)遞送至多種器官，包括神經(jīng)組織(Dao 等· (1997) Stem Cells. 15 :443-454 ；Meyerrose 等· (2007) Stem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose 等· (2008)Stem Cells. 26 :1713-1722；Nolta 等· (1994) Blood. 83 :3041-3051 ；Tsark 等.(2001)J Immunol. 166 :170-181 ；Wang 等.(2003) Blood. 101(10)4201-4208).在這些出版物中已報道MSC/骨髓基質(zhì)細(xì)胞以持續(xù)的方式強(qiáng)大地產(chǎn)生用于體內(nèi)遞送至其他細(xì)胞中的產(chǎn)品。申請人也已顯示MSC將siRNA和其他細(xì)胞組分直接注入受損的細(xì)胞中。使用該遞送方法，不必采用頻繁的siRNA重給予。使用該方法，開發(fā)出了基于成年干細(xì)胞治療的遞送策略，這對其中中毒的突變蛋白必須減少的任何神經(jīng)退行性疾病由深遠(yuǎn)的影響。預(yù)期將進(jìn)行臨床試驗以使用紋狀體內(nèi)注射抗突變htt siRNA改造的MSC以治療早期的HD，以預(yù)防進(jìn)一步的神經(jīng)元損失和衰弱(debilitation)。申請人剛結(jié)束十年之久的生物安全研究，該研究顯示遺傳改造的人MSC是安全的(Bauer等.Q008)MoI Ther. 16 1308-1315)。對于第三方MSC注入的I/II期臨床試驗現(xiàn)已對數(shù)百患者進(jìn)行過，沒有不利事件(早期結(jié)果參見Giordano等.Q007)J Cell Physiol. 211 :27-35) MSC已被成功注入 ALS 患者的腦中，沒有不利事件(Mazzini 等.Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 4 158-161).由于HD患者不幸地基本沒有其他選擇，所以該未來試驗的收益/風(fēng)險比特別的高。已有描述顯示不同的干細(xì)胞群體對肌肉、肝臟、心和脈管系統(tǒng)的再生有貢獻(xiàn)，盡管其實現(xiàn)機(jī)制還仍然沒有被很好理解。然而，已知干細(xì)胞分泌多種具有旁分泌和自分泌活性的細(xì)胞因子和生長因子。通過成年的MSC的組織修復(fù)和再生的一種理論是該作用機(jī)理基于干細(xì)胞固有的功能該注射的干細(xì)胞住在受傷的區(qū)域，特別是在含氧量低的、細(xì)胞凋亡的或炎癥的區(qū)域，并釋放促進(jìn)內(nèi)生修復(fù)的營養(yǎng)因子。這些分泌的生物活性因子抑制局部免疫系統(tǒng)，對于位于組織的干細(xì)胞增強(qiáng)血管發(fā)生，抑制纖維化和細(xì)胞凋亡，并刺激募集、駐留、有絲分裂和分化。這些營養(yǎng)效果不同于干細(xì)胞至待再生的組織的直接分化。MSC已顯示出對以下情況的組織恢復(fù)有貢獻(xiàn)多重?fù)p傷模型，例如心肌梗塞(Laflamme & Murry(2005)Nat Biotechnol. 23 :845-856)，中風(fēng)模型(Chen 等· (2003) J Neurosci Res. 73 :778-786 ；Li 等.Q005)GNa. 49 :407-417)，半月板損傷模型(Murphy 等.Q003)Arthritis Rheum. 48 3464-3474)，和下肢局部缺血(Rosova 等.(2008) Stem Cells26 :2173-2182).營養(yǎng)因子分泌和組織再生的總體增強(qiáng)已在心肌梗塞模型中有顯示((inecchi等.Q006)i^aseb J. 20 661-669)，并且包括HGF，F(xiàn)GF-2，胰島素生長因子-I (IGF-I)，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 的多重刺激生成血管的細(xì)胞因子的分泌已在MSC條件的培養(yǎng)基中檢測到。據(jù)發(fā)現(xiàn)MSC分泌的營養(yǎng)因子的復(fù)合物組顯示對損傷的組織體內(nèi)修復(fù)有顯著的貢獻(xiàn)，該修復(fù)通過刺激血管生成和減少細(xì)胞凋亡進(jìn)行。腦中MSC的營養(yǎng)效果包括通過分泌的生長因子促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)元生長，分泌抗細(xì)胞凋亡因子和調(diào)節(jié)炎癥。在缺乏酸的鞘磷脂酶的小鼠中，MSC的移植延遲了神經(jīng)異常的發(fā)育的發(fā)生并顯著延長了它們的壽命(Chen等· (2001) Stroke. 32 :1005-1011 Jin等· (2002) J Clin Invest. 109 :1183-1191)。由于MSC分泌的存活因子減少細(xì)胞死亡的預(yù)示，Mazzini等進(jìn)行了證實在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALQ患者中MSC移植的效果的臨床研究(Mazzini 等· (2003) Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 4 :158-161)。ALS 弓| 起導(dǎo)致肌肉功能性方面的累進(jìn)的和致命的衰退的運(yùn)動神經(jīng)元的損失。七個ALS患者參加了 MSC臨床試驗，他們的腿已經(jīng)具有嚴(yán)重的功能障礙。擴(kuò)展的(Expanded)MSC被移植至患者脊髓中。細(xì)胞移植三個月后，在四名患者的腿中觀察到肌肉強(qiáng)度下降的慢化的趨勢(Mazzini 等· (2003)Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 4 :158-161).由于沒有進(jìn)行隨機(jī)化的研究，因此該結(jié)果絕非確定的，但它們確實顯示在具有一種形式的神經(jīng)退行性的患者中MSC注入至腦脊液中是可以耐受的，沒有不利事件。本發(fā)明不僅利用MSC固有的營養(yǎng)效果，也使用它們來作為遞送工具以注入siRNA，該siRNA設(shè)計為攻擊對HD中神經(jīng)退行性疾病負(fù)責(zé)的突變RNA種類。有許多好的轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于過表達(dá)不同形式的突變的htt蛋白，該蛋白具有可變長度的重復(fù)(參見，例如，Heng 等.(2008)Neurobiol Dis. 32 1-9 ；Ramaswamy 等J2007)liar J. 48 :356-373).然而，人細(xì)胞不能可靠地移植至這些具有完全免疫能力的種類(strain)中。因此使用慢病毒載體通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠神經(jīng)元的模型被使用，如最初描述于de Almeida等.(2002) J Neurosci. 22 :3473_3483。該作者進(jìn)行了趨實體注射至左紋狀體和右紋狀體，以檢驗人htt蛋白的截短形式的慢病毒遞送的效果，該人htt蛋白具有擴(kuò)展的多聚谷氨酰胺區(qū)域(82個重復(fù))。嚙齒動物紋狀體中的細(xì)胞在早至慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后1 周開始表達(dá)突變htt蛋白的包涵體。注射后4周內(nèi)包涵體的數(shù)量和大小逐漸增加。神經(jīng)元變性和棘神經(jīng)元的缺失在注射的紋狀體中被觀察到(000 JNeurosci. 22 :3473-3483)。 本發(fā)明使用免疫缺陷小鼠并將第一次使對于人干細(xì)胞治療的缺陷測試能治療HD。一方面，本發(fā)明提供一種用于將SiRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述分離的間充質(zhì)干細(xì)胞包含或基本上由以下物質(zhì)組成、或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成表達(dá)該siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，并且其通過細(xì)胞突起或微泡將該siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞。另一方面，多核苷酸和 /或siRNA、miRNA或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。