專利名稱：環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種環(huán)境顆粒物表面外源轉(zhuǎn)基因蛋白的原位檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的發(fā)展和生物工程產(chǎn)業(yè)化的普及，某些具有生物活性的蛋白質(zhì)，肽， 以及具有危害性的DNA分子進(jìn)入環(huán)境的可能性越來越大。事實(shí)上，環(huán)境中的污染物并不僅僅局限于小分子有機(jī)和無機(jī)毒物，某些生物大分子同樣是我們所面臨的潛在污染物。這些在環(huán)境中并非固有存在的生物分子我們統(tǒng)稱為外源生物分子(Extraneous Biomolecules, 簡(jiǎn)稱EBM)，EBM的主要來源包括以下幾種類型(1)通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的蛋白和多肽類藥物，此類生物藥物的生產(chǎn)已經(jīng)進(jìn)入了較高的產(chǎn)業(yè)化水平，環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)較高。雖然蛋白和多肽類藥物對(duì)疾病具有治療作用，但對(duì)正常人群的副作用不可避免。(2)轉(zhuǎn)基因植物的大量種植，為外源基因(T-DNA)及其表達(dá)產(chǎn)物(外源活性蛋白)大量進(jìn)入環(huán)境提供了條件。如轉(zhuǎn) Bt基因的玉米，棉花以及大米已經(jīng)在世界范圍內(nèi)大量種植，其T-DNA及其表達(dá)蛋白通過根系分泌物以及桔桿還田過程被土壤顆粒物所吸附。另外通過轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的蛋白類藥物和疫苗也已經(jīng)進(jìn)入了試驗(yàn)階段，一旦進(jìn)入商業(yè)種植，各種外源活性蛋白在環(huán)境中的釋放水平勢(shì)必大大增加。上述EBM在環(huán)境中均主要以吸附態(tài)的形式存在于土壤顆粒、水體中的固相懸浮物，大氣飄塵等各類環(huán)境固相介質(zhì)并發(fā)揮著生物學(xué)效應(yīng)。要正確判斷EBM的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，首先應(yīng)明確固相表面吸附態(tài)EBM的存在，并對(duì)其定量分析。因此，開發(fā)環(huán)境顆粒物表面外源生物大分子的檢測(cè)方法尤為重要。本發(fā)明以檢測(cè)土壤顆粒物表面緊密吸附的殺蟲蛋白 CrylAb為目標(biāo)。通過該發(fā)明的實(shí)施可實(shí)現(xiàn)環(huán)境顆粒物表面吸附態(tài)CrylAb殺蟲蛋白的快速檢測(cè)。研究表明，CrylAb蛋白質(zhì)一旦被蒙脫土、高嶺土等微納米級(jí)顆粒物吸附后，其提取率極小，甚至根本無法提取，或提取后在提取劑中失活，在隨后對(duì)其它蛋白質(zhì)的研究及相關(guān)報(bào)道中也有類似的結(jié)果[12]。吸附于某些顆粒物表面的CrylAb蛋白雖然不能被提取和檢測(cè)，卻仍能保持相當(dāng)?shù)纳锘钚?，發(fā)揮著一定的生物學(xué)效應(yīng)。因此，如果不能對(duì)顆粒物表面吸附態(tài)生物分子進(jìn)行原位檢測(cè)，就不可能發(fā)現(xiàn)這些生物分子在環(huán)境中的存在，也不能判斷其對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。然而對(duì)吸附態(tài)生物分子的檢測(cè)與小分子污染物有著極大的不同，它們基本上不能依靠提取的方法將被測(cè)物轉(zhuǎn)移至溶液相后進(jìn)行測(cè)定。因此必須建立起顆粒物表面吸附態(tài)蛋白的原位檢測(cè)技術(shù)。圓二色譜(CD)、傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)，以及微量熱法(DSC)，原子力顯微鏡(AFM)等技術(shù)雖然可以探測(cè)固體表面吸附的生物分子，但上述方法不適合于環(huán)境顆粒物表面低濃度生物分子的檢測(cè)。