一種雞腸道上皮γδT細胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮γδT細胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明首先采用物理研磨配合化學酶法離散雞腸道上皮細胞，提高了腸道細胞離散程度，縮短了細胞處理時間，保證了細胞的高活性；最佳密度細胞分離液的使用，保證了腸道上皮淋巴細胞的純化；磁珠二抗分選法的使用，確保了目標細胞較高的純凈度；并經過細胞培養(yǎng)，發(fā)現本發(fā)明分離培養(yǎng)所得的目標細胞純度高達90％。本發(fā)明解決了分離培養(yǎng)雞腸道上皮γδT細胞過程中種種弊端，從而為雞腸道上皮γδT細胞培養(yǎng)及其生物學和免疫學研究奠定基礎。
【專利說明】-種雞腸道上皮Y 6 T細胞的分離培養(yǎng)方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] Y 5 T細胞是近20年人們新認識的1種T細胞亞群，其在機體出現異常變化時 做出的反應比a目T細胞更為迅速。與人和其他哺乳動物外周血中只有很少比例（3%? 5%)，Y S T細胞不同，家禽外周血中Y S T細胞占到約50%左右。在受到病原體入侵時，家 禽黏膜上皮和外周血中的Y 5T細胞在機體初期防御中發(fā)揮重要作用。但是長期W來雞腸 道上皮Y 5T細胞的分離培養(yǎng)一直較為困難。傳統研究多集中于體外擴增淋己細胞并選擇 性計數Y 5 T細胞（董思源.Y 5 T細胞體外擴增，i-IELs分離和免疫英光技術的建立.天 津：南開大學，2011)，該種方法并未將Y 5T細胞與其他淋己細胞分離開。由于Y 5T細 胞的增殖受到多種淋己細胞分泌的細胞因子的影響，而且體外擴增過程已將Y 5T細胞活 化，故傳統方法并不能完全獨立研究其靜息態(tài)下的生物、免疫活性及其激活機制。利用分離 自21?35日齡肉仔雞腸道上皮Y 5 T細胞進行體外分離培養(yǎng)試驗，與之相比，具有明顯的 優(yōu)點。該方法分離出的腸道上皮Y 5 T細胞，不受機體腸道其他淋己細胞的影響，不受腸道 食糜中某些活性成分的刺激，并能保持較靜息態(tài)和一定程度的特異性和免疫性，本方法的 建立有利于肉仔雞腸道中該細胞進一步研究。因此，雞腸道上皮Y 5T細胞分離培養(yǎng)方法 的建立，為研究雞腸道上皮Y 5T細胞生物學和免疫學奠定了基礎。
[0003] 雞腸道上皮細胞的離散是本方法的重要環(huán)節(jié)。常用方法為剪碎腸道壁后，消化酶 消化，但消化酶價格昂貴，然其種類和用量均難確定，處理時間也難W把握。該為腸道上皮 淋己細胞的分離帶來了很大的困難。
[0004] 雞腸道上皮淋己細胞的分離是本方法的又一重要環(huán)節(jié)。由于淋己細胞分離液密度 不合適，往往造成分離細胞純度不高，腸道上皮細胞大量混雜其中。進而大大浪費了下一步 操作中抗體和磁珠的用量，增加操作成本。
[0005] 此外，對雞腸道上皮Y 5T細胞研究，常用方法為混合淋己細胞培養(yǎng)，給予目標刺 激后，研究其增殖情況及生物免疫活性。但Y 5T細胞增殖活化與其他淋己細胞分泌的細 胞因子及其接觸的腸道上皮細胞都有密切關系?；旌吓囵B(yǎng)，并不能清晰反映目標刺激對 Y 5 T細胞的直接作用，為Y 5 T細胞研究帶來較大問題。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種雞腸道上皮Y 5T細胞的 分離培養(yǎng)方法，降低細胞分離過程中的污染風險和成本，減少因分離時間過長帶來的諸多 弊端，同時，能夠提高目標細胞的純度。
[0007] 本發(fā)明解決的上述技術問題所采用的技術方案為：
[0008] 1. -種雞腸道上皮Y 5T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括W下步 驟：
[0009] 步驟I ;由經過禁食采用靜脈放血處死的試驗雞，無菌手術取2?3cm腸段置于含 1 %雙抗的PBS中；
[0010] 步驟2 ;制備腸壁組織漿液經離也去上清液后，于沉淀中加入0. 05 %膠原酶混合 酶進行消化；
[0011] 步驟3 ;向細胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，離也；去上清，無血清培 養(yǎng)液重息細胞，離也洗涂細胞；再次重息細胞，分別經過不同目數自制細胞篩過濾細胞，離 也去上清；
