專利名稱：番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從番荔枝(Annona squamosa L.)種子制備的一種番荔枝內(nèi)酯(Annonaceous acetogenins)抗癌有效部位藥及其制備方法。
番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)(Annonaceous acetogenins)是由長鏈脂肪酸γ-內(nèi)酯衍生出的一類天然產(chǎn)物。這類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點是在一長脂肪鏈的一端有一甲基取代的α，β-不飽和γ-內(nèi)酯環(huán)，在脂肪鏈上有1～3個四氫呋喃環(huán)和其它一些含氧取代基，如羥基、乙酰氧基、酮基、環(huán)氧基，以及碳碳雙鍵等。這類天然產(chǎn)物僅存在于番荔枝科(Annonaceae)某些屬的植物中。
番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)具有多種生物活性，其中最重要的生物活性是極強的體外細(xì)胞毒和體內(nèi)抗腫瘤作用。其作用機理是通過選擇性地抑制癌細(xì)胞線粒體中NADH氧化還原酶，阻止呼吸鏈電子的傳遞，使ADP不能轉(zhuǎn)化成ATP，從而切斷癌細(xì)胞賴以生存和增殖的能量供應(yīng)，進而誘導(dǎo)癌細(xì)胞走向凋亡(Apoptosis)；同時，番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)還能夠克服癌細(xì)胞的多藥抗藥性(MDR)。因此，番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)成為近年來的研究熱點。于1982年報道第一個番荔枝內(nèi)酯化合物Uvaricin以來，至今已發(fā)現(xiàn)了約300個這類化合物。
國外的工作主要在單體化合物方面，但至今仍停留在分離、結(jié)構(gòu)、合成及生物活性等方面的研究，距離實際應(yīng)用尚很遙遠，原因有第一，在已發(fā)現(xiàn)的約300個化合物中，在體內(nèi)真正有效的高活性化合物并不多；第二，由于數(shù)目眾多的異構(gòu)體、同系物共存于同一植物中，有些植物中多達30多個同系物，且各同系物及異構(gòu)體的理化性質(zhì)極為相似，因此，單體化合物的分離、純化非常困難；第三，單個化合物在植物中的含量相對較低，植物資源有限；第四，番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)的分子中具有多個手性中心，亦難以通過化學(xué)合成得到特定單體物；第五，番荔枝內(nèi)酯單體化合物的毒性較高，治療指數(shù)較低。
國內(nèi)有人提出以番荔枝總內(nèi)酯用作藥物原料，但這樣的總內(nèi)酯組分復(fù)雜，難以建立藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制手段，因而無法保證藥物的質(zhì)量和療效，難以達到新藥應(yīng)有的“有效、安全、可控”的目標(biāo)。因此，番荔枝總內(nèi)酯亦將難以進入實際應(yīng)用。而且現(xiàn)有公知的番荔枝總內(nèi)酯制備方法也存在一些問題，例如CN1224016A公開的方法是以番荔枝種子為原料，首先用己烷或石油醚脫脂，然后用醇提取、氯仿萃取及己烷-乙醇分配處理，最后再經(jīng)硅膠吸附層析得到總內(nèi)酯。這種方法存在下列缺點(1)首先脫脂所用己烷或石油醚等有機溶劑的量很大，溶劑損耗大，處理時間長，導(dǎo)致成本增加；(2)由于己烷、石油醚等溶劑能溶出部分有效成分，因此首先脫脂會使部分有效成分損失。
另外，番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)具有極強的脂溶性，制劑亦是難點。
本發(fā)明目的在于解決下述問題(1)以單個番荔枝內(nèi)酯化合物用作藥物原料尚無實際應(yīng)用價值問題；(2)以番荔枝總內(nèi)酯作為藥物原料時，組分過于復(fù)雜，無法保證藥物的質(zhì)量，即質(zhì)量可控性問題；(3)番荔枝總內(nèi)酯制備方法中存在的問題；(4)制劑問題。以開發(fā)一種以番荔枝內(nèi)酯化合物為有效成分的有實用價值的抗癌有效部位藥。
本發(fā)明以番荔枝種子為原料，番荔枝(Annona squamosay L.)是產(chǎn)于我國南方地區(qū)的一種藥用植物，其果實是著名水果，資源豐富、易得，其種子含大量的番荔枝內(nèi)酯，其中不乏活性很強的成分。本發(fā)明先由番荔枝種子制備番荔枝總內(nèi)酯，然后將總內(nèi)酯經(jīng)精制處理，目的是除去大量活性不高或無活性的內(nèi)酯成分，僅保留高活性內(nèi)酯成分而成為一高效部位藥。這種高效部位由于已除去了大量無用內(nèi)酯成分而僅富集高活性內(nèi)酯成分，因而不僅活性更強，而且組成簡單，易于進行質(zhì)量控制；同時，其制備方法簡單、易實施、生產(chǎn)成本低；另外本發(fā)明對番荔枝總內(nèi)酯制備方法作了改進，首先用醇提取，乙醇提取物用有機溶劑例如石油醚脫脂，并用乙醇萃取出有機溶劑例如石油醚中的有效成分，減少了溶劑用量，提高了有效成分收率；還有本發(fā)明以脂肪乳作為其劑型，成功地解決了制劑問題。因此本發(fā)明具有極強的實用性。
