一種y染色體修飾方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Y染色體修飾方法及其應用。本發(fā)明公開一種動物Y染色體修飾方法，是利用TALEN方法對離體的動物體細胞的Y染色體進行特異性的自殺元件修飾。本發(fā)明為選擇性培育特定性別的動物、提高育種效率奠定基礎。
【專利說明】一種Y染色體修飾方法及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Y染色體修飾方法及其應用，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 動物的性別控制（sex control)技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為干 預，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術。性別控制技術在畜牧生產(chǎn)中 意義重大。首先，通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳） 和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如生長速度、肉質(zhì)等）的最大經(jīng)濟效益。其次，控制后代的性別 比例可增加選種強度，加快育種進程。通過控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異 性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害。
[0003] 性別控制技術最早起源于昆蟲"不育技術"的提出，昆蟲不育技術主要用于防止和 控制害蟲。特別是蚊子，需要釋放大量的雄性不育蚊子進入環(huán)境，因此，培養(yǎng)過程中需要性 別分離技術或者性控技術，獲得大量的雄性蚊子。同時，家蠶這種高經(jīng)濟性狀昆蟲，也需要 性控技術獲得高產(chǎn)絲、低消耗的雄性家蠶。魚類性別控制的研究，對水產(chǎn)養(yǎng)殖來說，具有 重要的實用意義。因為許多養(yǎng)殖魚類，其生物學或經(jīng)濟性狀諸如生長率、成熟年齡、繁殖方 式、體色、體型和個體大小等雌、雄魚之間存在差異。因此，人們可以根據(jù)需要專門生產(chǎn)全 雌或全雄苗種進行單性養(yǎng)殖以提高經(jīng)濟效益。除了上述物種，家畜動物也迫切需要性別控 制技術，從而提_生廣性狀，提_經(jīng)濟效益，例如牛、豬、羊和雞等等。國內(nèi)外實踐表明，在畜 牧業(yè)發(fā)展中，品種貢獻率達到40%以上，因此動物育種技術在促進畜牧業(yè)乃至農(nóng)業(yè)發(fā)展中 發(fā)揮至關重要甚至是不可替代的作用。然而在我國，主要畜牧類品種則嚴重依賴于進口，在 主要的畜牧類品種中，奶牛品種依賴程度達100%，豬、雞品種依賴程度接近90% !這意味 著動物農(nóng)業(yè)整個產(chǎn)業(yè)鏈的源頭--品種嚴重依賴于國際市場。因此如果我們國家要進一步 提高畜牧業(yè)的效率、進一步保證畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的安全，動物育種則是重中之重。因此，發(fā)展 性別控制技術可以大大促進動物育種的發(fā)展，大大提高經(jīng)濟效益。
[0004]目前，從昆蟲到家畜發(fā)展了很多性別控制方法，其中昆蟲主要包括：生物學法、傳 統(tǒng)遺傳學法和轉基因技術法。然而，家畜主要利用物理、化學和最新的分子技術的方法，對 精子或早期受孕胚胎進行鑒定，獲得想要的性別后代。這里主要介紹這方面研究。目前奶 牛性別控制的常用方法主要包括：x，Y精子的分離、胚胎性別的鑒定和環(huán)境控制等方法。
[0005] 第一，X，Y精子的分離。
[0006]原理根據(jù)X，Y精子在物理（體積，密度，電荷，運動性）和化學（DNA含量，表面抗 原）等方面的差異，建立的對精子進行分選的各種方法，包括沉降法、電泳法、離心法及其 目前應用比較多的流式細胞分離法、免疫學和FISH技術鑒定方法。
[0007] 流式細胞分離法：主要依據(jù)是X、Y精子DNA的含量不同。一般來說，X精子比Y精 子含有較多DNA，所以用熒光染料H 〇echst33342染色時，X精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光 也強，就此可以分辨出X與Y精子，然后再利用計算機控制使熒光強的X精子帶上正電荷， Y精子帶上負電荷，在通過高壓電場時便向不同的方向偏轉，從而達到分離目的，分辨率可 達90 %，但用流式細胞分離器分離精子時，精子需要一個個通過，這樣就必須稀釋精液，這 就會造成精子的運動能力下降，而且熒光染料對精子有毒害作用，加之效率太低儀器價格 昂貴，在授精后還有產(chǎn)仔數(shù)和妊娠率下降的情況，還無法用于生產(chǎn)實踐。
[0008] 免疫學方法：隨著免疫學的發(fā)展人們發(fā)現(xiàn)在雄性組織包括Y精子，存在有H- Y抗 原。雄性組織免疫雌性動物產(chǎn)生H-Y抗體，且只有Y精子才能表達H-Y抗原，因而利用H- Y抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的H- Y抗原，再通過免疫或分離方法獲得X、Y精子。1982年， 研究者Zavos把H- Y抗血清注入母兔陰道內(nèi)，15分鐘后輸精，所產(chǎn)生的雌性兔占74. 2%。 H- Y抗血清是利用免疫雌性動物后而獲取的，但H- Y抗原自身是一種弱抗原，加之動物個 體自身對免疫反應的差異，很難起到較好的免疫效果，而且分離精子活力下降也會影響受 胎率和產(chǎn)仔數(shù)。目前國內(nèi)外對H- Y克隆抗體都有廣泛的研究，可以期望未來免疫學方法能 在控制性別上得到應用。