一方面，分離的間充質(zhì)干細(xì)胞在適于通過細(xì)胞突起或微泡將siRNA、miRNA或 dsRNA多核苷酸轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的條件下置于與靶細(xì)胞的交流中。還提供的是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，它包含或基本由以下物質(zhì)組成，或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成外源的siRNA、miRNA或dsRNA序列，或者與編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的DNA序列組合。還提供的是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，它包含以下物質(zhì)或基本由以下物質(zhì)組成， 或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成單獨的編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列或者編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列與該siRNA、miRNA或dsRNA序列的組合。 另一方面，上文所述的MSC的每種都可以與靶細(xì)胞建立細(xì)胞突出，從而將多核苷酸和/或 siRNA,miRNA或dsRNA遞送至靶細(xì)胞。另一方面，MSC可以將多核苷酸和/或siRNA、miRNA 或dsRNA或編碼它的多核苷酸通過微泡遞送至靶細(xì)胞。另一方面，多核苷酸和/或siRNA 或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。一方面，該間充質(zhì)干細(xì)胞是一個分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且另一方面，該細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織或骨髓樣本中。本發(fā)明的MSC可通過細(xì)胞表面標(biāo)記物識別，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物包括，但不限于， CD90+，CD105+，CD44+，CD73+，CD34", CD45_。另一方面，編碼siRNA、miRNA或dsRNA的DNA序列被整合至MSC的基因組中。該 DNA被有效連接并整合至表達(dá)和/或遞送載體中。另一方面，該包含DNA序列的遞送和/或表達(dá)載體包含調(diào)節(jié)DNA表達(dá)的啟動子。啟動子的非限制性實例為聚合酶-III啟動子，例如 Hl-RNA基因啟動子。另一方面，siRNA、dsRNA或miRNA定向于介導(dǎo)疾病的基因，所述疾病例如遺傳疾病，病毒疾病或癌。疾病的非限制性實例包括亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷(ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ。在特定方面，該疾病為亨廷頓氏病且基因定向于突變Htt基因。一種siRNA定向的基因為363125_C-16。作為siRNA、miRNA或dsRNA接受者的靶細(xì)胞非限制性地包括一種或多種神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞(cardiac cell)、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞或視網(wǎng)膜細(xì)胞。該細(xì)胞可為在此鑒定為受試者的任何起源的，例如猿、牛、犬科動物、鼠或人。本發(fā)明的細(xì)胞可與載體組合，所述載體例如固體支持物、載體或藥學(xué)可接收的載體。另一方面，該組合物還包含干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。在特定的方面，衍生自干細(xì)胞的神經(jīng)元選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、MSC、脂肪衍生的干細(xì)胞或iPSC。包含多種以上描述的細(xì)胞的群體也被提供。該群體可對于MSC和/或靶細(xì)胞基本同源的或異種的。包含該群體的組合物還被提供，其中該群體與固體支持物、載體或藥學(xué)可接受的載體組合。上文所述的細(xì)胞和組合物，用于通過將靶細(xì)胞與本發(fā)明的MSC接觸遞送一種或多種siRNA、miRNA或dsRNA至靶細(xì)胞。因此，還提供的是一種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟或基本上由以下步驟組成、或還進(jìn)一步由以下步驟組成將靶細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)siRNA、miRNA 或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞。 該MSC可被單獨遞送或者與藥學(xué)可接受的載體組合遞送。不被理論束縛時，該遞送可以通過或經(jīng)由細(xì)胞突起和/或微泡獨立發(fā)生或組合發(fā)生。另一方面，多核苷酸和/或siRNA或 dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。一方面， 該間充質(zhì)干細(xì)胞是一個分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且另一方面，該細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織或骨髓樣本中。還提供的是一種治療受試者中由存在突變的等位基因介導(dǎo)的遺傳病癥(例如亨廷頓氏病)的方法，所述方法通過給予患者以下物質(zhì)來完成上述的MSC或包含間充質(zhì)干細(xì)胞，或基本上由間充質(zhì)干細(xì)胞組成或還進(jìn)一步由間充質(zhì)干細(xì)胞組成的組合物，其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA定向于突變的Htt基因編碼的RNA，并且可將siRNA、miRNA 或dsRNA遞送至患者的靶神經(jīng)細(xì)胞。不被理論束縛時，一方面，本發(fā)明的MSC是其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被單獨地或共同地通過細(xì)胞突起和/或微泡遞送，從而治療疾病的那種。一方面，該間充質(zhì)干細(xì)胞是一個分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且另一方面，該細(xì)胞存在于自合適的受試者分離的組織中，例如脂肪組織或骨髓樣本中。另一方面，DNA編碼定向于突變Htt基因的siRNA，其實例為363125_C-16。該靶細(xì)胞可為神經(jīng)元或干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元，其可得自一種或多種神經(jīng)上皮干細(xì)胞、MSC、脂肪衍生的干細(xì)胞或iPSC。通過該方法治療的受試者包括猿、牛、馬、犬、鼠或人患者。一些實施方案中，本發(fā)明提供的是一種包含或基本上由以下物質(zhì)組成、或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成的間充質(zhì)干細(xì)胞單獨或與編碼siRNA、dsRNA或miRNA序列的外源DNA 序列組合的外源siRNA、dsRNA或miRNA序列，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞可將該序列或編碼該序列的多核苷酸遞送至靶細(xì)胞。不受理論限制時，一方面MSC建立了與靶細(xì)胞的細(xì)胞突起， 由此遞送多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA。另一方面，它們被通過微泡遞送至靶細(xì)胞。另一方面，多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通過任何方法遞送至靶細(xì)胞，所述方法不包括通過連接蛋白的間隙連接。本發(fā)明的MSC可通過細(xì)胞表面標(biāo)記物識別，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物包括，但不限于， CD90+，CD105+，CD44+，CD73+，CD34", CD45_。一方面，DNA序列被整合至間充質(zhì)干細(xì)胞的基因組中。另一方面，該DNA序列還包含表達(dá)或遞送載體。另一方面，該表達(dá)或遞送載體為慢病毒載體。