專(zhuān)利名稱(chēng)：Glp-1及其類(lèi)似物在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-1 (Glucogon like p印tide-l， GLP-1)及其類(lèi)似物的新用途， 尤其是涉及其在制備治療阿爾茨海默氏病(Alzheimer disease, AD)藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)背景胰高血糖素樣肽-1 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)glp-1)是一種食物刺激腸道L細(xì)胞分泌的腸肽，由36 37 個(gè)氨基酸組成，是胰高血糖素原轉(zhuǎn)錄后的修飾產(chǎn)物。GLP-1的分子量約為3355，可以通過(guò)一 種特異的肽轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入大腦，在大腦皮層、海馬及小腦的神經(jīng)元都可檢測(cè)到碘標(biāo) GLP-1的低密度結(jié)合。GLP-1的功能由GLP-1受體(Glucagon like peptide-1 rec印tor， GLP-1R)介導(dǎo)。GLP-1R 在嚙齒類(lèi)動(dòng)物及人的腦中分布廣泛，在背側(cè)丘腦、腦干、矢中隔、穹窿下器、尾狀核、大腦 皮層、海馬、小腦中均有表達(dá)。GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體B家族(分泌素家族)中的胰高血 糖素受體亞家族，在人和鼠的胰島、肺、腦、胃、心臟及腎臟中都有廣泛的表達(dá)。glp-i廣泛分布于嚙齒動(dòng)物及人類(lèi)體內(nèi)，呈葡萄糖依賴(lài)性地作用于胰島e細(xì)胞，可促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和分泌，降低胰高血糖素的水平，降低胃排空率、提高飽 足感以及剌激胰島素生物合成。另外，2型糖尿病患者胰高血糖素水平常常升高，并因此導(dǎo) 致肝糖元輸出，而GLP-1對(duì)此有拮抗作用。這些效應(yīng)使得GLP-1成為一種治療2型糖尿病的 很好藥物。1、 GLP-1具有促進(jìn)胰島素分泌并抑制胰高血糖素分泌的作用現(xiàn)有資料表明，持續(xù)輸注GLP-1可顯著降低2型糖尿病患者的空腹和餐后血糖水平，連 續(xù)輸注6周GLP-1后，2型糖尿病患者的糖化血紅蛋白(HbAlc)可顯著降低。即使對(duì)于磺脲類(lèi) 藥物失效的2型糖尿病患者，輸注glp-1仍能引起顯著的降糖和促胰島素分泌作用。而且，與其他胰島素促泌劑不同的是，GLP-1促進(jìn)胰島素分泌的作用依賴(lài)于較高的葡萄 糖水平，在正常和較低葡萄糖水平下，GLP-1促胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用很 弱。細(xì)胞水平研究顯示，在低葡萄糖水平下，GLP-1與e細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體特異性結(jié)合后，僅引起鈣離子少量?jī)?nèi)流和胰島素微量釋放，而高血糖時(shí)，e細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷/二磯酸腺苷(atp/adp)比值升高，atp依賴(lài)的鉀通道開(kāi)放使e細(xì)胞復(fù)極化延遲，glp與其受體結(jié)合 后可引起鈣離子長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)流，并導(dǎo)致較多的胰島素釋放。因此，GLP-1促進(jìn)胰島素分泌的作 用呈葡萄糖依賴(lài)性，使得升高GLP-1水平的藥物基本不會(huì)引起低血糖。此外，在葡萄糖攝入前連續(xù)輸注3小時(shí)GLP-1，可顯著改善胰島素的第一時(shí)相分泌，表明其促胰島素分泌作用比較符合正常的生理模式。2、 GLP-i具有保護(hù)e細(xì)胞的作用e細(xì)胞功能衰退是2型糖尿病病情進(jìn)展的核心原因。現(xiàn)有資料表明，連續(xù)輸注6周GLP-1可顯著改善2型糖尿病患者的e細(xì)胞功能。動(dòng)物試驗(yàn)和體外研究表明，glp-i還能激活e細(xì)胞再生，保護(hù)人P細(xì)胞的正常形態(tài)，并且抑制0細(xì)胞凋亡。這一特性使得GLP-1可遏制2型 糖尿病的病情進(jìn)展。3、 胰腺外作用現(xiàn)有資料表明，注射GLP-1可延緩胃排空，長(zhǎng)期輸注GLP-1后，還可作用于下丘腦攝食 中樞，增加飽脹感并抑制進(jìn)食，這也有利于2型糖尿病患者控制血糖和體重。心肌細(xì)胞中也有g(shù)lp-1的特異性受體，glp-1與之結(jié)合后，可以模擬胰島素樣作用，增 加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。在重度充血性心衰患者中進(jìn)行的臨床研究顯示，此類(lèi)患者長(zhǎng)期 輸注GLP-1，可以改善左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),并增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力。