專利名稱：糖元合成酶激酶3的基于吡嗪的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)的吡嗪化合物，和含有這些化合物的藥物組合物，以及該化合物和組合物單獨(dú)或聯(lián)合其它藥物學(xué)上活性的藥劑的用途。本發(fā)明提供的化合物和組合物具有在治療由GSK3活性介導(dǎo)的疾病，如糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、肥胖、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血(特別是大腦缺血)、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙，免疫缺陷或癌癥等疾病中的實(shí)用性。
背景技術(shù)：
糖元合成酶激酶3(GSK3)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)其已鑒別出了兩種同工型α和β。Woodgett，Trends Biochem Sci.，16177-81(1991)。兩種GSK3同工型在靜止細(xì)胞中都具有組成型活性。最初，GSK被鑒定為通過直接磷酸化而抑制糖元合成酶的激酶。在胰島素活化時(shí)，GSK3被滅活，從而能夠激活糖元合成酶，并可能還有其它胰島素依賴性的事件，如葡萄糖運(yùn)輸。后來，已顯示其它生長(zhǎng)因子，它們像胰島素一樣，通過受體酪氨酸激酶(RTK)發(fā)出信號(hào)也滅活GSK3活性。這些信號(hào)分子的例子包括IGF-1和EGF。Saito等，Biochem J.，30327-31(1994)；Welsh等，Biochem J.，294625-29(1993)；和Cross等，Biochem J.，30321-26(1994)。
抑制GSK3活性的藥劑在治療由GSK3的活性介導(dǎo)的疾病中是有用的。另外，GSK3的抑制模仿生長(zhǎng)因子信號(hào)傳遞途徑的活化，因此GSK3抑制劑對(duì)治療這些途徑活性不足的疾病是有用的。下文描述了可用GSK3抑制劑治療的疾病的例子。
糖尿病2型糖尿病是老化過程中持續(xù)增長(zhǎng)的普遍疾病。其最初特征是對(duì)胰島素敏感性的降低，和循環(huán)的胰島素濃度的補(bǔ)償性上升，后者是維持正常的血糖水平所必需的。胰腺β細(xì)胞的分泌的增加導(dǎo)致了胰島素水平提高，而導(dǎo)致的高胰島素血癥是與糖尿病的心血管并發(fā)癥相關(guān)的。隨著胰島素抗性惡化，對(duì)胰腺β細(xì)胞的要求穩(wěn)定提高，直到胰腺不再能提供足夠水平的胰島素，導(dǎo)致血糖水平提高。最終，發(fā)生明顯的高血糖癥和高血脂癥，導(dǎo)致與糖尿病有關(guān)的破壞性的長(zhǎng)期并發(fā)癥，包括心血管疾病、腎衰竭和失明。尚未了解導(dǎo)致2型糖尿病的確切機(jī)制，但該機(jī)制導(dǎo)致葡萄糖對(duì)骨骼肌的運(yùn)輸受到損害，肝葡萄糖生產(chǎn)增加，和胰島素應(yīng)答不充分。膳食改善通常是無效的，因此大多數(shù)病人最終需要藥物干涉，來有效防止和/或減緩疾病并發(fā)癥的發(fā)展。可用一種或多種可購得的口服抗-糖尿病藥劑治療許多病人，包括磺脲，來提高胰島素分泌?；请逅幬锏睦影ㄒ种聘纹咸烟巧a(chǎn)的甲福明，和曲格列酮，一種胰島素敏化藥物。盡管利用這些藥劑，30-40％的糖尿病不能用這些藥物充分控制，而需要皮下胰島素注射。另外，這些治療各有副作用。例如，磺脲能導(dǎo)致低血糖，而曲格列酮能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝中毒。目前，需要新穎和改良的藥物來治療前驅(qū)糖尿病和糖尿病病人。
如上所述，GSK3抑制刺激胰島素依賴性的過程，而且因此在治療2型糖尿病中是有用的。最近用鋰鹽獲得數(shù)據(jù)提供了支持該觀點(diǎn)的證據(jù)。最近已報(bào)道鋰離子能抑制GSK3活性。Klein等，PNAS 938455-9(1996)。1924年以來，已報(bào)道鋰具有抗糖尿病效果，包括減少血漿葡萄糖水平，提高吸收，加強(qiáng)胰島素，上調(diào)葡萄糖合成酶活性和刺激皮膚、肌肉和脂肪細(xì)胞中的糖元的合成。然而，在抑制GSK3活性的使用中鋰還未被廣泛接受，可能是因?yàn)槠湮墨I(xiàn)記載的對(duì)GSK3以外的分子靶的效果。嘌呤類似物5-碘結(jié)核菌素(也是GSK3抑制劑)，在大鼠肝細(xì)胞中也刺激糖元合成并拮抗胰高血糖素和后葉加壓素對(duì)糖元合成酶的滅活。Fluckiger-Isler等，Biochem J，29285-91(1993)；和Massillon等，Biochem J 299123-8(1994)。然而，也已顯示該化合物抑制其它絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶。Massillon等，Biochem J 299123-8(1994)。
阿耳茨海默氏病GSK3也涉及與阿耳茨海默氏病(AD)相關(guān)的生物途徑。AD的病理學(xué)特征是淀粉樣前體蛋白(APP)的非正常加工形式的胞外斑，稱為β-淀粉肽(β-AP)，和含有大部分由高磷酸化τ蛋白組成的成對(duì)螺旋纖絲的胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的發(fā)展。GSK3是已發(fā)現(xiàn)的許多在PHFτ特征性非正常位點(diǎn)上體外磷酸化τ蛋白的激酶之一，而且是已被證明在活細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行該作用的唯一激酶。Lovestone等，Current Biology 41077-86(1994)；和Brownlees等，Neuroreport 83251-3255(1997)。另外，GSK3激酶抑制劑，LiCl，在細(xì)胞中封閉τ高磷酸化。Stambolic等，Current Biology 61664-8(1996)。因此GSK3活性可能對(duì)于神經(jīng)纖維纏結(jié)的產(chǎn)生和因此對(duì)于疾病的發(fā)展作出貢獻(xiàn)。近來已顯示GSK3β和另一種AD發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵蛋白，早老蛋白1(PS1)有關(guān)。Takashima等，PNAS 959637-9641(1998)。PS1基因中的突變導(dǎo)致β-AP產(chǎn)生的增加，但該文作者也證明突變的PS1蛋白與GSK3β結(jié)合得更緊密，并且加強(qiáng)τ的磷酸化，其與PS1的相同區(qū)域結(jié)合。