還另一方面，該載體包含調(diào)節(jié)dsRNA，miRNA或siRNA表達(dá)的啟動子。一方面，啟動子為聚合酶-III Hl-RNA基因啟動子。一方面，該方法提供待整合至間充質(zhì)干細(xì)胞基因組中的DNA序列。為產(chǎn)生該細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞自合適的組織或其它源獲得或分離，例如，自分化的胚胎干細(xì)胞或iPSC產(chǎn)生。siRNA，dsRNA,或miRNA使用化學(xué)或其它方法制備，并可被通過與 SID-I DNA共培養(yǎng)被動轉(zhuǎn)移至干細(xì)胞或siRNA，dsRNA，或miRNA可被插入至合適的載體例如此處描述的具有合適的調(diào)節(jié)序列的慢病毒載體。在插入siRNA，dsRNA，或miRNA之后該細(xì)胞群體可被適當(dāng)?shù)財U(kuò)展或分化。一些實施方案中，SiRNA定向于介導(dǎo)疾病的基因。一方面，所述疾病選自遺傳性疾病，其中所述患病者由存在突變等位基因、病毒感染或疾病、和癌或其它新生物引起。另一方面，所述疾病選自亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、(ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷(ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ及其他。其中所述疾病為亨廷頓氏病，該 siRNA, dsRNA或miRNA可定向于鄰近CAG重復(fù)突變Htt基因，或任何突變Htt基因的單核苷酸多態(tài)性，或單siRNA，dsRNA或miRNA定向于Htt基因的多突變形式。一方面，所述siRNA 為 363125_C-16。一些實施方案中，用于間充質(zhì)干細(xì)胞的靶細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞等。一些實施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞為哺乳動物來源的。一些實施方案中，哺乳動物來源為猿、牛、馬、鼠或人。分離此種細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域已知并且已經(jīng)由申請人公布。一些實施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞與干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元或其它細(xì)胞組合，例如，神經(jīng)上皮干細(xì)胞、野生型間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生的干細(xì)胞和用于該方法或組合物的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。一方面，用于插入siRNA、dsRNA或miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞為與所有其他細(xì)胞組分分離的或者，僅與宿主分離(即仍保留在組織中)的間充質(zhì)干細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的MSC和其它對于克隆繁殖或伸展或組織特異性分化必需的細(xì)胞。因此，另一方面，本發(fā)明提供由以下產(chǎn)生的擴(kuò)展的或分化的群體在合適的條件下生長或培養(yǎng)本發(fā)明的MSC以得到細(xì)胞群體，每個細(xì)胞中具有插入的siRNA，dsRNA，或miRNA，如同插入并存在于該群體起源的MSC中。還提供的是本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的群體，其為克隆衍生的因此基本同源?？寺〉財U(kuò)展MSC的方法是本領(lǐng)域已知的。另一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)展本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞非克隆的群體以及將它們分化至合適的組織類型的方法，所述方法通過使MSC在提供用于分化和擴(kuò)展的適當(dāng)條件下生長。此種通用方法在本領(lǐng)域已知。還提供的是擴(kuò)展性克隆的或分化的本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的群體。還提供的是包含本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞、本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的群體或本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)展的群體，和載體的組合物。在一些實施方案中，所述載體為如上所述的藥學(xué)可接受的載體。還提供的是一種將siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括，或基本由以下組成，或另外由以下組成將靶細(xì)胞與MSC的一個或多個接觸，所述 MSC為包含或基本由以下物質(zhì)組成，或還進(jìn)一步由以下物質(zhì)組成的群體MSC(克隆的或分化的)間充質(zhì)干細(xì)胞，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)該siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸的外源 DNA序列，由此將該siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起遞送至靶細(xì)胞。MSC可將該siRNA，dsRNA或miRNA通過細(xì)胞突起遞送至靶細(xì)胞。一方面，所述細(xì)胞突起是細(xì)胞質(zhì)延伸。另一方面，所述細(xì)胞突起是通道微管。還另一方面，該細(xì)胞突起選自廣泛領(lǐng)域的細(xì)胞接觸，細(xì)的、伸長的、活性絲足或?qū)有巫惆?、?xì)胞管狀構(gòu)造(cytoneme)、細(xì)胞管狀構(gòu)造類突起、頂端圍足部延伸、肌足、肌足類突起、細(xì)胞延伸或頂端或側(cè)面細(xì)胞突起。還提供的是一種將siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括，或基本由以下組成，或進(jìn)一步由以下組成將靶細(xì)胞置于與MSC,包含或基本由 MSC(克隆的或分化的)間充質(zhì)干細(xì)胞組成，或還進(jìn)一步由MSC(克隆的或分化的)間充質(zhì)干細(xì)胞組成的群體的任一種或多種，在適合將siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通過微泡轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的條件下交流，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)該siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將該siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通過微泡遞送至靶細(xì)胞。MSC和靶細(xì)胞之間的交流可為培養(yǎng)基、用于細(xì)胞生長的生物相容的支架，或例如動物身體或人身體的身體。因此MSC可被置于靶細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以使MSC分泌的微泡可移至靶細(xì)胞并將siRNA，dsRNA或miRNA遞送至靶。MSC也可被置于任何適合細(xì)胞生長、分化或遷移的平臺，在該平臺上MSC和靶細(xì)胞之間的微泡的移動式不受限制的。一些實施方案中，MSC被置于包含靶細(xì)胞的身體中，在此MSC可移到靶細(xì)胞附近并將多核苷酸經(jīng)微泡遞送至靶細(xì)胞。適合將siRNA，dsRNA或miRNA多核苷酸經(jīng)微泡從MSC轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的條件是指適合于細(xì)胞生長或遷移的條件。適合干細(xì)胞將多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的條件的實例包括Yuan 等.Q009)PLoS ONE, 4 (3) :e4722，其通過引用以全文形式結(jié)合至此，以及包在前述段落中描述的那些。