[0012] 步驟4 ;將細胞重息于密度為1.058g/mL淋己細胞分離液中；于離也管底部加入 4mL密度為1. 098g/mL淋己細胞分離液；將細胞息液鋪于之上，離也；取兩個不同密度的淋 己細胞分離液界面黃白色細胞層；
[001引步驟5 ;在濃度為IX IOVmL細胞息液中，先后加入一定量的TCRl抗體和磁珠，進 行磁珠二抗分選，并用PBS適當重息稀釋，保證二者與目標細胞結合；將細胞息液置于細胞 分選儀進樣口，得到陽性細胞；
[0014] 步驟6;將細胞息浮于10%胎牛血清1?^1-1640培養(yǎng)液，臺盼藍染色，計數活細胞 數，調整細胞濃度為1 X lOVmL，于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她后，測定其細胞存活情況。
[0015] 2.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 步驟1中的雙抗為青霉素和鏈霉素，濃度為1% (V/V)。
[0016] 3.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟 1所述的腸段為空腸中段。
[0017] 4.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟 2中所述的混合消化酶為膠原酶I和膠原酶IV混合酶制劑其質量比為為2:1。
[0018] 5.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟3中無血清1?^1-1640培養(yǎng)液為1?^1-1640細胞培養(yǎng)基中加入（￥/^)0.5%雙抗、1% k谷氨醜胺和1 %輕己基脈嗦己賴酸，pH 7. 2?7. 4。
[0019] 6.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟4不同密度淋己細胞分離液，經過密度為1. lOlg/mL的淋己細胞分離液原液與PBS 一定比例配制而得。
[0020] 7.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟5中的磁珠二抗分選法，具體為先加入一定量TCRl抗體，保證其濃度可達每IO 7個 細胞息液中含有20 y L抗體；賠化后，離也去上清；再加入磁珠，使其濃度達到每IO7個細胞 息液中含有5 y L磁珠，賠化離也去上清；PBS重息細胞，進行細胞分選儀分選。
[0021] 8.如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述 的步驟1中的禁食時間，24?36h為最佳禁食時間。
[0022] 本發(fā)明的詳細描述：
[0023] 雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法包括W下步驟：
[0024] 步驟1 ;對21?35日齡肉仔雞禁食24?36h，靜脈放血處死，75%酒精浸泡10? 15min ;0. 1%新潔爾滅浸泡5?lOmin。取出肉仔雞綁定，75%酒精消毒仔雞腹腿部，破開 腹腔；雙抗溶液噴于腹部各器官表面，手術綴找到空腸中段，取2?3cm腸段于1 %雙抗PBS 溶液中（V/V)。
[00巧]步驟2 ;將溶液移入超凈臺，縱向剪開腸壁，1%雙抗PBS溶液中沖洗，移入無雙抗 PBS溶液沖洗，手術剪剝離腸壁脂肪和結締組織，移入無雙抗PBS溶液，手術剪將腸壁剪為 漿糊狀，玻璃研磨器小也研磨；將組織勻漿液移入離也管，離也；去除上清，加入膠原酶I 和膠原酶IV混合酶制劑佑IBCO公司）（質量比為2:1)，37°C，5% C〇2,搖床震蕩15min。
[0026] 步驟3 ;向細胞液加入無血清RPMI-1640細胞培養(yǎng)液（其中按體積比加入了 0. 5% 雙抗、1 % k谷氨醜胺和1 %輕己基脈嗦己賴酸，抑調至7. 2?7. 4)終止消化，離也；去上 清，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重息細胞，離也洗涂細胞；再次重息細胞，分別經過100目，200 目自制細胞篩（自制細胞篩為經100目和200目網布緊固于燒杯而成），離也去上清。