環(huán)境顆粒物中吸附的生物分子其濃度通常在ng/g^g/g級(jí)別之間。而且，復(fù)雜的環(huán)境顆粒物本身的光譜信號(hào)會(huì)嚴(yán)重干擾生物分子的光譜信號(hào)。因此光譜學(xué)方法根本無法檢測(cè)EBM在環(huán)境顆粒物表面的存在。免疫分析技術(shù)的發(fā)展為痕量蛋白質(zhì)和DNA的檢測(cè)提供了技術(shù)基礎(chǔ)，然而環(huán)境微粒物對(duì)于免疫分析或DNA雜交分析中的底物分子，抗體的非特異性吸附極大，將嚴(yán)重干擾顆粒物表面吸附態(tài)被測(cè)生物分子所產(chǎn)生的特異性信號(hào)。因此要解決環(huán)境表面固相生物分子的定量檢測(cè)，關(guān)鍵的問題是要消除環(huán)境顆粒物對(duì)生物分析過程中底物、抗體、DNA探針分子的非特異性吸附。目前，納米微球作為生物分析探針的方法得到了迅速的發(fā)展。由于磁性納米微球(MNP)在磁場(chǎng)的作用下能比較方便地從各類復(fù)雜試樣介質(zhì)中的分離出來，已經(jīng)成為從復(fù)雜樣品中捕獲微量目標(biāo)生物分子的重要方法，尤其對(duì)于存在于復(fù)雜溶液樣品中的被測(cè)分子可以進(jìn)行直接的捕獲，然而用通常的MNP只能對(duì)被測(cè)物起到分離作用，本發(fā)明采用抗體偶聯(lián)的熒光磁性納米微球(FMNP)作為環(huán)境顆粒物表面生物分子的原位檢測(cè)試劑，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了分離與檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序。FMNP能較好地滲入到顆粒表面的微孔結(jié)構(gòu)中，并能觸及表面微孔中的吸附態(tài)生物分子而發(fā)生相應(yīng)的生化反應(yīng)(如結(jié)合)，而與顆粒物表面不發(fā)生特異性結(jié)合的FMNP可在磁場(chǎng)中與結(jié)合有FMNP的顆粒物進(jìn)行分離，并用熒光光度計(jì)對(duì)顆粒物表面產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。該方法有效地降低了非特異性信號(hào)，提高了原位分析的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明以土壤顆粒物表面吸附態(tài)CrylAb蛋白為檢測(cè)對(duì)象，用FMNP及熒光光譜分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了顆粒物表面的CrylAb蛋白的原位檢測(cè)。目前市場(chǎng)上并未見檢測(cè)環(huán)境顆粒物表面吸附態(tài)蛋白質(zhì)的原位檢測(cè)試劑及方法，其他現(xiàn)有的免疫分析方法并不適用這種特殊應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑及方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑，該試劑是一種熒光磁性納米微球，磁性顆粒物表面修飾帶有熒光基團(tuán)的氨基多糖。進(jìn)一步地，磁性顆粒物表面修飾的氨基多糖通過共價(jià)連接的方法連接各種有機(jī)熒光分子，如熒光素異硫氰酸酯，羅丹明異硫氰酸酯等。進(jìn)一步地，磁性顆粒物表面修飾的氨基多糖為殼聚糖，或部分乙?；臍ぞ厶牵驓ぞ厶堑难苌?。進(jìn)一步地，所述磁性納米顆粒材料是Fe3O4，F(xiàn)e2O3，其尺寸小于120nm。進(jìn)一步地，所述熒光標(biāo)記的氨基多糖與磁性納米顆粒在聚陰離子的交聯(lián)作用下形成納米微球；且其能夠用多種共價(jià)鍵合方式將針對(duì)外源生物分子的抗體固定在微球表面。