微泡在多種情況下自許多細(xì)胞類型流出，通常是由于活化或細(xì)胞凋亡，但也作為它們活性的正常功能。已報導(dǎo)胚胎干細(xì)胞通過微泡將miRNA轉(zhuǎn)移至鄰近細(xì)胞(Yuan 等· (2009)PLoS ONE, 4 (3) :e4722).申請人已觀察到在正常培養(yǎng)基中MSC流出含siRNA的微泡。另一方面，DNA序列還包含表達(dá)或遞送載體。另一方面，該表達(dá)或遞送載體是慢病毒。還另一方面，該載體包含調(diào)節(jié)siRNA表達(dá)的啟動子。一方面，該啟動子為聚合酶-III Hl-RNA基因啟動子。一些實施方案中，siRNA定向于介導(dǎo)疾病的基因。一方面，所述疾病選自遺傳疾病、 病毒疾病和癌。另一方面，所述疾病選自亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、(ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷 (ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ及其他。一方面，所述疾病是亨廷頓氏病。一方面，siRNA定位于突變Htt基因中鄰近CAG重復(fù)的SNP。一特定方面，所述 siRNA 為 363125 C-16。一些實施方案中，所述靶細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞或視黃醇(retinol)細(xì)胞。一些實施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為哺乳動物來源的。一些實施方案中，所述哺乳動物來源為猿、牛、鼠或人。一些實施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞與干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元或其它干細(xì)胞類型共給予。一方面，所述干細(xì)胞選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生的干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。一方面，該間充質(zhì)干細(xì)胞是分離的間充質(zhì)干細(xì)胞。所述方法可在體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)進(jìn)行。體外進(jìn)行時，MSC或包含本發(fā)明的MSC 的組合物與靶細(xì)胞的培養(yǎng)在允許RNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞中的條件下接觸。該方法的體外操作提供了對可選擇的方法和小分子的篩選。或者，該方法在間接體內(nèi)通過采用原代細(xì)胞培養(yǎng)或在合適條件下共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行。間接體內(nèi)方法用于在給予至例如人類患者的受試者之前測試治療。體內(nèi)方法可被進(jìn)行以產(chǎn)生動物模型來分析或視為受試者，也如在此提供的。
在體內(nèi)操作時，該方法可用于治療例如人類患者的受試者的亨廷頓氏病，所述治療通過給予患者單獨的MSC或與其它因子組合的MSC。MSC通過直接注射進(jìn)入組織給予，對于所述組織RNA是待轉(zhuǎn)移的。例如MSC可包含編碼定位于突變Htt基因的siRNA、dsRNA, 或miRNA序列的外源的DNA序列，并可將該siRNA、dsRNA，或miRNA通過細(xì)胞突起遞送至受試者的靶神經(jīng)細(xì)胞，由此治療疾病。一些實施方案中，該方法還包含對患者給予干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。一方面，該干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元在給予間充質(zhì)干細(xì)胞之前或之后給予。另一方面該干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元與間充質(zhì)干細(xì)胞一起給予。一些實施方案中，干細(xì)胞選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。一些實施方案中，所述給予包括注入至腦或其他CNS組織。一些實施方案中，所述給予包括靜脈注射或直接注入脊髓，靶細(xì)胞側(cè)的遠(yuǎn)端或近端。一特定實施方案中，對于所述方法的受試者為馬、牛、猿、犬或人患者。一更特定實施方案中，受試者為人類患者。還提供的是將siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸跨過血腦屏障遞送至患者的腦的方法，所述方法包括對患者給予間充質(zhì)干細(xì)胞，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)該siRNA，dsRNA, 或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將該siRNA，dsRNA,或miRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起遞送至腦中的靶細(xì)胞。一方面，所述給予包括靜脈注射、注射至腦，或注射至脊髓(靶細(xì)胞側(cè)的遠(yuǎn)端或近端)。還提供的是測定試驗基因的表達(dá)是否為細(xì)胞功能所需的方法，所述方法包括將試驗細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，其中間充質(zhì)干細(xì)胞包含編碼定向于試驗基因的siRNA，dsRNA， 或miRNA序列的外源DNA序列，由此將siRNA，dsRNA,或miRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起遞送至試驗細(xì)胞，其中細(xì)胞功能的中斷表示試驗基因的表達(dá)是細(xì)胞功能所需的。還提供的是遞送siRNA，dsRNA,或miRNA多核苷酸至靶細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)于遞送siRNA，dsRNA，或miRNA的使用說明書，所述間充質(zhì)干細(xì)胞含有表達(dá)siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞可與靶細(xì)胞建立細(xì)胞突起和/或微泡由此遞送siRNA，dsRNA,或miRNA至靶細(xì)胞。靶細(xì)胞如上所述。 該試劑盒還包含如上所述的基因遞送載體和/或使用說明書。示例性實施例實施例1. MSC輸入siRNA至靶細(xì)胞據(jù)發(fā)現(xiàn)MSC可用于強(qiáng)壯地將siRNA體內(nèi)遞送至受損的細(xì)胞中。圖1顯示eGFP標(biāo)記的MSC，它已將alexa-fluor標(biāo)記的抗突變htt siRNA (紅色)從鄰近的非GFP MSC轉(zhuǎn)移至其內(nèi)部(也參見圖幻。較亮的點在轉(zhuǎn)移后并生至溶酶體中，但較小的siRNA數(shù)量在細(xì)胞質(zhì)中是分散的。人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可被轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生siRNA和其他RNA修飾部分(siRNA/ miRNA雜交和其他)，以減少神經(jīng)元中突變httRNA水平和蛋白水平。據(jù)發(fā)現(xiàn)MSC可容易地將小RNA分子直接通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸轉(zhuǎn)移。該細(xì)胞-細(xì)胞接觸可包括細(xì)胞突起、細(xì)胞質(zhì)延伸或通道微管。已證實MSC快速定位(home)于身體的受傷或不良應(yīng)激的位點。MSC整合至免疫缺陷小鼠的組織存活高達(dá)18個月，并在該期間產(chǎn)生引入的轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物。參見，例如，Dao等.(1997) Stem Cells. 15 =443-454 ；Meyerrose 等· (2007)Stem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose 等· (2008)Stem Cells. 26 1713-1722 ； Nolta 等· (1994)Blood. 83 :3041-3051 ；Tsark 等· (2001)J Immunol. 