綜上所述，GLP-1的主要生理功能是調(diào)節(jié)血糖，通過(guò)刺激胰島素分泌和胰島素基因的表達(dá)，抑制高血糖素的分泌，促進(jìn)e細(xì)胞的增殖與分化，減少e細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胰島團(tuán)塊的形成。這一作用使得glp-1在較短時(shí)間內(nèi)即從一個(gè)正常的生理性?xún)?nèi)分泌激素轉(zhuǎn)變成為2型糖 尿病的治療藥物。雖然GLP-1具有多種治療2型糖尿病的有益機(jī)制，但是，將GLP-1作為治療2型糖尿病 的藥物應(yīng)用于臨床，長(zhǎng)期以來(lái)卻很有難度。glp-1進(jìn)入人體后，可以被廣泛存在的二肽基肽 酶-4(DPP-4)快速降解，半衰期不足5min，皮下注射的半衰期也只有1 2小時(shí)。所以，天然 的GLP-1不能直接作為藥物使用?？朔礼LP-1半衰期短，臨床上難以從血液中檢測(cè)到的缺點(diǎn)，從而能夠使GLP-1應(yīng)用于臨 床的可行方法之一是對(duì)GLP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使其不易被DPP-4降解。截至目前為止，已經(jīng)發(fā)展了多種GLP-1的類(lèi)似物，如表1中給出了 GLP-1及部分GLP-1 類(lèi)似物的氨基酸序列。這些已經(jīng)發(fā)展起來(lái)的GLP-1類(lèi)似物中，部分制劑已經(jīng)在美國(guó)獲FDA批 準(zhǔn)上市，或正在臨床試驗(yàn)中。其中，正在注冊(cè)的GLP-1增強(qiáng)劑有Vildagliptin、 Sitagliptin 等，進(jìn)入臨床III、 II期試驗(yàn)的有Denagliptin、 SYR 322、 Saxagliptin、 Ro-0730699、 PSN 9301、 TA 6666、 Exenatide(Ex4) 、 Val (8)GLP-1等。例如，Exenatide是爬蟲(chóng)類(lèi)激素exendin-4的人工合成品，具有與GLP-1作用相似的結(jié) 構(gòu)與功能，半衰期長(zhǎng)，已經(jīng)通過(guò)了美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局審批，成為治療2型糖尿病的 輔助藥物，并在2005年年中在美國(guó)上市，商品名Byetta。 Exenatide已被證實(shí)可以與大鼠胰島細(xì)胞的GLP-1R結(jié)合，可以對(duì)抗DPP-4對(duì)GLP-1的分解作用，表現(xiàn)出依賴(lài)性胰島素分泌增加 效應(yīng)；由于Exenatide的清除率較慢，其促胰島素功能比GLP-1強(qiáng)63%，并顯示出較好的安 全性和降糖療效。表1 GLP-1及部分GLP-1類(lèi)似物的氨基酸序列 7 16 30 36 45GLP-1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR G(8) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR V(8) HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR GG(2) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAP GG(3) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS GLP-1 ET HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS有資料證明，其它可以對(duì)抗DPP-4的GLP-1類(lèi)似物與Exenatide的作用相似。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供GLP-1及其類(lèi)似物的一種新用途。事實(shí)上，本發(fā)明涉及GLP-1及其類(lèi)似物作為制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物中的 應(yīng)用。由于GLP-1的半衰期較短，為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明擬以GLP-1的一種類(lèi) 似物Val (8) GLP-1的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。本發(fā)明所使用的GLP-1類(lèi)似物Val(8)GLP-l是由英國(guó)Ulster大學(xué)Dr Holster實(shí)驗(yàn)室贈(zèng) 送的。該藥物具有更高的生物學(xué)活性和更長(zhǎng)的藥理學(xué)活性，是一種新型的GLP-1類(lèi)似物，已 經(jīng)于2007年正式批準(zhǔn)為專(zhuān)利(該藥物同時(shí)也在中國(guó)申請(qǐng)了專(zhuān)利，公開(kāi)號(hào)CN1910201A)。