[0009] FISH技術鑒定法：熒光原位雜交技術（是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜 交樣本進行檢測的技術）。FISH由于其直觀，快速，敏感性高和方便靈活越來越得到廣泛的 應用。基本原理是：將標記了熒光的單鏈DNA(探針）和與其互補的DNA退火雜交，通過觀 察熒光信號在染色體上的位置來反映相應基因的情況。即利用Y染色體特異核酸探針與精 子上的特定的序列雜交，而后標定熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下直接觀察并區(qū)分X精子和Y精 子。該方法特別適用于X精子和Y精子DNA含量差別很微小，重分析不能保證準確性的情 況。最初運用FISH在牛精子上的結果是可清楚鑒定79%的精子。但是該方法的缺陷是耗 費時間長,且試劑的價格較高。
[0010] 第二：胚胎性別的鑒定
[0011] 原理是在胚胎期，利用核型分析法、免疫學法和SRY-PCR鑒定法檢測其雌性還是 雄性，從而選著目的性別胚胎進行后續(xù)操作。
[0012] 核型分析法：通過查明胚胎細胞的性染色體類型為XX型和XY型來鑒定胚胎的性 另IJ。操作過程為：取少量的胚胎細胞經(jīng)秋水仙素處理固定染色，檢查性染色體，根據(jù)染色體 在細胞分裂中期不同的譜帶和Y染色體的大小形態(tài)來判定性別，這種方法準確率幾乎可達 至IJ100%，但操作繁瑣，難以在生產(chǎn)中應用。目前主要用來驗證其他性別鑒定方法的準確率。
[0013] 免疫學法：先將8細胞桑葚胚期的胚胎與H- Y抗體反應30min，再與異硫氰酸鹽 熒光素（FITC)標記的免疫球蛋白IgM抗體反應，然后在熒光顯微鏡下檢查胚胎是否帶有熒 光素，若有則判定為H - Y+胚胎，不顯熒光則為H - Y-胚胎。在牛有89%的雌性鑒定準確 率，豬有81 %的鑒定準確率，綿羊有85%，的鑒定準確率。
[0014] SRY-PCR法：是一種利用雄性特異性基因探針和PCR擴增技術鑒定胚胎性別的方 法，該方法的原理：在SRY基因核心序列的兩側設計并合成一對特異性引物，分別互補于擴 增序列的兩條鏈，在TaqDNA聚合酶和胚胎細胞DNA存在的條件下，經(jīng)高溫變性，低溫退火和 鏈延伸三個步驟進行DNA擴增，將靶序列擴增至上百萬倍以上，經(jīng)電泳檢測擴增結果，能擴 增出SRY序列的為雄性，反之為雌性。Herr等在1990年首先成功的建立了牛胚胎性別鑒定 的PCR法。即通過合成SRY基因或其他Y染色體上特異性片段的部分序列作為引物，在一定 條件下PCR擴增反應能擴增出目標片段的胚胎為雄性胚胎，否則為雌性胚胎。通過PCR擴增 Y染色體DNA可大大增加靈敏度，改善準確率，經(jīng)活組織取樣的胚胎不會有很大的損傷且不 易被黏附在胚胎表面或透明帶里的精子污染，還有希望進一步冷凍，將采取的活細胞經(jīng)PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，染色即可觀察有無特異性片段，用PCR擴增的胚胎鑒定的準 確率可達90%以上是目前為止最為理想的胚胎性別鑒定方法之一。正因為如此該方法已被 廣泛應用在家畜，特別是牛，羊胚胎的性別鑒定。但這種方法對胚胎具有很大的損傷，且這 種分析需要較長時間，而胚胎在體外的時間和胚胎移入受體時間受到嚴格的限制，如果在 時間上不能同步，將使移植效率受到影響。為了解決這個問題，人們不得不將進行PCR分析 的胚胎暫時冷凍保存起來，待PCR結果出來后再進行解凍，這樣大大增加了操作的難度，并 對胚胎產(chǎn)生進一步的傷害?？傊?，目前的這些方法不能滿足生產(chǎn)應用，急需新的方法。
[0015] 動物轉基因技術是生物【技術領域】的研究熱點，特別是目前最新發(fā)展的人造核酸酶 介導的精確地基因組編輯技術，它的應用范圍已經(jīng)滲透到基礎研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等諸多領 域。1997年，首例體細胞克隆綿羊"Dolly"誕生的報道引起了社會各界的強烈關注，同時 也標志著生物領域的一種新的技術一哺乳動物體細胞核移植技術的成功建立。同年報道的 首例利用體細胞核移植技術培育出的轉基因綿羊"Polly"的誕生才是動物轉基因研究領域 真正的里程碑，它掀開了體細胞核移植技術用于生產(chǎn)轉基因大家畜的新篇章，同時伴隨著 "人造核酸酶技術"ZFN/TALEN和Cas9等精確基因組編輯技術的出現(xiàn)和發(fā)展，與傳統(tǒng)的大動 物體細胞核移植技術相結合，可以實現(xiàn)大動物精確基因組修飾及其多基因修飾，大大加快 了大動物轉基因技術的發(fā)展。盡管，轉基因技術不斷進展，但是利用此技術進行大動物性別 控制沒有研究。
[0016] SRY基因是大多數(shù)哺乳動物的性別控制基因，在哺乳動物的性別發(fā)育過程中，Y染 色體的存在決定其向雄性發(fā)育。在這一過程中起決定作用的基因是Y染色體連鎖的Sry， 它是哺乳動物唯一的睪丸決定因子，該基因是位于哺乳動物Y染色體上與性別發(fā)生直接相 關的基因，該基因的有無和突變與否直接決定了哺乳動物的性別表型。基因型為XX的帶 有SRY基因的個體會以雄性表型存在，SRY基因的突變也會在一定程度上引起性反轉或性 別異常，2013年研究人員報道SRY基因敲除小鼠，喪失雄性特征，變?yōu)榇菩浴RY蛋白屬于 含有HMG盒（High mobility group)并特異結合于DNA序列蛋白的一個亞類，該亞類包括 多種轉錄因子，可以激活下游很多雄性相關基因的表達，從而控制雄性發(fā)育。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種Y染色體修飾方法及其應用。
[0018] 本發(fā)明提供一種動物Y染色體修飾方法，是利用TALEN方法對離體的動物體細胞 的Y染色體進行特異性的自殺元件修飾；
