一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體（nano-liposome）的制備方法及其在治療炎癥性腸病的應(yīng)用，通過向磷酸卵磷脂和膽固醇混合物中加入CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液后進(jìn)行超聲水浴、過濾、分離、富集等工藝即可制得，制備方法步驟簡單；制得的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體能進(jìn)入腸道黏膜，有效抑制腸道細(xì)胞CSN8的表達(dá)，緩解腸炎癥狀，治療效果顯著。
【專利說明】—種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體(nano-liposome)的制備方法及其用于疾病治療方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂質(zhì)體最早約在40年前發(fā)展起來，是一種人工膜。當(dāng)兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時(shí)，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成直徑25~1000nm不等的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的的封閉囊泡，即脂質(zhì)體。
[0003]細(xì)胞主要通過內(nèi)吞的方式攝取周圍的大分子物質(zhì)。一些藥物和大分子物質(zhì)通常不能穿過細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層。脂質(zhì)體的疏水雙分子層有利于包裹水溶性物質(zhì)如用于治療的蛋白等，并將大分子物質(zhì)封裝于其親水的內(nèi)核中，既可以通過網(wǎng)格包被蛋白小窩上的受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，也可以通過細(xì)胞膜的直接融合作用將目的物質(zhì)運(yùn)輸入胞內(nèi)。因此脂質(zhì)體廣泛應(yīng)用于生化、醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)。目前，脂質(zhì)體作為給藥載體的途徑通常有靜脈注射、肌內(nèi)和皮下注射和口服給藥等。
[0004]當(dāng)物質(zhì)顆粒小于IOOnm時(shí)，物質(zhì)本身的固有特性發(fā)生質(zhì)的變化，呈現(xiàn)出奇特的物理化學(xué)性能，即納米效應(yīng)，包括表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀粒子效應(yīng)等。納米粒子載體的表面效應(yīng)可提高裝載率、溶出速率和吸收速率，且可延長被載物質(zhì)在血液中的滯留時(shí)間以提高其生物利用度。多數(shù)納米粒可直接穿過粘膜上皮細(xì)胞孔隙和血腦屏障。
[0005]基于上述納米脂質(zhì)體的特性以及脂質(zhì)體作為載體系統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)，理想的運(yùn)用于轉(zhuǎn)運(yùn)基因的脂質(zhì)體，大小應(yīng)達(dá)到納米尺度，粒徑平均為IOOnm或者更小，可直接穿過粘膜上皮細(xì)胞孔隙，對(duì)于質(zhì)粒DNA具有高包封率，保護(hù)DNA不被血漿核酸酶降解，介導(dǎo)細(xì)胞特異性內(nèi)吞。
[0006]CSN8是泛素化調(diào)節(jié)蛋白C0P9復(fù)合物的第八個(gè)亞基，發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白的功能，影響細(xì)胞增殖和凋亡。我們的研究表明CSN8在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，抑制CSN8蛋白的表達(dá)可顯著緩解炎癥性腸病癥狀。而反義寡核酸技術(shù)是基因治療的常用方法，根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)特定靶序列的反義核酸，在蛋白水平抑制特定基因表達(dá)。由于體內(nèi)無處不在的核酸酶作用，進(jìn)入胞內(nèi)的核酸容易被降解。納米脂質(zhì)體與核酸結(jié)合后，可避免核酸被過多降解，并提高其被細(xì)胞捕獲的可能性，因此近年來脂質(zhì)體作為基因的有效載體應(yīng)用越來越受到重視。本發(fā)明中制備了包裹CSNSshRNA質(zhì)粒的納米脂質(zhì)體，并用小鼠DSS炎癥性腸病模型評(píng)價(jià)該脂質(zhì)體對(duì)炎癥性腸病的療效，發(fā)現(xiàn)包裹CSNSshRNA質(zhì)粒的納米脂質(zhì)體能進(jìn)入腸道黏膜，有效抑制腸道細(xì)胞CSN8的表達(dá)，緩解腸炎癥狀，可能作為一種新的治療炎癥性腸病的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備方法及其該納米脂質(zhì)體在治療炎癥性腸病的應(yīng)用?！?br> [0008]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:[0009]一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0010]步驟(1):將憐酸卵憐脂(phosphatidylcholine)和膽固醇(cholesterol)溶于10倍體積的氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至形成具有均勻薄膜的第一混合物；
[0011]步驟(2):向所述第一混合物中加入1/2第一混合物體積的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物體積的CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液室溫?cái)嚢?~8小時(shí)形成第三混合物；