166:170-181 ；Wang 等· (2003) Blood. 101(10)4201-4208 ；Bauer 等· (2008) MoI Ther. 16 :1308-1315 ；Rosova 等· (2008) Stem Cells 26 :2173-2182 ；和 Wu 等.(2003) Transplantation. 75 :679-685.在一項十年之久的研究中，在遺傳修飾和移植之后，MSC已顯示為安全的，且不引起不利事件或腫瘤(Bauer等· (2008)Mol Ther. 16 1308-1315)。當(dāng)前的遞送方案顯示，除了分泌蛋白產(chǎn)物之外，小干擾RNA可從MSC通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸直接分泌至靶細(xì)胞中(圖1，圖幻。除了 MSC對修復(fù)受損的神經(jīng)元的營養(yǎng)效果，MSC可對于HD發(fā)展的嚴(yán)重性有顯著影響。也發(fā)現(xiàn)MSC可通過MSC分泌的微泡轉(zhuǎn)移小RNA分子。圖1中顯示siRNA出現(xiàn)在細(xì)胞外面的微泡中，如細(xì)胞外白圓圈所示。因此，MSC可遞送siRNA至靶細(xì)胞，或者通過例如細(xì)胞突起的直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸，或者通過MSC分泌的微泡直接轉(zhuǎn)移。實施例2. MSC分離和轉(zhuǎn)導(dǎo)人MSC可從正常供體收集并在臨床有關(guān)的條件下擴(kuò)展。申請人之前已證實人 MSC 容易吸收病毒載體(參見，例如，Dao 等· (1997) Stem Cells. 15 :443-454 ；Meyerrose 等· (2007)Stem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose(2008)Stem Cells. 26 :1713-1722 ；and Nolta (1994) Blood. 83 :3041-3051)。慢病毒載體已被開發(fā)用于表達(dá)幾種用于直接注入左紋狀體和右紋狀體的不同形式的突變htt蛋白，用于在允許的異種移植物背景下的開發(fā)。這些載體中的編碼序列包括具有CAG重復(fù)長度為18 (野生型，正?；?、44和82的編碼氨基酸1-400的Htt cDNA。當(dāng)使用所述的病毒載體方案引入至嚙齒類時，引入具有82個重復(fù)的基因?qū)е驴焖匍_始包涵體形成和行為缺失，由44個重復(fù)的基因引起的情況有1-3周延遲 (DiFiglia 等.(2007) Proc Natl Acad Sci USA. 104:17204-17209)。實施例3.等位基因特異性siRNA在HD中siRNA敲減的目的是抑制突變蛋白并保留自正常等位基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。 Schwarz等于2006年首次證實亨廷頓蛋白mRNA表達(dá)的等位基因特異性抑制是可能的 (Schwarz等.Q006)PLoS Genet. 2 :el40)。van Bilsen等證實直接從亨廷頓氏病患者分離的細(xì)胞中的內(nèi)生性亨廷頓蛋白表達(dá)的等位基因特異性抑制(van Bilsen等.Q008)Hum Gene Ther. 19 :710-719)。van Bilsen等已證實SNP位于遠(yuǎn)離CAG重復(fù)區(qū)域定位的靶。已知可減少突變基因的siRNA可被引入至小鼠中，定向于SNP rs363125，其具有44個CAG密碼子，對比野生型中19個CAG密碼子。表達(dá)與van Bilsen的研究中試驗的siRNA36125_ C-16相同的序列的載體已被制造并可利用針對82重復(fù)的Htt等位基因的特異性siRNA。也預(yù)期可使用定向于Htt基因的不同突變形式的siRNA載體，其可用于大多數(shù)患者。實施例4. siRNA轉(zhuǎn)移分析siRNA的轉(zhuǎn)移已在體外完成，使用熒光標(biāo)記的合成的siRNA。這些初始研究使用抗httl50序列。siRNA載體也可按如下制備Htt SiRNA的骨架是pCCLc-X，具有在“X”位置克隆的Hl啟動子(來自O(shè)ligoengine的pSuper載體)，操縱siRNA(不包括pCCLc-Hl p-Httl50siRNA)。U87細(xì)胞、自NOD/SCI D/MPSVII小鼠分離的皮成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、 快速生長腫瘤系和HD患者iPS細(xì)胞可用于開發(fā)HD神經(jīng)干細(xì)胞。正常細(xì)胞可有突變的人 htt等位基因轉(zhuǎn)移至其中，并且可作為受體細(xì)胞來試驗MSC介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)移和體外蛋白敲減的效率。供體和靶細(xì)胞可通過基于在MSC和神經(jīng)細(xì)胞之間不同的細(xì)胞表面標(biāo)記物的FACS 干凈地分離，或通過⑶SB表達(dá)分離，且然后可通過FACS (對于熒光siRNA轉(zhuǎn)移)和定量RT PCR、蛋白印跡(western blot)和用于蛋白水平的微陣列測試。在所有研究中，eGFP蛋白的敲減可通過MSC介導(dǎo)的抗-eGFP siRNA的轉(zhuǎn)移來完成，抗-eGFP siRNA作為容易被FACS 檢測到的陽性對照。實施例5. siRNA從MSC轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞alexa-fluor標(biāo)記的抗突變htt siRNA從MSC至靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移已被檢測。使用 Whtt siRNA 為 siRNA Httl50，最初描述于 DiFiglia 等.O007)Proc Natl Acad Sci U S Α. 104 17204-17209。轉(zhuǎn)移率為直接可視化的(圖2)。使用的設(shè)備為Deltavision去卷積顯微鏡，使用60X物鏡并在0. 2微米步驟采取60面(plane)。這些圖像也可被旋轉(zhuǎn)以確定 siRNA已被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，并且不在表面。直接的標(biāo)記的siRNA通過MSC的細(xì)胞-細(xì)胞的轉(zhuǎn)移比例已被檢測。用于產(chǎn)生圖2中的數(shù)據(jù)的方法可用于體外測試每種新siRNA和siRNA/ miRNA雜交結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移效率。FACS分析可確定從供體至靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移程度，并且可評估通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)連續(xù)產(chǎn)生的MSC衍生的抗eGFP siRNA的eGFP蛋白的百分比敲減。eGFP水平的減少可使用靶神經(jīng)細(xì)胞的FACS評估。實施例6.體內(nèi)測試人干細(xì)胞治療的HD模型為產(chǎn)生小鼠模型，NOD/SCID/MPSVII和NOG免疫缺陷小鼠可用編碼突變的或野生型的htt蛋白的慢病毒載體注射至右紋狀體和左紋狀體。這些小鼠將被麻醉然后在頭皮中切開小口，在該動物的顱骨中提供Imm粗邊(burr)洞的空間。該突變的或野生型的慢病毒將以 de Almeida，等(de Almeida 等.(2002) J Neurosci. 22 :3473-3483)描述的控制的速率被注射至紋狀體。每個實驗中將進(jìn)行12只小鼠的組，4/上臂Gper arm)，并重復(fù)8次， 使用來自不同供體的MSC。注射后，將骨蠟置于該粗邊洞以控制流出，并且該洞上的頭皮將用小的縫線閉合。注射病毒后一周開始，行為影響被評估。手術(shù)之前，小鼠將被訓(xùn)練通過一個橫梁走至一個箱子。橫梁將與紙排列以使小鼠的足可被墨水染色，使得能評估以其失足形式證實的行為缺失。開始注射四周后這些動物將被移植產(chǎn)生siRNA的MSC，對比亂序的產(chǎn)生iRNA的MSC，使用相同的紋狀體內(nèi)注射技術(shù)。另外，橫梁測試將在手術(shù)后一周開始，以尋找小鼠步態(tài)的改變。適當(dāng)?shù)募賹φ蘸捅磉_(dá)亂序siRNA的載體將用于確保任何觀察到的改變都是由于治療而不是手術(shù)自身的效果產(chǎn)生。小鼠將在不同的時間點被處死，它們的腦被取出用于評估，如以下進(jìn)一步所述。實施例7.從小鼠腦重獲取人MSC人MSC可使用GUSB FACS分選在特定的時間點之后從該腦組織重獲取。