專利名稱：人胰高血糖素樣肽-2二串體蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人胰高血糖素樣肽-2 (GLP-2)的二串體蛋白及其構(gòu)建方法、制備方法，以及該二串體蛋白的表達(dá)、純化及鑒定、在體外的生物學(xué)活性檢測(cè)等方面。
背景技術(shù)：
胰高血糖素樣肽-2 (glucagon-like peptide-2, GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon, PG)衍生肽類(P⑶P)之一,為PG轉(zhuǎn)錄、翻譯后處理加工的含33個(gè)氨基酸的多肽，其氨基酸殘基序列為:HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。PG在胰腺A細(xì)胞和腸道L細(xì)胞都有表達(dá)，但其表達(dá)產(chǎn)物卻因?yàn)榻M織特異性的加工修飾而不同。在胰腺主要產(chǎn)生胰高血糖素，而在腸道內(nèi)主要產(chǎn)生P⑶P (1-160個(gè)氨基酸)，P⑶P主要包括GLP-l、GLP-2、腸高血糖素、胃泌酸調(diào)節(jié)素等，而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。GLP-2和GLP-1 —樣由小腸和大腸的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，GLP-2的生物學(xué)活性包括:促進(jìn)小腸和大腸粘膜生長(zhǎng)、抑制腸和隱窩細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腸內(nèi)葡萄糖運(yùn)輸和GLUT-2表達(dá)、增加營養(yǎng)吸收、抑制胃排空和胃酸分泌、降低腸通透性、增高腸血流量等。除此之外，GLP-2還可促進(jìn)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和抑制骨吸收。鑒于GLP-2的上述生物學(xué)活性，其被開發(fā)用于短腸綜合征、腸型放射病等疾病的治療。值得注意的是，GLP-2只有以完整形式(1-33)存在時(shí)才有生物學(xué)活性，其在體內(nèi)的半衰期只有7min，可被二肽激酶4 (DPP4，又稱為T細(xì)胞表面抗原⑶26、DPPIV等)通過識(shí)別并水解N末端的Ala而成為無活性的GLP-2 (3-33)，并經(jīng)由腎臟排出。GLP-2通過其特異性受體GLP-2R來發(fā)揮作用，GLP-2R下游的分子機(jī)制涉及多條信號(hào)通路，目前還沒有完全明確。1GLP-2的生成和降解

GLP-2是胰高血糖素原(PG)基因的表達(dá)產(chǎn)物，是胰高血糖素原衍生肽類(P⑶P)之一。PG基因在胰腺A細(xì)胞和腸道L細(xì)胞都有表達(dá)，但其表達(dá)產(chǎn)物卻因?yàn)榻M織特異性的加工修飾而不同。在胰腺主要產(chǎn)生胰高血糖素，而在腸道內(nèi)主要產(chǎn)生P⑶P(l_160個(gè)氨基酸)，P⑶P主要包括GLP-1、GLP-2、腸高血糖素、胃泌酸調(diào)節(jié)素等，而GLP-2定位于第126-158位
氨基酸。GLP-2在各種哺乳動(dòng)物中比較保守，僅個(gè)別氨基酸有差異。GLP-2主要由腸道L內(nèi)分泌細(xì)胞合成和分泌，而且受攝食、疾病引起的腸粘膜病例損傷影響。GLP-2只有以完整形式(1-33)存在時(shí)才有生物學(xué)活性，其在體內(nèi)的半衰期只有7min，可被DPP4(⑶26)通過識(shí)別并水解N末端的Ala而成為無活性的GLP-2 (3-33)，并經(jīng)由腎臟排出。2GLP-2在腸道內(nèi)的生物學(xué)功能1971年Dowling等報(bào)導(dǎo)一位患有胰高血糖素瘤的婦女同時(shí)表現(xiàn)出小腸腫大，而腫瘤切除后小腸的異常腫大隨之消失。十年之后，第二例胰高血糖素瘤伴有絨毛異常增生的病例才報(bào)導(dǎo)出來。據(jù)報(bào)道腸絨毛異常增生和胰高血糖素瘤的關(guān)系可以被CT檢測(cè)到。這些病例使得人們對(duì)于PGDP分泌的增高及其對(duì)腸道疾病相關(guān)腸損傷的反應(yīng)產(chǎn)生了濃厚的興趣。盡管一系列實(shí)驗(yàn)證明PG基因和P⑶P的分泌升高有關(guān)，但P⑶P種類較多，具體是哪個(gè)特異因子發(fā)揮作用一直沒有確定。直到有人報(bào)道在PGDP中，GLP-2具有促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖的作用，對(duì)于GLP-2的研究才拉開了序幕。研究表明外源性GLP-2能促進(jìn)小腸的生長(zhǎng)。在體研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2可通過增加腸上皮層的細(xì)胞數(shù)量來顯著增加模型動(dòng)物的腸重量，其機(jī)制是GLP-2可刺激腸隱窩上皮細(xì)胞增殖并抑制隱窩和絨毛細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致隱窩-絨毛高度增高引起的。最終，外源性GLP-2可以增加粘膜的功能表面區(qū)域。GLP-2對(duì)腸的顯著作用在臨床試驗(yàn)中也得到了證實(shí)。短腸綜合癥(SBS)的受試者服用六個(gè)星期的GLP-2或者三個(gè)星期的GLP-2類似物(Teduglutide)(0.03-0.15mg/kg/day)可增加隱窩-絨毛高度和有絲分裂指數(shù)并且提高腸內(nèi)營養(yǎng)的吸收。相似的，給SBS患者服用20-24周的Teduglutide (0.05mg/kg/day)可以減少20-63%的腸道外營養(yǎng)。另一項(xiàng)研究表示通過評(píng)估血液中瓜氨酸的濃度，證明Teduglutide (0.05-0.2mg/kg/day)同樣可以增加Crohn’ s綜合癥患者的腸粘膜重量和高度。有趣的是，相比外源性GLP-2對(duì)腸的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的作用，內(nèi)源性GLP-2的作用比較溫和。通過應(yīng)用GLP-2R的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(例如GLP-2的代謝物GLP-23-33)或GLP-2R敲除小鼠，內(nèi)源性GLP-2的重要性已被證實(shí)。GLP-23-33在低濃度時(shí)是GLP-2的競(jìng)爭(zhēng)劑，高濃度時(shí)是部分抑制劑。服用GLP-23-3324小時(shí)或者4周均可降低小腸重量和隱窩_絨毛高度。最近GLP-2促進(jìn)腸功能的信號(hào)通路備受關(guān)注。