[0019] 所述自殺元件能特異性殺死其所在的含有Y染色體的生殖細胞，同時對其所在的 動物的體細胞不產(chǎn)生危害；
[0020] 所述修飾是在Y染色體的性別決定基因SRY上進行修飾；
[0021] 所述TALEN方法是利用TALE蛋白對Y染色體特異靶序列進行突變，同時將自殺元 件同源重組到靶序列位置。
[0022] 上述方法中，所述對離體的動物體細胞的Y染色體進行特異性的自殺元件修飾的 方法為：使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性動物A的離體體細胞中表達，得到Y染色 體上靶序列發(fā)生突變的體細胞；同時將自殺元件同源重組到靶序列位置，實現(xiàn)自殺元件在 雄性動物A的離體體細胞Y染色體上靶序列處的定點整合；
[0023] 所述TALE蛋白-I的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；
[0024] 所述TALE蛋白-II的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；
[0025] 所述靶序列如SEQIDNo.1所示；
[0026] 所述靶序列位于Y染色體的SRY基因上；
[0027] 所述TALE蛋白-I和TALE蛋白-II能分別與SEQIDNo.1中自5'末端起第4 位至第18位、第35位至第48位核苷酸序列特異結合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的 FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II 分別與靶序列特異結合位點之間的序列發(fā)生突變。
[0028] 上述任一所述的方法中，所述使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性動物A的 離體體細胞中表達的方法為：將分別含有TALE蛋白-I和TALE蛋白-II編碼基因的重組 表達質(zhì)粒導入所述雄性動物A的離體體細胞中；
[0029] 所述TALE蛋白-I的編碼基因序列如SEQIDNo.2所示；
[0030] 所述TALE蛋白-II的編碼基因序列如SEQIDNo.4所示；
[0031] 所述將自殺元件同源重組到靶序列位置為將所述自殺元件通過線性化的同源重 組載體整合在所述靶序列位置上；
[0032] 所述線性化的同源重組載體上具有靶序列同源左臂-自殺元件-靶序列同源右臂 的片段。
[0033] 上述任一所述的方法中，所述靶序列同源左臂的序列如SEQIDNo.9中自5'末端 起第676位至第1636位核苷酸所示；
[0034] 所述靶序列同源右臂的序列如SEQIDNo.9中自5'末端起第5526位至第6449 位核苷酸所示。
[0035] 上述任一所述的方法中，所述自殺元件包含精子特異性啟動子和自殺基因；
[0036] 所述自殺基因在精子成熟過程中被所述精子特異性啟動子啟動表達，殺死所述自 殺基因所在的含有Y染色體的精子；
[0037] 所述自殺元件的序列如SEQIDNo.9中自5'末端起第1948位至第3730位核苷 酸所示；
[0038] 所述靶序列同源左臂-自殺元件-靶序列同源右臂的的序列如SEQIDNo.9中自 5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示。
[0039] 上述任一所述的方法中，所述同源重組載體的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；
[0040] 所述線性化為限制性內(nèi)切酶Ahdl線性化；
[0041] 所述動物為牛。
[0042] 一種獲得雌性動物的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，是利用上述任一所述的方法 對雄性動物A的離體體細胞中的Y染色體進行修飾，得到帶有自殺元件的轉基因細胞；以轉 基因細胞為核供體細胞，通過體細胞克隆技術得到體細胞克隆雄性動物B;以體細胞克隆 雄性動物B為父本，獲得的后代均為雌性；
[0043] 所述動物具體為牛。
[0044] 一種試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒含有如下1)_4)的至少一種物 質(zhì)：
[0045] 1)含有SEQIDNo.3所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因 細胞系或重組菌；
[0046] 2)含有SEQ ID No. 5所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因 細胞系或重組菌；
[0047] 3) SEQ ID No. 9所示的DNA分子或含有該分子的轉基因細胞系或重組菌；
[0048] 4)含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分 子、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；
[0049] 所述SEQ ID No. 3所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID No. 2所示；
[0050] 所述SEQ ID No. 5所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID No. 4所示。
[0051] SEQ ID No. 9所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0052]和 / 或，