這種分選方案使得能將自腦回收的活細(xì)胞分離成GUSB陽性(人)和陰性(鼠)，以評估每種中的siRNA水平。人供體GUSB+細(xì)胞將從小鼠腦通過FACS活性分離，使用可擴(kuò)散的底物。在每次分析中遷移至組織的受傷區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量和百分比可通過使用NOD/SCID/MPSVII小鼠快速定量。使用基于GUSB的流動分析結(jié)合對鼠MHC的細(xì)胞表面分析將確定酶沒有被旁觀者效應(yīng)吸收也沒有被宿主巨噬細(xì)胞吞入死細(xì)胞。酶標(biāo)記是相當(dāng)特異性的，并且即使釋放的酶可被鄰近的細(xì)胞吸收，它是以不再被組織化學(xué)或基于FACS分析檢測到的處理過的形式(Sands 等.(1997)Neuromuscul Disord. 7 :352-360 ；Wolfe 等.(1992)Nature. 360 :749-753)。這將對于每種待檢測的細(xì)胞群體進(jìn)行驗證。從腦回收的細(xì)胞將進(jìn)行對htt蛋白和mRNA水平改變的評估，使用定量實時PCR和蛋白分析。使用NOD/SCI D/MPSVI I模型，來自小鼠組織的人細(xì)胞可被活性分離，這基于⑶SB酶的親脂底物。它們也可使用在人MSC上的⑶105被分離。獲得的MSC然后可在單克隆分析中培養(yǎng)，以確保完整的遺傳內(nèi)容，或立即進(jìn)行染色體分散和FISH(Wang等.(2003) Blood. 101(10)4201-4208)。GUSB+細(xì)胞將被從來自腦的單細(xì)胞懸液分離，使用^flux細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行。申請人已能夠從注射后的肝臟中回收高達(dá) 20%⑶SB+人細(xì)胞，以及從后肢局部缺血的肌肉回收5%⑶SB+人細(xì)胞。在移植后從腦也已經(jīng)回收足夠的水平。分離的數(shù)量對于所有分析是足夠的。已將siRNA遞送至腦的細(xì)胞將被回收并且將被分析htt蛋白水平的改變。大約10，000個細(xì)胞/分析對于最好的分析是需要的，并且較少的可以使用。在該研究中，任何不利事件將被緊密檢查，例如發(fā)生在小鼠腦中來自體內(nèi)人 MSC的異位異常組織分化或腫瘤形成，如已被報導(dǎo)的(Bauer等.^)08)MoI Ther. 16 1308-1315)。用人骨髓和脂肪衍生的MSC的免疫缺陷小鼠研究將在FDA要求的GLP (藥品安全性試驗規(guī)范)條件下進(jìn)行，以使他們對于基于MSC的組織修復(fù)治療可被直接翻譯。實施例8.間充質(zhì)干細(xì)胞改造和移植在申請人早期的研究中已被證實MSC代表容易獲得的且非常順從于慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞群體，使它們成為包括多種廣泛的末端組織靶的基于細(xì)胞的治療是良好的途徑。載體沉默的證據(jù)未被觀察到，而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物高達(dá)18個月(實驗期間)的持續(xù)和安全的體內(nèi)表達(dá)已被報導(dǎo)(Dao等.(1997) Stem Cells. 15 =443-454 ；Meyerrose 等· (2007)Stem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose 等· (2008)Stem Cells. 26 1713-1722 ； Nolta 等· (1994)Blood. 83 :3041-3051)。實施例9.人MSC體內(nèi)定量以證實對于測定siRNA功效的足夠細(xì)胞回收的可行性使用雙重qPCR系統(tǒng)通過同時測定鼠rapsyn和人β -珠蛋白基因以列舉人MSC/ 器官的貢獻(xiàn)(Meyerrose 等.Q007) Mem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose 等.Q008) Mem Cells. 26 :1713-1722)。在來自交互物種的IOOng總DNA中有少至0. 005ng的每個種類的 DNA被檢測到。靜脈注射后MSC遷移至腦，并且在六個月之后仍存在。絕對的人供體細(xì)胞貢獻(xiàn)/器官被計算為描述評估總存在的MSC (Meyerrose等.Q007) Mem Cells. 25 :220-227 ； Meyerrose等.(2008) Stem Cells. 26 :1713-1722)。直接注射入腦，這些細(xì)胞預(yù)期以更強(qiáng)健的數(shù)量存在并容易遷移通過該組織。也預(yù)期MSC可被注入脊髓。注入脊髓(腦中靶位點的遠(yuǎn)端或近端)之后，MSC可遷移至靶位點并遞送siRNA至靶位點。實施例10.用于人細(xì)胞的增強(qiáng)檢測的改進(jìn)的免疫缺陷小鼠模型粘多糖增多癥類型VII (MPSVII)由β -葡糖苷酸酶(⑶SB)活性缺失引起。NOD/ SCI D/M PSVII株使得能夠快速顯現(xiàn)相對于無該酶的小鼠組織背景的攜帶正常水平β-葡糖苷酸酶的人細(xì)胞。圖3中顯示將移植的人干細(xì)胞定位于鼠組織切片中的舒適和特異性的實例。該株(strain)已被用于突出顯示受損的器官中人干細(xì)胞介導(dǎo)的組織修復(fù)區(qū)域 (Meyerrose 等· (2007)Stem Cells. 25 :220-227 ；Meyerrose 等· (2008)Stem Cells. 26 1713-1722 ;Hess 等.(2008) Stem Cells 26 :611-620).該酶反應(yīng)之后，載玻片可用組織特異性蛋白標(biāo)記物的抗體復(fù)染(Hess等.(2008) Stem Cells 26 =611-620 ；Hofling 等.OO(XB)Bl0OdlOl =2054-2063).該酶染是相當(dāng)特異性的，并且盡管該釋放的酶可被鄰近細(xì)胞吸收，但它處于不再被組織化學(xué)分析檢測到的處理過的形式(Sands等.(1997) Neuromuscul Disord. 7 :352-360 ；Wolfe等.(1992)Nature. 360 :749-753).因此，該個體移植的人細(xì)胞相對于無GUSB鼠組織背景生動地突出。因此人細(xì)胞可被檢測到，不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物或引入的標(biāo)記物基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析也存在以重新分離人細(xì)胞，僅基于 GUSB酶活性而不是細(xì)胞表面表型或其它特征。NOD/SCID MPSVII小鼠的新模型提供了顯示、 跟蹤和在移植后回收人細(xì)胞的極好的機(jī)會，不依賴與表面蛋白或預(yù)期標(biāo)記的表達(dá)。該系統(tǒng)對于以下特別有用從小鼠腦中回收MSC、對于分析隨時程連續(xù)的siRNA生產(chǎn)、對于分析安全性研究的遺傳完整性，以及從小鼠細(xì)胞將它們干凈分離以使得能直接測量在小鼠神經(jīng)元中突變對于正常htt蛋白的量。實施例11.雙分支細(xì)胞治療用于HD的雙分支細(xì)胞治療方法被考慮。兩種細(xì)胞類型可被共遞送至新紋狀體使用hESC技術(shù)產(chǎn)生的棘神經(jīng)元，聯(lián)合MSC治療以減少內(nèi)生性的htt水平。該雙分支方法可對處于該疾病的較高級階段患者提供治療，所述患者已失去顯著數(shù)量的神經(jīng)組織。MSC也將保護(hù)該移植的神經(jīng)元免受免疫系統(tǒng)的排斥。該兩種細(xì)胞類型可被共給予，或先后給予。應(yīng)理解雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合上述實施方案被描述，但前述說明和實例意欲描述而非限制本發(fā)明的范圍。其他方面，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的優(yōu)勢和修改將對于本發(fā)明屬于的領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.用于將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述分離的間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，并且所述分離的間充質(zhì)干細(xì)胞通過微泡或細(xì)胞突起將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至所述靶細(xì)胞。