研究表明GLP-2其可以⑶36依賴性的方式升高小鼠和倉鼠血液中甘油三酯和膽固醇水平，促進(jìn)腸apoB48分泌。在⑶36缺陷小鼠中，GLP-2對(duì)腸脂類吸收的功能有所降低。這說明GLP-2具有CD36依賴性的促進(jìn)腸內(nèi)脂類吸收的功能。另有研究表明，GLP-2可增加豬和人腸系膜血流量，這是又一個(gè)有利于消化和營養(yǎng)吸收的機(jī)制。由于GLP-2對(duì)胃腸道的諸多有利效用，Teduglutide已進(jìn)入臨床試驗(yàn)用于治療克羅恩病(II期)和短腸綜合癥(In期)(http://www.npsp.com)。與其它生長(zhǎng)因子不同的是，GLP-2 的促生長(zhǎng)作用具有器官特異性(僅限于胃腸道)，因此受到廣泛關(guān)注。然而，在推廣應(yīng)用前，對(duì)于GLP-2的作用機(jī)制還有待于更深入的研究。3GLP-2作用機(jī)制GLP-2通過結(jié)合GLP-2R來發(fā)揮生物學(xué)作用。GLP-2R屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其編碼基因位于人染色體17pl3.3。它主要分布在胃腸道，在肺和下丘腦也有少量分布。雖然GLP-2對(duì)腸道的功能已經(jīng)確證，但由于腸上皮細(xì)胞不表達(dá)GLP-2R，故其作用機(jī)制仍不甚明了。GLP-2R在腸上皮下的成纖維細(xì)胞(ISEMF)表達(dá)，由此可以推測(cè)GLP-2通過GLP-2R+細(xì)胞ISEMF分泌的下游因子間接的發(fā)揮其對(duì)腸道的作用。雖然目前用于機(jī)制研究的細(xì)胞模型還不多，但GLP-2通過旁分泌因子發(fā)揮間接作用已經(jīng)初步明確。研究表明角質(zhì)化生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮NOS分別是GLP-2誘導(dǎo)結(jié)腸生長(zhǎng)和提高腸血流量的介導(dǎo)因子。最近更多的研究則集中在胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)、ErbB網(wǎng)絡(luò)和血管活性腸肽方面。IGFs (包括IGF-1和IGF-2)是能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的致有絲分裂多肽因子。IGFs有許多和GLP-2相似的功能。IGF-1基因敲除小鼠給于GLP-2處理，并沒有表現(xiàn)出促隱窩細(xì)胞增殖、隱窩-絨毛長(zhǎng)度和重量增加的反應(yīng)，說明IGF-1在GLP-2促進(jìn)小腸和大腸生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。而IGF-2的作用相對(duì)較弱，只對(duì)粘膜表面有影響。進(jìn)一步研究表明，GLP-2可提高小鼠腸內(nèi)IGF-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。Nelson等證明粘膜生長(zhǎng)不僅依賴于IGF-1mRNA水平，而且還會(huì)受到GLP-23-33的抑制。然而，IGF-1在許多組織中都會(huì)產(chǎn)生，除了腸道外，在血液循環(huán)中也有。因此，需要更深入地探討與GLP-2協(xié)同作用的IGF-1是否來源于腸道，如果是，源于哪種細(xì)胞？除了 IGFs，ErbB配體作為GLP-2促腸作用的下游因子最近逐漸引起人們的關(guān)注。ErbB網(wǎng)絡(luò)是一種能維持腸粘膜生長(zhǎng)和功能的強(qiáng)效的增殖系統(tǒng)。用GLP-2處理小鼠I小時(shí)和4小時(shí)之后，小腸中ErbB配體的外調(diào)蛋白和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白有所上調(diào)。相似的，給予GLP-2或者EGF可以提高ErbB配體、雙調(diào)蛋白、外調(diào)蛋白等mRNA的水平，也可以激活c_fos、egr-1這些立早基因。此外，通過利用ErbB的抑制劑，證明ErbB受體在GLP-2促進(jìn)腸增殖和生長(zhǎng)中是必須的。最近，又有實(shí)驗(yàn)表明給予EGF可以使GLP-2R敲除小鼠腸得到重新生長(zhǎng)。與此相反，也有人利用ErbB受體抑制劑gefitinib證明GLP-2增加腸重量和隱窩-絨毛高度的功能與ErbB信號(hào)無關(guān)。目前還不知道如何協(xié)調(diào)關(guān)于ErbB相關(guān)的發(fā)現(xiàn)和IGF-1-1EC-1GF-1R這條通路。有研究表明，培養(yǎng)腸上皮下的成纖維細(xì)胞(ISEMF)時(shí)給予GLP-2可以升高IGF-1的轉(zhuǎn)錄水平，而不能提高ErbB配體轉(zhuǎn)錄，這提示ErbB位于IGF-1下游。與此相反，外源性EGF可以使GLP-2R基因敲除小鼠腸得到重新生長(zhǎng)，而IGF-1卻不行，這又暗示IGF-1系統(tǒng)是EGF/ErbB的下游信號(hào)。盡管如此，IGF-1R與ErbB受體有互動(dòng)關(guān)系已經(jīng)得到驗(yàn)證，說明這兩個(gè)信號(hào)通路可以相互調(diào)節(jié)。通過研究其它的細(xì)胞模型也證明了這兩個(gè)通路是相互依賴的。為了說明IGF-1R和ErbB在GLP-2腸促作用中的關(guān)系，還需要更多特異性的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)。最后，聯(lián)系到粘膜下層腸神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)GLP-2R，最近有研究發(fā)現(xiàn)GLP-2可以通過刺激產(chǎn)生VIP的神經(jīng)來降低腸炎和損傷。在許多有腸炎的大鼠和小鼠模型中，給予GLP-2可降低炎癥因子(IFN-Y、TNF-a、IL_li3)的水平，并且可以促進(jìn)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，與此同時(shí)增加小腸粘膜層表達(dá)VIP的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。與正常腸道中GLP-2可以促進(jìn)有絲分裂的作用形成對(duì)比，Sigalet等觀察到，在炎癥模型中，GLP-2介導(dǎo)降低腸上皮的增殖速率，使炎癥向正常轉(zhuǎn)化。GLP-2或VIP處理都能提高腸重量的損失并且減少腸道損傷。另外，VIP競(jìng)爭(zhēng)劑可以阻止GLP-2的抗炎作用。通過對(duì)IL-10無效的小鼠模型的研究證明GLP-2通過一種依賴IL-10的機(jī)制發(fā)揮降低粘膜炎癥和隱窩細(xì)胞增殖的功能。