非b亞型gag蛋白在慢病毒包裝中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及慢病毒包裝載體，所述慢病毒包裝載體包含非B亞型gag-pol序列，尤其是D亞型gag-pol序列。本發(fā)明還涉及用于制備和使用這些載體的方法。本發(fā)明還涉及包含HIV-1非B亞型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒載體顆粒。
【專利說明】非B亞型GAG蛋白在慢病毒包裝中的應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0001]重組疫苗已隨重組DNA技術(shù)的進步而發(fā)展，重組DNA技術(shù)能夠修飾病毒基因組以產(chǎn)生修飾的病毒。通過這種方式，已能夠?qū)⑦z傳序列引入非致病性病毒，從而它們編碼需要在干擾后于靶細胞內(nèi)得以表達的免疫原性蛋白質(zhì)，以在其宿主內(nèi)發(fā)展特定免疫應(yīng)答。
[0002]此類疫苗構(gòu)成了疫苗技術(shù)中的重大進步(Kutzler等，Nat RevGenet, 9 (10): 776-788，2008)。具體而言，它們具有優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢:避免活(減毒的)病毒和消除滅活疫苗制造的相關(guān)風險。
[0003]采用經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的基因遞送在上世紀80年代早期由Mann等描述(Cell，33 (I): 153-9，1983)。最常用的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因組簡單，從該基因組產(chǎn)生多聚蛋白質(zhì)Gag、Pol和Env,并以反式形式供病毒復制所需(Breckpot等,2007, Gene Ther, 14(11):847-62; He等，2007，Expert Rev vaccines, 6(6):913-24)。一般需要的順式序列是長末端重復序列(LTR)及其如下周邊序列:整合所需的反向重復序列(IR或att位點)、包裝序列Ψ、轉(zhuǎn)運RNA結(jié)合位點(引物結(jié)合位點，PBS)，和逆轉(zhuǎn)錄涉及的一些其它序列(LTR內(nèi)的重復R，以及多嘌呤序列(PPT)，正鏈起始所必需)。為了生成復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表達盒替代。
[0004]源自慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(即，慢病毒載體)已涌現(xiàn)為用于基因治療和免疫治療目的的有希望的工具，因為它們顯示優(yōu)于其它病毒系統(tǒng)的若干優(yōu)勢。具體而言，慢病毒載體本身無毒，并且不像其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒能夠轉(zhuǎn)導非分裂細胞，尤其是樹突細胞(He等,2007，Exper t Rev vaccines, 6 (6): 913-24),這允許通過內(nèi)源性通路的抗原遞呈。慢病毒代表逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)的一個慢病毒(slow virus)屬,其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性腦炎病毒(EIAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以無限地持續(xù)存在于其宿主內(nèi)，并且在一生的感染期間以不同速度連續(xù)復制。所述病毒在其宿主內(nèi)的持續(xù)復制取決于其避開宿主防御的能力。
[0005]重組慢病毒載體的設(shè)計基于所述慢病毒的順式與反式作用序列的分離。非分裂細胞中的有效整合與復制需要所述慢病毒基因組中存在兩種順式作用序列:中心多嘌呤序列(CPPT)和中心終止序列(CTS)。它們導致形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)，稱為中心DNA “瓣(flap)”，該結(jié)構(gòu)使基因進入非分裂細胞(包括樹突細胞(DC))核內(nèi)的效率最大化(Zennou等，2000，Cell, 101 (2) 173-85; Arhel 等，2007，EMBO J, 26(12): 3025-37)。
[0006]已經(jīng)基于由包裝構(gòu)建體為反式包裝載體提供B亞型Gag、Pol、Tat和Rev蛋白而生成了 HIV-1 慢病毒載體(Naldini 等,PNAS15:11382-8 (1996) ; Zufferey 等,Nature B1technologyl5:871-875，1997) ;Dull 等,Journal of Virology (1997))。這些研究米用 B 亞型Gag和Pol蛋白進行。而HIV-1包裝構(gòu)建體中非B亞型gag和pol序列的作用還未經(jīng)評估。
[0007]除B亞型外存在HIV-1的多種不同亞型。HIV-1的一些亞型，例如C、E和A亞型，似乎在轉(zhuǎn)送上比HIV-1B亞型(美國和歐洲的主要亞型)更為有效。Essex等，Adv VirusRes.1999;53:71-88。在發(fā)達西方國家，發(fā)現(xiàn)HIV-1優(yōu)勢亞型是進化枝B，這與存在于非洲和亞洲(絕大多數(shù)HIV感染人類的居住地)的那些亞型和重組子相差甚遠。Spira等，J.Antimicrobial Chemotherapy (2003) 51, 229-240。因此,在北美和歐洲所見的B亞型逆轉(zhuǎn)錄病毒與全球范圍人類傳染的那些病毒亞型之間可能存在嚴重差異(出處同上)。亞型差異可影響HIV傳播模式。同性傳播和靜脈內(nèi)藥物濫用是在歐洲和美國觀察到的進化枝B株系的主要傳播模式(出處同上)。相反，進化枝A、C、D和E在非洲和亞洲占優(yōu)勢，在這些地方異性傳播為主(出處同上)。此外，一些研究提出艾滋病(AIDS)的進展視感染性亞型而有不同(出處同上)。因此，似乎HIV-1B亞型與其它HIV-1亞型差異很大。