有趣的是，也已顯示另一種GSK3底物，β-連環(huán)蛋白，與PS1結(jié)合。Zhong等，Nature 395698-702(1998)。GSK3磷酸化時(shí)降解的目標(biāo)是胞液β-連環(huán)蛋白，而降低的β-連環(huán)蛋白活性與神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)β-AP誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡敏感性的增加有關(guān)。因此，GSK3β和突變PS1增加的締合可說明在PS1突變性AD病人大腦中已觀察到的β-連環(huán)蛋白水平的降低，和疾病相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加。與這些觀察一致，顯示注射反義而不是有義GSK3在體外封閉了β-AP對(duì)神經(jīng)元的病理學(xué)作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡開始延遲24小時(shí)，并使1小時(shí)的細(xì)胞存活率從12提高到35％。Takashima等，PNAS 907789-93(1993)。在這些后來的研究中，胞內(nèi)GSK3活性的加倍先于細(xì)胞死亡作用(施用β-AP3-6小時(shí)內(nèi))，提示除了提高GSK3與其底物的接近性的遺傳機(jī)制外，β-AP確實(shí)能提高GSK3活性。通過觀察到GSK3蛋白質(zhì)表達(dá)水平(但就此而言，不是比活性)在AD的突觸后上清液中，比在正常腦組織中增加了50％提供了GSK3對(duì)AD的作用的進(jìn)一步證據(jù)。Pei等，J Neuropathol Exp 5670-78(1997)。因此，相信GSK3的特異性抑制劑將對(duì)緩解阿耳茨海默氏病的發(fā)展起作用。
其它CNS疾病除了鋰鹽對(duì)上述疾病的作用，使用鋰鹽治療雙向性精神障礙疾病(躁狂抑郁綜合征)已有很長(zhǎng)的歷史。該對(duì)鋰的臨床反應(yīng)可反映GSK3活性和雙向性精神障礙的病源有關(guān)，在該情況下GSK3抑制劑將與該指標(biāo)有關(guān)。為了支持該觀點(diǎn)，最近已顯示2-丙基戊酸鹽(valproate)(另一種常用于治療雙向性精神障礙的藥物)也是GSK3抑制劑。Chen等，J.Neurochemistry 721327-1330(1999)。鋰和其它GSK3抑制劑可對(duì)治療雙向性精神障礙起作用的一種機(jī)制是提高經(jīng)受反常高水平的，由神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸誘導(dǎo)的興奮的神經(jīng)元的存活率。Nonaka等，PNAS，952642-2647(1998)。還相信谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮毒性是與急性損傷，如腦缺血、外傷性腦損傷和細(xì)菌感染等有關(guān)的神經(jīng)變性的主因。另外，相信過量谷氨酸信號(hào)是阿耳茨海默氏病，杭廷頓氏舞蹈病、帕金森氏病、AIDS相關(guān)性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(AML)和多發(fā)性硬化(MS)等疾病中可見的慢性神經(jīng)元損傷的因子。Thomas，J.Am.Geriatr.Soc 431279-89(1995)。因此相信GSK3抑制劑是對(duì)這些疾病和其它神經(jīng)變性疾病治療是有用的。
免疫加強(qiáng)
GSK3使轉(zhuǎn)錄因子NF-AT磷酸化，并促進(jìn)其從核中運(yùn)出，和鈣調(diào)磷酸酶的作用正相反。Beals等，Science 2751930-33(1997)。因此，GSK3通過NF-AT封閉早期免疫應(yīng)答的基因活化，而且GSK3抑制劑可允許并延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的活化。因此，相信GSK抑制劑能延長(zhǎng)和加強(qiáng)某些細(xì)胞因子的免疫刺激作用，而且這種作用能加強(qiáng)那些用于腫瘤免疫治療或一般用于免疫治療的細(xì)胞因子的能力。
其它疾病鋰還有其它生物學(xué)上的作用。它在體外和在體內(nèi)都是造血作用的強(qiáng)刺激劑。Hammond等，Blood 5526-28(1980)。在犬中，碳酸鋰消除了嗜中性白血球減少癥的復(fù)發(fā)，并使其它血細(xì)胞計(jì)數(shù)正常化。Doukas等，Exp Hematol 14215-221(1986)。如果鋰的這些作用是通過GSK3的抑制介導(dǎo)的，則GSK3抑制劑將具有更廣泛的治療用途。
由于GSK3的抑制劑能用于治療許多疾病，新穎GSK3抑制劑的鑒定是非常需要的。
發(fā)明簡(jiǎn)述現(xiàn)在，已驚人的發(fā)現(xiàn)糖元合成酶激酶3(GSK3)活性能在體外或在體內(nèi)被本發(fā)明提供的一些基于吡嗪的衍生物抑制。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的吡嗪化合物對(duì)GSK3具有特異性。因此，本發(fā)明提供了用于在體外抑制GSK3活性和在體內(nèi)治療GSK3介導(dǎo)的疾病的新穎化合物、組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新穎化合物 其中X和Y分別選自氮、氧和可任選取代的碳；A1和A2是可任選取代的芳基或雜芳基；R1、R2、R3和R4分別選自氫、羥基、和可任選取代的低級(jí)烷基、環(huán)狀低級(jí)烷基、烷基氨基烷基、低級(jí)烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、芳基和雜芳基；
R1’、R2’、R3’和R4’分別選自氫和可任選取代的低級(jí)烷基；R5、R6分別選自氫、羥基、鹵素、羧基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亞酰胺基、亞脒基、氰基和取代或未取代的低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺?；?、磺酰氨基(sulfonylamino)、亞磺酰氨基(sulfonamido)、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、雜芳基氨基、雜芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、脒基、環(huán)烷基、環(huán)酰氨基、環(huán)硫代酰氨基、環(huán)脒基、雜環(huán)脒基、環(huán)亞酰氨基、雜環(huán)亞酰氨基、胍基、氰基胍基、芳基、聯(lián)芳基、雜芳基、雜聯(lián)芳基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、芳基磺酰基和芳基磺酰氨基；和其藥物學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的方法、化合物和組合物可單獨(dú)，或與其它藥理學(xué)活性劑聯(lián)用，可應(yīng)用在治療GSK3活性介導(dǎo)的疾病，如治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙，免疫缺陷或癌癥等。