雖然VIP在GLP-2降低腸道炎癥疾病中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制仍不清楚。總之，GLP-2對(duì)腸的作用機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種下游因子(例如eNOS、ErbB配體、IGF-UKGF和VIP)，這些因子都具有細(xì)胞特異性并且依賴生物的生理或病理狀態(tài)。雖然利用動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)來了解GLP-2的下游因子已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但是這些研究并不能為GLP-2R的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制提供信息。所以又有許多不同的細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)GLP-2R信號(hào)。與其它的B族G蛋白偶聯(lián)受體一樣，配體結(jié)合異種細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)染的GLP-2R可以導(dǎo)致cAMP劑量依賴性的升高并且激活PKA、cAMP反應(yīng)元件蛋白和AP-1。此外，GLP-2對(duì)轉(zhuǎn)染了 GLP-2R的細(xì)胞有一種PKA依賴的促增殖作用，并且可以通過抑制糖原合酶kinase-3 β和Bcl_2相關(guān)的死亡啟動(dòng)子來抑制凋亡。不過，利用異種和同種細(xì)胞模型得到的結(jié)果并不完全一致。雖然原代培養(yǎng)的小鼠粘膜細(xì)胞，腸肌肉細(xì)胞和新生小鼠內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過GLP-2處理后cAMP水平均增高；但原代ISEMF細(xì)胞中，GLP-2對(duì)cAMP_PKA_CREB途徑并沒有影響；與此相似的，HeLa細(xì)胞經(jīng)GLP-2處理后cAMP水平也無變化。此外，令人意外的是，在ISEMF細(xì)胞中GLP-2調(diào)節(jié)IGF-1的轉(zhuǎn)錄依賴于(PI3K)Akt，而此前并沒有發(fā)現(xiàn)該途徑和GLP-2R的激活相關(guān)。事實(shí)上，雖然GLP-2同樣激活I(lǐng)EC中的PI3K/Akt信號(hào)，但被推測(cè)并不是因?yàn)镚LP-2R的直接信號(hào)，IGF-1R和ErbB受體都能刺激IEC細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)證實(shí)了這個(gè)假設(shè)。與此相似，雖然經(jīng)典的cWnt/ β -catenin信號(hào)通路最近被證實(shí)與GLP-2對(duì)體內(nèi)隱窩細(xì)胞的影響有關(guān)，但有可能通過IEC-1GF-1R間接作用，而不是直接和GLP-2R相關(guān)。這個(gè)想法同樣被PI3K/Akt信號(hào)通過Ser的磷酸化激活腸干細(xì)胞的β -catenin和祖細(xì)胞得到了證實(shí)。因此，雖然GLP-2可以激活I(lǐng)EC細(xì)胞中的多條信號(hào)通路，但目前在腸內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)ISEMF細(xì)胞表達(dá)GLP-2R。腸神經(jīng)細(xì)胞或內(nèi)分泌細(xì)胞中關(guān)于GLP-2激活的信號(hào)通路仍未見報(bào)道。4GLP-2研究中存在的問題雖然GLP-2的腸道特異性使得其比IGF-1等其它生長(zhǎng)因子具有更大優(yōu)勢(shì)，但是和其它生長(zhǎng)因子一樣，GLP-2促進(jìn)腫瘤形成的影響也不容忽視。Thulesen等用GLP-2喂養(yǎng)用1，2-DMH誘發(fā)腫瘤的小鼠，發(fā)現(xiàn)GLP-2組與對(duì)照組的生存率無顯著差異，但GLP-2組腫瘤體積更大。Iakoubov等利用azoxymethane在小鼠中誘導(dǎo)腫瘤模型并研究GLP-2的促癌變作用，發(fā)現(xiàn)GLP-2類似物可以增加異常隱窩的聚集并導(dǎo)致小鼠惡性腫瘤的形成，而GLP-2R拮抗劑，GLP-2(3-33)可以減少異常隱窩的聚集。上述實(shí)驗(yàn)預(yù)示著GLP-2可以促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展。雖然機(jī)制還不明確，但可能與cfct和PI3K/Akt途徑有關(guān)。與此相反，也有體內(nèi)與體外試驗(yàn)表明GLP-2不能促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展。Koehler等用人GLP-2R轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系并研究GLP-2的促增殖和抑凋亡作用，不管是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是裸鼠移植瘤模型中，都沒有發(fā)現(xiàn)GLP-2的作·用。Bengine等利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究30種結(jié)腸癌相關(guān)的腫瘤中GLP-2R的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)只有在正常的粘膜細(xì)胞中有表達(dá)。因此，雖然GLP-2和其類似物在治療腸道疾病時(shí)功效顯著，但其致癌性還存在爭(zhēng)議，仍然需要更深入的調(diào)查研究才能確認(rèn)其安全性。GLP-2是一種腸上皮特異性因子，在治療腸道疾病時(shí)作用明顯，目前GLP-2類似物Teduglutide治療短腸綜合癥已經(jīng)進(jìn)入了 III期臨床試驗(yàn)。但是關(guān)于GLP-2發(fā)揮作用的分子機(jī)制還不清楚，這也是目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，關(guān)于GLP-2促癌作用的爭(zhēng)議也會(huì)影響GLP-2及其類似物進(jìn)入臨床應(yīng)用。