經(jīng)修飾的微生物和使用其制造丁二烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明大體上涉及微生物，其包含一或多種編碼一或多種路徑中催化可發(fā)酵碳源向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。還提供在工業(yè)過(guò)程中使用所述微生物的方法，包括用于制造丁二烯和衍生自其的產(chǎn)物。
【專利說(shuō)明】經(jīng)修飾的微生物和使用其制造丁二烯的方法

【背景技術(shù)】
[0001] 丁二烯（1，3- 丁二烯，CH2= CH-CH = CH 2, CAS 106-99-0)是典型地通過(guò)蒸汽裂解 石油基烴制造（與其它4-碳分子一起）的直鏈、共軛4-碳烴。此工藝涉及苛刻條件和高 溫（至少約850°C )。其它丁二烯制造方法涉及有毒和/或昂貴的催化劑、高度可燃和/或 氣態(tài)碳來(lái)源以及高溫。全世界每年制造幾百萬(wàn)噸含丁二烯的聚合物。丁二烯可以聚合以形 成聚丁二烯，或在鎳催化劑存在下與氰化氫（氫氰酸）反應(yīng)以形成己二腈（一種尼龍前驅(qū) 體）。然而，更通常地，丁二烯與其它烯烴聚合以形成共聚物，例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯 (ABS)、丙烯腈-丁二烯（ABR)或苯乙烯-丁二烯（SBR)共聚物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0002] 本發(fā)明大體上涉及微生物（例如非天然存在的微生物，在本文中也稱為被修飾的 微生物），其包含一或多種編碼一或多種路徑中催化碳源向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸； 和所述微生物在工業(yè)過(guò)程中的用途，包括用于制造丁二烯和衍生自其的產(chǎn)物。
[0003] 本發(fā)明提供從可發(fā)酵碳源制造丁二烯的方法，其包含：提供可發(fā)酵碳源；使所述 可發(fā)酵碳源與微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中接觸，所述微生物包含一或多種編碼在丁二烯制造路 徑中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸，和一或多種編碼 路徑中催化所述一或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸；以及使所述一或多種編碼 在所述丁二烯制造路徑中所述路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述 酶的多核苷酸、和所述一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的 多核苷酸在所述微生物中表達(dá)，以制造丁二烯。
[0004] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，在所述丁二 烯制造路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1-3中的任 一者中。
[0005] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，催化所述一 或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1-3中的任一者中。
[0006] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，丁二烯經(jīng)由 乙酰CoA和丙酰CoA中間物；巴豆酰CoA中間物；和/或甲酸中間物來(lái)制造。
[0007] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼酮硫解酶， 包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陳列的多核苷酸編碼的酮硫解酶。
[0008] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化酮戊酰CoA向（R)或（S) 3-羥基戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼氧化 還原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陳列的多核苷酸編碼的氧化還原酶。
[0009] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化（R)或（S)羥基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫 水酶，包括例如由如SEQ ID N0:37-55中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫水酶。
[0010] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼轉(zhuǎn)移酶或水解酶， 包括例如分別由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陳列的多核苷酸編碼的轉(zhuǎn)移酶或 水解酶。
[0011] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫羧酶。
[0012] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼異構(gòu)酶，包括例如和由 如SEQ ID N0:99-102中的任一者陳列的多核苷酸編碼的異構(gòu)酶。
[0013] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化4-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫羧酶，包括例如由如SEQ ID NO:79-98中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫羧酶。
[0014] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2-戊烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫氫酶， 包括例如由如SEQ ID NO: 124-139中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫氫酶。
[0015] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化戊-2, 4-二烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酸轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼轉(zhuǎn)移酶 或水解酶，包括例如分別由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陳列的多核苷酸編碼的 轉(zhuǎn)移酶或水解酶。
[0016] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2, 4-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫羧酶，包括例如由如 SEQ ID N0:79-98中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫羧酶。
[0017] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化巴豆酰CoA向巴豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼氧化還原酶，包括例如由 如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陳列的多核苷酸編碼的氧化還原酶。
[0018] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化巴豆酰CoA向巴豆醛轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼氧化還原酶，包括例如由 如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陳列的多核苷酸編碼的氧化還原酶。