[0027] 步驟4 ;將細胞重息于密度為1.058g/mL淋己細胞分離液中；在離也管底部加入 4mL密度為1.098g/mL的淋己細胞分離液（不同密度淋己細胞分離液，經過密度為1. IOlg/ 血淋己細胞分離液原液訂抓Science公司）與PBS-定比例配制而得）；將細胞息液鋪于 之上，離也；取兩個不同密度的淋己細胞分離液界面黃白色細胞層，無血清RPMI-1640培養(yǎng) 液重息細胞，離也去上清，洗涂，即為腸道上皮淋己細胞；顯微鏡下計數細胞，約為1 X IOV 血，細胞活率95% W上。
[002引 步驟5 ;在濃度為1 X IOVmL細胞息液中加入鼠抗雞TCRl抗體（Souther Biotech 公司），輕輕混勻，賠化lOmin，離也去上清；PBS重息細胞，使細胞濃度達到I XioVu L， 加入磁珠，賠化15min，離也去上清；PBS重息細胞5 X lOVmL ;將細胞息液置于細胞分選儀 (Milteny Biotec GmbH公司，型號：autoMAC巧進樣口，得到陽性細胞，進行培養(yǎng)。
[0029] 步驟6 ;將細胞息浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液，臺盼藍染色，計數活細胞數 (>95% )，調整細胞濃度為IX lOVmL。之后于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔植入190 UL細胞息 液，隨后加入刀豆球蛋白ConA(終濃度為5y g/mL)，培養(yǎng)體系為200UL。置5% C02,4(TC 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她，MIT法染色細胞，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長下測定OD值。
[0030] 本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法。與目前常用的混合培養(yǎng) 研究雞腸道上皮Y 5T細胞相比，本發(fā)明關于一種雞腸道上皮Y 5T細胞的分離培養(yǎng)方法 有較大的創(chuàng)新性和獨特性，建立了成熟的雞腸道上皮Y 5T細胞的分離培養(yǎng)方法，分離得 到了純度高且原始靜息的雞腸道上皮Y 5T細胞，減少了分離過程的污染風險，縮短了分 離所需的時間，保證了分離過程中細胞的活力。該方法的建立有利于獨立研究雞腸道上皮 Y 5T細胞的生物活性和免疫活性。
[0031] 本發(fā)明中的雞腸道上皮淋己細胞的分離，采用了物理輕微研磨和化學酶消化相結 合的方法。物理研磨分離細胞的弊端在于極易破壞細胞膜，減弱細胞活性，但其可縮短分離 時間；化學處理方法溫和，但酶的種類、濃度W及處理時間難W確定，該樣同樣帶來抑制細 胞活性的弊端。本發(fā)明先采用物理輕微研磨，即將剪碎的腸道上皮移入玻璃研磨器，輕且慢 研磨兩次，每次時間不超過IOs ;該步驟提高了細胞分離的效率，損傷細胞的程度較?。粸?化學消化奠定了基礎。將物理研磨后的細胞移入培養(yǎng)皿中，加入終濃度為0. 05%的膠原酶 I和膠原酶IV混合酶制劑，37C，5% (?,置于搖床震蕩15min，即可看見離散較好的細胞。 酶消化法較為溫和，不易直接損傷細胞，加之之前的物理消化方法，可在較短時間內得到活 力較好的細胞。物理研磨加之化學酶消化，得到了離散較好，活力較好的雞腸道上皮細胞。
[0032] 密度梯度分離腸道淋己細胞，利用較為精準的密度淋己細胞分離液，得到了純度 較高的淋己細胞，從而去除了含量較高的腸道上皮細胞及其它雜細胞。
[0033] 磁珠二抗淋己細胞分選儀分選，得到純凈的雞腸道上皮的Y 5T細胞。先將得到 的腸道上皮淋己細胞與鼠抗雞TCRl -抗賠化，使TCRl與目標細胞表面的Y 5抗原結合， 之后加入磁珠賠化，使TCRl與磁珠結合，經由分選儀的磁性分選，得到陽性細胞，即為目標 細胞Y 5 T細胞。磁珠二抗分選方法，解決了雞腸道上皮Y 5 T細胞分離純度差的問題。使 廣大科研工作者可W獨立研究雞腸道上皮Y 5T細胞。
[0034] 本發(fā)明的有益效果