Morris水迷宮檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Val (8)GLP-1保護(hù)組比STZ模型組的潛伏期短，過(guò)平 臺(tái)次數(shù)多，說(shuō)明Val(8)aP-l對(duì)于抑制AD的形成存在一定的保護(hù)作用。免疫組織檢測(cè)結(jié)果也 發(fā)現(xiàn)，Val(8)GLP-l保護(hù)組大鼠血清中AP變化不明顯、大腦皮層中的AP含量也沒(méi)有明顯增 加，表明Val(8)GLP-l具有降低Ae含量的功能，在該AD模型中發(fā)揮有一定的保護(hù)作用。根據(jù)氨基酸序列表和現(xiàn)有資料所示，GLP-1及其類(lèi)似物具有相似的功效，因此，使用GLP-1 及其其他類(lèi)似物均可達(dá)到同樣的藥理效果，區(qū)別僅在于不同的類(lèi)似物的半衰期有所差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，GLP-1及其類(lèi)似物確實(shí)具有防止AD形成的作用，均可以作為制備治 療或預(yù)防AD病的藥物應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
5下面通過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物側(cè)腦室給予Val (8) GLP-1 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)V8)，觀察V (8)對(duì)側(cè)腦室注射鏈脲 菌素(Str印tototocis， STZ)誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型的保護(hù)作用。 一、V(8)對(duì)STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)改變的保護(hù)作用經(jīng)典的Morris水迷宮檢測(cè)的是大鼠在多次訓(xùn)練中，學(xué)會(huì)尋找固定位置的隱蔽平臺(tái)，形成 穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，這種空間認(rèn)知是加工空間信息(外部線(xiàn)索)形成的。平臺(tái)的位置與大鼠 自身所處的位置和狀態(tài)無(wú)關(guān)，是一種以異我為參照點(diǎn)的參考認(rèn)知，所形成的記憶是一種空間 參考記憶。從信息的加工和提取方式來(lái)看，這種空間參考記憶進(jìn)入意識(shí)系統(tǒng)，其儲(chǔ)存的機(jī)制 主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮層有關(guān)腦區(qū)，應(yīng)該屬于陳述性記憶。而臨床健忘和癡 呆的病人正是陳述性記憶首先受損，而且比較突出，所以從檢測(cè)的記憶屬性來(lái)說(shuō)，運(yùn)用Morris 水迷宮來(lái)進(jìn)行防治此類(lèi)疾病有效藥物的篩選研究是比較恰當(dāng)?shù)?。本試?yàn)中應(yīng)用側(cè)腦室注射STZ誘導(dǎo)AD模型，試圖檢測(cè)V(8)對(duì)該模型有何干預(yù)效果，以 期待其是否具有防止AD的作用。1、 實(shí)驗(yàn)材料1) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重230 250g，數(shù)量50只，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中 心提供。動(dòng)物詞養(yǎng)環(huán)境用實(shí)驗(yàn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，排除體質(zhì) 較差大鼠兩只(食欲較差，體重明顯下降)，手術(shù)前，10只一籠飼養(yǎng)，手術(shù)后，21天內(nèi)分籠 飼養(yǎng)。2) 試劑及儀器水合氯醛，天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)；雙氧水，天津市東方華工廠(chǎng)；Morris水 迷宮，北京隆冠科技發(fā)展有限公司及中科院心理研究所研制；STZ，美國(guó)Sigma公司；腦立體 定位儀，深圳沃瑞森公司；電子秤，SART0RIAS LC;微量推進(jìn)器，深圳沃瑞森公司。2、 實(shí)驗(yàn)方法 l)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩査實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行水迷宮初篩，以測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)與記憶獲取能力，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用7 天的平均數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集和處理由Morris迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理。 