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了在體外或體內(nèi)抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)活性的化合物、組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新穎化合物 其中X和Y分別選自氮、氧和可任選取代的碳；A1和A2是可任選取代的芳基或雜芳基；R1、R2、R3和R4分別選自氫、羥基、和可任選取代的低級(jí)烷基、環(huán)狀低級(jí)烷基、烷基氨基烷基、低級(jí)烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、芳基和雜芳基；R1’、R2’、R3’和R4’分別選自氫和可任選取代的低級(jí)烷基；R5、R6分別選自氫、羥基、鹵素、羧基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亞酰胺基、亞脒基、氰基和取代或未取代的低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲?；⒌图?jí)烷基羰基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺?；⒒酋０被?sulfonylamino)、亞磺酰氨基(sulfonamido)、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、雜芳基氨基、雜芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、脒基、環(huán)烷基、環(huán)酰氨基、環(huán)硫代酰氨基、環(huán)脒基、雜環(huán)脒基、環(huán)亞酰氨基、雜環(huán)亞酰氨基、胍基、氰基胍基、芳基、聯(lián)芳基、雜芳基、雜聯(lián)芳基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、芳基磺?；头蓟酋０被?；和其藥物學(xué)上可接受的鹽。
在本發(fā)明的一個(gè)目前的優(yōu)選例中，X和Y中至少一個(gè)是氮。該組的代表性化合物包括其中X和Y之一是氮，而X和Y中另一個(gè)是氧或可任選取代的碳的那些化合物。優(yōu)選X和Y都是氮。
構(gòu)成部分A1和A2分別可以是具有3-10個(gè)環(huán)上原子和可任選的一個(gè)或多個(gè)環(huán)上雜原子的芳環(huán)。因此在一個(gè)實(shí)施例中，A1和/或A2可以是任選取代的碳環(huán)芳基。另外，A1和/或A2是任選取代的雜芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、吡嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯并噻唑基、苯并吡啶基和苯并咪唑基，其可被至少一個(gè)，不多于三個(gè)取代基團(tuán)取代。代表性取代基團(tuán)可選自例如硝基、氨基、氰基、鹵素、硫代酰氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亞脒基、胍基、磺酰氨基、羧基、甲?；?、低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)芳烷基羰基、低級(jí)雜芳烷基羰基、烷硫基，氨基烷基和氰基烷基。
在本發(fā)明的一個(gè)目前特別優(yōu)選例中，A1和/或A2具有式 其中R8和R9分別選自氫、硝基、氨基、氰基、鹵素、硫代酰氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亞脒基、胍基、亞磺酰氨基、羧基、甲酰基、低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)芳烷基羰基、低級(jí)雜芳烷基羰基、烷硫基、芳基和芳烷基。最優(yōu)選的A是選自硝基吡啶基、氨基硝基吡啶基、氰基吡啶基、氰基噻唑基、氨基氰基吡啶基、三氟甲基吡啶基、甲氧基吡啶基、甲氧基硝基吡啶基、甲氧基氰基吡啶基和硝基噻唑基。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，R1、R2、R3和R4的至少一個(gè)是氫、未取代或取代的低級(jí)烷基，選自鹵代低級(jí)烷基、雜環(huán)氨基烷基和低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷基；或低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷基。目前本發(fā)明優(yōu)選例包括其中R1、R2和R3是氫，而R4選自氫、甲基、乙基、氨基乙基、二甲基氨基乙基、吡啶基乙基、哌啶基、吡咯烷基乙基、哌嗪基乙基和嗎啉基乙基的化合物。
目前，本發(fā)明的其它優(yōu)選化合物包括式(I)的化合物，其中R5和R6的至少一個(gè)選自取代和未取代的芳基、雜芳基和聯(lián)芳基。在目前的優(yōu)選例中，R5和R6的至少一個(gè)是取代或未取代的下式的基團(tuán) 其中R10、R11、R12、R13和R14分別選自氫、硝基、氨基、氰基、鹵素、硫代酰氨基、羧基、羥基和可任選取代的低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、鹵代低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷硫基、烷基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、氨基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、氨基芳烷基、低級(jí)烷基氨基烷基、芳基、雜芳基、環(huán)雜烷基、芳烷基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、芳基羰氧基烷基、烷基羰氧基烷基、雜芳基羰氧基烷基、芳烷基羰氧基烷基、和雜芳烷基羰氧基烷基。目前獲得的特別優(yōu)選的化合物是其中R10、R11、R13和R14是氫，而R12是選自鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、嗎啉代基、哌啶基和氰基；R11、R13和R14是氫，而R10和R12分別選自鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷基、嗎啉代基、哌啶基和氰基；R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜芳基；R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜環(huán)烷基；和其中R10、R11、R12、R13和R14的至少一個(gè)是鹵素，而R10、R11、R12、R13和R14的剩下基團(tuán)是氫。優(yōu)選的，R5和R7中的至少一個(gè)選自氯苯基、二氯苯基、氟苯基、二氟苯基、溴苯基、二氯氟苯基、三氟甲基苯基、氯氟苯基、溴氯苯基、溴氟苯基、乙基苯基、甲基氯苯基、乙基氯苯基、咪唑基苯基、氰基苯基、嗎啉代苯基和氰基氯苯基。
