一種抗氧化多肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽，其氨基酸序列為Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述抗氧化多肽的制備方法，包括以下步驟：1)以鰱魚魚肉為原料，加水混合，于80～90℃水浴中靜置15～20min，勻漿，得到魚肉勻漿液；2)在步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，在95～100℃下保溫3～5min，冷卻至室溫，離心，收集上清液；3)取步驟2)所得上清液，用孔徑為2500-3000道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到所述抗氧化多肽。本發(fā)明所述多肽具有優(yōu)異的抗氧化功能，可以作為抗氧化原料應(yīng)用于功能食品中。
【專利說明】一種抗氧化多肽及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)食品加工領(lǐng)域，具體涉及一種以鰱魚魚肉為原料生產(chǎn)的具有抗氧 化功能的生物活性肽，以及該抗氧化多肽的制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)經(jīng)過水解得到多肽，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被改變，疏水區(qū)的活性官能基團(tuán)暴 露，隨著肽鍵的裂解，游離氨基酸增加，從而可以提供質(zhì)子或電子源，保持較高的氧化還原 電位，使其具有清除活性自由基的能力，具有抑制脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，從而抗氧化肽的 抗氧化活性得以提高。氧化對需氧生物特別是脊椎動物和人類是一個重要的代謝過程，但 是它卻導(dǎo)致了自由基的形成。自由基是高度不穩(wěn)定的、易于和其他分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，活性 氧自由基（ROS)被認(rèn)為能引起氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激涉及多種人類疾病如癌癥，動脈粥樣硬 化，糖尿病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病，帕金森氏病等等，以及老齡化。在食品體系中， 脂類或蛋白質(zhì)可能會受到ROS的攻擊經(jīng)歷氧化過程，從而導(dǎo)致食品產(chǎn)生不愉快味道，顏色 發(fā)暗，同時也可能產(chǎn)生潛在的毒性產(chǎn)物?？寡趸嚯牡膽?yīng)用能使人體免受氧化應(yīng)激的破壞， 并防止食品成分由于捐獻(xiàn)電子給ROS以及中和ROS的負(fù)面作用而變質(zhì)。因此抗氧化肽在醫(yī) 學(xué)、化妝品、生物、食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值。
[0003] 目前，國內(nèi)外專利對于抗氧化肽的開發(fā)均有所涉及。（1)專利EP1188767A1公開 了一種來源于酪蛋白的抗氧化肽的制備和分離純化方法；（2)專利US 7273847制備了來自 肺表面活性蛋白化合物的多肽具有抑制脂肪氧化的作用和抗菌性；（3)專利US8232243B2 公開了含有色氨酸和酪氨酸的肽作為抗氧化的方法，這種抗氧化劑可以用于治療和預(yù)防氧 化過程帶來的疾病和綜合征；（4)專利CN103275180A公開了一種馬面飩魚頭蛋白抗氧化肽 及其制備方法和用途，該抗氧化肽的氨基酸序列為Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr (LSHGPY)，分 子量為672Da ; (5)專利CN 103103242A公開了一種抗氧化活性肽及其制備方法，其特征在 于以藍(lán)圓鰺魚肉蛋白為原料，采用枯草桿菌2709產(chǎn)生的堿性蛋白酶水解，水解液滅酶后經(jīng) 離心、超濾、凝膠層析和反相高效液相色譜等分離并確定其中兩種天然抗氧化肽的結(jié)構(gòu)，其 氨基酸序列分別為His-Asp-His-Pro-Val-Cys (組氨酸-天冬氨酸-組氨酸-脯氨酸-纈 氨酸-半胱氨酸）和His-Glu-Lys-Val-Cys (組氨酸-谷氨酸-賴氨酸-纈氨酸-半胱氨 酸）；（6)專利CN103431158A公開了一種鴨肉蛋白源抗氧化肽的酶法制備工藝，包括酶解底 物的制備、酶解方法和檢測等步驟。
[0004] 目前，國內(nèi)外專利中未見以淡水魚魚肉為資源，利用胃蛋白酶制備抗氧化肽的相 關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于，針對抗氧化多肽產(chǎn)品開發(fā)的現(xiàn)狀，提供一種全新的、具有 優(yōu)異抗氧化性能的多肽。
[0006] 本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽，其氨基酸序列為：
[0007] Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。
[0008] 所述多肽可以以鰱魚魚肉為原料通過酶解后得到，也可以通過多肽固相合成等方 法得到。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡便、高效、低成本地制備所述抗氧化多肽的方 法。
[0010] 具體的，所述制備方法包括以下步驟：
[0011] 1)以鰱魚魚肉為原料，加水混合，于80?90°C水浴中靜置15?20min，勻漿，得到 魚肉勻漿液；