嚴(yán)格按照Morris方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為兩部分第一部分，定位航行實(shí)驗(yàn)。歷時(shí)7天，從第1天起，每天分上、下午各訓(xùn)練l次。訓(xùn)練 時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(潛伏 期)，每次訓(xùn)練時(shí)間為60s。如果大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期記 為60s，每次訓(xùn)練后讓其在平臺(tái)上停留15s。第二部分，空間搜索實(shí)驗(yàn)。在第6天撤除水下平臺(tái)，隨機(jī)選取一入水點(diǎn)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在60s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)和第一次通過(guò)平臺(tái)的 時(shí)間。實(shí)驗(yàn)前1天將每只大鼠頸部染黑。實(shí)驗(yàn)前，預(yù)先在水池中注入自來(lái)水，水深30cm(水面 高出站臺(tái)表面lcm，使大鼠不能見(jiàn)到站臺(tái))，站臺(tái)位于一個(gè)象限的中央，加入奶粉使水池中水呈乳白色，水溫保持在2i士rc。在隔音、較暗的房間內(nèi)進(jìn)行，通過(guò)初篩，去除先天癡呆(潛 伏期平均值〉50s)和游泳姿勢(shì)不良者。2) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將篩查合格大鼠隨機(jī)分為三組空白對(duì)照組，模型組和V(8)保護(hù)組。每組10只，共30只。3) 實(shí)驗(yàn)前Morris水迷宮行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)操作方法同篩査，數(shù)據(jù)采集和處理由Morris迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。4) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物側(cè)腦室注射經(jīng)水迷宮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩査、適應(yīng)性訓(xùn)練后，對(duì)Wistar大鼠禁食不禁水12小時(shí)，腹腔注射 10y。水合氯醛(3ml/kg)施以麻醉。參考《大鼠腦立體定向圖譜》，將大鼠的頭固定于立體定位 儀上，剪去局部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線(xiàn)切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約1.5cm，將骨膜向兩側(cè)推開(kāi)顯露 顱骨。在前囟后l.Omm、矢狀縫側(cè)方1.5ram處鉆孔，以微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)入，深度距離腦表 面3.5mm處緩慢注入STZ。 STZ按照3 mg/kg的劑量溶解于生理鹽水中，在手術(shù)的第1和第3 天分別向兩側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射，每次每側(cè)注入約1(M1。V(8)保護(hù)組同時(shí)給予每只V(8) (3nmolA4) 5W?？瞻讓?duì)照組注射相同體積的生理鹽水。每側(cè)注入時(shí)間10min，留針5min，緩慢出針，以 防止顱壓升高過(guò)快。無(wú)菌骨蠟封閉鉆孔，術(shù)區(qū)滴注慶大霉素，縫合消毒。手術(shù)后大鼠分籠飼 養(yǎng)，給予普通伺料及自來(lái)水喂養(yǎng)。5) 手術(shù)后Morris水迷宮行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)各組大鼠分別于術(shù)后21天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)定大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，方 法同實(shí)驗(yàn)前。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白對(duì)照組、STZ模型組和V(8)保護(hù)組分別給予生理鹽水、STZ以及STZ加V(8)， 21天 后觀察潛伏期和過(guò)平臺(tái)次數(shù)兩項(xiàng)數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。