[0008]HIV種系分類法一般基于源自相同分離物的多個亞基因組區(qū)域(gag、pol和env)的核苷酸序列，或基于全長基因組序列分析。對于HIV-1的接近全長序列的種系分析揭示，HIV-1B亞型在遺傳上與HIV D亞型最緊密相關(guān)(圖1)。對于HIV-1Gag和Pol蛋白序列的種系分析也顯示，HIV-1B亞型在遺傳上與HIV D亞型最緊密相關(guān)(圖2)。
[0009]不過，HlV-1-NDK(—種D亞型病毒)對⑶4+淋巴細胞的細胞致病性顯著高于HIV-1-BRU原形(一種B亞型病毒)。這可能歸因于D亞型病毒的增強的致融性(fusogenicity)和感染性。De Mareuil 等,J.Virol.66:6797 (1992)。重組病毒的表型分析表明，來自HIV-1-NDK基質(zhì)(MA)蛋白N末端部分的75個氨基酸與HIV-1-NDK的包膜糖蛋白一同造成了 HIV-1-NDK在⑶4+淋巴細胞中增強的致融性以及HIV-1-NDK在一些⑶4-細胞系中增強的感染性(出處同上)。
[0010]本領(lǐng)域需要慢病毒包裝構(gòu)建體來生成更高效價的經(jīng)包裝慢病毒載體，以減少注射體積，提高劑量，降低疫苗接種的成本，并且增加能在一批次中治療的患者的數(shù)量。本發(fā)明滿足了這一需要。
[0011]發(fā)明概述
[0012]用D亞型HIV-1的gag-pol基因替代慢病毒包裝質(zhì)粒(構(gòu)建體ρ8.74)中的HIV-1B亞型的gag-pol基因，以生成構(gòu)建體pThV-GP-N。所述構(gòu)建體用于慢病毒載體的生成。相較于構(gòu)建體P8.74，使用pThV-GP-N質(zhì)粒獲得約2倍高的效價。因此，相對于B亞型病毒的Gag-Pol, D亞型病毒的Gag-Pol提高了慢病毒載體顆粒的效價。本發(fā)明涉及包含D亞型gag-pol序列,尤其是來自HIV-1NDK的D亞型gag-pol序列的慢病毒包裝載體。在一個優(yōu)選實施方式中，所述慢病毒包裝載體包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述慢病毒包裝載體編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0013]SEQ ID NOl的核苷酸序列是:
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種復制缺陷型慢病毒包裝載體，所述載體缺乏Ψ位點且編碼Hiv-1GagMA蛋白； 其中，所述HIV-1Gag MA蛋白具有如下特點: a)第12位的氨基酸不是谷氨酸， b)第15位的氨基酸不是精氨酸， c)不同時在第46位具有纈氨酸且在第61位具有亮氨酸；和 其中，相較于編碼HIV-1BRU的HIV-1Gag MA蛋白的慢病毒包裝載體，所述編碼HIV-1GagMA蛋白的慢病毒包裝載體產(chǎn)生的經(jīng)包裝慢病毒載體的效價至少增加至1.5倍。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第12位的氨基酸是賴氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第12位的氨基酸是精氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第15位的氨基酸是蘇氨酸。
5.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第15位的氨基酸是丙氨酸。
6.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
7.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第61位的氨基酸是異亮氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第61位的氨基酸是甲硫氨酸。
9.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述第15位的氨基酸是蘇氨酸。
10.權(quán)利要求書10缺失
11.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
12.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述第61位的氨基酸是異亮氨酸。
13.如權(quán)利要求9所述的載體，其特征在于，所述第46位的氨基酸是亮氨酸。
14.如權(quán)利要求9所述的載體，其特征在于，所述第61位的氨基酸是異亮氨酸。
15.如權(quán)利要求13所述的載體，其特征在于，所述第61位的氨基酸是異亮氨酸。
16.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述HIV-1GagMA蛋白是HIV-1NDK的HIV-1GagMA 蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的載體，其特征在于，所述載體編碼序列SEQID N0:4的氨基酸序列。
18.一種用于產(chǎn)生包裝載體的方法，所述方法包括:將來自非B亞型HIV-1病毒的Gag和/或Pol序列插入質(zhì)粒中受非HIV啟動子控制，以產(chǎn)生所述包裝載體。
19.一種用于產(chǎn)生慢病毒載體的方法，所述方法包括向細胞給予編碼非B亞型HIV-1Gag或Pol蛋白的包裝載體和慢病毒載體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法還包括選擇包裝載體，所述包裝載體包裝的慢病毒載體的效價高于編碼B亞型HIV-1Gag或Pol蛋白的相同包裝載體。
【文檔編號】C12N15/867GK104039968SQ201280046712
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月26日
【發(fā)明者】T-L·特蘭, P·沙紐, C·伯奇 申請人:賽拉?？碌偎构? 巴斯德研究院