本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥是由下述兩個工序制得的物質(zhì)首先有番荔枝總內(nèi)酯制備工序，以番荔枝種子為原料制備番荔枝總內(nèi)酯；其特征在于還有精制工序，把前步工序中所制備的番荔枝總內(nèi)酯經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，最好100～200目，與所述的番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量比為15∶1～50∶1，最好為30∶1，層析后用體積比為3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脫，用薄層層析檢查，在阿諾寧-6(Annonin VI)流出時開始收集至阿諾寧-1(Annonin I)全部流出為止，洗脫劑石油醚-丙酮的用量就由此來決定，將收集的所述餾分濃縮、干燥，即得本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥。
所述的番荔枝總內(nèi)酯制備工序可采用現(xiàn)有各種公知的方法，例如CN1224016A的方法。但為了提高有效成分收率和減少溶劑用量，本發(fā)明對該工序作了改進。本發(fā)明番荔枝總內(nèi)酯的制備工序為把番荔枝種子粗粉用80％～97％乙醇浸泡提取，乙醇的用量、浸泡時間和次數(shù)隨意選擇，乙醇提取液濃縮后用有機溶劑萃取脫脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，最好100～200目，與氯仿萃取物的質(zhì)量比為5∶1～20∶1，最好為10∶1，層析后以體積比為100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脫，用薄層層析檢查，在番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)大量流出時開始收集，至無番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)流出時為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯。
上述的各次萃取所用的溶劑用量和萃取次數(shù)均可隨意選擇。脫脂工序可使用公知的有機溶劑例如石油醚、己烷等。在所述的有機溶劑例如石油醚萃取脫脂前在蒸去乙醇的提取物中最好先加水；脫脂后的有機溶劑例如石油醚層最好用體積分?jǐn)?shù)為60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在濃縮后并入脫脂后的水溶液中，具體制備工藝流程詳見附

圖1。
所述的薄層層析檢查是控制本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥質(zhì)量的方法，可采用通常的薄層層析板，為方便本發(fā)明采用自制硅膠H硬板(CMC為粘合劑)，以體積比為3∶1的石油醚-丙酮作為展開劑，可選用下列三種顯色劑中之一種進行顯色(1)Kedde試劑即3，5-二硝基苯甲酸斑點呈紅色，色斑很快消褪；(2)Dragendorff試劑即碘化鉍鉀試劑呈橙黃色斑點，顏色持久；(3)碘蒸汽呈褐色斑點，顏色持久。
結(jié)果本發(fā)明番荔枝總內(nèi)酯有效部位藥在TLC上按上述條件展開后，對三種顯色劑均顯示兩個斑點，分別對映于對照品阿諾寧-1和阿諾寧-6。
高效液相色譜法測定本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥中兩個主要成分的含量用ODS柱(6mm×15cm)，甲醇-水(體積比9∶1)為流動相，流速1mL/min，用紫外檢測儀，檢測波長210nm，萘為內(nèi)標(biāo)，由峰面積積分值通過內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測定阿諾寧-1和阿諾寧-6的含量，二者的回歸方程如下阿諾寧-1(Annonin I)y＝5065.05x-6902.7 r＝0.9998；阿諾寧-6(Annonin VI)y＝4975.92x-4179.8 r＝0.9998。
結(jié)果阿諾寧-1的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)42％～55％，典型值為52.3％，阿諾寧-6的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8％～15％，典型含量為10.5％，二者的含量之和為質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～70％，典型值為63.1％。