在本發(fā)明的代表性實(shí)施例中，R5和R6可以是芳烷基、羥基烷基、氨基烷基、氨基芳烷基、羰基氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、芳基羰基氨基烷基、芳烷基羰基氨基烷基、氨基烷氧基烷基和芳基氨基烷基等取代烷基；烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳基烷基氨基、芳基羰基氨基、烷硫基羰基氨基、芳基磺?；被㈦s芳基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基和雜芳烷基羰基氨基等取代氨基；或未取代或取代的氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基和烷基氨基烷氧基羰基等取代羰基。在其它實(shí)施例中，R6可選自脒基、胍基、環(huán)酰亞氨基、雜環(huán)酰亞氨基、環(huán)酰氨基、雜環(huán)酰氨基、環(huán)硫代酰氨基和雜環(huán)低級(jí)烷基。在其它優(yōu)選例中，R6可以是芳基或雜芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、吡咯基吡啶基、苯并噻唑基、苯并吡啶基、苯并三唑基和苯并咪唑基。本文所用的代表性雜環(huán)基團(tuán)包括例如下列所示基團(tuán)(其中取代基團(tuán)和其它下文所示的取代基團(tuán)的結(jié)合點(diǎn)，是通過上部的左手鍵)。這些雜環(huán)基團(tuán)可進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性雜芳基基團(tuán)包括下文所示的那些。這些雜芳基基團(tuán)可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性環(huán)亞酰氨基和雜環(huán)酰亞氨基基團(tuán)包括下文所示的那些。這些環(huán)酰亞氨基和雜環(huán)酰亞氨基可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性取代脒基和雜環(huán)脒基基團(tuán)包括下文所示的那些。這些取代脒基和雜環(huán)脒基基團(tuán)可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性取代烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、氨基烷氧基羰基氨基和芳基羰基氨基基團(tuán)包括例如下文所示的那些。這些基團(tuán)可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性取代氨基羰基基團(tuán)包括例如下文所示的那些。這些雜環(huán)基團(tuán)可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 代表性取代烷氧基羰基基團(tuán)包括例如下文所示的那些。這些烷氧基羰基基團(tuán)可被進(jìn)一步取代，并可在如對(duì)于有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容是明顯的不同位置結(jié)合。 目前優(yōu)選的該組的代表性化合物包括例如{2-[(3-氨基-4-硝基苯基)氨基]乙基}[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]胺、[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]{2-[(4-硝基苯基)氨基]乙基}胺、4-[(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)氨基]苯甲腈、[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]甲基{2-[(4-硝基-苯基)氨基]乙基}胺、N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}-氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]乙酰胺、N-(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)(叔丁氧基)羧酰胺、[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺和N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]-2-(甲基氨基)乙酰胺。
在另一方面，本發(fā)明提供了組合物，該組合物含有一定量的式(I)的化合物(該量的化合物當(dāng)被施用到在人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，能有效調(diào)節(jié)GSK3的活性)和藥物學(xué)上可接受的載體。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在人或動(dòng)物中抑制GSK3活性的方法，包括對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體施用GSK3抑制量的結(jié)構(gòu)(I)的化合物。
本發(fā)明還提供了治療患GSK3介導(dǎo)的疾病的人或動(dòng)物個(gè)體的方法，包括將治療有效量的上式(I)的化合物，單獨(dú)或聯(lián)合其它治療上活性的藥劑一起施給人或動(dòng)物個(gè)體。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用作藥物的如上文限定的式I的化合物，以及在制造用于治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、肥胖、動(dòng)脈硬化性心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血(特別是腦部缺血)、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌癥的藥劑中使用這些化合物的方法。