因此，只有明晰GLP-2作用的分子機(jī)制，才能避免GLP-2治療腸道疾病時(shí)潛在的安全隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將無法在大腸桿菌中直接表達(dá)的人胰高血糖素樣肽-2以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)，并且提供一種人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白的制備方法，此方法制備的人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白具有生物學(xué)活性，促進(jìn)Caco-2細(xì)胞(人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞)的增殖，活性優(yōu)于化學(xué)合成的單體，為其廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的之一是提供一種重組的、分離的或合成的二串體蛋白，該二串體蛋白由兩個(gè)人胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)通過連接肽連接獲得。本發(fā)明對(duì)GLP-2的氨基酸序列進(jìn)行了優(yōu)化，用Gly代替第二位氨基酸(Ala)后，再用連接肽將突變序列進(jìn)行串聯(lián)設(shè)計(jì)，獲得的GLP-2 二串體蛋白既能保持生物學(xué)活性，又可延長(zhǎng)體內(nèi)或體外的半衰期。所述的二串體蛋白，其特征在于，所述連接肽為Gly-Ser。所述的二串體蛋白，其中所述人胰高血糖素樣肽-2的基因序列為I) 6)中任一種:I) SEQ ID NO:1 所示的序列；
2) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:1所示序列所編碼的多肽相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的保守替代的多肽；3)與SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列；4)與SEQ ID NO:1所示序列互補(bǔ)的序列；5)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而衍生自SEQ ID NO:1所示序列的序列之一。6)編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。所述的二串體蛋白，其中所述二串體蛋白為以下任一種:I)其編碼基因序列為SEQ ID NO:2所不的序列；2)SEQ ID NO:2所不序列編碼的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加而衍生的多肽。所述的_二串體蛋白，其中所述一串體蛋白的氣基酸序列為SEQ ID N0:3所不。所述的二串體蛋白，其中所述二串體蛋白的基因序列為以下a) f)中任一種:a) SEQ IDNO:3 所示的序列；b) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的保守替代的多肽；c)與SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列；d)與SEQ ID NO:3所示序列互補(bǔ)的序列；e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而衍生自SEQ ID NO:3所示序列的序列之一；f)編碼SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的基因序列。所述二串體蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:4所示。本發(fā)明的目的之一是提供含有上述任一二串體蛋白的表達(dá)載體或表達(dá)盒；或提供含有上述任一二串體蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。本發(fā)明的目的之一是提供一種二串體蛋白的制備方法，該方法的步驟包括:I)將上述任一所述二串體蛋白、或上述表達(dá)載體或表達(dá)盒、或上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒進(jìn)行重組表達(dá),獲得重組表達(dá)產(chǎn)物；2)純化重組表達(dá)產(chǎn)物，獲得所述二串體蛋白。本發(fā)明的目的之一是提供上述任一二串體蛋白在制備預(yù)防或治療腸道疾病的藥物中的應(yīng)用；其中所述腸道疾病為短腸綜合征、腸型放射病、結(jié)腸癌、Crohn' s綜合癥、腸道炎、或克羅恩病。本發(fā)明的目的之一是提供上述任一二串體蛋白在制備促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之一是提供一種供有腸道吸收障礙的病人口服食用的組合物，其包含上述任一所述二串體蛋白，該組合物可以是食品、食品添加劑或保健品等。本發(fā)明還提供了上述任一二串體蛋白在制備促進(jìn)消化或營養(yǎng)吸收的食品或保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明之所以采用連接肽Gly-Ser (編碼基因GCATCC)，一方面，GAATTC為BamHI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，有利于后期的基因克隆等的操作；另一方面，GAATTC翻譯后為兩個(gè)小的氨基酸殘基=Gly-Ser,可以作為柔性臂，不影響兩個(gè)單體肽的各自折疊成為正確的空間構(gòu)象；此外，體內(nèi)的生物活性分子大多采用的是二聚化以后與相應(yīng)的受體結(jié)合激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮生物學(xué)效用，因此將兩個(gè)多肽連接為二串體，可以使其模擬二聚體效果而發(fā)揮更高的生物學(xué)活性；二串體蛋白分子量相對(duì)較大，容易在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)其原核表達(dá)，大大方便了其制備；二串體蛋白分子量較大，在生物體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，可以有效的延長(zhǎng)其作用時(shí)間，相對(duì)于單體而言具有更好的成藥性。本發(fā)明制備的GLP-2 二串體蛋白的編碼基因在大腸桿菌中獲得了高水平表達(dá)，經(jīng)過硫酸銨鹽析和離子交換柱層析即可獲得純化的重組蛋白樣品，純化的GLP-2 二串體對(duì)Caco-2細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)增殖效果，其生物學(xué)活性優(yōu)于化學(xué)合成單體。