[0012]步驟(3):將所述第三混合物在4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再補(bǔ)充與步驟(2)中所加氯仿同等體積的緩沖液，再進(jìn)行4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘即得脂質(zhì)體混懸液；
[0013]步驟(4):將步驟(3)制得的脂質(zhì)體混懸液通過0.1 ii m的微孔濾膜，20000~36000g超速離心20~60min，上層即為所需的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體，所述CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的直徑小于等于lOOnm。
[0014]優(yōu)選的，所述緩沖液為PBS、HEPES或生理鹽水。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟(4)中將步驟(3)制得的脂質(zhì)體混懸液通過0.1 y m的微孔濾膜后，再通過0.02 y m的超濾膜進(jìn)行過濾，取被截留液體，即可富集到所需的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體。
[0016]優(yōu)選的，所述CSN8shRNA質(zhì)粒是根據(jù)RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)合成的針對(duì)CSN8的編碼基因的siRNA (Small interfering RNA)編碼序列與表達(dá)載體連接而成的。
[0017]所述CSN8shRNA質(zhì)粒制備的步驟如下:
[0018]首先，設(shè)計(jì)針對(duì)人CSN8編碼基因的siRNA (Small interfering RNA)目標(biāo)序列，優(yōu)選的目標(biāo)序列為“GCACTTAGAGATGCAACAA”，同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠CSN8編碼基因的siRNA (Small interfering RNA)目標(biāo)序列，優(yōu)選的目標(biāo)序列為“GCCCTTAGAGATGCAACAA”;按照 pSilencerTM hygro Kit (Ambion Part Number AM5760, AM5766)操作說明，合成針對(duì)上述目標(biāo)序列的siRNA莖環(huán)模板序列(Hairpin siRNA Template Insert),并分別連接合成序列至表達(dá)載體pSilencer3.1-Hlhygro0
[0019]優(yōu)選的，所述CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液中CSN8shRNA質(zhì)粒的濃度為I U g/ml~1000 Ii g/ml。
[0020]優(yōu)選的，步驟(1)中磷酸卵磷脂和膽固醇的體積比為(I:1)~(10:1)。
[0021]利用如上所述制備方法制得的CSN8 shRNA納米脂質(zhì)體的應(yīng)用，其特征在于，該CSN8shRNA納米脂質(zhì)體可用于炎癥性腸病治療。
[0022]所述炎癥性腸病為潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。
[0023]發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
[0024]本發(fā)明所述制備方法的制備工藝簡單，制得的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體穩(wěn)定易進(jìn)入腸道黏膜，有效抑制腸道細(xì)胞CSN8的表達(dá)，緩解腸炎癥狀，而且治療方法易操作，可通過口月艮，治療效果明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為人CSN8shRNA納米脂質(zhì)體干擾人直腸癌細(xì)胞株SW480中CSN8蛋白表達(dá)Western Blotting 檢測結(jié)果；[0026]圖2為DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠腸炎模型DAI評(píng)分結(jié)果；
[0027]圖3為小鼠CSN8shRNA納米脂質(zhì)體灌胃DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠后小鼠CSN8蛋白表達(dá)量Western Blotting檢測結(jié)果；
[0028]圖4為灌胃小鼠CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的炎癥性腸病C57BL/6小鼠DAI評(píng)分結(jié)果;
[0029]圖5為小鼠CSN8shRNA納米脂質(zhì)體灌胃DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠小腸上皮TNF- a、IL-6和IL-1蛋白表達(dá)量ELISA檢測結(jié)果；
[0030]圖6為灌胃對(duì)照納米脂質(zhì)體的DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病C57BL/6小鼠的小腸病理切片結(jié)果；
[0031]圖7為灌胃小鼠CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病C57BL/6小鼠的小腸病理切片結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0033]實(shí)施例1:
[0034]一、制備方法
[0035]實(shí)驗(yàn)組:CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備
