專利名稱：具有動(dòng)員活性的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
近年來(lái)，大量研究用來(lái)探討增加哺乳動(dòng)物(尤其是人類)外周血循環(huán)中干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的含量的可能性。實(shí)際上，干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的獲得在一些領(lǐng)域是非常重要的，這些領(lǐng)域諸如有循環(huán)造血祖細(xì)胞的自體移植、循環(huán)造血祖細(xì)胞的異體移植以及在循環(huán)造血細(xì)胞的基因治療的過(guò)程中。
盡管出生后，干細(xì)胞和祖細(xì)胞幾乎只存在于骨髓中，但它們?nèi)匀痪哂羞w移性質(zhì)；也就是說(shuō)，在生理?xiàng)l件下它們可以通過(guò)骨髓腔進(jìn)入血液循環(huán)。該過(guò)程，即通常所說(shuō)的“動(dòng)員”，通過(guò)各種處理例如使用細(xì)胞因子特別是粒細(xì)胞集落生長(zhǎng)因子(G-CSF)，可以在哺乳動(dòng)物中擴(kuò)增。該過(guò)程的反過(guò)程(稱作“歸巢”)發(fā)生在例如造血細(xì)胞移植后接受放射治療的病人中；然而，動(dòng)員和歸巢的機(jī)制仍然不明確(C.F.Craddock等人，“在靈長(zhǎng)類和小鼠中VLA4整聯(lián)蛋白抗體動(dòng)員長(zhǎng)效種群恢復(fù)細(xì)胞和增大細(xì)胞因子誘導(dǎo)的遷移(Antibodies to VLA4 IntegrinMobilize Long-Term Repopulating Cells and Augment Cytokine-InducedMobilization in Primates and Mice)”，Blood，Vol.90，n.12，1997，pp.4779-4788；F.Prosper等，“外周血祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢與α4β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)和功能的可逆減量調(diào)節(jié)有關(guān)(Mobilization and Homing of PeripheralBlood Progenitors is Related to Reversible Downregulation of α4β1Integrin Expression and Function)”，J.Clin.Invest.，Vol.101，n.11，1998，pp.2456-2467；M.Vermeulen等，“粘著分子在鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的歸巢和動(dòng)員中的作用(Role of Adhesion Molecules in the Homing andMobilization of Murine Hermatopoietic Stem and Progenitor Cells)”，Blood，Vol.92，n.3，1998，pp.894-900)。
G-CSF(CAS登記號(hào)為143011-2-7/Merck Index，1996，page 4558)是一種造血生長(zhǎng)因子，其在粒系祖細(xì)胞的增殖和分化中是不可缺少的；該因子是一種分子量為18-22KDa、通常響應(yīng)各種細(xì)胞的特定刺激而產(chǎn)生的糖蛋白，其中這些細(xì)胞包括單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“去纖維蛋白多核苷酸”(CAS登記號(hào)83712-60-1)通常是指從動(dòng)物和/或植物組織中提取的一種多脫氧核糖核苷酸(US3,770,720和US3,899,481)；該多脫氧核糖核苷酸一般是以堿金屬鹽(通常為鈉鹽)的形式存在。去纖維蛋白多核苷酸主要用作抗凝劑(US3,829,567)，但它還可用于其它用途，如用于治療急性腎功能不全(US4,694,134)和急性心肌缺血(US4,693,995)。美國(guó)專利US4,985,552和US5,223,609中描述了一種制備去纖維蛋白多核苷酸的工藝方法，通過(guò)此工藝制成的產(chǎn)品具有穩(wěn)定和確切的物理-化學(xué)特性，同時(shí)也無(wú)任何不良副作用。
根據(jù)本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“去纖維蛋白多核苷酸”應(yīng)被理解為從動(dòng)物和/或植物組織中特別是從哺乳動(dòng)物的器官中提取出來(lái)的任一種寡核苷酸和/或多核苷酸。優(yōu)選地，去纖維蛋白多核苷酸是根據(jù)上述專利中所描述的方法生產(chǎn)出來(lái)的，因此這些方法本身也應(yīng)作為本說(shuō)明書的一部分；更為優(yōu)選的是，去纖維蛋白多核苷酸是用美國(guó)專利US4,985,552和US5,223,609中所描述的方法生產(chǎn)的發(fā)明詳述人們業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時(shí)或依次施用一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞的能力的造血因子，可以增加干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的遷移。
從實(shí)施例中可以看出，通過(guò)施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時(shí)或依次施用一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，所獲得的動(dòng)員能力大大高于單獨(dú)服用造血因子所獲得的動(dòng)員能力。