該發(fā)明克服了單體GLP-2無法原核表達(dá)的缺陷，經(jīng)過簡(jiǎn)單的技術(shù)即可制備大量的高活性GLP-2串聯(lián)體，為下一步短腸綜合征和腸型放射病等動(dòng)物模型治療研究奠定一定的基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:利用大腸桿菌偏愛密碼子，合成人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因，構(gòu)建人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因表達(dá)載體pET-22b (+) -GLP-2②，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鹽析和離子交換作用層析純化重組蛋白，最終獲得了高純度的人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白，并采用Western blot和HPLC對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過Caco-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定其活性，結(jié)果表明，人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白可促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的增殖，其促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖的能力高于化學(xué)合成的單體。具體內(nèi)容如下:1.合成[Gly-2]GLP_2②基因序列由文獻(xiàn)可知，人體內(nèi)的GLP-2容易被二酰肽酶IV (DPPIV)水解氨基末端的前兩個(gè)氨基酸而失去活性，DPPIV的作用位點(diǎn)是GLP-2氨基末端第二位的丙氨酸殘基，如果用甘氨酸殘基取代后形成[Gly2]GLP-2，則能抵抗DPPIV的水解，從而延長(zhǎng)GLP-2的半衰期。優(yōu)化后的[Gly2]GLP-2 的氨基酸序列為 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO:2)。依據(jù)大腸桿菌偏愛 密碼子，將優(yōu)化后的[Gly-2]GLP-2的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為基因序列，兩個(gè)重復(fù)基因之間用GGATCC (BamH I酶切位點(diǎn)，翻譯后為GS)作為柔性臂串聯(lián)，5’端引入保護(hù)堿基AG和Nde I酶切位點(diǎn)CATATG，3’端引入終止密碼子TAA和Sal I酶切位點(diǎn)GTCGAC，合成目的基因?yàn)閇Gly-2]GLP-2②。2.構(gòu)建人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因表達(dá)載體pET_22b (+) -GLP-2②以Nde I和Sal I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化pET22b載體，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切大片段，以Nde I和Sal I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶消化合成的含[Gly_2]GLP_2②基因的載體，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切小片段，回收的pET-22b大片段和回收的[Gly-2]GLP-2②小片段用T4連接酶在16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂板、培養(yǎng)，挑取單克隆，進(jìn)行酶切鑒定。候選克隆進(jìn)行質(zhì)粒序列測(cè)定，得到含有目的基因片段的陽性克隆，稱為pET22b-[Gly-2]GLP-2②。3.人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白的表達(dá)、純化構(gòu)建好的pET22b-[Gly-2]GLP_2②轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)并進(jìn)行酶切鑒定，陽性克隆命名為pET22b-[Gly-2]GLP-2②/BL21。陽性克隆培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期經(jīng)ImM IPTG誘導(dǎo)4h后收集菌體。超聲裂菌后的上清經(jīng)(NH4) 2S04鹽析和離子交換作用層析進(jìn)行純化。4.人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白的鑒定
用免疫印跡的分析純化產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性，用HPLC鑒定純化產(chǎn)物的純度。5.人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白體外生物學(xué)活性檢測(cè)用MTT法檢測(cè)人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白在體外對(duì)于Caco-2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。


圖1是重組質(zhì)粒pET-22b (+)-GLP-2②的酶切鑒定圖，圖中M:DNA marker ;1，2:pET-22b (+) -GLP-2 ② /Nde I 和 Sal I 雙酶切。圖2是pET_22b (+) -GLP-2②的質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果圖。圖3是目的蛋白質(zhì)經(jīng)過陰離子柱層析分離的色譜圖，O:穿過峰；1，2:雜蛋白洗脫峰；3:目的蛋白洗脫峰。圖4是人GLP-2 二串體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化結(jié)果，圖中M:蛋白質(zhì)分子量 marker ;1:未誘導(dǎo) pET_22b (+)-GLP-2 ② /BL21 菌體總蛋白；2:1mM IPTG 誘導(dǎo)pET-22b(+)-GLP-2②/BL214h后菌體總蛋白；3:超聲裂菌上清；4:25%硫酸銨鹽析上清；5:30%硫酸銨鹽析沉淀；6:陰離子交換層析洗脫峰I ;7:陰離子交換層析洗脫峰2 ;8:陰離子交換層析洗脫峰3 (目的蛋白)圖5是人GLP-2 二串體蛋白的免疫印跡鑒定，1:未誘導(dǎo)菌體總蛋白；2 =ImMEDTA誘導(dǎo)4h后囷體總蛋白。圖6是人GLP-2 二串體蛋白的HPLC鑒定結(jié)果；圖7是用MTT法 測(cè)定人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的影響。