[00巧]本發(fā)明涉及一種雞腸道上皮Y 5 T細胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明首先采用物理研 磨配合化學酶法離散雞腸道上皮細胞，提高了腸道細胞離散程度，縮短了細胞處理時間，保 證了細胞的高活性；最佳密度細胞分離液的使用，保證了腸道上皮淋己細胞的純化；磁珠 二抗分選法的使用，確保了目標細胞較高的純凈度；并經過細胞培養(yǎng)，發(fā)現本發(fā)明分離培養(yǎng) 所得的目標細胞純度高達90%。本發(fā)明解決了分離培養(yǎng)雞腸道上皮Y 5T細胞過程中種種 弊端，從而為雞腸道上皮Y 5T細胞培養(yǎng)及其生物學和免疫學研究奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1 ;新分離的肉仔雞腸道上皮Y 5 T細胞圖中顯示分離得到的肉仔雞腸道上皮 Y 5T細胞（IXioVmL)D
[0037] 圖2 ;培養(yǎng)4她的肉仔雞腸道上皮Y 5T細胞圖中顯示培養(yǎng)4她后的肉仔雞腸道 上皮Y 5T細胞巧X107mL)。

【具體實施方式】
[0038] 為了進一步說明本發(fā)明的內容，下面結合本發(fā)明的實施例作進一步詳細描述。
[0039] 實施例1
[0040] 本實施例W 30日齡1. 5kg健康白羽肉雞分離培養(yǎng)腸道上皮Y 5 T細胞。先進行 2化的禁食，部污物皮屑，去除腹部及腿部羽毛，浸泡15min ;再于0. 1 %新潔爾滅溶液中浸 泡IOmin;取出肉仔雞，綁定于手術臺上，75%酒精噴于仔雞腹腿部，破開腹腔；1%雙抗溶 液噴于腹部各器官表面，手術綴找到空腸中段，取3cm腸段于1 %雙抗PBS溶液中。
[0041] 將溶液移入超凈臺，縱向剪開腸壁，1 %雙抗PBS溶液中測洗H次，移入無雙抗 PBS溶液測洗兩次，手術剪剝離腸壁脂肪和結締組織，移入無雙抗PBS溶液，手術剪將腸壁 剪為漿糊狀，玻璃研磨器小也研磨2次；將組織勻漿液移入15mL離也管，25(K)r/min，離也 IOmin ;去除上清，加入5血0. 05%膠原酶混合酶液，37°C，5% (?,置于搖床震蕩15min。
[0042] 向細胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，25(K)r/min，離也IOmin ;去上 清，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重息細胞，離也洗涂細胞；再次重息細胞，分別經過100目，200 目自制細胞師，貿也去上清。
[0043] 將細胞重息于密度為1. 058g/mL淋己細胞分離液（配制方法同上）；在15血離也 管底部加入4mL密度為1. 098g/mL的淋己細胞分離液；將細胞息液鋪于之上，30(K)r/min， 20min離也；取兩個不同密度的淋己細胞分離液界面黃白色細胞層，無血清RPMI-1640培養(yǎng) 液重息細胞，離也去上清，洗涂H次，即為本發(fā)明所制備的雞腸道上皮Y 5 T細胞（腸道上 皮淋己細胞）；顯微鏡下計數細胞，約為IXioVmU活率95% W上。
[0044] 將細胞息液離也去上清，PBS重息細胞，使細胞濃度達到IXioVmU加入鼠抗雞 TCRl -抗，輕輕混勻，保證其濃度可達每IO7個細胞息液中含有20 y L抗體，4°C賠化lOmin， 250化/min,離也IOmin去上清；PBS重息細胞，再加入磁珠，使其濃度達到每IO7個細胞息液 中含有5 U L磁珠，4°C賠化15min，2500r/min，離也IOmin去上清；PBS重息細胞5 X IOVmL ; 將細胞息液置于細胞分選儀進樣口，得到陽性細胞。
[0045] 收集細胞后，臺盼藍染色，計數活細胞數（>95%)，調整細胞濃度為IX 1〇7個/mL。 之后于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔植入190 y L細胞息液，隨后加入刀豆球蛋白Con A (終濃度 為5 y g/血)，培養(yǎng)體系為200 y L。置5% C〇2,4(TC二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4她，每孔輕輕吸棄 上清10011^加入100111不含小牛血清的1?^1-1640培養(yǎng)基，同時加入5111肖/1111^11'1'溶液 100 U L，繼續(xù)培養(yǎng)化，培養(yǎng)結束后，每孔加入100 y L DMSO溶液，靜置10-15min，使紫色結晶 完全溶解，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長下測定OD值。
[0046] 實施例2