如上文和本文其它地方所用，下列術(shù)語具有如下定義的意義“糖元合成酶激酶3”和“GSK3”可在本文中交替使用，指任何與人GSK3β氨基酸序列(Genbank登錄號(hào)L33801)的56和340位之間的氨基酸具有60％以上的序列同源性的蛋白質(zhì)。為了測(cè)定兩條氨基酸序列或兩條核酸之間的同源性百分?jǐn)?shù)，按最佳比較目的排列該序列(如，可在一條多肽或核酸中引入缺口，來與另一條多肽或核酸最佳排列)。然后比較在對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一條序列中的一個(gè)位置被另一條序列中對(duì)應(yīng)位置上的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，分子在那一個(gè)位置是同源的(即，如本文所用氨基酸或核酸“同源”等價(jià)于氨基酸或核酸“等同”)。兩條序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)是2條序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同源性＝#相同位置/總#位置×100)。如Woodgett，Trends Biochem Sci.，16177-81(1991)所述(在此引入以供參考)，最初通過其使糖元合成酶磷酸化作用鑒定了GSK3。通過調(diào)節(jié)GSK3激酶活性，可抑制或可刺激GSK活性的下游活性。例如，當(dāng)GSK3活性被抑制時(shí)，可活化糖元合成酶，使糖元的生產(chǎn)增加。也知道GSK3能在各種其它環(huán)節(jié)(包括例如c-jun、β-連接蛋白和τ-蛋白)中作為激酶。可理解，GSK3激酶活性的抑制可在不同的生物學(xué)環(huán)節(jié)中導(dǎo)致各種效果。然而，本發(fā)明不受任何本發(fā)明運(yùn)作機(jī)制的理論限制。
本文所用的“GSK3抑制劑”指顯示在下文一般描述的對(duì)GSK3抑制劑活性的無細(xì)胞試驗(yàn)中測(cè)量的，與GSK3相關(guān)的IC50不大于約100μM，更典型的不大于約50μM的化合物?！癐C50”是將酶(如GSK3)活性降低到最大值一半的水平的抑制劑濃度。已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明代表性的化合物展示對(duì)GSK3的抑制劑活性。本發(fā)明的化合物優(yōu)選展示如在無細(xì)胞GSK3激酶試驗(yàn)中測(cè)量得到的，對(duì)GSK3的IC50不大于約10μM、更優(yōu)選不大于5μM，而更優(yōu)選不大于約1μM，而最優(yōu)選不大于200nM。
“可任選取代”指用單價(jià)或二價(jià)基團(tuán)取代氫。合適的取代基團(tuán)包括例如羥基、硝基、氨基、亞氨基、氰基、鹵素、硫代、硫代酰氨基、脒基、亞脒基、氧代、氨肟基、甲氧肟基、亞脒基、胍基、亞磺酰氨基、羧基、甲?；⒌图?jí)烷基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基等。
取代基團(tuán)自身可被取代。取代取代基團(tuán)的基團(tuán)可以是羧基、鹵素、硝基、氨基、氰基、羥基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、氨基羰基、-SR、硫代酰氨基、-SO3H、-SO2R或環(huán)烷基、其中R通常是氫、羥基或低級(jí)烷基。
當(dāng)被取代的取代基包含直鏈基團(tuán)時(shí)，取代可在鏈內(nèi)(如2-羥基丙基、2-氨基丁基等)或在鏈末端(如2-羥乙基、3-氰基丙基等)發(fā)生。被取代的取代基可以是共價(jià)鍵合的碳或雜原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀排列。
本文所用的“低級(jí)烷基”指支鏈或直鏈烷基基團(tuán)，包含1到10個(gè)未取代或取代(如用1個(gè)或多個(gè)鹵素、羥基或其它基團(tuán)，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、三氟甲基、五氟乙基等)的碳原子。
“亞烷基”指具有1到20個(gè)碳原子的二價(jià)直鏈或支鏈飽和脂族基團(tuán)。本發(fā)明化合物中使用的典型亞烷基基團(tuán)是低級(jí)亞烷基基團(tuán)(在骨架中具有1到約6個(gè)碳原子)。本文的“烯基”指具有1個(gè)或多個(gè)雙鍵和2到20個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀基團(tuán)。本文的“炔基”指具有1或多個(gè)三鍵和2到20個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀基團(tuán)。
本文所用的“低級(jí)烷氧基”指RO-，其中R是低級(jí)烷基。低級(jí)烷氧基的代表例包括甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、三氟甲氧基等。
“環(huán)烷基”指單-或多環(huán)、雜環(huán)或碳環(huán)烷基取代基。典型環(huán)烷基取代基具有3到8個(gè)骨架(即環(huán))原子，其中各骨架原子是碳或雜原子。本文的術(shù)語“雜環(huán)烷基”指在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有1到5、更典型是1到4個(gè)雜原子的環(huán)烷基取代基。本發(fā)明化合物中使用的合適雜原子是氮、氧和硫。代表性雜環(huán)烷基基團(tuán)包括嗎啉代、哌嗪基、哌啶基(Piperadinyl)等。碳環(huán)烷基基團(tuán)是環(huán)烷基基團(tuán)，其中所有的環(huán)上原子都是碳。當(dāng)與環(huán)烷基取代基聯(lián)用時(shí)，術(shù)語“多環(huán)”在本文中指稠合或非稠合的烷基環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
本文的“鹵素”指鹵素基團(tuán)，如氟、氯、溴或碘?！胞u代烷基”指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的烷基基團(tuán)。術(shù)語“鹵代低級(jí)烷基”指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的低級(jí)烷基基團(tuán)。術(shù)語“鹵代烷氧基”指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的烷氧基基團(tuán)。術(shù)語“鹵代低級(jí)烷氧基”指被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代的低級(jí)烷氧基基團(tuán)。