本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥可配成乳劑，其配方比例和制造方法如下每1000mg本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥中，加入50～200g大豆油(最適用量為100g)和10～20g(最適用量為12g)卵磷脂，加熱混合、溶解，待全部溶解后加注射用水至總體積為500～1500mL，最好1000mL，經(jīng)乳化處理后，過濾、灌封、滅菌，即成本發(fā)明乳劑，所述的乳化處理可以采用一般的乳化方法，例如可用多級超聲乳化處理。
本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥進行下述藥理學(xué)試驗。
(1)急性毒性試驗小鼠急性毒性試驗，以Bliss法計算LD50，結(jié)果如下腹腔注射 ip×1次 LD50＝1.124(1.017～1.242)mg/kg；灌胃 po×1次 LD50＝74.754(58.662～95.260)mg/kg。
(2)體外細(xì)胞毒試驗本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥體體外對肺癌(A-549)、鼻咽癌(CNE2、SUNE1)、肝癌(BEL-7402)、HT-29(結(jié)腸癌)、乳腺癌(MCF-7)及肺腺癌(GLC-82)等7種人癌細(xì)胞進行了細(xì)胞毒實驗，以Taxol作為陽性對照藥物，結(jié)果如表1。顯示本發(fā)明有效部位藥對試驗的7種細(xì)胞株均有細(xì)胞毒作用，其中對A-549、CNE2、BEL-7402等三種細(xì)胞株的作用最強，作用強于taxol或與taxol相當(dāng)。
表1 對各種人癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用(IC50半數(shù)抑制濃度)
(3)對小鼠移植性腫瘤的抗瘤作用采用腹腔注射(ip)和灌胃(po)兩種給藥途徑，ip以小鼠肝癌HepS和小鼠肉瘤S-180兩種動物移植性腫瘤、po還增加網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤(L2)進行體內(nèi)抑瘤試驗。本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥設(shè)3～4個劑量組，對照組為不含藥物的脂肪乳，陽性藥物對照組在ip給藥時為環(huán)磷酰胺(CTX)，在po給藥時為氟脲嘧啶(5-Fu)，各組連續(xù)給藥10天，每個試驗重復(fù)3～4批。結(jié)果(見表2～表6)表明在ip給藥劑量為0.03～0.09mg/(kg.d)時，抑瘤率接近化療藥物CTX 18mg/kg劑量組的抑瘤率，在劑量低至0.01mg/(kg.d)×10天時仍可顯示一定的抑制作用；采用灌胃經(jīng)藥，亦顯示出極強的體內(nèi)抗腫瘤作用，但與腹腔注射給藥相比，灌胃給藥的劑量較大，說明灌胃給藥途徑藥物的吸收性較差。實驗中除高劑量(0.09mg/(kg.d))組有部分批次有10％的荷瘤鼠死亡外，其他有效劑量組的荷瘤鼠行為活動正常，未見明顯消瘦、松毛、腹瀉等毒性表現(xiàn)。
表2 腹腔注射給藥對小鼠移植性肝癌HepS的抑制作用
表3 腹腔注射給藥對小鼠肉瘤S-180的抑制作用
表4灌胃給藥對小鼠移植性肝癌HepS的抑制作用
表5 灌胃給藥對小鼠肉瘤S-180的抑制作用
表6 灌胃給藥對小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤L2的抑制作用
經(jīng)上述藥理學(xué)試驗說明本發(fā)明達到下述技術(shù)效果(1)抗腫瘤作用強，由于本發(fā)明是將番荔枝總內(nèi)酯經(jīng)進一步精制處理，排除大量活性較低或無活性的內(nèi)酯成分，僅富集了高活性成分，因而其作用更高；(2)組分簡單、明確，易于進行質(zhì)量控制；(3)制備方法簡單、易實施，成本低；(4)用脂肪乳作為其藥物劑型，成功地解決了制劑問題。
附圖1為本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥制備工藝流程圖。
本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥實施例如下
總內(nèi)酯的分離將上述得到的總內(nèi)酯提取物上硅膠G(300g，100～200目，青島海洋化工廠)柱，用氯仿-甲醇梯度洗脫，每份接收200mL，起始用純氯仿洗脫，流分為1～13份，然后換為氯仿-甲醇(98∶2)，為14～21份；再換(97∶3)，22～26份；最后用(90∶10)洗脫，27～36份。用TLC檢查，將第19～29份合并，濃縮、干燥，得總內(nèi)酯(15.15g)。
總內(nèi)酯的精制取上述制備的總內(nèi)酯10g，再上硅膠G(300g，100～200目，青島海洋化工廠)柱，用石油醚-丙酮按如下比例洗脫3∶1，6000mL；7∶3，2000mL；65∶35，1500mL；1∶1，1000mL；以每份100mL接收。用TLC檢查，從阿諾寧-6流出時開始收集直至阿諾寧-1全部流出時為止(第43～93份)，將這部分流分合并、濃縮、干燥，得到6.6g微黃色蠟狀固體，即為番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥物(批號981225)。其主要成分的含量見表7。