[0019] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化巴豆醛向巴豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼氧化還原酶或CoA合成酶，包 括例如分別由如SEQ ID NO: 103-123或SEQ ID NO 34-36中的任一者陳列的多核苷酸編碼 的氧化還原酶或合成酶。
[0020] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化巴豆醇向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫水酶，包括例如由如SEQ ID NO:37-55中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫水酶。
[0021] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或 多種編碼路徑中催化CO 2向甲酸轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫氫酶，包括例如由如SEQ ID NO: 124-139中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫氫酶。
[0022] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化丙酮酸酯和CoA向乙酰CoA和甲酸轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼酮硫解酶， 包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陳列的多核苷酸編碼的酮硫解酶。
[0023] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化甲酸向甲酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼轉(zhuǎn)移酶或CoA合成酶，包括例 如分別由如SEQ ID NO: 1-28或34-36中的任一者陳列的多核苷酸編碼的轉(zhuǎn)移酶或CoA合 成酶。
[0024] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化2乙酰CoA向乙酰乙酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼酮硫解酶，包括例 如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陳列的多核苷酸編碼的酮硫解酶。
[0025] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化乙酰乙酰CoA和甲酰CoA向3, 5-酮戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼 酮硫解酶，包括例如由如SEQ ID N0:58-78中的任一者陳列的多核苷酸編碼的酮硫解酶。
[0026] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化3, 5-酮戊酰CoA向（R)或（S) -5-羥基-3-酮戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核 苷酸編碼氧化還原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陳列的多核苷酸編碼 的氧化還原酶。
[0027] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化（R)或（S)-5-羥基-3-酮戊酰CoA向（R)或（S)-3, 5-二羥基戊酰CoA 轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼氧化還原酶，包括例如由如SEQ ID NO: 103-123中的任一者陳列 的多核苷酸編碼的氧化還原酶。
[0028] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化（R)或（S)-3, 5-二羥基戊酰CoA向（R)或（S) 3-羥基-4-戊烯酰CoA 轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫水酶，包括例如由如SEQ ID N0:37-55中的任一者陳列的多核 苷酸編碼的脫水酶。
[0029] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化（R)或（S) -3-羥基-4-戊烯酰CoA向3-羥基-4-戊烯酸轉(zhuǎn)化的酶的多 核苷酸編碼轉(zhuǎn)移酶或水解酶，包括例如分別由如SEQ ID NO: 1-28或29-33中的任一者陳列 的多核苷酸編碼的轉(zhuǎn)移酶或水解酶。
[0030] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述一或多 種編碼路徑中催化3-羥基-4-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸編碼脫羧酶，包括例如 由如SEQ ID N0:79-98中的任一者陳列的多核苷酸編碼的脫羧酶。
[0031] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述 微生物是選自由以下組成的屬的細(xì)菌：伯克霍爾德菌屬（Burkholderia)、丙酸桿菌 屬（Propionibacterium)、丙酸螺菌屬（Propionispira)、梭菌屬（Clostridium)、芽抱 桿菌屬（Bacillus)、埃希氏菌屬（Escherichia)、暗桿菌屬（Pelobacter)或乳桿菌屬 (Lactobacillus) 〇
[0032] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述微生物 是真核生物，是酵母、絲狀真菌、原生動(dòng)物或藻類。
[0033] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述酵母是 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)或巴斯德 畢赤酵母（Pichia pastoris)。
[0034] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述碳源是 甘蔗汁、甘蔗糖蜜、水解淀粉、水解木質(zhì)纖維素材料、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳酸酯、乳糖、木 糖、丙酮酸酯或甘油，呈其任何形式或混合物形式。
[0035] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述碳源是 單糖、寡糖或多糖。
[0036] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述丁二烯 由所述微生物分泌到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0037] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述方法可 以進(jìn)一步包含從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收所述丁二烯。
[0038] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述微生物 已經(jīng)被遺傳修飾，以使所述一或多種編碼在所述丁二烯制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵 碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸、和所述一或多種編碼路徑中催化一或多種中 間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸表達(dá)。