“芳基”指具有3到14個(gè)骨架碳或雜原子的單環(huán)和多環(huán)芳族基團(tuán)，同時(shí)包括碳環(huán)芳族基團(tuán)和雜環(huán)芳族基團(tuán)。碳環(huán)芳基是芳環(huán)中的所有成環(huán)原子都是碳的芳基。本文術(shù)語“雜芳基”指具有1到4個(gè)在芳族環(huán)中作為環(huán)上原子的雜原子，而剩下的環(huán)上原子是碳原子的芳基。當(dāng)與芳基取代基聯(lián)用時(shí)，本文的術(shù)語“多環(huán)”指稠合和非稠合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)是芳族的，如苯并二噁唑基(具有與苯基稠合的雜環(huán)，即 )萘基等。本發(fā)明化合物中用作取代基的示范性芳基基團(tuán)包括苯基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯并噻唑基、苯并吡啶基和苯并咪唑基等。
“芳烷基”指被芳基取代的烷基基團(tuán)。通常，本發(fā)明化合物中使用的芳烷基基團(tuán)具有結(jié)合在芳烷基基團(tuán)的烷基部分的1到6個(gè)碳原子。本發(fā)明化合物中使用的合適芳烷基包括例如芐基、甲基吡啶基等。
本文的“氨基”指-NH2基團(tuán)。本文術(shù)語“烷基氨基”指-NRR’基團(tuán)，其中R和R’分別是選自氫或低級(jí)烷基。本文術(shù)語“芳基氨基”指-NRR’基團(tuán)，其中R是芳基而R’是氫、低級(jí)烷基或芳基。本文的術(shù)語“芳烷基氨基”指-NRR’基團(tuán)，其中R是低級(jí)芳烷基，而R’是氫、低級(jí)烷基、芳基、或低級(jí)芳烷基。
本文的術(shù)語“芳基環(huán)烷基氨基”指芳基-環(huán)烷基-NH-基團(tuán)，其中環(huán)烷基是二價(jià)環(huán)烷基基團(tuán)。通常，環(huán)烷基具有3到6個(gè)骨架原子，其中可任選1到約4個(gè)為雜原子。術(shù)語“氨基烷基”指末端被氨基取代的烷基基團(tuán)。
術(shù)語“烷氧基烷基”指-烷基1-O-烷基2基團(tuán)，其中烷基1指亞烷基或鏈烯基，而烷基2是烷基或鏈烯基。術(shù)語“低級(jí)烷氧基烷基”指烷氧基烷基，其中烷基1是低級(jí)亞烷基或低級(jí)鏈烯基，而烷基2是低級(jí)烷基或低級(jí)鏈烯基。術(shù)語“芳氧基烷基”指-亞烷基-O-芳基基團(tuán)。術(shù)語“芳烷氧基烷基”指-亞烷基-O-芳烷基基團(tuán)，其中芳烷基是低級(jí)芳烷基。
本文的術(shù)語“烷氧基烷基氨基”指-NR-(烷氧基烷基)基團(tuán)，其中R通常是氫、低級(jí)芳烷基或低級(jí)烷基。本文的術(shù)語“氨基低級(jí)烷氧基烷基”指氨基烷氧基烷基，其中烷氧基烷基是低級(jí)烷氧基烷基。
本文的術(shù)語“氨基羰基”指-C(O)-NH2基團(tuán)。本文的術(shù)語“取代的氨基羰基”指-C(O)-NRR’基團(tuán)，其中R是低級(jí)烷基，而R’是氫或低級(jí)烷基。本文的術(shù)語“芳基氨基羰基”指-C(O)-NRR’基團(tuán)，其中R是芳基而R’是氫、低級(jí)烷基或芳基。本文的“芳烷基氨基羰基”指-C(O)-NRR’基團(tuán)，其中R是低級(jí)芳烷基，而R’是氫、低級(jí)烷基、芳基或低級(jí)芳烷基。
本文的“氨基磺?；敝?S(O)2-NH2基團(tuán)。本文的“取代的氨基磺?；敝?S(O)2-NRR’基團(tuán)，其中R是低級(jí)烷基，而R’是氫或低級(jí)烷基。本文的術(shù)語“芳烷基氨基磺?；蓟敝?芳基-S(O)2-NH-芳烷基基團(tuán)，其中芳烷基是低級(jí)芳烷基。
“羰基”指二價(jià)-C(O)-基團(tuán)。
“羰氧基”一般指-C(O)-O-基團(tuán)，這些基團(tuán)包括酯-C(O)-O-R，其中R是低級(jí)烷基、環(huán)烷基、芳基或低級(jí)芳烷基。本文的術(shù)語“羰氧基環(huán)烷基”一般同時(shí)指“羰氧基碳環(huán)烷基”和“羰氧基雜環(huán)烷基”，即，其中R分別是碳環(huán)烷基或雜環(huán)烷基。本文的術(shù)語“芳基羰氧基”指-C(O)-O-芳基基團(tuán)，其中芳基是單-或多環(huán)，碳環(huán)芳基或雜環(huán)芳基。本文的術(shù)語“芳烷基羰氧基”指-C(O)-O-芳烷基基團(tuán)，其中芳烷基是低級(jí)芳烷基。
本文的術(shù)語“磺?；敝?SO2-基團(tuán)。“烷基磺?；敝附Y(jié)構(gòu)為-SO2R-的取代的磺?；渲蠷是烷基。本發(fā)明化合物中使用的烷基磺?；鶊F(tuán)通常是低級(jí)烷基磺?；鶊F(tuán)，在其骨架結(jié)構(gòu)中具有1到6個(gè)碳原子。因此，本發(fā)明化合物中使用的典型烷基磺?；鶊F(tuán)包括例如甲基磺?；?即，R是甲基)，乙基磺?；?即，其中R是乙基)，丙基磺?；?即，其中R是丙基)等。本文的術(shù)語“芳基磺?；敝?SO2-芳基基團(tuán)。本文的術(shù)語“芳烷基磺?；敝?SO2-芳烷基基團(tuán)，其中芳烷基是低級(jí)芳烷基。本文的術(shù)語“磺酰氨基”指-SO2NH2。
本文所用的術(shù)語“羰基氨基”指二價(jià)-NH-C(O)-基團(tuán)，其中羰基氨基基團(tuán)的酰胺氮的氫原子可被低級(jí)烷基、芳基或低級(jí)芳烷基基團(tuán)取代。這些基團(tuán)包括氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-R)和酰胺-NH-C(O)-NR’-R，其中R和R’是直鏈或支鏈低級(jí)烷基，環(huán)烷基、或芳基、或低級(jí)芳烷基。術(shù)語“低級(jí)烷基羰基氨基”指烷基羰基氨基，其中R是在骨架結(jié)構(gòu)中具有1到6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基。術(shù)語“芳基羰基氨基”指-NH-C(O)-R基團(tuán)，其中R是芳基。相似的，術(shù)語“芳烷基羰基氨基”指羰基氨基，其中R是低級(jí)芳烷基。
本文所用的術(shù)語“胍基(guanidino)”或“胍基(guanidyl)”指衍生自胍H2N-C(＝NH)-NH2的基團(tuán)。這些基團(tuán)包括鍵合在帶有形式雙鍵的氮原子上的(胍的“2”-位，如二氨基亞甲基氨基，(H2N)2C＝NH-))和鍵合在帶有形式單鍵的各氮原子上的(胍的“1-”位和/或“3-”位，如H2N-C(＝NH)-NH-)。任一這些氮原子上的氫原子可被合適的取代基，如低級(jí)烷基、芳基、或低級(jí)芳烷基取代。
本文所用的術(shù)語“脒基”指基團(tuán)R-C(＝N)-NR’(基團(tuán)在“N1”氮上)和R(NR’)C＝N-(基團(tuán)在“N2”氮上)，其中R和R’可以是氫、低級(jí)烷基、芳基、或低級(jí)芳烷基。
可用本文所述的方法，或其它本領(lǐng)域熟知的方法輕易合成本發(fā)明的化合物。
可用已知方法，如層析、結(jié)晶等純化本發(fā)明的GSK3抑制劑化合物。