[0053] 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子也 屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0054]和 / 或，
[0055] SEQ ID No. 2所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0056]和 / 或，
[0057] SEQ ID No. 4所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0058] 上述試劑盒或上述DNA分子在制備自殺元件修飾動物離體體細胞Y染色體的產(chǎn)品 中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0059]或，
[0060] 上述試劑盒或上述DNA分子在制備Y染色體上帶有自殺元件的雄性動物的產(chǎn)品中 的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0061]或，
[0062] 上述試劑盒或上述DNA分子在制備Y染色體上帶有自殺元件的雄性動物細胞的產(chǎn) 品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0063] 所述自殺元件具體如SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所 示的DNA分子，具體位于Y染色體的SRY基因上；
[0064]或，
[0065] 上述試劑盒或上述DNA分子在制備用于動物性別的選擇和/或控制的產(chǎn)品中的應 用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0066]或，
[0067] 上述試劑盒或上述DNA分子在動物繁育中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0068] 所述動物具體為牛。
[0069] 本發(fā)明的原理是首先對雄性動物A體細胞中的Y染色體的性別決定基因SRY進行 "自我殺死含Y染色體精子"元件修飾，同時不破壞SRY基因，將其作為核供體細胞，再通過 體細胞克隆技術得到體細胞克隆雄性動物B，由于體細胞克隆雄性動物B的精子成熟后，Y 染色上的DTA基因特異表達，殺死含有Y染色體的精子，因此含Y染色體的精子死亡，而含 X染色體的精子正常存活，體細胞克隆雄性動物B的精子進行受精獲得的個體全部是雌性， 從而達到性別控制的目的。
[0070] 本發(fā)明提供的方法為一種通過精確基因修飾的雄性哺乳動物體細胞，進而實現(xiàn)鑒 定和/或選擇特定性別動物的目的的方法。本發(fā)明為選擇性培育特定性別的動物、提高育 種效率奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0071] 圖 1 為 pSRY-TALEN-F 和 pSRY-TALEN-R 載體圖譜。
[0072] 圖2為同源重組供體載體pPRMl-DTA單酶切后的線性圖譜。
[0073] 圖3為細胞克隆的PCR鑒定結果。
[0074] 圖4為克隆牛的PCR鑒定結果。
[0075] 圖5為克隆牛的精液PCR鑒定結果。
[0076] 圖6為克隆牛的后代性別鑒定的PCR結果。

【具體實施方式】
[0077] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0078] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0079] DMEM/F12+10% FBS培養(yǎng)基按照如下方法配制：該培養(yǎng)基由DMEM/F12和胎牛血清 (FBS)混勻而成，F(xiàn)BS與DMEM/F12的體積比為1 :9。
[0080] pPGKloxPneo2 購自addegen，產(chǎn)品目錄號為 13443。
[0081] 成熟液的制備方法如下：將M199培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS)按照體積比9:1混勻， 得到混合液，在混合液中加入0. 01U/mL bFSH (促卵泡生長激素）、0. 01U/mL bLH (促黃體生 成素）和1 U g/mL雌二醇。
[0082] 操作液的制備方法如下：將M199培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS)按照體積比9:1混勻， 得到混合液，在混合液中加入7. 5 ii g/mL細胞松馳素B。
[0083] Zimmerman液按照如下方法配制：含有0? 3M甘露醇、0? 1M MgS04、0. 05M CaCl2、 0? 5mM HEPES、0. 05g/100mL BSA 的水溶液，pH7. 2,用 0? 22 ii m 濾膜過濾
[0084] A23187 液購自 sigma，貨號為 C9275。
[0085] CRlaa培養(yǎng)液按照如下方法配制：114mM氯化鈉、3. ImM氯化鉀、26. 2mM碳酸氫鈉、 20. 4mM丙酮酸鈉的水溶液，PH7. 2,用0. 22um濾膜過濾。
[0086] B0液的配制：
[0087] (1) A 液（100ml)
[0088] NaCl 0.8185g KCI 0. 0376g NaH2P04 0 . 0 1 61g MgCl, ? 2H20 0.01:32% CaCl2 0.0311g
[0089] 超純水100ml定容。
[0090] (2)B 液（100ml)
[0091] NaHC03 1. 1552g
[0092] 超純水 100ml定容。
[0093] A、B液均經(jīng)高溫消毒后備用。
[0094] (3) B0 液（100ml)
[0095] A 液 80ml
[0096] B 液 20ml