一種應(yīng)用上述原位檢測(cè)試劑的原位檢測(cè)方法，用檢測(cè)試劑與吸附有外源生物分子的環(huán)境顆粒物混合，用磁場(chǎng)分離磁性物質(zhì)，并在磁性通道內(nèi)捕獲結(jié)合有磁性熒光納米微球的目標(biāo)顆粒物，并用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)目標(biāo)顆粒物的熒光強(qiáng)度。進(jìn)一步地，光顯微鏡直接觀察在磁性通道內(nèi)帶有熒光特征的顆粒物。進(jìn)一步地，將磁分離后的顆粒物配置成懸浮液后，泵入毛細(xì)管通道，用激光器發(fā)射的激光聚焦后對(duì)準(zhǔn)毛細(xì)管通道，在特定的角度用光電倍增管測(cè)量流經(jīng)毛細(xì)管的顆粒物熒光發(fā)射光強(qiáng)度及散射光強(qiáng)度，并動(dòng)態(tài)采集每個(gè)顆粒物流經(jīng)毛細(xì)管通道后的熒光和散射光脈沖信號(hào)。本發(fā)明的有益效果是(1)熒光磁性納米微球具有熒光和磁性的雙重性質(zhì)，對(duì)目標(biāo)顆粒物同時(shí)具有分離捕獲及檢測(cè)的功能。(2)顆粒物表面吸附的外源轉(zhuǎn)基因蛋白無需提取即可直接進(jìn)行原位檢測(cè)。(3)采用磁分離手段避免了熒光試劑及抗體在顆粒物表面的非選擇性吸附。本發(fā)明在生命體系的超痕量分析，環(huán)境生物污染的原位檢測(cè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是用于分離及觀察被目標(biāo)顆粒物捕獲的熒光磁性納米微球的裝置結(jié)構(gòu)示意圖中，微通道1、PDMS薄膜2、硅片3、磁鐵4、反射式顯微鏡物鏡5、被捕獲的目標(biāo)顆粒物圖像6。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括以下幾個(gè)方面
1、熒光磁性納米微球的制備熒光磁性納米微球的制備已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，本發(fā)明公開的熒光磁性納米微球是一種表面被具有功能基的高分子包裹的鐵磁性納米微球，可方便地實(shí)現(xiàn)生物探針分子及熒光信號(hào)分子的偶聯(lián)固定，且與高分子連接的熒光基團(tuán)具有較高的穩(wěn)定性。2、熒光磁性納米微球在磁場(chǎng)作用下與不同尺度環(huán)境顆粒物的分離方法的建立納米磁性微球作為探針用于顆粒物表面生物分子原位檢測(cè)試劑的優(yōu)越性就在于磁性微球容易與其它固相基質(zhì)分離，從而大大降低固相基質(zhì)與探針分子的非特異性吸附，提高原位檢測(cè)的準(zhǔn)確度。本發(fā)明提供了土壤顆粒物，熒光納米磁性微球，及土壤顆粒物與熒光納米磁性微球的磁分離方法。3、熒光磁性納米微球與CrylAb抗體的偶聯(lián)及顆粒物表面吸附態(tài)CrylAb蛋白的檢測(cè)本發(fā)明公開了熒光磁性納米微球表面偶聯(lián)抗體的方法。連接有抗體的熒光磁性納米微球作為顆粒物表面的生物分子原位檢測(cè)試劑，同時(shí)具有識(shí)別、分離及檢測(cè)的功能。對(duì)吸附態(tài)外源生物分子-CrylAb蛋白的活性檢測(cè)采用偶聯(lián)有抗CrylAb蛋白抗體的熒光納米磁性微球，這種熒光磁性納米微球與吸附態(tài)CrylAb蛋白具有特異性結(jié)合能力。結(jié)合有熒光納米磁性微球的土壤顆粒能與未結(jié)合的熒光納米磁性微球、未吸附CrylAb蛋白的土壤顆粒在一定的磁場(chǎng)強(qiáng)度中分離。將磁分離得到的結(jié)合有FMNP的土壤顆粒分散于緩沖溶液中即可進(jìn)行熒光定量分析。用本發(fā)明所建立的原位技術(shù)測(cè)定可檢測(cè)Bt轉(zhuǎn)基因植物種植區(qū)及周圍土壤樣品及粉塵顆粒表面吸附的CrylAb蛋白進(jìn)行分析。具體來說，本發(fā)明包括以下內(nèi)容