·[0036]步驟(1):將憐酸卵憐脂(phosphatidylcholine)和膽固醇(cholesterol)溶于10倍體積的氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至形成具有均勻薄膜的第一混合物；磷酸卵磷脂和膽固醇的體積比例可為2:1。
[0037]步驟(2):向所述第一混合物中加入1/2第一混合物體積的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物體積的CSN8shRNA質(zhì)粒的緩沖液室溫?cái)嚢?~8小時(shí)形成第三混合物；所述CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液中CSN8shRNA質(zhì)粒的濃度為500 u g/ml。
[0038]CSN8shRNA質(zhì)粒制備步驟如下:設(shè)計(jì)針對(duì)人CSN8編碼基因的siRNA (SmalIinterfering RNA)目標(biāo)序列，優(yōu)選的目標(biāo)序列為“GCACTTAGAGATGCAACAA”，同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠CSN8編碼基因的siRNA (Small interfering RNA)目標(biāo)序列，優(yōu)選的目標(biāo)序列為“GCCCTTAGAGATGCAACAA” ；按照 pSilencerTM hygro Kit(Ambion Part NumberAM5760, AM5766)操作說明，合成針對(duì)上述目標(biāo)序列的siRNA莖環(huán)模板序列(Hairpin siRNATemplate Insert),并分別連接合成序列至表達(dá)載體pSilencer3.1-Hlhygro。
[0039]步驟(3):將所述第三混合物在4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再補(bǔ)充與步驟(2)中所加氯仿同等體積的緩沖液，再進(jìn)行4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘即得脂質(zhì)體混懸液；
[0040]步驟(4):將步驟(3)制得的脂質(zhì)體混懸液通過0.1 ii m的微孔濾膜,20000~36000g超離20~60min，上層即為所需的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體，所述CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的直徑小于等于lOOnm。
[0041]對(duì)照組:對(duì)照組質(zhì)粒米用pSilencer? hygro Kit (Ambion Part NumberAM5760, AM5766)試劑盒中自帶的陰性對(duì)照質(zhì)粒 pSilencer3.1-Hlhygro NegativeControl o除加入的質(zhì)粒不同外,含有對(duì)照質(zhì)粒的納米脂質(zhì)體制備步驟同CSN8shRNA納米脂質(zhì)體制備方法步驟I~4。[0042]二、應(yīng)用及療效評(píng)估:
[0043]一)人CSN8shRNA納米脂質(zhì)體對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中CSN8蛋白表達(dá)干擾評(píng)估
[0044]用上述制得的人CSN8shRNA納米脂質(zhì)體處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，檢測SW480細(xì)胞中CSN8蛋白表達(dá)量，同時(shí)比對(duì)對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0045]在37°C，5%C02條件下，用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞以3 X IO5個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞豐度達(dá)到85%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組用2ml含人CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的RPMI1640培養(yǎng)基處理SW480細(xì)胞，對(duì)照組用2ml含對(duì)照質(zhì)粒的RPMI1640培養(yǎng)基處理SW480細(xì)胞。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均做3個(gè)復(fù)孔。6小時(shí)后，換成10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)上述被納米脂質(zhì)體處理的SW480細(xì)胞。
[0046]36小時(shí)后，用Western Blotting法分別檢測SW480細(xì)胞CSN8蛋白表達(dá)量。如圖1所示:結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Nano-1 iposome+vector)相比，實(shí)驗(yàn)組(Nano-1 iposome+CSN8shRNA)CSN8蛋白表達(dá)量明顯被下調(diào)。P -actin表達(dá)量為內(nèi)參。
[0047]為了評(píng)估CSN8shRNA納米脂質(zhì)體對(duì)炎癥性腸病的療效，我們建立了 DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病模型，采用上述制得的小鼠CSNSshRNA納米脂質(zhì)體以灌胃方式給藥，治療炎癥性腸病模型小鼠，治療過程和結(jié)果如下:
[0048]二)、DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病模型的建立
[0049]I)實(shí)驗(yàn)材料
[0050]動(dòng)物:C57BL/6小鼠，早，體重 20_25g，SPF 級(jí)，40 只。