[0097] 丙酮酸鈉 0.0138g
[0098] 青霉素 3.lmg
[0099] 鏈霉素 3.lmg
[0100] 肝素鈉 3mg。
[0101] 實施例1、"自我殺死含Y染色體精子"元件精確修飾Y染色體性別控制基因SRY 的種公牛的體細胞的制備
[0102] -、種公牛成纖維細胞系的建立
[0103] 取荷斯坦奶牛種公牛的耳部皮膚組織，將耳部下緣背側去毛后用體積百分含量為 70 %的乙醇水溶液清洗干凈，再用刀片從耳部下緣背側剔取面積為lcm2左右的皮膚，置于 0°C的DMEM/F12培養(yǎng)基中盡快運回實驗室，以PBS和體積百分含量為70%的乙醇水溶液清 洗數(shù)遍后剪碎成1mm 3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍后分批植塊于含lmLDMEM/F12+10% FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補加DMEM/F12+10% FBS至6mL，于37°C、 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7d，每2d換液1次，待細胞生長匯合后，以0. 25%胰蛋白酶消化傳代 2-3次，分批以細胞凍存液凍存。這樣，經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍等體外培養(yǎng)操作，建立了 種公牛成纖維細胞系。
[0104] 二、祀點序列的確定
[0105] 選定的靶序列在SRY基因內(nèi)部，序列如下：
[0106] 5 '-ctTTCTTGTGCTTATTTTCAATATTGACTTCCTTACTCTCGCTAACAAag-3'(SEQ ID No.1)
[0107] SEQIDNo. 1中自5'末端起第4位至第18位、第35位至第48位核苷酸序列為可被 TALENs蛋白中的結合功能域特異結合的部分，結合位點中間部分為TALENs蛋白的Fok I內(nèi) 切核酸酶切割識別位點。
[0108] 三、構建作用于SRY基因的TALEN
[0109] pSRY-TALEN-F和pSRY-TALEN-R載體的示意圖如圖1所示。
[0110] pSRY-TALEN-F中SRY-F的編碼基因序列如SEQ ID No. 2所示，SRY-F的氨基酸序 列如SEQ ID No. 3所示，SRY-F即為TALE蛋白-I。
[0111] pSRY-TALEN-R中SRY-R的編碼基因序列如SEQ ID No. 4所示，SRY-R的氨基酸序 列如SEQ ID No. 5所示，SRY-R即為TALE蛋白-II。
[0112] TALE蛋白-I和TALE蛋白-II能分別與SEQ ID No. 1中自5 '末端起第4位至第 18位、第35位至第48位核苷酸序列特異結合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的FokI 功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II分別與 靶序列特異結合位點之間的序列發(fā)生突變；如果TALENs蛋白發(fā)揮切割作用，細胞會啟動自 身修復機制，在切割位點會出現(xiàn)小片段的刪除或者插入，測序結果峰圖為雜合峰圖。
[0113] 四、構建同源重組供體載體pPRMl-DTA
[0114]1、Notl 單酶切 p2014Gene-l，得到 3070bp 的基因片段（如 SEQ ID No. 6 所示）， 該基因片段含有同源供體載體的5'端同源臂及"自我殺死含Y染色體精子"元件；Notl單 酶切pPGKl 〇XPne〇2,得到6307bp的載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組 質(zhì)粒，將其命名為pDonor-5HR-DTA，將pDonor-5HR-DTA送測序，結果正確。
[0115] 2、提取步驟一的種公牛成纖維細胞的基因組DNA，以其為模板，以引物B171和 B172為引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0116] B171 :5, -AAGGATGCAAGCTAGCCTTCCTTACTCTCGCTAACAA-3' ； (SEQ ID No. 7)
[0117] (下劃線所示序列為Nhel酶切識別位點）
[0118] B172 :5' -ATGCAAGTGCGTCGACATCAGATTAATCAGACAGGAT-3'。(SEQ ID No. 8)
[0119] (下劃線所示序列為Sail酶切識別位點）
[0120] 該PCR擴增產(chǎn)物為943bp，將其作為同源重組供體載體的3'端同源臂。
[0121] 將該PCR擴增產(chǎn)物連接pMD-19T載體，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pMD19T-3HR，將 PMD19T-3HR送測序，結果正確。
[0122] 3、Nhel和Sail雙酶切pMD19T-3HR，得到943bp的基因片段；Nhel和Sail雙酶 切pD 〇n〇r-5HR-DTA，得到9. 3kb的載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì) 粒，將其命名為PPRM1-DTA，將pPRMl-DTA送測序，結果正確。
[0123] pPRMl-DTA 的序列如 SEQ ID No. 9 所示。
[0124] SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第1636位為靶序列同源左臂、第1948位 至第3730位為"自我殺死含Y染色體精子"元件、第5526位至第6449位為靶序列同源右 臂。
[0125] "自我殺死含Y染色體精子"元件包含精子特異性啟動子和自殺基因。