1、制備熒光標(biāo)記的氨基多糖將有機(jī)染料熒光素異硫氰酸酯首先與氨基多糖反應(yīng)，以此制備高分子熒光試劑，步驟如下稱取一定量的分子量在9. 7 X IO4 — 5. OX IO6之間的氨基多糖。并將其溶解在3% (ν/ν)醋酸溶液中，使氨基多糖的濃度控制在0. — (w/ ν)。用NaOH溶液調(diào)節(jié)ρΗ為4. 0 — 7. 0之間。加入5mg/ml — 20mg/ml的熒光素異硫氰酸酯(FITC)的無水二甲基亞砜(DMSO)溶液。氨基多糖溶液和FITC的DMSO溶液的體積比為 2-10:1。用錫箔包住反應(yīng)試管，避光反應(yīng)Ih — 10h，得到FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液。2、制備納米級(jí)磁流體取帶有功能基團(tuán)的高分子聚合物置于三頸燒瓶中，超聲波分散lOmin，在N2保護(hù)的條件下，加入一定量FeCl2及H2O2溶液，攪拌均勻，滴加NaOH溶液至堿性，升溫并調(diào)節(jié)攪拌速度，攪拌3h后停止加熱，得均勻黑色磁流體分散液。將該分散體系在磁場(chǎng)中沉降，約隔4h用二次重蒸水清洗一次，棄掉上層無色清液，依次反復(fù)操作，直到磁流體顯中性。3、熒光標(biāo)記的氨基多糖包裹的納米磁性微球的制備。將步驟2制備的磁流體和步驟1制備的FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液及聚乙二醇(PEG)溶液加入三頸燒瓶中，用超聲波分散，直到PEG全部溶解。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌分散，逐滴滴加濃度為0. 1%到1%之間的三聚磷酸鈉(TPP)溶液，得到黃褐色乳液。磁分離后用去離子水不斷浸洗，得到氨基多糖包裹的熒光磁性納米微球。4、熒光磁性納米微球與CrylAb蛋白抗體之間的偶聯(lián)比較常用的抗體偶聯(lián)方法有溴化氰活化法、N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)活化法、N, N’ -琥珀酰亞胺碳酸酯(DCS)活化法、羰基二咪唑(⑶I)活化法、還原氨化法、2 —氟一 1 一甲基吡叮甲苯4碘酸鹽(FMP) 活化法等。本發(fā)明采用CDI，NHS，或戊二醛活化熒光磁性納米顆粒表面后可直接共價(jià)偶聯(lián) CrylAb蛋白抗體。5、熒光納米磁性微球與環(huán)境顆粒物的混合及磁分離將步驟(4)與CrylAb蛋白抗體之間的偶聯(lián)后的熒光磁性納米微球與經(jīng)過超聲分散的土壤顆粒物懸濁液混合，并在恒溫振蕩一種振蕩孵育1小時(shí)，置于磁力架中，將磁性物質(zhì)與未捕獲磁性微球的土壤顆粒物分離。分離到的磁性物質(zhì)以一定流速泵入磁性分離通道內(nèi)，磁性分離通道的裝置圖見說明書附圖。通過該磁性通道后，熒光磁性納米顆粒與結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物得到分離。將上述結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物用一定量的緩沖液配制成懸浮物后，用熒光分析法進(jìn)行定量分析，具體方法包括以下三種(1)用熒光分光光度計(jì)在480nm 激發(fā)測(cè)量懸浮液在520nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度。(2)用熒光顯微鏡的物鏡對(duì)準(zhǔn)磁性通道，用汞燈激發(fā)被磁場(chǎng)捕獲的顆粒物，觀察磁性通道內(nèi)的顆粒物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量或半定量分析。 (3)將磁分離后的顆粒物配置成懸浮液后，泵入毛細(xì)管通道，用488nm激光器發(fā)射的激光聚焦后對(duì)準(zhǔn)毛細(xì)管通道，在90度角用光電倍增管測(cè)量發(fā)射光強(qiáng)度，并動(dòng)態(tài)采集每個(gè)顆粒物流經(jīng)毛細(xì)管通道后的熒光脈沖信號(hào)。實(shí)施例1