[0012] 2)在步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，充分反應(yīng)后，在95? 100°C下保溫3?5min，冷卻至室溫，離心，收集上清液；
[0013] 3)取步驟2)所得上清液，用孔徑為2500-3000道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到含有 所述抗氧化多肽的多肽溶液。
[0014] 本發(fā)明步驟1)中，水的加入量與魚肉重量比優(yōu)選為1?3:1 ;所述勻漿的條件為 10000?13000rpm，勻漿時間優(yōu)選為1?3min。
[0015] 本發(fā)明步驟2)中，胃蛋白酶的加入量與步驟1)所述鰱魚魚肉原料的重量比優(yōu)選 為I :100?300 ;所述酶解的具體條件為：在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)， 酶解反應(yīng)應(yīng)該充分進(jìn)行，反應(yīng)時間優(yōu)選為0. 25?2. Oh ;所述離心的條件為4000?6000g， 離心時間優(yōu)選為5?lOmin。
[0016] 本發(fā)明步驟3)中，利用孔徑為2500-3000道爾頓陶瓷膜，采用常規(guī)操作進(jìn)行超濾， 收集分子量小于濾膜孔徑的多肽的溶液，該混合溶液中富集了本發(fā)明請求保護(hù)的抗氧化多 肽。該混合溶液進(jìn)行濃縮、干燥后，可以得到含有目標(biāo)多肽的多肽混合物。
[0017] 本發(fā)明提供的制備方法還可以包括對所述混合溶液/混合物的純化步驟，純化產(chǎn) 物經(jīng)濃縮、冷凍干燥后，即可得到純度較高的目標(biāo)抗氧化多肽。
[0018] 所述純化可以根據(jù)本發(fā)明請求保護(hù)的抗氧化多肽的性質(zhì)選擇特定的凝膠柱、硅膠 柱以及相應(yīng)的流動相體系，通過常規(guī)的色譜法操作進(jìn)行純化。
[0019] 具體的，本發(fā)明提供的制備方法可以包括以下純化步驟：取本發(fā)明所述步驟3)得 到的多肽溶液，濃縮，使用Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜柱，以去離子水為流動相進(jìn)行洗 脫，收集含有目標(biāo)多肽的洗脫液。
[0020] 本發(fā)明提供的制備方法可以進(jìn)一步包括以下純化步驟：取經(jīng)S印hadex G-25凝膠 色譜柱洗脫得到的洗脫液，濃縮，使用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以含有〇. 1 %三氟乙酸的 乙腈-水為流動相進(jìn)行洗脫，收集含有目標(biāo)多肽的洗脫液。
[0021] 上述各純化步驟中，可以根據(jù)所述抗氧化多肽的性質(zhì)，通過紫外吸收法、反相高效 液相色譜法、標(biāo)準(zhǔn)品對照法等方法檢測洗脫液中的目標(biāo)多肽。
[0022] 本發(fā)明所述方法得到的多肽，可通過LC-MS/MS進(jìn)行氨基酸序列的測定和驗(yàn)證。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述抗氧化多肽的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明提供的多肽具有較好清除自由基作用，是天然的抗氧化劑，其應(yīng)用主要在 于作為抗氧化原料添加于功能食品中。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的多肽及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)本發(fā)明所得 的多肽具有優(yōu)異的抗氧化功能，可以作為抗氧化原料添加于功能食品中；2)本發(fā)明基于食 品源，利用食品級胃蛋白酶，經(jīng)過特定的酶解和分離技術(shù)獲得特定分子量的魚肉蛋白多肽， 能廣泛應(yīng)用于抗氧化功能食品，安全可靠；3)本發(fā)明開發(fā)的抗氧化多肽制備方法原料易 得，方法簡單，成本低廉，所得多肽的純度和活性均不低于固相合成法得到的多肽，適于產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)，有效地解決目前抗氧化多肽難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為實(shí)施例1所得多肽的質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 實(shí)施例1 :抗氧化多肽的制備
[0029] 1、多肽的制備：
[0030] 1)取鰱魚魚肉100克，加入200克水，在85°C水浴中靜置20min，采用分散均質(zhì)機(jī) 在12000rpm條件下勻漿2min，得到魚肉勻漿液300克；
[0031] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶1克，在pH2. 5、溫度37°C條件下 進(jìn)行酶解，反應(yīng)2小時后，在95°C下保溫3min，冷卻至室溫，在5000g條件下離心5min，收集 上清液；
[0032] 3)取步驟2)所得上清液，利用孔徑為3000道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到含有分子 量小于3000道爾頓的多肽的溶液；
[0033] 4)取步驟3)所得多肽溶液，濃縮，使用S印hadex G-25凝膠色譜柱（色譜柱長 100cm，直徑2. 6cm)，以去離子水為流動相進(jìn)行洗脫，洗脫液流速為0. 8mL/min，在280nm下 檢測各洗脫組分的吸收值，參考目標(biāo)多肽的吸收值，收集含有目標(biāo)多肽的洗脫液；