[0047] --本發(fā)明的方法與傳統方法對比試驗
[0048] 對比實驗采用傳統的0. 05%膠原酶IV消化，37°C，5% C〇2,置于搖床震蕩45min， 促使細胞完全離散。之后經過密度梯度離也，采用磁珠二抗分選后，得到雞腸道上皮淋己細 胞，檢測細胞活力。
[0049] 發(fā)明人使用本方法及對比實施例所述方法，均作了十次試驗進行比較，并進行了 細胞分離情況的數據統計，如表1比較：
[0050] 表1本發(fā)明的方法與傳統方法分離細胞對比試驗
[0051]

【權利要求】
1. 一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括以下步驟： 步驟1 :由經過禁食采用靜脈放血處死的試驗雞，無菌手術取2?3cm腸段置于含1% 雙抗的PBS中； 步驟2 :制備腸壁組織漿液經離心去上清液后，于沉淀中加入0. 05%膠原酶混合酶進 行消化； 步驟3 :向細胞液加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，離心；去上清，無血清培養(yǎng)液 重懸細胞，離心洗漆細胞；再次重懸細胞，分別經過不同目數自制細胞篩過濾細胞，離心去 上清； 步驟4 :將細胞重懸于密度為1. 058g/mL淋巴細胞分離液中；于離心管底部加入4mL密 度為1. 098g/mL淋巴細胞分離液；將細胞懸液鋪于之上，離心；取兩個不同密度的淋巴細胞 分離液界面黃白色細胞層； 步驟5 :在濃度為1 X 107/mL細胞懸液中，先后加入一定量的TCR1抗體和磁珠，進行磁 珠二抗分選，并用PBS適當重懸稀釋，保證二者與目標細胞結合；將細胞懸液置于細胞分選 儀進樣口，得到陽性細胞； 步驟6 :將細胞懸浮于10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，臺盼藍染色，計數活細胞數，調 整細胞濃度為1 X 107/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，測定其細胞存活情況。
2. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟 1中的雙抗為青霉素和鏈霉素，濃度為1% (V/V)。
3. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟1所 述的腸段為空腸中段。
4. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是步驟2中 所述的混合消化酶為膠原酶I和膠原酶IV混合酶制劑其質量比為為2:1。
5. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的 步驟3中無血清RPMI-1640培養(yǎng)液為RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中加入（V/V)0. 5%雙抗、1% L-谷氨酰胺和1 %羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7. 2?7. 4。
6. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟4不同密度淋巴細胞分離液，經過密度為1. 101g/mL的淋巴細胞分離液原液與PBS -定 比例配制而得。
7. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟5中的磁珠二抗分選法，具體為先加入一定量TCR1抗體，保證其濃度可達每107個細胞 懸液中含有20 y L抗體；孵化后，離心去上清；再加入磁珠，使其濃度達到每107個細胞懸液 中含有5 y L磁珠，孵化離心去上清；PBS重懸細胞，進行細胞分選儀分選。
8. 如權利要求1所述一種雞腸道上皮Y ST細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征是所述的步 驟1中的禁食時間，24?36h為最佳禁食時間。
【文檔編號】C12N5/0783GK104357393SQ201410645751
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】張海軍, 楊金玉, 武書庚, 齊廣海, 岳洪源, 王晶 申請人:中國農業(yè)科學院飼料研究所