一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑，制備過程如下 稱取IOmg的分子量在9. 7X IO4 — 5. OX IO6之間的氨基多糖。并將其溶解在3% (ν/ ν)醋酸溶液中，使氨基多糖的濃度控制在0. — l%(w/v)。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5. O。 加入20mg/ml的熒光素異硫氰酸酯(FITC)的無水二甲基亞砜(DMSO)溶液。氨基多糖溶液和FITC的DMSO溶液的體積比為5:1。用錫箔包住反應(yīng)試管，避光反應(yīng)2h，得到FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液。取35.5 g聚乙二醇(PEG)于三頸燒瓶中，超聲波分散101^11，在隊(duì)保護(hù)的條件下，加入40 mLH20,33 mL 1% FeCl2，攪拌均勻，加入12 mL 0. 06%H202溶液，攪拌均勻，滴加 3 mol/L的NaOH溶液到pHll-13，升溫到55攝氏度，調(diào)節(jié)攪拌速度為60rpm，繼續(xù)攪拌3h后停止加熱，就可得到均勻黑色磁流體分散液。將該分散體系在磁場(chǎng)中沉降，約隔4h用二次重蒸水清洗一次，棄掉上層無色清液，依次反復(fù)操作，直到磁流體顯中性。最后將磁流體定量至25mL。在上述磁流體中加入FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌分散，逐滴滴加濃度為0. 1%到1%之間的三聚磷酸鈉(TPP)溶液，得到黃褐色乳液。磁分離后用去離子水不斷浸洗，得到氨基多糖包裹的熒光磁性納米微球(FMNP)。取IOmg FMNP 粒子用 0. lmol/L PBS (NaCl 1. 4mol/L, Tween-20 0. 05%, pH=7. 4) 充分洗滌除去表面的其他物質(zhì)，并分散在5ml丙酮溶液中，加入25mg CDI室溫?cái)嚢杌罨痩h。 用數(shù)倍體積的溶劑除去活化過程中產(chǎn)生的咪唑。將上述活化后的粒子立刻加入IOml Img/ ml的CrylAb蛋白抗體溶液(溶解在0. 1 mol/L pH=8. 5硼酸鈉緩沖液)。4°C下攪拌反應(yīng) 24h。反應(yīng)完成后，用0.1 mol/L pH=8. 5硼酸鈉緩沖液充分洗滌，除去未反應(yīng)的抗體后，即可得檢測(cè)顆粒物表面CrylAb蛋白的試劑。4°C保存在0. 01mol/L Tris (150mmol/L NaCl, 0. l%NaN3,pH=8. 2)中備用。實(shí)施例2
一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑，制備過程如下 稱取IOmg的分子量在9. 7X IO4 — 5. OX IO6之間的氨基多糖。并將其溶解在3% (ν/ ν)醋酸溶液中，使氨基多糖的濃度控制在0. — l%(w/v)。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5.0。 加入20mg/ml的熒光素異硫氰酸酯(FITC)的無水二甲基亞砜(DMSO)溶液。氨基多糖溶液和FITC的DMSO溶液的體積比為5:1。用錫箔包住反應(yīng)試管，避光反應(yīng)2h，得到FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液。在實(shí)施例1中獲得的磁流體中加入FITC標(biāo)記的氨基多糖溶液。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下機(jī)械攪拌分散，逐滴滴加濃度為0. 1%到1%之間的三聚磷酸鈉(TPP)溶液，得到黃褐色乳液。磁分離后用去離子水不斷浸洗，得到氨基多糖包裹的熒光磁性納米微球(FMNP)。取IOmg FMNP 粒子用 0. lmol/L PBS (NaCl 1. 4mol/L, Tween-20 0. 05%, pH=7. 4) 充分洗滌除去表面的其他物質(zhì)，加入0. Iml 戊二醛，室溫振蕩反應(yīng)lh，離心洗去未反應(yīng)的戊二醛?；罨蟮牧Ｗ又匦路稚⒃?.8ml PBS抗體偶聯(lián)緩沖液中，加入0.2ml 10mg/L CrylAb蛋白抗體溶液，在4°C攪拌反應(yīng)24h。在上述溶液中加入Iml Glycine (甘氨酸)封閉液，室溫反應(yīng)2h。離心去掉上清液，加入5. Omg NaBH4，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢依次用洗液 (1)，洗液(2)離心充分洗滌，除去未結(jié)合的抗體和甘氨酸。即可得檢測(cè)顆粒物表面CrylAb 蛋白的試劑。4°C保存在 0. 01mol/L Tris (150mmol/L NaCl，0. l%NaN3,pH=8. 2)中備用。實(shí)施例3:
一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)方法，過程如下 熒光納米磁性微球與經(jīng)過超聲分散的土壤顆粒物懸濁液混合，并在恒溫振蕩一種振蕩孵育1小時(shí)，置于磁力架中，將磁性物質(zhì)與未捕獲磁性微球的土壤顆粒物分離。分離到的磁性物質(zhì)以一定流速泵入如圖1所示的磁性分離通道內(nèi)，磁性分離通道的裝置圖見說明書附圖。如圖1所示，含有微通道1的PDMS薄膜2經(jīng)氧等離子體處理后與相同方法處理后的硅片3粘合，在硅片下放置具有一定磁場(chǎng)強(qiáng)度的磁鐵4，將顆粒物懸浮液以一定流速泵入微通道1，結(jié)合有熒光磁性納米微球的目標(biāo)顆粒物在未通道內(nèi)磁場(chǎng)捕獲，沉積于硅基底3，反射式顯微鏡物鏡5對(duì)組微通道1中的磁性區(qū)域。顯微鏡目鏡觀察沉積后的顆粒物，獲得顆粒物圖像6。通過該磁性通道后，熒光磁性納米顆粒與結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物得到分離。收集結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物用一定量的緩沖液配制成懸浮物后，用熒光分光光度計(jì)在480nm激發(fā)測(cè)量懸浮液在520nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度。實(shí)施例4
一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)方法，過程如下熒光納米磁性微球與經(jīng)過超聲分散的土壤顆粒物懸濁液混合，并在恒溫振蕩一種振蕩孵育1小時(shí)，置于磁力架中，將磁性物質(zhì)與未捕獲磁性微球的土壤顆粒物分離。分離到的磁性物質(zhì)以一定流速泵入如圖1所示的磁性分離通道內(nèi)，磁性分離通道的裝置圖見說明書附圖。通過該磁性通道后，熒光磁性納米顆粒與結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物得到分離。在一定流速下，通道內(nèi)保留的是結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物。用熒光顯微鏡的物鏡對(duì)準(zhǔn)磁性通道，用汞燈激發(fā)被磁場(chǎng)捕獲的顆粒物，觀察磁性通道內(nèi)的顆粒物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量或半定量分析。實(shí)施例5
一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)方法，過程如下 熒光納米磁性微球與經(jīng)過超聲分散的土壤顆粒物懸濁液混合，并在恒溫振蕩一種振蕩孵育1小時(shí)，置于磁力架中，將磁性物質(zhì)與未捕獲磁性微球的土壤顆粒物分離。分離到的磁性物質(zhì)以一定流速泵入如圖1所示的磁性分離通道內(nèi)，磁性分離通道的裝置圖見說明書附圖。通過該磁性通道后，熒光磁性納米顆粒與結(jié)合有熒光磁性納米微球的土壤顆粒物得到分離。將磁分離后的顆粒物配置成懸浮液后，泵入毛細(xì)管通道，用488nm激光器發(fā)射的激光聚焦后對(duì)準(zhǔn)毛細(xì)管通道，在90度角用光電倍增管測(cè)量發(fā)射光強(qiáng)度，并用數(shù)據(jù)采集卡動(dòng)態(tài)采集由光電倍增管獲得的每個(gè)顆粒物流經(jīng)毛細(xì)管通道后的熒光脈沖信號(hào)及散射光信號(hào)。根據(jù)脈沖信號(hào)數(shù)量及強(qiáng)度對(duì)顆粒物表面吸附態(tài)CrylAb蛋白進(jìn)行定量分析。本文中，如無特別說明，各百分比均為質(zhì)量百分比。