[0126] 五、pPRMl-DTA載體線性化
[0127] 用Ahdl單酶切pPRMl-DTA載體，得到線性化片段，并用無水乙醇法純化回收線性 化片段，用于轉染種公牛成纖維細胞系。
[0128] 線性化載體結構如圖2所示。
[0129] 圖2中，5HR和3HR代表同源重組的位置，PRM1表示牛的精子特異啟動子；DTA為白 喉毒素基因即自殺基因；PGK為磷酸甘油激酶強啟動子；Nec/表示新霉素抗性基因；polyA 表示轉錄終止信號。
[0130] 新霉素抗性基因是為了便于后續(xù)的轉基因細胞的篩選所設置。
[0131] 六、基因轉染
[0132] pPRMl-DTA與TALENs質(zhì)粒的細胞共轉染：將3ug Ahdl酶切線性化的pPRMl-DTA及 3ug TALENs質(zhì)粒（pSRY-TALEN-F和pSRY-TALEN-R各1. 5ug共轉染步驟一制備的種公牛成 纖維細胞（細胞數(shù)約2 X 106)得到轉基因細胞。
[0133] pSRY-TALEN-F 和 pSRY-TALEN-R 分別編碼的 TALE 蛋白-I 和 TALE 蛋白-II 能分 別與種公牛成纖維細胞Y染色體上的SEQ ID No. 1中自5'末端起第4位至第18位、第35 位至第18位核苷酸序列特異結合，TALE蛋白-I和TALE蛋白-II中的Fok I功能域形成 二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，使得TALE蛋白-I和TALE蛋白-II分別與靶序列特異 結合位點之間的序列發(fā)生突變；同時將帶有外源基因的Ahdl酶切的線性化pPRMl-DTA導入 后，"自我殺死含Y染色體精子"元件同源重組到靶序列位置，實現(xiàn)種公牛成纖維細胞中的Y 染色體性別控制基因SRY被"自我殺死含Y染色體精子"元件精確修飾。
[0134] 七、PCR鑒定陽性轉基因細胞
[0135] 以轉基因細胞的基因組DNA為模板，以K0D2-F和K0D2-R為引物，進行PCR擴增，得 到PCR擴增產(chǎn)物，如果PCR擴增產(chǎn)物為2. lkb的片段，表明轉基因細胞為陽性轉基因細胞， 同時以ddH20為模板，進行上述實驗，作為對照。
[0136] K0D2-F :5，-tgctcctgccgagaaagtat-3，；（SEQ ID No. 10)
[0137] K0D2-R :5, -AAACAGTCTGTGAAGTTACCT-3，。（SEQ ID No. 11)
[0138] 結果如圖3所示。
[0139] 圖3表明，標號1、6的轉基因細胞克隆鑒定為陽性轉基因細胞克隆，并對PCR擴增 產(chǎn)物進行測序，結果正確。將陽性轉基因細胞作為體細胞克隆核供體細胞，下述實施例中的 轉基因細胞均為陽性轉基因細胞。
[0140] 實施例2、利用"自我殺死含Y染色體精子"元件精確修飾Y染色體性別控制基因 SRY的種公牛的體細胞培育體細胞克隆種公牛
[0141] 一、卵母細胞的成熟培養(yǎng)
[0142] 從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30°C的生理鹽水，在4h內(nèi)送到實驗室，將卵巢 在37°C的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0. 7mm針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態(tài)均 勻、結構致密的卵丘-卵母細胞復合體（COCs)，以成熟液洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞 復合體以50-60枚/孔放入含成熟液的4孔板，在38. 5°C、5 % C02培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18-20h 后，得到成熟的細胞，將成熟的細胞放入盛有含體積百分含量〇. 1 %的透明質(zhì)酸酶的水溶液 的管內(nèi)振蕩2-3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態(tài) 完整,細胞質(zhì)均勻并帶有第一極體的卵母細胞為核受體細胞。
[0143] 二、體細胞克隆種公牛的獲得
[0144] 1、將帶有第一極體的卵母細胞移入操作液中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體 上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20 y m的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內(nèi) 的染色體一并吸除，再放入含有體積百分含量20% FBS的M199溶液中洗三遍后，得到去核 的卵母細胞，將其置于培養(yǎng)箱中備用。
[0145] 2、將血清饑餓2-4d的實施例1制備的轉基因細胞（核供體細胞）用0. 25%胰蛋白 酶（trypsin)消化2-4min，用20 iim直徑玻璃管將直徑為10-12 iim的轉基因細胞移入步驟 1制備的去核的卵母細胞的透明帶內(nèi)，然后將其放入Zi_erman液中平衡（現(xiàn)用現(xiàn)配）3-5 分鐘后放入融合槽內(nèi)轉動卵細胞使核供體細胞與去核的卵母細胞接觸而與電場垂直，同時 在場強為2. 5kV/cm的直流脈沖場中，在脈沖時間為10 ii s、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為Is 的條件下融合（融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，得到融合胚，將其迅速移入含有體積百 分含量10% FBS的M199中培養(yǎng)數(shù)小時后，挑選融合胚（具體挑選供體細胞和卵母細胞完全 融合的重構胚）進行激活處理。將融合胚放入5mM A23187液中5分鐘后換到胚胎激活液 (含5ug/ml細胞松馳素B、10ug/ml放線菌酮的M199培養(yǎng)液）中5小時，待融合胚被激活后 換入含有體積百分含量5%的FBS的CRlaa中，在38. 5°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 天后觀察融合胚的囊胚發(fā)育率，結果表明克隆囊胚發(fā)育率為20% -60%。