[0039] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述可發(fā)酵 碳源向丁二烯的所述轉(zhuǎn)化是ATP陽(yáng)性（例如每分子制造的丁二烯產(chǎn)生凈ATP)，并且可以與 NADH消耗路徑組合以提供丁二烯制造的厭氧工藝。
[0040] 本發(fā)明還提供微生物，其包含一或多種編碼在丁二烯制造路徑中路徑中催化可發(fā) 酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸、和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種 中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。
[0041] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，在所述丁二 烯制造路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1-3中的任 一者中。
[0042] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，催化所述一 或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1-3中的任一者中。
[0043] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，丁二烯經(jīng)由 乙酰CoA和丙酰CoA中間物；巴豆酰CoA中間物；和/或甲酸中間物來(lái)制造。
[0044] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述微生物 是選自由以下組成的屬的細(xì)菌：伯克霍爾德菌屬、丙酸桿菌屬、丙酸螺菌屬、梭菌屬、芽孢桿 菌屬、埃希氏菌屬、暗桿菌屬或乳桿菌屬。
[0045] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述微生物 是真核生物，是酵母、絲狀真菌、原生動(dòng)物或藻類。
[0046] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述酵母是 釀酒酵母、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或巴斯德畢赤酵母。
[0047] 在一些可以與上文或下文提及的實(shí)施例中的任一者組合的實(shí)施例中，所述微生物 已經(jīng)被遺傳修飾，以使所述一或多種編碼在所述丁二烯制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵 碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸、和所述一或多種編碼路徑中催化一或多種中 間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸表達(dá)。
[0048] 本發(fā)明的這些和其它實(shí)施例將更詳細(xì)揭示于下文中。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 本發(fā)明的以上
【發(fā)明內(nèi)容】
以及以下【具體實(shí)施方式】當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)將得到更好理 解。出于說(shuō)明本發(fā)明的目的，圖中展示本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于 所示的確切配置、實(shí)例和手段。
[0050] 圖1描繪經(jīng)由乙酷CoA和丙酰CoA中間物從可發(fā)酵碳源制造丁二烯的一例示性路 徑。
[0051] 圖2描繪經(jīng)由巴豆酷CoA中間物從可發(fā)酵碳源制造丁二烯的一例示性路徑。
[0052] 圖3描繪經(jīng)由甲酸中間物從可發(fā)酵碳源制造丁二燔的一例示性路徑。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 本發(fā)明大體上涉及微生物（例如非天然存在的微生物；被修飾的微生物），其包含 被遺傳修飾的路徑；和所述微生物用于將可發(fā)酵碳源轉(zhuǎn)化為丁二烯的用途（參看圖1-3)。 所述微生物包含一或多種編碼經(jīng)由新穎酶路徑催化可發(fā)酵碳源向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核 苷酸。任選地，所制造的丁二烯接著可以轉(zhuǎn)化為聚丁二烯或許多其它含丁二烯的聚合物。
[0054] 本發(fā)明部分提供新穎酶路徑（包括例如新穎酶路徑組合）的發(fā)現(xiàn)，其用于從碳源 (例如可發(fā)酵碳源）制造丁二烯。本文中揭示的酶路徑允許經(jīng)由以下來(lái)酶促制造丁二烯： 乙酰CoA和丙酰CoA中間物；巴豆酰CoA中間物；和/或甲酸中間物。
[0055] 本文中提供的方法提供類似于滅菌的最后結(jié)果而無(wú)典型地為建立和在整個(gè)制造 工藝期間維持無(wú)菌所需的高資金支出和持續(xù)較高管理成本。在此方面，大多數(shù)工業(yè)規(guī)模的 丁二烯制造工藝因其工藝的好氧性質(zhì)而在可測(cè)量數(shù)目的細(xì)菌污染物存在下操作。據(jù)信，丁 二烯制造工藝的細(xì)菌污染導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率降低和制造丁二烯的微生物的生長(zhǎng)抑制。由于制造 的丁二烯的有毒性質(zhì)減少制造工藝中的污染物，因此現(xiàn)有方法的所述缺陷通過(guò)本發(fā)明揭示 的方法來(lái)避免。
[0056] 本文中揭示的酶路徑與先前已知酶路徑相比對(duì)于制造丁二烯來(lái)說(shuō)是有利的，由于 本文中揭示的酶路徑是ATP陽(yáng)性并且當(dāng)與NADH消耗路徑組合時(shí)它可以提供丁二烯的厭氧 路徑。雖然有可能使用好氧工藝制造丁二烯，但厭氧工藝因當(dāng)在發(fā)酵工藝（尤其丁二烯發(fā) 酵）期間烯烴（其本質(zhì)上是爆炸性的）與氧氣混合時(shí)招致的風(fēng)險(xiǎn)而是優(yōu)選的。此外，在發(fā) 酵器中補(bǔ)充氧氣和氮?dú)庑枰諝鈮嚎s機(jī)、發(fā)酵器（泡罩塔或氣提發(fā)酵器）、溫度控制和氮?dú)?的額外投資。氧氣的存在還可以催化丁二烯的聚合并且可以促進(jìn)發(fā)酵器培養(yǎng)液中好氧污 染物的生長(zhǎng)。另外，制造丁二烯的好氧發(fā)酵工藝在工業(yè)規(guī)模下呈現(xiàn)出幾個(gè)缺陷（其中它對(duì) 于維持無(wú)菌條件是技術(shù)上有挑戰(zhàn)的），例如以下事實(shí)：（i)獲得更多生物質(zhì)，對(duì)于所要產(chǎn)物 來(lái)說(shuō)降低碳的總產(chǎn)率；（ii)存在和氧氣促進(jìn)污染物的生長(zhǎng)（韋斯特許斯（Weusthuis)等 人，2011，生物技術(shù)動(dòng)向（Trends in Biotechnology), 2011，第 29 卷，第 4 期，153-158); 和（iii)氧氣與氣態(tài)化合物（例如丁二烯）的混合物造成嚴(yán)重爆炸風(fēng)險(xiǎn)；（iv)氧氣可能會(huì) 催化不期望的烯烴聚合反應(yīng)；以及最終（V)在好氧條件下的較高發(fā)酵和純化成本。另外，通 過(guò)本文中揭示的工藝制造的丁二烯未攙入0 2和N2，因此防止所制造的丁二烯的高成本并且 費(fèi)時(shí)的純化。