因此，本發(fā)明的主題為一種制劑，其包括作為“活性成分”的去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，優(yōu)選為G-CSF。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該制劑由一種可注射的水溶液組成。另外，該制劑也可以由兩種不同的溶液構(gòu)成，其中一種含有去纖維蛋白多核苷酸，另一種含有具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。因此本發(fā)明的制劑可以是一種可以同時(shí)、單獨(dú)或依次使用上文所述活性成分的復(fù)合制劑，以增加哺乳動(dòng)物外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的第二個(gè)主題是，去纖維蛋白多核苷酸聯(lián)合至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子在制備制劑中的應(yīng)用。該制劑能夠增加哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是，一種增加哺乳動(dòng)物外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，給哺乳動(dòng)物施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時(shí)或依次服用至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所用的造血因子為G-CSF；然而，本發(fā)明并不排除通過(guò)使用G-CSF之外的、具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的其它造血因子也可以得到類似的結(jié)果，這些造血因子諸如有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落生長(zhǎng)因子(GM-CSF)、Flt3配體(FL)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素8(IL-8)以及其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的造血因子。
在實(shí)驗(yàn)的第一階段與G-CSF聯(lián)合使用的去纖維蛋白多核苷酸是Crinos Spa提供的ProciclideTM，該產(chǎn)品按照美國(guó)專利US4,985,552和US5,223,609中所描述的方法生產(chǎn)。
至于施用上述兩種活性成分的方法并不受到本發(fā)明目的的限制。也就是說(shuō)，可以按照本領(lǐng)域公知的方法和劑量給予哺乳動(dòng)物(特別是人類)去纖維蛋白多核苷酸和具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子；通?？梢酝ㄟ^(guò)口服、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或靜脈內(nèi)注射給藥。其中靜脈注射為優(yōu)選的給藥途徑。
上述兩種活性成分也可以同時(shí)或依次施用。也就是說(shuō)，第一種情況是，通過(guò)使用單一制劑給予上述兩種活性成分，該單一抑制劑包括上述兩種活性成分，并可以任選地在其中加入本領(lǐng)域公知的賦型劑和/或輔助劑；另一種情況是，上述兩種活性成分可以依次給予，也就是說(shuō)，使用兩個(gè)不同的制劑，其中一個(gè)含有具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子、優(yōu)選為G-CSF，而另一個(gè)含有去纖維蛋白多核苷酸。
通常，皮下注射G-CSF，其劑量為5-24ug/kg，而DEF可以通過(guò)連續(xù)的靜脈輸注給予，劑量為5-15mg/kg/hr，連續(xù)輸注2-7天。
從本申請(qǐng)的實(shí)施例中可以看出(但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例)，給鼠(最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)用哺乳動(dòng)物模型)和猴聯(lián)合施用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸，所獲得的動(dòng)員能力比單獨(dú)施用G-CSF所獲得的動(dòng)員能力高得多。這一點(diǎn)對(duì)于那些希望獲得高水平動(dòng)員能力的治療領(lǐng)域來(lái)說(shuō)是非常有利的。
實(shí)施例1本試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)施用G-CSF和/或去纖維蛋白多核苷酸(DEF)對(duì)鼠科動(dòng)物血液中存在的白細(xì)胞(WBC)數(shù)量的影響。對(duì)年齡在6-8周、體重為20-25克的BALB/c鼠腹膜內(nèi)注射給予G-CSF(5ug/鼠/天)，DEF(1mg/鼠/天)，或聯(lián)合使用G-CSF(5ug/鼠/天)和增加劑量的DEF(1，10，15mg/鼠/天)。對(duì)未給予G-CSF和/或DEF的對(duì)照組的小鼠腹膜內(nèi)注射稀釋至0.1％的鼠血清白蛋白的鹽溶液(PBS/MSA)。對(duì)小鼠進(jìn)行上述治療5天，在經(jīng)上述治療的3天或5天后、或停止上述治療的3天后將小鼠處死。本試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)

圖1。下列標(biāo)記代表各組小鼠G-CSF(■)(n＝24)，DEF1(○)(n＝3)，G-CSF+DEF1(◆)(n＝13)，G-CSF+DEF10(▲)(n＝6)，G-CSF+DEF15(●)(n＝23)。給予PBS/MSA的對(duì)照組小鼠的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.87±0.2×106/毫升血。用平均數(shù)±平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)表示各組數(shù)據(jù)。
實(shí)施例2研究實(shí)施例1中的小鼠每毫升血中形成總的集落細(xì)胞(CFC)的動(dòng)員動(dòng)力學(xué)。給予PBS/MSA的對(duì)照組小鼠的平均CFC計(jì)數(shù)為39±12/毫升血。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2，并用平均數(shù)±SEM表示，其是由每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每個(gè)動(dòng)物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實(shí)施例3實(shí)施例1中小鼠的每105個(gè)外周血的棕黃層細(xì)胞(buffy-coat cell)中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU-Mix+HPP-CFC)的頻數(shù)改變。對(duì)照組小鼠中的平均CFC計(jì)數(shù)為3.5±1；數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3，并用平均數(shù)±SEM表示，其是由每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)每個(gè)動(dòng)物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實(shí)施例4實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)5天治療的小鼠每毫升血中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU-Mix+HPP-CFC)數(shù)量。