表7 不同批次番荔枝內(nèi)酯有效部位藥中主要成分的含量
實施例4乳劑的制備取本發(fā)明番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥1000mg，加注射用大豆油100g，再加12g卵磷脂，在90℃的水浴上加熱使全部固體物溶解于大豆油中，加注射用水至1000mL，經(jīng)多級超聲乳化處理后，過濾、灌封、滅菌，即成番荔枝內(nèi)酯有效部位藥乳劑。
權(quán)利要求
1.一種番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥是由下述兩個工序制得的物質(zhì)首先有番荔枝總內(nèi)酯制備工序，以番荔枝種子為原料制備番荔枝總內(nèi)酯；其特征在于還有精制工序，把前步工序中所制備的番荔枝總內(nèi)酯經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與所述的番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量比為15∶1～50∶1，層析后用體積比為3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脫，用薄層層析檢查，在阿諾寧-6(Annonin VI)流出時開始收集至阿諾寧-1(Annonin I)全部流出時止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥，其特征在于所述的番荔枝總內(nèi)酯制備工序如下把番荔枝種子粗粉用80％～97％乙醇浸泡提取，乙醇提取液濃縮后用有機溶劑萃取脫脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與氯仿萃取物的質(zhì)量比為5∶1～20∶1，層析后以體積比為100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脫，用薄層層析檢查，在番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)大量流出時開始收集，至無番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)流出時為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥，其特征在于所述的番荔枝總內(nèi)酯制備工序如下把番荔枝種子粗粉用體積分?jǐn)?shù)80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液濃縮后，加水，用有機溶劑萃取脫脂，有機溶劑層用體積分?jǐn)?shù)60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在濃縮后并入脫脂后的水溶液中，濃縮后用氯仿萃取，氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與氯仿萃取物的質(zhì)量比為5∶1～20∶1，層析后以體積比為100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脫，用薄層層析檢查，在番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)大量流出時開始收集，至無番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)流出時為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥，其特征在于所述的硅膠粒度為100～200目，與番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量比為30∶1，所述的阿諾寧1的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)42％～55％，所述的阿諾寧-6的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)8％～15％，所述的阿諾寧-1與阿諾寧-6含量之和為質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～70％。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥，其特征在于所述的阿諾寧-1含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)52.3％，所述的阿諾寧-6含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.5％，所述的阿諾寧-6與阿諾寧1的含量之和為質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.1％。