和至少一種其它激酶比較，本發(fā)明的化合物優(yōu)選展現(xiàn)對(duì)GSK3相對(duì)充分選擇性的抑制劑活性。本文所用的術(shù)語“選擇性”指和至少一種其它激酶比較，更高的對(duì)GSK3的抑制性。優(yōu)選本發(fā)明的GSK3抑制劑與其它兩類激酶比較，對(duì)GSK3是選擇性的。對(duì)GSK3以外的其它激酶的激酶活性試驗(yàn)是公知的。見Havlicek等，J.Med.Chem.，40408-12(1997)，在此引入以供參考。可根據(jù)下式定量GSK3選擇性GSK3選擇性＝IC50(其它激酶)÷IC50(GSK3)，其中當(dāng)IC50(其它激酶)＞IC50(GSK3)時(shí)，GSK3抑制劑對(duì)GSK3是選擇性的。因此，對(duì)GSK3有選擇性的GSK3抑制劑展示的GSK3選擇性比對(duì)GSK3以外的其它激酶的抑制性的選擇性大1倍以上。在本文中，術(shù)語“其它激酶”指GSK3以外的激酶。這種選擇性通常用實(shí)施例20中所述的無細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)量。
通常，本發(fā)明的GSK3抑制劑對(duì)GSK3比對(duì)其它激酶展示至少約2倍(即IC50(其它激酶)÷IC50(GSK3))以上的選擇性，而更典型的是它們至少展示約5倍的選擇性。通常，本發(fā)明的GSK3抑制劑展示的對(duì)GSK3的選擇性，是至少一種其它激酶的至少約10倍，理想的至少約100倍，而更優(yōu)選的，至少約1000倍。
可用本文所述的試驗(yàn)，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的試驗(yàn)輕易的檢測(cè)出GSK3抑制劑活性。鑒定GSK3特異性抑制劑的示范性方法包括無細(xì)胞和基于細(xì)胞的GSK3激酶試驗(yàn)。無細(xì)胞GSK3激酶試驗(yàn)檢測(cè)通過與多肽GSK3直接相互作用起作用的抑制劑，而基于細(xì)胞的GSK3激酶試驗(yàn)可鑒定通過與GSK自身直接相互作用，或干擾GSK3表達(dá)或干擾產(chǎn)生成熟活性GSK3的轉(zhuǎn)錄后加工起作用的抑制劑。
一般，無細(xì)胞GSK3激酶試驗(yàn)可容易地通過下列步驟進(jìn)行(1)將GSK3與肽底物、放射性標(biāo)記的ATP(如γ33P-或γ32P-ATP，兩者都購自Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)、鎂離子、和可任選的一種或多種候選抑制劑一起培育；(2)將混合物培育一段時(shí)間，使放射性標(biāo)記的磷酸通過GSK3活性摻入肽底物中；(3)將全部或部分酶反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中，一般是微量滴定孔中，其含有均一量的捕獲配體，它結(jié)合到在肽底物上的錨定配體上；(4)洗滌，以除去未反應(yīng)的放射性標(biāo)記ATP；然后(5)對(duì)留在各孔中的33P或32P定量。該量代表摻入肽底物的放射性標(biāo)記磷酸的量。抑制作用被觀察為摻入肽底物的放射性標(biāo)記的減少。
用于無細(xì)胞試驗(yàn)的合適肽底物可以是任何肽、多肽或合成的肽衍生物，其在適量ATP存在下可被GSK3磷酸化。合適的肽底物可基于GSK3的各種天然蛋白底物序列的部分，而且還可含有N-末端或C-末端修飾或延伸，包括間隔序列和錨定配體。因此，肽底物可置于較大的多肽中，或可是為GSK3磷酸化而設(shè)計(jì)的孤立的肽。
例如，可基于DNA結(jié)合蛋白CREB的亞序列，如Wang等，Anal.Chem.，220397-402(1994)(在此引入以供參考)中所述的CREB DNA結(jié)合蛋白中的SGSG-連接的CREB肽序列，來設(shè)計(jì)肽底物。在Wang等報(bào)道的試驗(yàn)中，CREB肽SXXXS基元的C-末端絲氨酸是可被cAMP-依賴典型蛋白激酶(PKA)酶促預(yù)磷酸化的，這是一個(gè)使基元N-末端絲氨酸能被GSK3磷酸化的步驟?；蛘?，可用修飾的CREB肽底物(其具有同樣的SXXXS基元，而且也含有N-末端錨定配體，但其合成時(shí)C-末端絲氨酸是被預(yù)磷酸化的(這樣的底物可從Chiron Technologies PTY Ltd.，Clayton，Australia商業(yè)購得))。當(dāng)肽合成時(shí)，在SXXXS基元中第二個(gè)絲氨酸的磷酸化免除了對(duì)作為獨(dú)立步驟的，用PKA酶促磷酸化該殘基的需要，而且錨定配體的摻入促進(jìn)了在其與GSK3反應(yīng)后肽底物的捕獲。
一般，用于激酶活性試驗(yàn)的肽底物可含有一個(gè)或多個(gè)可被GSK3磷酸化的位點(diǎn)，和一個(gè)或多個(gè)可被其它激酶，但不被GSK3磷酸化的位點(diǎn)。因此，這些其它位點(diǎn)可被預(yù)磷酸化，來產(chǎn)生可被GSK3磷酸化的基元。本文的術(shù)語“預(yù)磷酸化”指在用底物肽進(jìn)行激酶試驗(yàn)之前，用非放射性標(biāo)記的磷酸磷酸化底物肽。在肽底物合成中，可方便的進(jìn)行這種預(yù)磷酸化。
SGSG-連接的CREB肽可與錨定配體(如生物素)連接，其中P和Y之間靠近C末端的絲氨酸被預(yù)磷酸化。本文所用的術(shù)語“錨定配體”指可與肽底物結(jié)合，使肽底物易于被捕獲配體捕獲的配體，它能在洗滌步驟中固定肽底物，從而能除去未反應(yīng)的放射性標(biāo)記的ATP。示范性錨定配體是生物素。本文的術(shù)語“捕獲配體”指能以高親和力結(jié)合錨定配體的分子，其與固體結(jié)構(gòu)結(jié)合。結(jié)合捕獲載體的例子包括例如抗生素蛋白或抗生蛋白鏈菌素涂布的微量滴定孔或瓊脂糖珠。帶有捕獲配體的珠還可以與閃爍材料聯(lián)合，來提供檢測(cè)捕獲到的放射性標(biāo)記的底物肽的工具，或可在以后步驟中將閃爍材料加到捕獲的肽中。
用已知方法可在閃爍計(jì)數(shù)器中定量捕獲到的放射性肽底物。如果酶反應(yīng)在僅有限部分(如少于20％)肽底物被磷酸化的條件下進(jìn)行，在閃爍計(jì)數(shù)器中檢測(cè)到的信號(hào)將與GSK3的活性成正比。如果在反應(yīng)中存在抑制劑，GSK3活性將降低，因此摻入肽底物的放射性標(biāo)記的磷酸量將變少。因此，將檢測(cè)到較低的閃爍信號(hào)。結(jié)果，GSK3抑制劑活性將作為閃爍信號(hào)，與陰性對(duì)照(在反應(yīng)中不存在抑制劑)比較的降低被檢測(cè)出來。下文實(shí)施例265中更詳細(xì)描述了該試驗(yàn)。