[0057] 應(yīng)理解，本文中描述的任何和所有方法中涉及的步驟可以按任何次序進(jìn)行并且不 限制或局限于具體敘述的次序。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供從可發(fā)酵碳源制造丁二烯的方法，其 包含：提供可發(fā)酵碳源；使所述可發(fā)酵碳源與微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中接觸，所述微生物包 含一或多種編碼在丁二烯制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化 的酶的多核苷酸，和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多 核苷酸；以及使所述一或多種編碼在所述丁二烯制造路徑中所述路徑中催化所述可發(fā)酵碳 源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶的多核苷酸、和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種 中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸在所述微生物中表達(dá)，以制造丁二烯。因此，使所述一 或多種編碼在所述丁二烯制造路徑中所述路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物 轉(zhuǎn)化的所述酶的多核苷酸、和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化 的酶的多核苷酸在所述微生物中表達(dá)以制造丁二烯可以在使所述可發(fā)酵碳源與微生物在 發(fā)酵培養(yǎng)基中接觸之前或之后進(jìn)行，所述微生物包含一或多種編碼在所述丁二烯制造路徑 中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸、和一或多種編碼路 徑中催化所述一或多種中間物向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。
[0058] 還應(yīng)理解，本文中揭示的微生物可以包含圖1-3中的任一者中揭示的整個(gè)路徑， 包括、包含所有編碼催化可發(fā)酵碳源向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。或者，還應(yīng)理解，本文 中揭示的微生物可以包含一或多種編碼圖1-3中的任一者中的催化可發(fā)酵碳源向丁二烯 轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸（例如微生物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上編碼如圖 1-3中的任一者中所揭示的催化可發(fā)酵碳源向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸）。
[0059] 在一些實(shí)施例中，所制造的丁二烯的克數(shù)與可發(fā)酵碳源的克數(shù)的比率是0.20、 0· 21、0· 22、0· 23、0· 24、0· 25、0· 26、0· 27、0· 28、0· 29、0· 30、0· 31、0· 32、0· 33、0· 34、0· 35、 0· 36、0· 37、0· 38、0· 39、0· 40、0· 41、0· 42、0· 43、0· 44、0· 45、0· 46、0· 47、0· 48、0· 49、0· 50、 0· 51、0· 52、0· 53、0· 54、0· 55、0· 56、0· 57、0· 58、0· 59、0· 60、0· 61、0· 62、0· 63、0· 64、0· 65、 0· 66、0· 67、0· 68、0· 69、0· 70、0· 71、0· 72、0· 73、0· 74、0· 75、0· 76、0· 77、0· 78、0· 79、0· 80、 0. 81、0. 82、0. 83、0. 84、0. 85、0. 86、0. 87、0. 88、0. 89、0. 90、0. 91、0. 92、0. 93、0. 94、0. 95、 0· 96、0· 97、0· 98、0· 99 或 L 00。
[0060] 在一些實(shí)施例中，所制造的丁二烯中的碳的摩爾數(shù)目構(gòu)成可發(fā)酵碳源中的碳的 摩爾數(shù)目的 20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33 %,34 %,35 %,36 %,37 %,38 %,39 %,40 %,41 %,42 %,43 %,44 %,45 %,46 %,47 %, 48 %,49 %,50 %,51 %,52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %, 63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %, 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0061] 如本文中所用，"丁二烯"旨在意指丁 -1，3-二烯或1，3- 丁二烯（CAS 106-99-0)， 通式是CH2= CH-CH = CH 2，并且分子質(zhì)量是54. 09g/mol。
[0062] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"生物活性"或"功能活性"當(dāng)提及蛋白質(zhì)、多肽或肽時(shí)，可以 意指所述蛋白質(zhì)、多肽或肽展現(xiàn)關(guān)于某一生物過(guò)程、路徑或反應(yīng)適用的功能或性質(zhì)。生物或 功能活性可以指例如與另一多肽或分子相互作用或締合（例如結(jié)合）的能力，或它可以指 催化或調(diào)節(jié)其它蛋白質(zhì)或分子的相互作用（例如酶促反應(yīng)）的能力。
[0063] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)"可以指使細(xì)胞（例如微生物細(xì)胞）群體在適用于生長(zhǎng) 的條件下在液體培養(yǎng)基中或在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
[0064] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"衍生自"可以涵蓋術(shù)語(yǔ)源自、獲自、可獲自、分離自和產(chǎn)生自， 并且一般來(lái)說(shuō)表示一種規(guī)定物質(zhì)在另一規(guī)定物質(zhì)中得到其來(lái)源或具有可以參考另一規(guī)定 物質(zhì)描述的特征。
[0065] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"可以指含有編碼多肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸或核酸 序列（例如可操作地連接于一或多個(gè)能夠影響宿主中的編碼序列表達(dá)的適合控制序列的 DNA編碼序列（例如基因順序））的DNA構(gòu)建體。所述控制序列包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控 制所述轉(zhuǎn)錄的任選的操縱序列、編碼適合mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻 譯的終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅是可能的基因組插入物。在轉(zhuǎn)型到 適合宿主中后，載體可以復(fù)制并且獨(dú)立于宿主基因組而起作用（例如獨(dú)立載體或質(zhì)粒），或 在一些情況下，可以自身整合到基因組中（例如整合的載體）。質(zhì)粒是最常用的表達(dá)載體形 式。然而，本發(fā)明旨在包括這樣的其它表達(dá)載體形式，以便提供等效功能并且在本領(lǐng)域中已 知或變得已知。
[0066] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"可以指基于編碼多肽（例如基因）的核酸序列制造多 肽的過(guò)程。所述過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0067] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"基因"可以指制造多肽或蛋白質(zhì)（例如融合蛋白）中涉及的 DNA區(qū)段，并且包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)以及個(gè)別編碼區(qū)段（外顯子）之間的介入序列 (內(nèi)含子）。