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4，并用平均數(shù)±SEM表示，其是對(duì)每個(gè)動(dòng)物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實(shí)施例5實(shí)施例1中小鼠的每105個(gè)外周血的棕黃層細(xì)胞中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU+Mix+HPP-CFC)的頻數(shù)。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖5，并用平均數(shù)±SEM表示，其是對(duì)每個(gè)動(dòng)物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實(shí)施例6該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)施用G-CSF和/或DEF對(duì)猴外周血循環(huán)中造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞(高增殖潛能集落刺激細(xì)胞，或HPP-CFC)數(shù)量的影響。實(shí)驗(yàn)中使用4-6歲的、健康的獼猴(Macaca Mulatta)，其血液學(xué)和臨床化學(xué)的檢測(cè)指標(biāo)均正常。皮下注射G-CSF，劑量為100μg/kg，連續(xù)使用2個(gè)周期，每周期5天；在第二個(gè)周期中靜脈輸注DEF，劑量為15mg/kg/hr，連續(xù)5天。進(jìn)行采血、G-CSF給藥、換藥時(shí)對(duì)受試動(dòng)物實(shí)施麻醉。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖6。從該圖中可以看出，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸的猴子中的HPP-CFC的動(dòng)員能力是單獨(dú)使用G-CSF的猴子的8倍。
結(jié)論從圖1可以很容易地看出，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸使小鼠血液循環(huán)中白細(xì)胞的含量顯著增加。需要特別指出的是，單獨(dú)使用去纖維蛋白多核苷酸對(duì)血液循環(huán)中白細(xì)胞的含量并無(wú)積極作用。因此，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸能夠使白細(xì)胞數(shù)量驚人地增加，并存在著劑量-效果關(guān)系，其并不僅僅是兩個(gè)相互獨(dú)立效應(yīng)的加和。
圖2至圖5清楚地表明在小鼠中聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸而達(dá)到的動(dòng)員水平是單獨(dú)使用G-CSF的動(dòng)員水平的10倍至100倍。最后，圖6證實(shí)，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸使猴子中干細(xì)胞(HPP-CFC)的動(dòng)員能力是單獨(dú)使用G-CSF的8倍。
兩個(gè)活性成分的聯(lián)合效應(yīng)存在著劑量-效果關(guān)系，因?yàn)閯?dòng)員能力的增加與施用的去纖維蛋白多核苷酸的量呈現(xiàn)一定的比例；所有情況下動(dòng)員能力的最高峰均在施用藥物的大約第5天左右出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種制劑，包括作為活性成分的去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
3.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述制劑為水溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于由兩個(gè)不同的、單獨(dú)服用的制劑組成，其中一個(gè)含有具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，另一個(gè)含有去纖維蛋白多核苷酸。
5.一種作為復(fù)合制劑使用的制劑，含有去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，優(yōu)選為G-CSF，用于同時(shí)、單獨(dú)或依次施用以增加哺乳動(dòng)物外周血液循環(huán)中的干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
6.如權(quán)利要求1-5所述的制劑，進(jìn)一步含有常用的賦形劑和/或輔助劑。
7.與至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子聯(lián)合使用的去纖維蛋白多核苷酸在制備能夠增加哺乳動(dòng)物外周血液循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的制劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
9.一種增加哺乳動(dòng)物外周血液循環(huán)中的干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，給予哺乳動(dòng)物去纖維蛋白多核苷酸，并聯(lián)合或依次使用至少一種具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，具有動(dòng)員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，G-CSF的劑量為5-24ug/kg，去纖維蛋白多核苷酸的劑量為5-15mg/kg/hr。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，連續(xù)2-7天給予G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，哺乳動(dòng)物為人類。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增加哺乳動(dòng)物外周血液循環(huán)中干細(xì)胞和祖細(xì)胞數(shù)量的方法。其特征在于，施用去纖維蛋白多核苷酸，并聯(lián)合或依次施用至少一種能夠動(dòng)員造血祖細(xì)胞的造血因子，優(yōu)選為粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1434719SQ01808202
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者L·費(fèi)羅, R·波塔, M·艾克貝里, A·M·吉亞尼, C·C·司泰拉 申請(qǐng)人:金蒂姆股份公司