由于潛伏期和過(guò)平臺(tái)次數(shù)均為非正 態(tài)分布，采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)后21天相比，空白對(duì)照組的潛伏時(shí)間無(wú)顯著差異 (P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)后STZ模型組和V(8)保護(hù)組的潛伏期明顯增加，并且有顯著性差異(P<0.05)，對(duì)實(shí)驗(yàn)后21天的三組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，三組數(shù)據(jù)間存在顯著性差異，說(shuō) 明實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)了大鼠的潛伏時(shí)間(表1)。而在大鼠過(guò)平臺(tái)次數(shù)方面，實(shí)驗(yàn)后21天三組數(shù)據(jù)的均 值都有下降，用方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)后21天的三組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)STZ模型組與空白對(duì) 照組相比有顯著性差異(P〈0.05)，與V(8)保護(hù)組相比亦有顯著性差異，而V(8)保護(hù)組和空 白對(duì)照組相比，次數(shù)略有減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。表2大鼠潛伏時(shí)間的變化(s) n=10實(shí)驗(yàn)前(s)實(shí)驗(yàn)后第21天(s)空白對(duì)照組18. 20±8. 1917. 23±6. 29STZ模型組18.34±7. 9650. 23±3. 22V(8)保護(hù)組17. 89±8. 0240. 59±4. 23*注STZ模型組與空白對(duì)照組和V(8)保護(hù)組比較，*P<0.05表3大鼠過(guò)平臺(tái)次數(shù) n=10實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后第21天空白對(duì)照組3. 18±1. 183. 12±1. 29STZ模型組3. 06±1.550. 63 ±0. 55V(8)保護(hù)組3. 13±0. 992. 86±1.03*注STZ模型組與空白對(duì)照組和V(8)保護(hù)組比本P〈0. 05STZ模型組的潛伏期比空白對(duì)照組長(zhǎng)，說(shuō)明STZ誘導(dǎo)的AD模型中存在著空間記憶能力下 降，表明該模型在行為學(xué)方面誘導(dǎo)出了AD變化。V(8)保護(hù)組比STZ模型組潛伏期短，過(guò)平臺(tái) 次數(shù)多，說(shuō)明V(8)存在一定的保護(hù)作用，但是V(8)保護(hù)組與空白對(duì)照組的潛伏期相比仍然較 長(zhǎng)，或許與V(8)的劑量或給予次數(shù)有關(guān)，需進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)。二、 V(8)對(duì)STZ誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清和腦組織A 6表達(dá)的作用AD有兩大病理特征， 一是因神經(jīng)元細(xì)胞外過(guò)多AP沉積形成SPs，另一個(gè)是因Tau蛋白 過(guò)度磷酸化誘導(dǎo)NFTs， SPs和NFTs均可引起神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致AD發(fā)病和認(rèn)知功能衰退。側(cè)腦室注射STZ誘導(dǎo)AD模型，可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)AP增加、Tau蛋白過(guò)度磷酸化。AP沉積 在AD患者的老年斑中，是各種原因誘發(fā)AD的共同途徑，也是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。1、實(shí)驗(yàn)材料l)試劑及儀器水合氯醛，天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)；雙氧水，天津市東方華工廠(chǎng)；Morris水 迷宮，北京隆冠科技發(fā)展有限公司及中科院心理研究所研制；STZ，美國(guó)Sigma公司；P淀粉樣蛋白放射免疫測(cè)定試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所；e淀粉樣蛋白免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；即用型SABC免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑，武漢博士德生物工程有限公司；腦立體定位儀，深圳沃瑞森公司；Mias-2000圖像分析儀，四川大智勝股份有限公司；SN-695B型智能放免Y-測(cè)量?jī)x，上海原子核研 究所日環(huán)儀器一廠(chǎng)；電子秤，SARTORIAS LC;微量推進(jìn)器，深圳沃瑞森公司；D-37520型低 溫高速離心機(jī)，德國(guó)Kendro公司。2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一部分。