[0068] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"異源"關(guān)于核酸、多核苷酸、蛋白質(zhì)或肽可以指非天然存在于 規(guī)定細(xì)胞（例如宿主細(xì)胞）中的核酸、多核苷酸、蛋白質(zhì)或肽。希望所述術(shù)語(yǔ)涵蓋由天然存 在的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。相比之下，術(shù)語(yǔ)同源關(guān)于核酸、多核苷 酸、蛋白質(zhì)或肽是指天然存在于細(xì)胞中的核酸、多核苷酸、蛋白質(zhì)或肽。
[0069] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"可以指細(xì)胞或細(xì)胞系，包括細(xì)胞，例如重組表達(dá)載 體可以被轉(zhuǎn)染用于表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)（例如融合蛋白）的微生物。宿主細(xì)胞包括單一宿主 細(xì)胞的子代，并且子代因天然、意外或蓄意突變而可以不必與初始母細(xì)胞完全一致（在形 態(tài)方面或在總基因組DNA互補(bǔ)序列方面）。宿主細(xì)胞可以包括用表達(dá)載體進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染或 轉(zhuǎn)型的細(xì)胞。
[0070] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"引入"在將核酸序列或多核苷酸序列插入到細(xì)胞中的情形 下，可以包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)型或轉(zhuǎn)導(dǎo)并且指將核酸序列或多核苷酸序列并入到真核或原核細(xì)胞 中，其中核酸序列或多核苷酸序列可以被并入到細(xì)胞的基因組（例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或 線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)。
[0071 ] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"非天然存在"在關(guān)于本發(fā)明的微生物體或微生物使用時(shí)旨在 意指微生物體具有至少一個(gè)在所參考物種的天然存在菌株（包括所參考物種的野生型菌 株）中并不常見的基因改變?；蚋淖儼ɡ缫刖幋a代謝多肽的可表達(dá)核酸的修飾、 其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物體遺傳物質(zhì)的其它功能性破壞。所述修飾包括例如 所參考物種的異源、同源或異源與同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。其它修飾包括例如修 飾改變了基因或操縱子的表達(dá)的非編碼調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明的非天然存在的微生物體可以含有 穩(wěn)定基因改變，其是指可以被培養(yǎng)五代以上而無(wú)改變損失的微生物。一般來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定基因改 變包括持續(xù)10代以上的修飾，具體地說(shuō)穩(wěn)定修飾將持續(xù)約25代以上，并且更具體地說(shuō)穩(wěn)定 遺傳修飾將持續(xù)50代以上，包括無(wú)限期。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，包括本文中例示的代 謝修飾的基因改變參考適合宿主生物體（例如大腸桿菌（E. coli))和其相應(yīng)代謝反應(yīng)或所 要遺傳物質(zhì)（例如所要代謝路徑的基因）的適合來(lái)源生物體來(lái)描述。然而，考慮到多種生 物體的完整基因組定序和基因組學(xué)領(lǐng)域中的高技術(shù)水平，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地 將本文中提供的教示和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有其它生物體。舉例來(lái)說(shuō)，本文中例示的大腸 桿菌代謝改變可以通過(guò)并有來(lái)自不同于所參考物種的物種的相同或類似編碼核酸容易地 應(yīng)用于其它物種。所述基因改變大體上包括例如物種同源物的基因改變，和尤其直系同源 物、旁系同源物或非直系同源基因置換。
[0072] 如本文中所用，"丁二烯"旨在意指一種共軛直鏈二烯，分子式是C4H6,通式是CH2 =CH-CH = CH2，并且分子質(zhì)量是54. 09g/mol。丁二烯在本領(lǐng)域中還稱為1，3- 丁二烯、 丁 -1，3-二稀、聯(lián)乙稀、刺桐稀、二乙稀和乙稀基乙稀。
[0073] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"可以指規(guī)定元件的并置或配置，其使所述元 件一齊起作用以實(shí)現(xiàn)一種效果。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子在它控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)可以可操作 地連接于編碼序列。
[0074] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"可以指結(jié)合RNA聚合酶以引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄中涉及的調(diào) 節(jié)序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)性啟動(dòng)子或組成性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)性啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié) 條件下活性的啟動(dòng)子。
[0075] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核酸序列"可以指具有任何長(zhǎng)度和任何三維結(jié) 構(gòu)并且單鏈或多鏈（例如單鏈、雙鏈、三螺旋等）的核苷酸聚合形式，其含有脫氧核糖核苷 酸、核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的類似物或被修飾的形式，包括被修 飾的核苷酸或堿基或其類似物。所述多核苷酸或核酸序列可以編碼氨基酸（例如多肽或蛋 白質(zhì)，例如融合蛋白）。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以一個(gè)以上密碼子可以用以編碼具體氨 基酸，并且本發(fā)明涵蓋編碼具體氨基酸序列的多核苷酸?？梢允褂萌魏晤愋偷谋恍揎椀暮?苷酸或核苷酸類似物，只要多核苷酸在使用條件下維持所要功能即可，包括增加核酸酶抗 性的修飾（例如脫氧、2' -Ο-Me、硫代磷酸酯等）。還可以出于檢測(cè)或捕獲例如放射性或非放 射性標(biāo)記或錨定（例如生物素）的目的并入標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括肽核酸（PNA)。多 核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。術(shù)語(yǔ)多核苷酸、核酸和寡核苷酸在本文中可互 換使用。多核苷酸可以含有RNA、DNA或兩者和/或其被修飾的形式和/或類似物。核苷酸 的序列可以雜有非核苷酸組分。一或多個(gè)磷酸二酯鍵聯(lián)可以置換為替代性鍵聯(lián)基團(tuán)。這些 替代性鍵聯(lián)基團(tuán)包括（但不限于）其中磷酸酯置換為P (〇) S (硫代酯）、P (S) S (二硫代酯）、 (0) NR2 (酰胺化物）、P (0) R、P (0) OR'、COCH2 (甲縮醛）的實(shí)施例，其中每個(gè)R或R'獨(dú)立地 是H或被取代或未被取代的烷基（1-20個(gè)C)，任選地含有乙醚（-0-)鍵聯(lián)、芳基、烯基、環(huán)烷 基、環(huán)烯基或芳醛基。多核苷酸中并非所有鍵聯(lián)都需要相同。多核苷酸可以是直鏈或環(huán)狀 或包含直鏈和環(huán)狀部分的組合。