[0051]動(dòng)物分組:A，正常對(duì)照組n=10 ；B, 3.5%DSS實(shí)驗(yàn)組n=30，n指小鼠的數(shù)量。
[0052]2) DSS誘導(dǎo)炎癥性腸病模型`的方法
[0053]給予實(shí)驗(yàn)組雌性C57BL/6小鼠含有3.5%DSS的飲用水，同時(shí)給予對(duì)照組等量蒸餾水作為飲用水，7天后改成正常飲用水。每天觀察小鼠大便情況，并稱量小鼠體重。
[0054]3)炎癥性腸病模型建立結(jié)果
[0055](I)疾病活動(dòng)度指數(shù)(The Disease Activity Index, DAI)評(píng)分
[0056]根據(jù)體重減失率分?jǐn)?shù)和大便隱血程度判斷疾病活動(dòng)指數(shù)。參考文獻(xiàn)(OkayasuI,Hatakeyyama S，Yamada M，Ohkusa T，Inagaki Y，Nakaya R.A novel method in theinduction of reliable experimental acute chronic ulcerative colitis in mice.Gastroenterology 1900; 98:694-702)對(duì)小鼠進(jìn)行 DAI 評(píng)分。
[0057]體重減失率計(jì)算方法:注射實(shí)驗(yàn)前稱量小鼠體重，注射后每天稱量小鼠體重按照公式100%X (實(shí)驗(yàn)前體重-稱量后體重)+實(shí)驗(yàn)前體重。
[0058]大便隱血程度由尿糞隱血試劑盒測定。
[0059]各組小鼠DAI評(píng)分曲線見圖2，飲用含3.5%DSS的小鼠與對(duì)照組(飲用蒸餾水)相t匕，DAI評(píng)分在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的7天之內(nèi)明顯升高。
[0060](2)小腸病理切片觀察
[0061]在正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別選擇3只小鼠處死，分離小腸，參考文獻(xiàn)(EkstromCM.0xazo1ne-1nduced colitis in rats: effects of budesonide，cyclosporinA，and5_aminosal cylic acid.Scand J Gastroenteroll998; 33:174-179)，對(duì)小鼠小腸進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分。
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟(1):將磷酸卵磷脂和膽固醇溶于10倍體積的氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至形成具有均勻薄膜的第一混合物； 步驟(2):向所述第一混合物中加入1/2第一混合物體積的氯仿，形成第二混合物，再加入所述1/3第二混合物體積的CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液室溫?cái)嚢?~8小時(shí)形成第三混合物； 步驟(3):將所述第三混合物在4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再補(bǔ)充與步驟(2)中所加氯仿同等體積的緩沖液，再進(jìn)行4~37°C條件下，30~50W功率水浴超聲處理5~30分鐘即得脂質(zhì)體混懸液； 步驟(4):將步驟(3)制得的脂質(zhì)體混懸液通過0.1 μ m的微孔濾膜，20000~36000g超速離心20~60min，上層即為所需的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體，所述CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的直徑小于等于lOOnm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為PBS、HEPES或生理鹽水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中將步驟(3)制得的脂質(zhì)體混懸液通過0.1μm的微孔濾膜后，再通過0.02 μ m的超濾膜進(jìn)行過濾，取被截留液體，即可富集到所需的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述CSN8shRNA質(zhì)粒是根據(jù)RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)合成的針對(duì)CSN8的編碼基因的siRNA(Smallinterfering RNA)編碼序列與表達(dá)載體連接而成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述CSN8shRNA質(zhì)粒緩沖液中CSN8shRNA質(zhì)粒的濃度為1 U g/ml~1000 u g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中磷酸卵磷脂和膽固醇的體積比為(1:1)~(10:1)。
7.如權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述制備方法制得的CSN8shRNA納米脂質(zhì)體的應(yīng)用，其特征在于，該CSN8shRNA納米脂質(zhì)體可用于炎癥性腸病治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的CSNSshRNA納米脂質(zhì)體的應(yīng)用，其特征在于，所述炎癥性腸病為潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。
【文檔編號(hào)】A61P1/04GK103655476SQ201310641638
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】居頌文, 尹娟, 唐靜 申請(qǐng)人:蘇州市立醫(yī)院