[0034] 5)取步驟4)所得洗脫液，濃縮，使用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以含有0. 1 %三氟 乙酸的乙腈-水為流動相進(jìn)行洗脫，流動相流速為lmL/min，參考相同洗脫條件下目標(biāo)多肽 的出峰保留時間，收集含有目標(biāo)多肽的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得抗氧化多肽〇.24g，純 度為 91. 25%。
[0035] 2、多肽的檢測：
[0036] 將所得多肽通過LC-MS/MS法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，可知其氨基酸序列 為 Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr(YTIQY)，分子量為 686Da。
[0037] 實(shí)施例2 :抗氧化多肽的制備
[0038] 1)取鰱魚魚肉300克，加入900克水，在80°C水浴中靜置20min，采用分散均質(zhì)機(jī) 在13000rpm條件下勻漿lmin，得到魚肉勻漿液350克；
[0039] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶2克，在pHl. 8、溫度35°C條件下 進(jìn)行酶解，反應(yīng)1小時后，在95°C下保溫5min，冷卻至室溫，在6000g條件下離心5min，收集 上清液；
[0040] 3)取步驟2)所得上清液，利用孔徑為2500道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到含有分子 量小于2500道爾頓的多肽的溶液；
[0041] 步驟4)和5)同實(shí)施例1 ;即得抗氧化多肽0. 69g，純度為89. 08%。
[0042] 實(shí)施例3 :抗氧化多肽的制備
[0043] 1)取鰱魚魚肉200克，加入200克水，在90°C水浴中靜置15min，采用分散均質(zhì)機(jī) 在IOOOOrpm條件下勻漿3min，得到魚肉勻漿液240克；
[0044] 2)調(diào)節(jié)步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶1.5克，在pH2. 5、溫度40°C條 件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)1. 5小時后，在KKTC下保溫3min，冷卻至室溫，在4000g條件下離心 IOmin,收集上清液；
[0045] 3)取步驟2)所得上清液，利用孔徑為2800道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到含有分子 量小于2800道爾頓的多肽的溶液；濃縮，冷凍干燥，得混合多肽4. 2g。
[0046] 經(jīng)反相高效液相色譜法檢測，所得混合多肽中目標(biāo)抗氧化多肽的含量為10. 6%。
[0047] 對比例1 :
[0048] 委托GenScript公司，采用常規(guī)多肽固相合成方法，得到的本發(fā)明提供的序列為 Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr 的多肽，純度為 90. 15%。
[0049] 對比例2 :
[0050] 委托GenScript公司，采用常規(guī)多肽固相合成方法，合成專利文獻(xiàn) CN103275180A公開的抗氧化肽，純度為89. 69 % ;所述抗氧化肽的氨基酸序列為 Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr(LSHGPY)，分子量為 672Da。
[0051] 實(shí)驗(yàn)例
[0052] 1、樣品來源：實(shí)施例1?3和對比例1、2提供的多肽。
[0053] 2、抗氧化活性檢測：
[0054] 1)清除DPPH自由基能力經(jīng)測定：取濃度為20 ii g/mL的多肽溶液I. 5mL，加入 I. 5mL 99. 5%的乙醇和0. 675mL的0. 02% DPPH乙醇溶液混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴 30min，然后在517nm下檢測體系吸光值；空白為去離子水。
[0055] DPPH自由基清除能力％=[(空白吸光值-樣品吸光值）/空白吸光值]X 100。
[0056] 2)還原力的測定：取濃度為20 ii g/mL的多肽溶液lmL，加入2. 5mL 0? 2M磷酸緩沖 液（pH6. 6)和2. 5mL 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的鐵氰化鉀溶液，混勻后放入50°C水浴加熱20min ; 取出迅速冷卻，加入2. 5mL 10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸（TCA)溶液，混合均勻后用3000g離 心IOmin ;取上清液2. 5mL，加入2. 5mL去離子水和0? 5mL 1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯化鐵溶液， 充分混勻，在室溫下反應(yīng)IOmin后，用700nm波長測定吸光度；還原力可用700nm波長處吸 光值表不。