6.一種番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥的制備方法，有下述兩個工序首先有番荔枝總內(nèi)酯制備工序，以番荔枝種子為原料制備番荔枝總內(nèi)酯；其特征在于還有精制工序，把前步工序中所制備的番荔枝總內(nèi)酯經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與所述的番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量比為15∶1～50∶1，層析后用體積比為3∶1～3∶2的石油醚-丙酮洗脫，用薄層層析檢查，在阿諾寧-6(Annonin VI)流出時開始收集至阿諾寧-1(Annonin I)全部流出為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6與所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥的制備方法，其特征在于所述的番荔枝總內(nèi)酯制備工序如下把番荔枝種子粗粉用體積分?jǐn)?shù)80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液濃縮后用有機溶劑萃取脫脂，然后用氯仿萃取，氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與氯仿萃取物的質(zhì)量比為5∶1～20∶1，層析后以體積比為100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脫，用薄層層析檢查，在番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)大量流出時開始收集，至無番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)流出時為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥的制備方法，其特征在于所述的番荔枝總內(nèi)酯制備工序如下把番荔枝種子粗粉用體積分?jǐn)?shù)80％～97％的乙醇浸泡提取，乙醇提取液濃縮后，加水，用有機溶劑萃取脫脂，有機溶劑層用體積分?jǐn)?shù)60％～97％的乙醇萃取，乙醇萃取液在濃縮后并入脫脂后的水溶液中，濃縮后用氯仿萃取，氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析，所述的硅膠柱中充填的硅膠粒度為80～300目，與氯仿萃取物的質(zhì)量比為5∶1～20∶1，層析后以體積比為100∶0～90∶10的氯仿-甲醇洗脫，用薄層層析檢查，在番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)大量流出時開始收集，至無番荔枝內(nèi)酯類物質(zhì)流出時為止，將收集的所述餾分濃縮、干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥的制備方法，其特征在于所述的硅膠粒度為100～200目，與所述的番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量比為30∶1，所述的薄層層析檢查用硅膠H硬板，以體積比3∶1的石油醚-丙酮為展開劑，以Dragendorff試劑即碘化鉍鉀試劑顯色。
10.一種番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥乳劑的制備方法，其特征在于所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥乳劑配比如下每1000g權(quán)利要求1～5所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥中加入50～200g大豆油和10～20g卵磷酯，按上述比例加熱混合至物質(zhì)溶解后加注射用水至總體積為500～1500mL，經(jīng)乳化處理后過濾，灌封，滅菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥乳劑的制備方法，其特征在于所述的大豆油為100g，所述的卵磷酯為12g，所述的總體積為1000mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種番荔枝內(nèi)酯抗癌有效部位藥及其制備方法,以番荔枝種子為原料,首先用有機溶劑提取制備番荔枝總內(nèi)酯,然后番荔枝總內(nèi)酯經(jīng)硅膠柱層析,石油醚－丙酮洗脫精制處理后,制備得阿諾寧－1和阿諾寧－2總含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%～70%的抗癌藥,并以脂肪乳作為劑型。本發(fā)明抗癌藥中由于富集了高活性番荔枝內(nèi)酯成分,因而不僅活性更強,而且組成簡單,易于質(zhì)量控制;同時,其制備方法簡單、易實施、生產(chǎn)成本低,并成功解決制劑問題,具有極強實用性。
文檔編號A61K31/365GK1370530SQ0110759
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者魏孝義, 謝海輝, 吳淑君, 鄭祥慈, 劉梅芳, 楊仁洲 申請人:中國科學(xué)院華南植物研究所