2、實(shí)驗(yàn)方法1) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩査 同第一部分。2) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 同第一部分。3) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物側(cè)腦室注射 同第一部分。4) 實(shí)驗(yàn)取材在側(cè)腦室注射STZ前，以及注射后的第7、第14及第21天，分別對(duì)各組大鼠采取斷尾 取血，靜置lh， 3000rpm/min離心20min，用移液槍移取血清，置Eppendorf管中，一20。C 冰箱內(nèi)保存待用。在第21天大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，將動(dòng)物處死，斷頭，分離大腦 皮層，以4%多聚甲醛和乙醇的固定液固定，梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋待用。5) 檢測(cè)血清AP水平 5. l)測(cè)定方法采用平衡飽和競(jìng)爭(zhēng)放射免疫法檢測(cè)，取聚苯乙烯試管編號(hào)，按下表操作表4 AP PIA加液程序(W)試劑 T NSB S。 S「S2 樣品緩沖液/200 100//標(biāo)準(zhǔn)液// /100/樣 品// //100抗血清// 1001001001251_ 0100100 100100100混勻 4°C 24hPR試劑500500 500500500充分混勻，室溫放置20min后，4。C下3500rpm/min離心20min，棄去上清液，在Y計(jì)數(shù)器上測(cè)定cpm數(shù)。5. 2)結(jié)果計(jì)算以B/T計(jì)算NSB、 S。結(jié)合百分率，以B/B。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品結(jié)合百分率，在半對(duì)數(shù) 坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并查出樣品值，或由Y計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)。 6)AP免疫組化染色6. l)載玻片防脫片處理6.1. l)將新載玻片在酸液中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水反復(fù)沖洗，蒸餾水沖洗，95%乙醇浸泡2小 時(shí)，綢布擦干。6. 1. 2)將載玻片浸入新鮮配制的1 : 50 APES丙酮液內(nèi)30秒，取出稍停片刻，再放入純 丙酮溶液中，涮去未結(jié)合的APES，自然晾干。 6. 2)免疫組織化學(xué)染色程序應(yīng)用鏈霉素 一 卵白素 一 生物素一 過(guò)氧化物酶法(SABC): 6. 2. 1)蠟塊4Wn連續(xù)切片，撈片后置于6(TC烤箱24小時(shí)。6.2.2) 二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。6.2.3) 蒸餾水新鮮配置3%過(guò)氧化氫室溫15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶反應(yīng)。蒸餾 水洗3次。6.2.4) 熱抗原修復(fù)將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸緩沖液(pH二6.0)中，電爐加熱至沸騰 后斷電，間隔10分鐘后重復(fù)一次。冷卻后以0. lmol/L PBS洗滌3次。6.2.5) 正常山羊血清封閉40分鐘，甩去多余液體，不洗。6.2.6) 滴加兔抗大鼠AP多克隆抗體1 : 50稀釋?zhuān)糜跐窈袃?nèi)，4'C下過(guò)夜，PBS洗2分 鐘X3次。6.2.7) 滴加生物素化山羊抗血清抗兔IgG， 37。C溫箱20分鐘，PBS洗2分鐘X3次。 6. 2. 8)滴加試劑SABC， 37'C溫箱20分鐘，PBS洗5分鐘X4次。 6.2.9)DAB鏡下控染，蒸餾水充分洗滌，以洗去殘余的染色劑。6.2. IO)蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。 6. 3)結(jié)果判定用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。以神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，應(yīng)用Mias-2000 圖像分析儀，每張切片的陽(yáng)性結(jié)果區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，測(cè)定一定面積內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)平均 灰度值，計(jì)算各組平均灰度值。