[0076] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"或"多核苷酸"可以指包含氨基酸并且由本領(lǐng)域的技 術(shù)人員公認(rèn)為蛋白質(zhì)的組合物。本文中使用氨基酸殘基的常規(guī)一字母或三字母編碼。術(shù)語(yǔ) 蛋白質(zhì)和多肽在本文中可互換用以指具有任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物，包括包含鍵聯(lián)（例如 融合）肽/多肽（例如融合蛋白）的那些。聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含被修飾 的氨基酸，并且它可以雜有非氨基酸。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋已經(jīng)被天然地或通過(guò)介入而修飾的 氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操縱或修飾，例 如與標(biāo)記組分結(jié)合。定義內(nèi)還包括例如含有一或多種氨基酸（包括例如非天然氨基酸等） 類似物以及本領(lǐng)域中已知的其它修飾的多肽。
[0077] 如本文中所用，相關(guān)蛋白質(zhì)、多肽或肽可以涵蓋變異蛋白質(zhì)、多肽或肽。變異蛋白 質(zhì)、多肽或肽在少量氨基酸殘基方面不同于母體蛋白質(zhì)、多肽或肽和/或彼此。在一些實(shí)施 例中，不同氨基酸殘基的數(shù)目是以下中的任一者：約1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或 50個(gè)。在一些實(shí)施例中，變異體相差約1到約10個(gè)氨基酸?；蛘呋蛄硗?，變異體與參考蛋 白或核酸可以具有規(guī)定程度的序列一致性，例如如使用序列比對(duì)工具（例如BLAST、ALIGN 和CLUSTAL)測(cè)定（參看下文）。舉例來(lái)說(shuō)，變異蛋白質(zhì)或核酸與參考序列可以具有至少 約 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至99.5%氨基酸序列一致 性。
[0078] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"回收"、"隔離"、"純化"和"分離"可以指從至少一種組分移 出的物質(zhì)（例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、多核苷酸或細(xì)胞），其與所述組分天然地相關(guān)。舉例來(lái)說(shuō)， 這些術(shù)語(yǔ)可以指實(shí)質(zhì)上或基本上不含如其天然狀態(tài)下可見的通常伴隨其的組分（例如完 整生物系統(tǒng)）的物質(zhì)。
[0079] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"重組"可以指已經(jīng)由人操縱以使得其與如天然所見的核酸、 多肽和細(xì)胞不相同的核酸序列或多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)以及基于其的細(xì)胞。重組還可以 指已經(jīng)被修飾以改變其序列或表達(dá)特征（例如通過(guò)使編碼序列突變以制造改變的多肽、使 編碼序列與另一編碼序列或基因融合、在不同啟動(dòng)子控制下放置基因、使基因在異源生物 體中表達(dá)、使基因以降低或提升的水平表達(dá)、使基因有條件地或組成性地以不同于其天然 表達(dá)譜的方式表達(dá)等）的遺傳物質(zhì)（例如核酸序列或多核苷酸、其編碼的多肽或蛋白質(zhì)以 及包含所述核酸序列或多核苷酸的載體和細(xì)胞）。
[0080] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"選擇性標(biāo)記"或"可選擇標(biāo)記"可以指能夠表達(dá)于宿主細(xì)胞 中的基因，其提供那些含有引入的核酸序列、多核苷酸或載體的宿主的選擇便利性。可選擇 標(biāo)記的實(shí)例包括（但不限于）抗微生物物質(zhì)（例如潮霉素、博萊霉素或氯霉素）和/或賦 予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢(shì)（例如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)）的基因。
[0081] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上類似"和"實(shí)質(zhì)上一致"在至少兩個(gè)核酸、多核苷酸、蛋 白質(zhì)或多肽的情形下，可以意指核酸、多核苷酸、蛋白質(zhì)或多肽包含與參考（例如野生型） 核酸、多核苷酸、蛋白質(zhì)或多肽相比具有至少約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或甚至99. 5%序列一致性的序列。序列一致性可以使用已知程序（例如 BLAST、ALIGN和CLUSTAL)使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。（參看例如阿特休爾（Altshul)等人（1990) 分子生物學(xué)雜志（J. Mol. Biol. )215:403-410;亨尼科夫（Henikoff)等人（1989)國(guó)家科 學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. )89:10915;卡林（Karin)等人（1993)國(guó)家科學(xué)院院刊 90:5873;和希金斯（Higgins)等人（1988)基因（Gene)73:237)。可在國(guó)家生物技術(shù)信息 中心（the National Center for Biotechnology Information)公開獲得用于執(zhí)行 BLAST 分析的軟件。此外，可以使用FASTA搜尋數(shù)據(jù)庫(kù)（珀森（Person)等人（1988)國(guó)家科學(xué)院 院刊85:2444-2448)。在一些實(shí)施例中，實(shí)質(zhì)上一致多肽不同之處僅是一或多個(gè)保守氨基酸 取代。在一些實(shí)施例中，實(shí)質(zhì)上一致多肽是可免疫交叉反應(yīng)的。在一些實(shí)施例中，實(shí)質(zhì)上一 致核酸分子在嚴(yán)格條件下（例如在一系列高嚴(yán)格性的培養(yǎng)基內(nèi)）彼此雜交。
[0082] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)型"可以指將外源核酸或多核苷酸插入到宿主細(xì) 胞中。外源核酸或多核苷酸可以維持為非整合載體（例如質(zhì)粒）形式，或者，可以整合到宿 主細(xì)胞基因組中。術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)染（transfecting或transfection)旨在涵蓋用于將核酸或多核 苷酸引入到宿主細(xì)胞中的所有常規(guī)技術(shù)。轉(zhuǎn)染技術(shù)的實(shí)例包括（但不限于）磷酸鈣沉淀、 DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和顯微注射。
[0083] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)型"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)型"和"轉(zhuǎn)基因"可以指具有非天然（例如異 源）核酸序列或多核苷酸序列整合到其基因組中或?yàn)橛坞x型質(zhì)粒形式維持多代的細(xì)胞。
[0084] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"載體"可以指經(jīng)設(shè)計(jì)以將核酸引入到一或多種細(xì)胞類型中的 多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、單鏈和雙鏈盒 等。