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑，其特征在于，該試劑是一種熒光磁性納米微球，磁性顆粒物表面修飾帶有熒光基團(tuán)的氨基多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性熒光納米微球，其特征在于，磁性顆粒物表面修飾的氨基多糖通過共價(jià)連接的方法連接各種有機(jī)熒光分子，如熒光素異硫氰酸酯，羅丹明異硫氰酸酯等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性熒光納米微球，其特征在于，磁性顆粒物表面修飾的氨基多糖為殼聚糖，或部分乙?；臍ぞ厶?，或殼聚糖的衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的磁性熒光納米微球，其特征在于，所述磁性納米顆粒材料是Fe3O4, Fe2O3，其尺寸小于120nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的磁性熒光納米微球，其特征在于，所述熒光標(biāo)記的氨基多糖與磁性納米顆粒在聚陰離子的交聯(lián)作用下形成納米微球；且其能夠用多種共價(jià)鍵合方式將針對(duì)外源生物分子的抗體固定在微球表面。
6.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述原位檢測(cè)試劑的原位檢測(cè)方法，其特征在于，用檢測(cè)試劑與吸附有外源生物分子的環(huán)境顆粒物混合，用磁場(chǎng)分離磁性物質(zhì)，并在磁性通道內(nèi)捕獲結(jié)合有磁性熒光納米微球的目標(biāo)顆粒物，并用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)目標(biāo)顆粒物的熒光強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外源生物分子的原位檢測(cè)方法，其特征在于，所述用熒光顯微鏡直接觀察在磁性通道內(nèi)帶有熒光特征的顆粒物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外源生物分子的原位檢測(cè)方法，其特征在于，將磁分離后的顆粒物配置成懸浮液后，泵入毛細(xì)管通道，用激光器發(fā)射的激光聚焦后對(duì)準(zhǔn)毛細(xì)管通道，在特定的角度用光電倍增管測(cè)量流經(jīng)毛細(xì)管的顆粒物熒光發(fā)射光強(qiáng)度及散射光強(qiáng)度，并動(dòng)態(tài)采集每個(gè)顆粒物流經(jīng)毛細(xì)管通道后的熒光和散射光脈沖信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)境顆粒物表面外源生物分子的原位檢測(cè)試劑及方法，本發(fā)明以檢測(cè)土壤顆粒物表面吸附的殺蟲蛋白Cry1Ab為目標(biāo)，在磁性熒光納米微球表明連接Cry1Ab蛋白抗體，將土壤顆粒物懸濁液與上述磁性熒光納米微球孵育一段時(shí)間后，表面吸附有Cry1Ab蛋白的土壤顆粒物表面通過抗原抗體相互作用俘獲上述磁性熒光納米微球，通過磁分離后，將帶有磁性的顆粒物懸濁液置于石英比色皿中，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)顆粒物產(chǎn)生的熒光信號(hào)。其熒光強(qiáng)度與土壤顆粒物表面吸附的Cry1Ab蛋白在一定范圍內(nèi)呈正比，據(jù)此可以直接定量顆粒物表面吸附的Cry1Ab蛋白。也可采用熒光顯微鏡及激光誘導(dǎo)熒光散射脈沖譜進(jìn)行動(dòng)態(tài)定量分析。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102323424SQ20111014766
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者葉慶富, 唐艷艷, 李臻, 趙偉潔, 鄔建敏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)