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果i)血清Ae檢測(cè)結(jié)果對(duì)三組大鼠進(jìn)行血清Ae水平檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組、STZ模型組和V(8)保護(hù)組數(shù) 據(jù)都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但通過(guò)T檢驗(yàn)可以看出(表5)，空白對(duì)照組和V(8)保護(hù)組的變化 不顯著(P〉0. 05)，而STZ模型組的AP升高并且在第7天、第14天和第21天與實(shí)驗(yàn)前相比 均有顯著性差異(P〈0. 05),且STZ模型組的AP隨著時(shí)間的增加變化越來(lái)越明顯。V(8)保護(hù)組的血清Ae變化不明顯，表明V(8)具有降低AP含量的功能，在該AD模型中 發(fā)揮一定的保護(hù)作用。表5 各組血清AP水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前第7天第14天第21天空白對(duì)照組8.84±3.099. 14±2. 749. 09±2. 548.96±2. 58STZ模型組9. 11±2. 969.36±2. 2016. 59±3. 32*22.68±3.85*V(8)保護(hù)組9. 25±3. 039. 02±2. 419. 18±2. 299. 65±2. 79注STZ模型組AP含量第7天，14天，21天與試驗(yàn)前相比沖<0.052)腦組織Ae含量從免疫組化染色結(jié)果可以看出，在STZ模型組出現(xiàn)免疫染色陽(yáng)性神經(jīng)元，其特征是免疫陽(yáng)性部位為棕黃色，顏色深淺顯示Ae量的多寡，主要出現(xiàn)于大腦皮層，但并未出現(xiàn)由Ae沉積形成的成熟老年斑。而空白對(duì)照組和V(8)保護(hù)組基本沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性染色。圖像分析結(jié)果顯 示STZ模型組和V(8)保護(hù)組與空白對(duì)照組相比，Ae免疫染色在大鼠大腦皮層染色灰度值均 較對(duì)照組低，即A P含量增高(表6)。由于三組數(shù)據(jù)相對(duì)比較獨(dú)立，因此采用非參數(shù)體檢驗(yàn)中的Kiallis方法，假設(shè)三組數(shù)據(jù) 沒(méi)有顯著性差異，把三組數(shù)據(jù)混合后計(jì)算平均秩，得到P值小于0.05，故拒絕原假設(shè)，從平 均秩來(lái)看STZ模型組的最大，因而這組數(shù)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即STZ對(duì)照組的大腦皮層 AP含量高于空白對(duì)照組和V(8)保護(hù)組，而V(8)保護(hù)組與空白對(duì)照組相比，大腦皮層中Ae 含量沒(méi)有明顯增加，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表6 大鼠大腦皮層AP含量(灰度，空白對(duì)照組STZ模型組V(8)保護(hù)組腦組織AP含量65. 17±9. 8473. 44±10. 8*68. 07 ±13. 92注STZ模型組與空白對(duì)照組及V(8)保護(hù)組相比承P〈0. 051權(quán)利要求
1、GLP-1在制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物中的應(yīng)用。
2、 GLP-1類(lèi)似物在制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物中的應(yīng)用。
3、 GLP-1類(lèi)似物Val (S)GLP-l在制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及GLP-1及其類(lèi)似物在制備治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以GLP-1的類(lèi)似物Val(8)GLP-1進(jìn)行藥理試驗(yàn)，Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示，Val(8)GLP-1保護(hù)組比STZ模型組的潛伏期短，過(guò)平臺(tái)次數(shù)多，說(shuō)明Val(8)GLP-1對(duì)于抑制AD的形成存在一定的保護(hù)作用；免疫組織檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Val(8)GLP-1保護(hù)組大鼠血清Aβ變化不明顯、大腦皮層中的Aβ含量也沒(méi)有明顯增加，表明Val(8)GLP-1具有降低Aβ含量的功能，在該AD模型中發(fā)揮有一定的保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，GLP-1及其類(lèi)似物確有防止AD形成的作用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101607079SQ20091007455
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者張志鋒, 琳 李, 穎 高 申請(qǐng)人:琳 李