具體實(shí)施例方式下面將通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的描述。按照本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:利用大腸桿菌偏愛密碼子，合成人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因，構(gòu)建人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因表達(dá)載體pET-22b (+)-GLP-2②，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鹽析和離子交換作用層析純化重組蛋白，最終獲得了高純度的人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白，并采用Western blot和HPLC對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過Caco-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白可促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的增殖，其促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖的能力高于化學(xué)合成的單體。實(shí)現(xiàn)上述人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行:1.合成[Gly-2]GLP_2②基因序列由文獻(xiàn)可知，人體內(nèi)的GLP-2容易被二酰肽酶IV (DPPIV)水解氨基末端的前兩個(gè)氨基酸而失去活性，DPPIV的作用位點(diǎn)是GLP-2氨基末端第二位的丙氨酸殘基，如果用甘氨酸殘基取代后形成[Gly2]GLP-2，則能抵抗DPPIV的水解，從而延長(zhǎng)GLP-2的半衰期并增高其活性。優(yōu)化后的[Gly2]GLP-2 的氨基酸序列為 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (SEQ ID NO:2)。依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子，將優(yōu)化后的[Gly-2]GLP-2的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為基因序列，兩段重復(fù)的基因序列用GGATCC (對(duì)應(yīng)GS)串聯(lián)，5’端引入保護(hù)堿基AG和Nde I酶切位點(diǎn)CATATG，3’端引入終止密碼子TAA和SalI酶切位點(diǎn)GTCGAC，合成目的基因[Gly_2]GLP-2②。合成的基因序列如下:5，-AGCATATGCATGGCGATGGCAGCTTTAGCGATGAAATGAACACCATTCTGNde I 起始碼GATAACCTGGCGGCGCGCGATTTTATTAACTGGCTG ATTCAGACCAAAATTACCGATGGATCCCATGGCGATGGCAGCTTTAGCGATGAAATGAACACCATTlinkerCTGGATAACCTGGCGGCGCGCGATTTTATTAACTGGCTGATTCA GACCAAAATTACCGATTAAGTCGAC (SEQ ID NO:5)終止碼SalI2.構(gòu)建人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因表達(dá)載體pET_22b (+) -GLP-2②用Nde I和Sal I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切pET22b載體，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切大片段，再用Nde I和Sal I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切合成的含有[Gly_2]GLP_2②基因的pGH-GLP-2②質(zhì)粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切小片段，將回收的大、小片段用T4連接酶在16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期的大、小片段(圖1)。DNA測(cè)序結(jié)果顯示合成的[Gly-2]GLP-2②基因成功的連接到了 pET-22b載體上面(圖2)。將此質(zhì)粒命名為pET-22b (+)-GLP-2②。3.人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白的表達(dá)、純化重組質(zhì)粒pET-22b(+)-GLP_2②轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，12h后挑取邊緣整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，搖床37°C培養(yǎng)過夜，次日以1: 100的比例接種于新鮮LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100mg/L)中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到OD6tltl = 0.4 0.6，加入終濃度ImM IPTG，誘導(dǎo)4h后收集菌體。按Ig 菌體加 IOml 裂菌緩沖液 STE(20mM Tris-HCl pH 7.5, IOOmM NaCl, ImMEDTA)的比例將菌體重懸，在冰浴中300W超聲裂解菌體30min，工作5秒，間隙10秒。離心(12000rpmX20min，4°C )，收集超聲上清，冰浴中邊攪拌邊加研磨細(xì)的固體(NH4)#04至25%飽和度，加完后繼續(xù)攪拌30min，之后4°C靜置lh，離心(12000rpmX 20min，4°C )，收集上清。上清再邊攪拌邊加研磨細(xì)的固體(NH4)2SO4至30%飽和度，加完后繼續(xù)攪拌30mim，之后4°C靜置lh，離心(12000rpmX20min，4°C )，收集沉淀。