[0085] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"野生型"、"天然"或"天然存在的"蛋白質(zhì)可以指天然所見的 那些蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)野生型序列是指天然所見或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些實(shí)施 例中，野生型序列是蛋白質(zhì)工程化計(jì)劃（例如制造變異蛋白質(zhì)）的起點(diǎn)。
[0086] 除非另作定義，否則在本文中，本文中所用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有如本發(fā) 明所屬的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。辛格爾頓（Singleton)等人，微 生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第 二版，約翰威利父子公司（John Wiley and Sons),紐約（New York) (1994)和黑爾&馬 卡姆（Hale&Markham),哈泊柯林斯生物學(xué)詞典（The Harper Collins Dictionary of Biology),哈泊永久公司（Harper Perennial),紐約（1991)給技術(shù)人員提供本發(fā)明中所用 的許多術(shù)語(yǔ)的通用詞典。此外，應(yīng)理解本文中路徑中的任一者中揭示的底物中的任一者可 以或者包括底物的陰離子或陽(yáng)離子。
[0087] 本文中提供的數(shù)值范圍包括界定所述范圍的數(shù)目。
[0088] 除非另外說(shuō)明，否則對(duì)應(yīng)地，核酸序列以5'到3'定向左到右地書寫；氨基酸序列 以氨基到羧基定向左到右地書寫。
[0089] 雖然本發(fā)明能夠以各種形式形式體現(xiàn)，但以下對(duì)幾個(gè)實(shí)施例的描述在以下理解下 進(jìn)行：本發(fā)明應(yīng)視為本發(fā)明的例證，并且不旨在將本發(fā)明限于說(shuō)明的具體實(shí)施例。標(biāo)題僅為 了方便起見而提供并且不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明。任何標(biāo)題下說(shuō)明的實(shí)施例都可以 與任何其它標(biāo)題下說(shuō)明的實(shí)施例組合。
[0090] 除非另外明確指示，否則本申請(qǐng)案中規(guī)定的各個(gè)數(shù)量值中的數(shù)值的使用陳述為仿 佛所述范圍內(nèi)的最小和最大值前面都有詞語(yǔ)"約"的近似值。此外，本發(fā)明的范圍預(yù)期為連 續(xù)范圍，包括所述最小與最大值之間的每個(gè)值以及可以通過(guò)所述值形成的任何范圍。本文 中還揭示可以通過(guò)用揭示的數(shù)值除任何其它揭示的數(shù)值而形成的任何和所有比率（和任 何所述比率的范圍）。因此，技術(shù)人員應(yīng)理解，許多所述比率、范圍和比率范圍可以明確衍生 自本文中呈現(xiàn)的數(shù)值，并且在所有情況下，所述比率、范圍和比率范圍都表示本發(fā)明的各個(gè) 實(shí)施例。
[0091] 微生物的修飾
[0092] 微生物可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法修飾（例如遺傳工程化）以包含和/或 表達(dá)（例如包括過(guò)表達(dá)）一或多種編碼一或多種路徑中能夠?qū)⒖砂l(fā)酵碳源轉(zhuǎn)化為丁二烯的 酶的多核苷酸（例如異源多核苷酸和/或非異源多核苷酸）。微生物可以天然地表達(dá)一或 多種路徑中將可發(fā)酵碳源轉(zhuǎn)化為丁二烯所需的全部酶，或可以被修飾以表達(dá)（包括例如過(guò) 表達(dá)）一或多種路徑中的一或多種酶。在一些實(shí)施例中，微生物可以包含所述路徑中的少 于全部酶，并且編碼缺少的酶的多核苷酸可以被遺傳引入到微生物中。舉例來(lái)說(shuō)，被修飾的 微生物可以被修飾以包含一或多種編碼丁二烯制造路徑中催化可發(fā)酵碳源（例如葡萄糖） 向一或多種中間物（例如乙酰CoA和丙酰CoA ;巴豆酰CoA ;和/或甲酸）轉(zhuǎn)化的酶的多核 苷酸。另外或或者，被修飾的微生物可以被修飾以包含一或多種編碼催化一或多種中間物 (例如乙酰CoA和丙酰CoA;巴豆酰CoA;和/或甲酸）向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。在 一些實(shí)施例中，多核苷酸可以編碼丁二烯制造路徑中催化一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶。在一 些實(shí)施例中，多核苷酸可以被修飾（例如遺傳工程化）以調(diào)節(jié)（例如增大或減小）編碼的 酶的底物特異性，或多核苷酸可以被修飾以改變編碼的酶的底物特異性（例如編碼對(duì)一底 物具有特異性的酶的多核苷酸可以被修飾以使得酶對(duì)另一底物具有特異性）。優(yōu)選的微生 物可以包含編碼如表1-3和圖1-3中的任一者中陳列的酶的多核苷酸。
[0093] 微生物可以包含一或多種編碼路徑中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶 的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，一或多種編碼路徑中催化乙酰CoA和丙酰CoA向丁二烯轉(zhuǎn) 化的酶的多核苷酸可以包括（但不限于）：
[0094] - -或多種編碼路徑中催化乙酰CoA和丙酰CoA向酮戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶（例如硫 解酶）的多核苷酸；
[0095] -一或多種編碼路徑中催化酮戊酰CoA向（R)或（S) 3-羥基戊酰CoA轉(zhuǎn)化的酶（例 如羥基戊酰CoA脫氫酶）的多核苷酸；
[0096] -一或多種編碼路徑中催化（R)或（S)羥基戊酰CoA向2-戊烯酰CoA轉(zhuǎn)化的酶 (例如羥基戊酰CoA脫水酶）的多核苷酸；
[0097] -一或多種編碼路徑中催化2-戊烯酰CoA向2-戊烯酸轉(zhuǎn)化的酶（例如戊烯酰CoA 水解酶或轉(zhuǎn)移酶）的多核苷酸；
[0098] --或多種編碼路徑中催化2-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶（例如2-戊烯酸脫羧酶） 的多核苷酸；
[0099] -一或多種編碼路徑中催化2-戊烯酸向4-戊烯酸轉(zhuǎn)化的酶（例如移位C = C鍵 異構(gòu)酶）的多核苷酸；
[0100] --或多種編碼路徑中催化4-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶（例如4-戊烯酸脫羧酶） 的多核苷酸；
[0101] -一或多種編碼路徑中催化2-戊烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酰CoA轉(zhuǎn)化的酶（例如 戊烯酰CoA脫氫酶）的多核苷酸；
[0102] - -或多種編碼路徑中催化戊_2, 4-二烯酰CoA向戊-2, 4-二烯酸轉(zhuǎn)化的酶（例 如戊-2, 4-二烯酰CoA水解酶或轉(zhuǎn)移酶）的多核苷酸；和/或
[0103] --或多種編碼路徑中催化2, 4-戊烯酸向丁二烯轉(zhuǎn)化的酶（例如戊-2, 4-二烯酸 脫羧酶）的多核苷酸。
[0104] 在一些實(shí)施例中，微生物進(jìn)一步包含一或多種編碼路徑中催化可發(fā)酵碳源（例如 葡萄糖）向甲基丙二酰CoA和/或丙烯酰CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核苷酸。
[0105] 在一些實(shí)施例中，提供一種微生物，其包含一或多種以上多核苷酸，包括所有的以 上多核苷酸。
[0106] 將乙酰CoA和丙酰CoA轉(zhuǎn)化為丁二烯的例示性酶以及其作用的底物和其制造的產(chǎn) 物呈現(xiàn)于下表1中。表1中表示的酶編號(hào)與圖1中所用的酶編號(hào)有關(guān)，所述圖示意地表示 可發(fā)酵碳源經(jīng)由乙酰CoA和丙酰CoA中間物向丁二烯的酶促轉(zhuǎn)化。
[0107] 表1 :經(jīng)由乙酰CoA和丙酰CoA中間物制造丁二烯.