[0057] 3)氧化自由基吸收能力（ORAC)的測定方法：不同濃度的抗氧化多肽溶液20 ii L 與75mM磷酸鹽緩沖液80 ii L(pH 7. 4)及50 ii L 200nM的熒光試劑充分混合后在37°C溫育 15min，然后再加入50 ii L 80mM的AAPH溶液。用酶標(biāo)儀每分鐘讀取熒光值共進(jìn)行l(wèi)OOmin。 熒光的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。 以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)對照，使用的濃度為0, 2,4,8,12,16 ii M，繪制熒光淬滅曲線。ORAC值用 樣品曲線的斜率與Trolox曲線的斜率之比，ORAC值得單位表示為ii M Trolox/mg肽。
[0058] 該方法詳見下述論文：Huang, W. ;Majumder, K. ;Wu, J. Oxygen radical absorbance capacity of peptides from egg white protein ovotransferrin and their interaction with phytochemicals. Food Chem. 2010, 123,635-641。
[0059] 3、測定結(jié)果，參見表1。
[0060] 表I :抗氧化肽的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0061]

【權(quán)利要求】
1?一種抗氧化多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr。
2. 權(quán)利要求1所述抗氧化多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 以鰱魚魚肉為原料，加水混合，于80?90°C水浴中靜置15?20min，勻漿，得到魚肉 勻漿液； 2) 在步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，充分反應(yīng)后，在95?100°C下 保溫3?5min，冷卻至室溫，離心，收集上清液； 3) 取步驟2)所得上清液，用孔徑為2500-3000道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到含有所述 抗氧化多肽的多肽溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述勻漿具體為：在10000? 13000rpm條件下勻楽1?3min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述酶解具體為：在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的條件下反應(yīng)0? 25?2. Oh。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述離心具體為：在4000? 6000g條件下離心5?lOmin。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2?5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，還包括對步驟3)所得 多肽溶液進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥后，即得抗氧化多肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述純化包括以下步驟：使用 Sephadex G-25凝膠色譜柱，以去離子水為流動相進(jìn)行洗脫，收集含有所述抗氧化多肽的洗 脫液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述純化還包括以下步驟：使用十八 烷基鍵合硅膠色譜柱，以含有〇. 1 %三氟乙酸的乙腈-水為流動相進(jìn)行洗脫，收集含有所述 抗氧化多肽的洗脫液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取鰱魚魚肉，加入1?3倍于魚肉重量的水，于80?90°C水浴中靜置15?20min， 在10000?13000rpm條件下勻漿1?3min，得到魚肉勻漿液； 2) 在步驟1)所得魚肉勻漿液中加入胃蛋白酶，所述胃蛋白酶與步驟1)所述鰱魚魚肉 的質(zhì)量比為1 :1〇〇?300,在pH 1. 8?2. 5、35?40°C的條件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)0. 25?2. Oh 后，在95?100°C下保溫3?5min，冷卻至室溫，在4000?6000g條件下離心5?lOmin， 收集上清液； 3) 取步驟2)所得上清液，利用孔徑為2500-3000道爾頓陶瓷膜進(jìn)行超濾，得到多肽溶 液； 4) 取步驟3)所得多肽溶液，濃縮，使用Sephadex G-25凝膠色譜柱，以去離子水為流動 相進(jìn)行洗脫，收集含有所述抗氧化多肽的洗脫液； 5) 取步驟4)所得洗脫液，濃縮，使用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以含有0. 1 %三氟乙酸 的乙腈-水為流動相進(jìn)行洗脫，收集含有所述抗氧化多肽的洗脫液；濃縮，冷凍干燥，即得 抗氧化多肽。
10. 權(quán)利要求1所述抗氧化多肽或由權(quán)利要求2?9任意一項(xiàng)所述制備方法得到的抗 氧化多肽的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P21/06GK104356203SQ201410645383
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】羅永康, 尤娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)