[0146] 3、胚胎移植與妊娠檢測
[0147] 將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入同期發(fā)情的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的 第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并分別在移植后的第60d和第90d進行 直腸檢測以確定妊娠率，妊娠率為40%。
[0148] 4、對妊娠母牛按常規(guī)飼養(yǎng)方法進行飼養(yǎng)，經(jīng)過280天，妊娠母牛正常分娩，得到體 細胞克隆種公牛。
[0149] 三、種公牛及的生物學鑒定
[0150] 采集體細胞克隆種公牛耳部組織樣，提取其基因組DNA，以基因組DNA為模板，以 K0D2-F和K0D2-R為引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，同時以ddH 20為模板，進行上 述實驗，作為對照。
[0151] PCR 反應程序：94 °C 5min ;94 °C 30sec，62 °C 30sec，72 °C 120sec，30 個循環(huán)； 72。。7min。
[0152] 如果PCR擴增產(chǎn)物為2.lkb的片段，表明基因敲入成功。
[0153] 結果表明共有5頭個體，PCR都擴增出2. lkb的陽性片段，如圖4所示。進一步將 PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結果正確。證實步驟二成功獲得體細胞克隆種公牛，該體細胞克隆 種公牛的Y染色體性別控制基因SRY被"自我殺死含Y染色體精子"元件精確修飾。
[0154] 實施例3、體細胞克隆種公牛精液的分子生物學鑒定
[0155] 將實施例2培育得到的體細胞克隆種公牛進行精子采集，然后用PCR方法進行鑒 定，確定其精子是否全是含X染色體的精子，具體步驟如下：
[0156] 以體細胞克隆種公牛精子的基因組DNA為模板，以SRY基因特異的PCR引物SRY-F 和SRY-R為引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。同時以ddH 20為模板，進行上述實驗， 以野生型荷斯坦奶牛種公牛的精子的基因組DNA為模板，進行上述實驗，作為對照。
[0157] 引物序列如下：
[0158] SRY-F:5' -AACGACGATGTTTACAGTCCA-3' ；（SEQ ID No. 12)
[0159] SRY-R:5,-GCCCGGGTATTTGTCTCGGT-3,。（SEQ ID No. 13)
[0160] PCR 反應程序：94 °C 5min ;94 °C 30sec，62 °C 30sec，72 °C 30sec，30 個循環(huán)； 72。。7min。
[0161] 含有Y染色體的精子特異含有SRY基因，因此PCR擴增可以擴增出340bp片段，而 只含有X染色體的精子，不能擴增出條帶。
[0162] 結果如圖5所示。
[0163] 圖5表明，體細胞克隆種公牛的精液沒有擴增出目的條帶，說明體細胞克隆種公 牛含Y染色體的精子自動死亡，只剩下正常的含X染色體的精子。
[0164] 實施例4、體細胞克隆種公牛后代個體的鑒定
[0165] 取Y染色體性別控制基因SRY被"自我殺死含Y染色體精子"元件精確修飾的實施 例2獲得的體細胞克隆種公牛的精液，加入到含有肝素（50ug/ml)、咖啡因（0. Olnmol/ml)、 BSA (3. Omg/ml)的B0液中稀釋洗滌兩遍（以1800轉/分鐘，離心8分鐘），去上清后再加 入lml相同的含有肝素（50ug/ml)、咖啡因（0. 01nmol/ml)、BSA(3. 0mg/ml)的B0液混合均 勻后，取50ul加到50ul的含有20-30枚卵母細胞的受精液（含10mg/ml BSA，不含脂肪酸 的B0液）中共培養(yǎng)5小時后，將其轉入到體外培養(yǎng)液CRlaa中繼續(xù)培養(yǎng)5到7天，待受精 卵發(fā)育到桑椹至囊胚期然后移植到受孕母體，得到后代個體進行PCR和形態(tài)學進行性別鑒 定。
[0166] 以牛耳細胞的基因組DNA為模板，以SRY-F和為SRY-R為引物，進行PCR擴增，得 到PCR擴增產(chǎn)物。同時以ddH 20為模板，進行上述實驗，以野生型荷斯坦奶牛種公牛的精子 的基因組DNA為模板，進行上述實驗，作為對照。
[0167] 結果如圖6所示。
[0168] 圖6表明，野生型荷斯坦奶牛種公牛的精子可以擴增出340bp的目的片段，標號為 1和2的后代個體均沒有擴增出目的條帶，并且所有的后代個體經(jīng)形態(tài)學鑒定后都顯示為 雌性母牛。
【權利要求】