[0108]

【權(quán)利要求】
1. 一種從可發(fā)酵碳源制造了二締的方法，所述方法包含： a. )提供可發(fā)酵碳源； b. )使所述可發(fā)酵碳源與微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中接觸，所述微生物包含一或多種編碼 在了二締制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸， 和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間物向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；W及 C.)使所述一或多種編碼在了二締制造路徑中所述路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或 多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶的多核巧酸、和所述一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間 物向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸在所述微生物中表達(dá)，W制造了二締。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述了二締制造路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向 一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1到3中的任一者中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中催化所述一或多種中間物向了二締轉(zhuǎn)化的所述酶 陳列于表1到3中的任一者中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中了二締經(jīng)由己酷CoA和丙酷CoA中間物；己豆酷 CoA中間物訊/或甲酸中間物來(lái)制造。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化己酷 CoA和丙酷CoA向酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化酬戊酷CoA 向（時(shí)或（巧3-哲基戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或（S) 哲基戊酷CoA向2-戊締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊締酷 CoA向2-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化 的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊締酸向4-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸； 一或多種編碼路徑中催化4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中 催化2-戊締酷CoA向戊-2, 4-二締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化 戊-2, 4-二締酷CoA向戊-2, 4-二締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/或一或多種編碼路徑中 催化2, 4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化己豆酷 CoA向己豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化己豆酷CoA向己豆醒轉(zhuǎn)化的 酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化己豆醒向己豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/或一 或多種編碼路徑中催化己豆醇向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化C0 2向 甲酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化丙酬酸醋和CoA向己酷CoA和甲酸轉(zhuǎn) 化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化甲酸向甲酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或 多種編碼路徑中催化2己酷CoA向己酷己酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑 中催化己酷己酷CoA和甲酷CoA向3, 5-酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼 路徑中催化3, 5-酬戊酷CoA向（時(shí)或（訂-5-哲基-3-酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸； 一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA向（時(shí)或（S)-3, 5-二哲基戊 酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或（S)-3, 5-二哲基戊酷CoA向 (時(shí)或（巧3-哲基-4-戊締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或 (S) -3-哲基-4-戊締酷CoA向3-哲基-4-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/或一或多種 編碼路徑中催化3-哲基-4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物是選自由W下組成的屬的細(xì) 菌；伯克霍爾德菌屬炬urldiolderia)、丙酸桿菌屬（Propionibacterium)、丙酸螺菌 屬（Propionispira)、梭菌屬（Clostridium)、芽抱桿菌屬炬acillus)、埃希氏菌屬 巧scherichia)、暗桿菌屬（Pelobacter)或乳桿菌屬（Lactobacillus)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物是真核生物，是酵母、絲狀真菌、原生 動(dòng)物或藻類。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酵母是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌狂ymomonas mobilis)或己斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碳源是甘庶汁、甘庶糖蜜、水解淀粉、水解木 質(zhì)纖維素材料、葡萄糖、庶糖、果糖、乳酸醋、乳糖、木糖、丙酬酸醋或甘油，呈其任何形式或 混合物形式。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碳源是單糖、寡糖或多糖。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述了二締由所述微生物分泌到所述發(fā)酵培養(yǎng) 基中。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包含從所述發(fā)酵培養(yǎng)基回收所述了二締。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物已經(jīng)遺傳修飾，W使所述一或多種編 碼在所述了二締制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多 核巧酸、和所述一或多種編碼路徑中催化一或多種中間物向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸表 達(dá)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述可發(fā)酵碳源向了二締 的所述轉(zhuǎn)化是ATP陽(yáng)性，并且當(dāng)與NADH消耗路徑組合時(shí)，它可W提供了二締制造的厭氧過(guò) 程。
17. -種微生物，其包含一或多種編碼在了二締制造路徑中路徑中催化可發(fā)酵碳源向 一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸、和一或多種編碼路徑中催化所述一或多種中間物向 了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中在所述了二締制造路徑中催化所述可發(fā)酵碳 源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的所述酶陳列于表1到3中的任一者中。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中催化所述一或多種中間物向了二締轉(zhuǎn)化的所 述酶陳列于表1到3中的任一者中。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中了二締經(jīng)由己酷CoA和丙酷CoA中間物；己 豆酷CoA中間物訊/或甲酸中間物來(lái)制造。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化 己酷CoA和丙酷CoA向酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化酬戊酷 CoA向（時(shí)或（巧3-哲基戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或 (巧哲基戊酷CoA向2-戊締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊 締酷CoA向2-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊締酸向了二締 轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化2-戊締酸向4-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧 酸；一或多種編碼路徑中催化4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑 中催化2-戊締酷CoA向戊-2, 4-二締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催 化戊-2, 4-二締酷CoA向戊-2, 4-二締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/或一或多種編碼路徑 中催化2, 4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化己 豆酷CoA向己豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化己豆酷CoA向己豆醒轉(zhuǎn) 化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化己豆醒向己豆醇轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/ 或一或多種編碼路徑中催化己豆醇向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物包含一或多種編碼路徑中催化 (?向甲酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化丙酬酸醋和CoA向己酷CoA和甲 酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化甲酸向甲酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸； 一或多種編碼路徑中催化2己酷CoA向己酷己酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼 路徑中催化己酷己酷CoA和甲酷CoA向3, 5-酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編 碼路徑中催化3, 5-酬戊酷CoA向（時(shí)或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸； 一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或（S)-5-哲基-3-酬戊酷CoA向（時(shí)或（S)-3, 5-二哲基戊 酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或（S)-3, 5-二哲基戊酷CoA向 (時(shí)或（巧3-哲基-4-戊締酷CoA轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；一或多種編碼路徑中催化（時(shí)或 (S) -3-哲基-4-戊締酷CoA向3-哲基-4-戊締酸轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸；和/或一或多種 編碼路徑中催化3-哲基-4-戊締酸向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧酸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物是選自由W下組成的屬的細(xì)菌： 伯克霍爾德菌屬、丙酸桿菌屬、丙酸螺菌屬、梭菌屬、芽抱桿菌屬、埃希氏菌屬、暗桿菌屬或 乳桿菌屬。
25. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物是真核生物，是酵母、絲狀真菌、 原生動(dòng)物或藻類。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的微生物，其中所述酵母是釀酒酵母、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或己 斯德畢赤酵母。
27. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的微生物，其中所述微生物已經(jīng)遺傳修飾，W使所述一或多 種編碼在所述了二締制造路徑中路徑中催化所述可發(fā)酵碳源向一或多種中間物轉(zhuǎn)化的酶 的多核巧酸、和所述一或多種編碼路徑中催化一或多種中間物向了二締轉(zhuǎn)化的酶的多核巧 酸表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK104471068SQ201280069265
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】馬特烏斯·施萊納·加爾賽斯羅佩斯, 阿芙拉姆·邁克爾·斯洛維奇, 尤里·埃斯特拉達(dá)·戈維亞, 約翰納·林科內(nèi)斯·佩雷斯, 盧卡斯·彭德森·帕里奇 申請(qǐng)人:布拉斯科南美公司(巴西)