2.包含外源siRNA、miRNA或dsRNA或編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的多核苷酸序列的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌包含所述siRNA、miRNA或dsRNA 的微泡。
3.包含編碼siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞可將所述siRNA、miRNA或dsRNA遞送至靶細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì)胞在適于通過細(xì)胞突起或微泡將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的條件下被處于與靶細(xì)胞的交流中。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述DNA序列被整合至所述間充質(zhì)干細(xì)胞的基因組中。
6.權(quán)利要求3的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞通過細(xì)胞突起或微泡遞送所述外源DNA序列或所述siRNA、miRNA或dsRNA序列。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述DNA序列還包含表達(dá)或遞送載體。
8.權(quán)利要求7的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述載體還包含調(diào)節(jié)所述siRNA、miRNA或dsRNA 表達(dá)的啟動子。
9.權(quán)利要求7的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述啟動子為聚合酶-IIIHl-RNA基因啟動子。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介導(dǎo)疾病的基因。
11.權(quán)利要求10的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述疾病選自遺傳疾病、病毒疾病和癌。
12.權(quán)利要求10的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述疾病選自亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病 (PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥 (ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷(ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。
13.權(quán)利要求10的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述疾病為亨廷頓氏病。
14.權(quán)利要求13的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于突變的Htt 基因。
15.權(quán)利要求14的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述siRNA為363125_C-16。
16.權(quán)利要求1至9中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述靶細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞、 肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、視黃醇細(xì)胞和干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。
17.權(quán)利要求15的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元衍生自選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生的干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的干細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1至16中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞為哺乳動物來源的。
19.權(quán)利要求18的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述哺乳動物來源為猿、牛、馬、犬、鼠或人。
20.權(quán)利要求18的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述哺乳動物來源為人。
21.權(quán)利要求1至20中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)展的克隆的或分化的群體。
22.權(quán)利要求1至21中任一項的間充質(zhì)干細(xì)胞的群體。
23.權(quán)利要求22的群體，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞為基本同源的。
24.權(quán)利要求22的群體，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞為異源的。
25.一種包含權(quán)利要求1至20中任一項的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，或者權(quán)利要求21至 24中任一項的群體，和載體的組合物。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述載體是藥學(xué)可接受的載體。
27.權(quán)利要求沈的組合物，還包含干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。
28.—種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述靶細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源siRNA、miRNA或dsRNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至所述靶細(xì)胞。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述序列通過細(xì)胞突起被遞送。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述DNA序列被整合至所述間充質(zhì)干細(xì)胞的基因組中。
31.權(quán)利要求觀的方法，其中所述DNA序列還包含表達(dá)或遞送載體。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述載體包含調(diào)節(jié)所述siRNA、miRNA或dsRNA表達(dá)的啟動子。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述啟動子為聚合酶-IIIHl-RNA基因啟動子。
34.權(quán)利要求28至33中任一項的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介導(dǎo)疾病的基因。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述疾病選自遺傳疾病、病毒疾病和癌。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述疾病選自亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷(ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARQ和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述疾病為亨廷頓氏病。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于突變的Htt基因。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述siRNA為363125_C_16。
40.權(quán)利要求28至34中任一項的方法，其中所述靶細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞。