用同上清體積相同的A液:20mM Tris-HCl pH 7.5，ImM EDTA重新溶解沉淀，然后對(duì)30倍體積A液透析，中間換液三到四次，透析后液體過0.22 μ m的濾膜,然后用經(jīng)A液充分平衡的Q Sepharose FastFlow (Pharmacia 公司)層析純化，用 B 液:20mM Tris-HCl pH 7.5，IM NaCl, ImM EDTA 連續(xù)梯度洗脫6個(gè)柱床體積，收集目的蛋白所在洗脫峰進(jìn)行分析(圖3)。將其對(duì)30倍體積PBS透析，用0.22 μ m濾膜過濾除菌,分裝后-20°C保存?zhèn)溆谩?.人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白鑒定I) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳取20μ I待鑒定樣品加入20yL 2 X載樣緩沖液混勻，沸水中煮lOmin，離心(12000rpmX10min)，取10 μ I上清進(jìn)行15% SDS-PAGE，上樣后電壓為30V約lh，樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至60V約4h，用 0.5 %考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2h，脫色直至背景清洗后進(jìn)行膠的保存(圖4)。2) Western-Blot 檢測(cè)產(chǎn)物在SDS-PAGE結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇)中1OOV恒壓電泳lh，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出PVDF膜，洗滌液TBST(20mM Tris-HCl，ρΗ7.5、150mM NaCl.0.05% Tween-20)清洗后浸入封閉液(含 5%脫脂奶粉的TBST)中4°C封閉過夜。次日，TBST室溫洗膜3次，每次5min ;加入兔抗人胰高血糖素樣肽-2單克隆抗體(1: 1600稀釋)，室溫孵育1h ；TBST室溫洗3次，每次5min ;再加入HRP標(biāo)記山羊抗兔1gG 二抗(I: 5000)，室溫孵育1h ；TBST室溫洗3次，每次5min ;最后用 TBST 和 TBS (20mM Tris-HCl，ρΗ7.5、150mM NaCl)各洗 3 次，每次 5min ;PVDF 膜按照 ECL產(chǎn)品說明書進(jìn)行顯色。(圖5).
3) HPLC純度鑒定用流動(dòng)相(50mMTris-HCl 1mM EDTA pH 7.5)平衡 TSK-Gel G3000SW 色譜柱至基線平穩(wěn)，流速為0.8ml/min,取20 μ I蛋白樣品上樣，用流動(dòng)相洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，記錄并分析結(jié)果(圖6)。4)GLP_2②生物學(xué)活性測(cè)定運(yùn)用MTT法測(cè)定GLP-2②對(duì)于Caco_2細(xì)胞的促進(jìn)增值作用。首先，將Caco_2細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)基(含有10 % FBS和非必需氨基酸等)，調(diào)節(jié)至5 X 1O4個(gè)/mL，將細(xì)胞以1OOuL/孔加入96孔板中。然后37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，加入用DMEM培養(yǎng)基稀釋的GLP-2②lOOuL，設(shè)定化學(xué)合成的單體GLP-2作為陽性對(duì)照，DMEM培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)18/36/72小時(shí)，然后每孔加入20uL的MTT (5mg/mL)，孵育4小時(shí)。棄去上清，每孔加入150uL的DMSO并室溫孵育30分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處光吸收值并計(jì)算活細(xì)胞的比例。本發(fā)明的效果如下:a)利用基因人工合成技術(shù)成功構(gòu)建了人胰高血糖素樣肽-2 二串體基因表達(dá)載體pET-22b (+) -GLP-2②，其酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。b)工程菌pET-22b (+) -GLP-2②/BL21經(jīng)ImM IPTG誘導(dǎo)后便可高效表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)后菌體的超聲裂解上清經(jīng)鹽析和離子交換作用層析，可得到純度大于95%的目的蛋白。c)采用免疫印跡證明人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白可與兔抗人胰高血糖素樣肽-2單克隆抗體特異性結(jié)合，HPLC分析結(jié)果表明制備的人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白純度可達(dá)95%以上。d)純化的人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品人胰高血糖素樣肽-2均可促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖，二串體的活性高于化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)品。序列表SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)<120>人胰高血糖素樣肽-2 二串體蛋白及其制備方法<130>2012<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1
<211>99<212>DNA〈213〉人工序列<400>1catggcgatg gcagctttag cgatgaaatg aacaccattc tggataacct ggcggcgcgc 60gattttatta actggctgat tcagaccaaa attaccgat99<210>2<211>33<212>PRT〈213〉人工序列<400>2His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp AsnI51015`
Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys He Thr202530Asp<210>3<211>207<212>DNA〈213〉人工序列<400>3atgcatggcg atggcagctt tagcgatgaa atgaacacca ttctggataa cctggcggcg 60cgcgatttta ttaactggct gattcagacc aaaattaccg atggatccca tggcgatggc 120agctttagcg atgaaatgaa caccattctg gataacctgg cggcgcgcga ttttattaac 180tggctgattc agaccaaaat taccg`at 207<210>4<211>69<212>PRT〈213〉人工序列<400>4Met His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp151015Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys Ile202530Thr Asp Gly Ser His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr354045He Leu Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln505560Thr Lys He Thr Asp
65<210>5<211>221<212>DNA〈213〉人工序列〈400>5agcatatgca tggcgatggc agctttagcg atgaaatgaa caccattctg gataacctgg 60cggcgcgcga ttttattaac tggctgattc agaccaaaat taccgatgga tcccatggcg 120atggcagctt tagcgatgaa atgaacacca ttctggataa cctggcggcg cgcgatttta 180
ttaactggct gattcagacc aaaattaccg attaagtcga c22權(quán)利要求
1.重組的、分離的或合成的二串體蛋白，其由兩個(gè)人胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)通過連接肽連接獲得。
2.權(quán)利要求1所述的二串體蛋白，其中所述人胰高血糖素樣肽-2的基因序列為I) 6)中任一種: 1)SEQ IDNO:1所示的序列； 2)DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:1所示序列所編碼的多肽相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的保守替代的多肽； 3)與SEQID NO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列； 4)與SEQID NO:1所示序列互補(bǔ)的序列； 5)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而衍生自SEQID NO:1所示序列的序列之一； 6)編碼SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。
3.權(quán)利要求2所述的二串體蛋白，其特征在于，所述連接肽為Gly-Ser。
4.權(quán)利要求1所述的二串體蛋白，其中所述二串體蛋白的基因序列為a) f)中任一種: a)SEQ ID NO:3所不的序列； b)DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的保守替代的多 肽； c)與SEQID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其酶活性片段的序列； d)與SEQID NO:3所示序列互補(bǔ)的序列； e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而衍生自SEQID NO:3所示序列的序列之一； f)編碼SEQID NO:4所示氨基酸序列的基因序列。
5.權(quán)利要求1所述的_■串體蛋白，其中所述_■串體蛋白的氣基酸序列為SEQIDNO:4所/Jn ο
6.含有權(quán)利要求1-5任一所述二串體蛋白的表達(dá)載體或表達(dá)盒。
7.含有權(quán)利要求1-5任一所述二串體蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
8.一種二串體蛋白的制備方法，該方法的步驟包括: 1)將權(quán)利要求1-5任一所述二串體蛋白、或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體或表達(dá)盒、或權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒進(jìn)行重組表達(dá)，獲得重組表達(dá)產(chǎn)物； 2)純化重組表達(dá)產(chǎn)物，獲得所述二串體蛋白。
9.權(quán)利要求1-5任一所述二串體蛋白在制備預(yù)防或治療腸道疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述腸道疾病為短腸綜合征、腸型放射病、結(jié)腸癌、Crohn; s綜合癥、腸道炎、或克羅恩病。
11.權(quán)利要求1-5任一所述二串體蛋白在制備促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
12.—種供有腸道吸收障礙的病人口服食用的組合物，其包含權(quán)利要求1-5任一所述~■串體蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種人胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)的二串體蛋白及其構(gòu)建方法，將人胰高血糖素樣肽-2的氨基酸片段的第二位突變并應(yīng)用連接肽將其兩個(gè)片段串聯(lián)起來，模擬GLP-2二聚體結(jié)構(gòu)，應(yīng)用人工合成的方法獲得了其二串體蛋白的編碼基因，將編碼基因克隆入pET22b(+)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在大腸桿菌中高效表達(dá)，經(jīng)過硫酸銨分段鹽析，陰離子交換柱層析獲得了純化的重組目的蛋白。該重組目的蛋白可以刺激Caco-2細(xì)胞，顯著的促進(jìn)Caco-2細(xì)胞的增殖，表明人胰高血糖素樣肽-2二串體蛋白具有天然生物學(xué)活性，為人GLP-2的進(jìn)一步研究和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A23L1/29GK103159848SQ201310002909
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者薛曉暢, 劉爍, 王增祿, 張偉, 張英起 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)