1. 一種動物Y染色體修飾方法，是利用TALEN方法對離體的動物體細胞的Y染色體進 行特異性的自殺元件修飾； 所述自殺元件能特異性殺死其所在的含有Y染色體的生殖細胞，同時對其所在的動物 的體細胞不產(chǎn)生危害； 所述修飾是在Y染色體的性別決定基因 SRY上進行修飾。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述對離體的動物體細胞的Y染色體進 行特異性的自殺元件修飾的方法為：使TALE蛋白-I和TALE蛋白-II在雄性動物A的離 體體細胞中表達，得到Y染色體上靶序列發(fā)生突變的體細胞；同時將自殺元件同源重組到 靶序列位置，實現(xiàn)自殺元件在雄性動物A的離體體細胞Y染色體上靶序列處的定點整合； 所述TALE蛋白-I的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述TALE蛋白-II的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述靶序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述使TALE蛋白-I和TALE蛋 白-II在雄性動物A的離體體細胞中表達的方法為：將分別含有TALE蛋白-I和TALE蛋 白-II編碼基因的重組表達質(zhì)粒導入所述雄性動物A的離體體細胞中； 所述TALE蛋白-I的編碼基因序列如SEQ ID No. 2所示； 所述TALE蛋白-II的編碼基因序列如SEQ ID No. 4所示； 所述將自殺元件同源重組到靶序列位置為將所述自殺元件通過線性化的同源重組載 體整合在所述靶序列位置上； 所述線性化的同源重組載體上具有靶序列同源左臂-自殺元件-靶序列同源右臂的片 段。
4. 根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述靶序列同源左臂的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第1636位核苷酸所示； 所述靶序列同源右臂的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第5526位至第6449位核 苷酸所示。
5. 根據(jù)權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述自殺元件包含精子特異性啟 動子和自殺基因； 所述自殺基因在精子成熟過程中被所述精子特異性啟動子啟動表達，殺死所述自殺基 因所在的含有Y染色體的精子； 所述自殺元件的序列如SEQ ID No. 9中自5'末端起第1948位至第3730位核苷酸所 示； 所述靶序列同源左臂-自殺元件-靶序列同源右臂的的序列如SEQ ID No. 9中自5' 末端起第676位至第6449位核苷酸所示。
6. 根據(jù)權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述同源重組載體的核苷酸序列 如 SEQ ID No. 9 所示； 所述線性化為限制性內(nèi)切酶Ahdl線性化。
7. -種獲得雌性動物的方法，是利用權利要求1-6任一所述的方法對雄性動物A的離 體體細胞中的Y染色體進行修飾,得到帶有自殺元件的轉基因細胞；以轉基因細胞為核供 體細胞，通過體細胞克隆技術得到體細胞克隆雄性動物B ;以體細胞克隆雄性動物B為父 本，獲得的后代均為雌性。
8. -種試劑盒，該試劑盒含有如下1)-4)的至少一種物質(zhì)： 1) 含有SEQ ID No. 3所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因細胞 系或重組菌； 2) 含有SEQ ID No. 5所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因細胞 系或重組菌； 3. SEQ ID No. 9所示的DNA分子或含有該分子的轉基因細胞系或重組菌； 4) 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子、重 組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述SEQ ID No. 3所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID No. 2所示； 所述SEQ ID No. 5所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID No. 4所示。 9. SEQ ID No. 9所示的DNA分子； 和/或， 含有SEQ ID No. 9中自5'末端起第676位至第6449位核苷酸所示的DNA分子； 和/或， SEQ ID No. 2所示的DNA分子； 和/或， SEQ ID No. 4所示的DNA分子。
10. 權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備自殺元件修飾動物 離體體細胞Y染色體的產(chǎn)品中的應用； 或， 權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備Y染色體上帶有自殺元 件的雄性動物的產(chǎn)品中的應用； 或， 權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備Y染色體上帶有自殺元 件的雄性動物細胞的產(chǎn)品中的應用； 或， 權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備用于動物性別的選擇和 /或控制的產(chǎn)品中的應用； 或， 權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在動物繁育中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104450673SQ201410646037
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】戴蘊平, 孫照霖, 丁方榮, 王海萍, 李京, 李玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學