41.權(quán)利要求觀至40中任一項的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞為哺乳動物來源的。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動物來源為猿、牛、馬、犬、鼠或人。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述哺乳動物來源為人。
44.權(quán)利要求28至43中任一項的方法，還包含給予干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述神經(jīng)元衍生自選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、 脂肪衍生的干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的干細(xì)胞。
46.權(quán)利要求觀至45中任一項的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞為分離的間充質(zhì)干細(xì)
47.權(quán)利要求觀至46中任一項的方法，其中所述接觸為體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)。
48.一種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述靶細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞在適于將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通過微泡轉(zhuǎn)移至所述靶細(xì)胞的條件下處于交流，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸經(jīng)所述微泡遞送至所述靶細(xì)胞。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述DNA序列被整合至所述間充質(zhì)干細(xì)胞的基因組中。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介導(dǎo)疾病的基因。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病選自亨廷頓氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纖維化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、老化相關(guān)的黃斑變性(AMD)、急性肺損傷(ALI)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARQ和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病為亨廷頓氏病。
53.權(quán)利要求48至52中任一項的方法，其中所述靶細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞、心細(xì)胞、肺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞。
54.權(quán)利要求48至53中任一項的方法，其中所述接觸為體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)。
55.一種治療患者的亨廷頓氏病的方法，所述方法包括給予所述患者間充質(zhì)干細(xì)胞，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含編碼定向于突變Htt基因的siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列，并可將所述siRNA、miRNA或dsRNA通過細(xì)胞突起遞送至所述患者的靶神經(jīng)細(xì)胞，由此治療所述疾病。
56.權(quán)利要求55的方法，還包含將干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元給予至患者。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元在給予所述間充質(zhì)干細(xì)胞之前或之后給予。
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元與所述間充質(zhì)干細(xì)胞一起給予。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述干細(xì)胞選自神經(jīng)上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生的干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
60.權(quán)利要求55或56的方法，其中所述給予包含注射至腦。
61.權(quán)利要求55或56的方法，其中所述給予包含靜脈注射，或注射入所述靶細(xì)胞側(cè)的遠(yuǎn)端或近端的脊髓。
62.權(quán)利要求55至61中任一項的方法，其中所述患者為人患者。
63.一種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸跨血腦屏障遞送至患者腦的方法，所述方法包括將間充質(zhì)干細(xì)胞給予所述患者，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA 多核苷酸的外源DNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起遞送至腦中的靶細(xì)胞。
64.一種將siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸跨血腦屏障遞送至患者腦的方法，所述方法包括將間充質(zhì)干細(xì)胞給予所述患者，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA 多核苷酸的外源DNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通過微泡遞送至腦中的靶細(xì)胞。
65.權(quán)利要求63或64的方法，其中所述給予包括經(jīng)脈注射，注射入腦，或注射入所述靶細(xì)胞側(cè)的遠(yuǎn)端或近端的脊髓。
66.一種測定試驗基因的表達(dá)是否為細(xì)胞功能所需的方法，所述方法包括將試驗細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含編碼定向于所述試驗基因的siRNA、miRNA或 dsRNA序列的外源DNA序列，由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起遞送至所述試驗細(xì)胞，其中所述細(xì)胞功能的中斷表示所述試驗基因的表達(dá)是所述細(xì)胞功能所需的。
67.一種遞送siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸至靶細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)于遞送所述siRNA、miRNA或dsRNA的使用說明書，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞可與所述靶細(xì)胞建立細(xì)胞突起由此將所述siRNA、miRNA或dsRNA遞送至所述靶細(xì)胞。
全文摘要
將siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸遞送至靶細(xì)胞的組合物和方法，所述方法包括將所述靶細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸，該間充質(zhì)干細(xì)胞包含表達(dá)所述siRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此將所述siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通過細(xì)胞突起或微泡遞送至靶細(xì)胞。
文檔編號A61K48/00GK102439136SQ201080021928
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者斯科特·奧爾森, 簡·A·諾塔, 路易莎·沃瑟林 申請人:加州大學(xué)校董