基于細(xì)胞的GSK3激酶活性測(cè)試通常利用能同時(shí)表達(dá)GSK3和GSK3底物的細(xì)胞，如用編碼GSK3及其底物的基因，包括表達(dá)該基因的調(diào)控序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。為了實(shí)施基于細(xì)胞的試驗(yàn)，在本發(fā)明化合物存在下培育能表達(dá)這些基因的細(xì)胞。細(xì)胞被裂解，通過觀察其相對(duì)于未磷酸化形式在SDS PAGE上的泳動(dòng)性，或通過測(cè)定對(duì)底物的磷酸化形式特異性的抗體識(shí)別的底物量來測(cè)定磷酸化形式的底物比例。底物磷酸化的量是化合物抑制劑活性的指標(biāo)，即，作為與不存在抑制劑下進(jìn)行的試驗(yàn)比較，磷酸化的減少檢測(cè)了抑制作用。在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中檢測(cè)到的GSK3抑制活性可以是由于GSK3表達(dá)的抑制，或通過對(duì)GSK3激酶活性的抑制。
因此，基于細(xì)胞的試驗(yàn)還可用來具體測(cè)試與GSK3抑制有關(guān)的活性，如τ蛋白磷酸化的抑制、胰島素信號(hào)的加強(qiáng)等。例如，為了評(píng)估GSK3抑制劑抑制阿耳茨海默氏病類微管相關(guān)蛋白τ的磷酸化，可用人GSK3β和人τ蛋白共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后與一種或多種候選抑制劑一起培育。對(duì)于這類試驗(yàn)可用各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和表達(dá)載體。例如，可同時(shí)用人GSK3β表達(dá)質(zhì)粒(根據(jù)Stambolic等，1996，CurrentBiology，61664-68中所述的方案(在此引入以供參考))和含有在SV40早啟動(dòng)子下的人τ蛋白編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒，如pSG5轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。還可見Goedert等，EMBO J，8393-399(1989)，在此引入以供參考。可用特異性抗體，如AT8，其可從Polymedco Inc.(Cortlandt Manor，New York)購得，在裂解細(xì)胞后容易的檢測(cè)出τ的阿耳茨海默氏病類磷酸化。該下文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了該試驗(yàn)。
類似的，GSK3抑制劑化合物通過活化糖元合成酶加強(qiáng)胰島素信號(hào)的活性可容易的用基于細(xì)胞的糖元合成酶活性試驗(yàn)來確定。該試驗(yàn)使用通過提高糖元合成酶活性，來響應(yīng)胰島素刺激的細(xì)胞，如CHO-HIRC細(xì)胞系，其過度表達(dá)野生型胰島素受體(～100，000結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞)。可如Moller等，J Biol.Chem.，26514979-14985(1990)和Moller等，Mol.Endocrinol.，41183-1191(1990)(兩者都在此引入以供參考)所述產(chǎn)生CHO-HIRC細(xì)胞系。試驗(yàn)可通過在培養(yǎng)基中存在各種濃度的本發(fā)明化合物的條件下，培育血清-饑餓的CHO-HIRC細(xì)胞來進(jìn)行，然后在培育期終點(diǎn)裂解細(xì)胞。如Thomas等，Anal.Biochem.，25486-499(1968)所述，在裂解液中檢測(cè)到糖元合成酶活性。對(duì)各樣品作為最大糖元合成酶活性的百分?jǐn)?shù)，計(jì)算糖元合成酶活性，如Thomas等，同上所述，并作為候選GSK3抑制劑濃度的函數(shù)作圖?？捎帽绢I(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的常規(guī)擬合方法擬合一條四參數(shù)S形曲線，來計(jì)算將糖元合成酶活性提高到其最高水平一半(即，EC50)的候選GSK3抑制劑濃度。這在下文實(shí)施例266中更詳細(xì)的描述。
用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的方法可輕易的篩選GSK3抑制劑的體內(nèi)活性。例如，可通過檢測(cè)在2型糖尿病動(dòng)物模型中提高葡萄糖耐受性的能力來方便的鑒定在2型糖尿病治療中具有加強(qiáng)的治療活性的候選化合物。特別是，可在糖尿病小鼠(如KK、db/db、ob/ob)或糖尿病大鼠(如Zucker Fa/Fa或GK)中施用葡萄糖丸前，用數(shù)種途徑之任一施給候選化合物。施用候選化合物和葡萄糖后，在預(yù)定時(shí)間間隔取血，并評(píng)估血清葡萄糖和胰島素水平。在不存在內(nèi)源胰島素分泌水平的升高的情況下，葡萄糖處理的改善可看作胰島素敏化和可指示化合物效力。下文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了該試驗(yàn)。
可以衍生自無機(jī)或有機(jī)酸的鹽形式使用本發(fā)明的化合物。這些鹽包括但不限于下列乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate)、果膠酸鹽(pectinate)、硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。含氮基團(tuán)還可用低級(jí)烷基鹵化物(如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘化物)；硫酸二烷酯(如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯)；長(zhǎng)鏈鹵化物(如癸基、十二烷基、肉豆蔻基和十八烷基氯、溴和碘化物)；芳烷基鹵化物(如芐基和苯乙基溴化物)等試劑季銨化。從而獲得可溶或可分散于水或油的產(chǎn)物。
可用來形成藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括鹽酸、硫酸和磷酸等無機(jī)酸，和草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸等有機(jī)酸。可在式(I)的化合物最后分離和純化中原位制備堿加成鹽，或獨(dú)立的通過使羧酸分子與合適的堿，如藥物學(xué)上可接受的金屬陽離子或銨的氫氧化物、羧酸鹽或羧酸氫鹽，或有機(jī)的伯、仲或叔胺反應(yīng)。藥物學(xué)上可接受的鹽包括但不限于基于堿金屬和堿土金屬的陽離子，如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、鋁鹽等，以及無毒的銨鹽、季銨鹽和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙胺、乙胺等。其它可用來形成堿加成鹽的代表性有機(jī)胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
可用各種途徑，包括腸內(nèi)、腸道外和外用途徑施藥來施用本發(fā)明的化合物。例如，施藥的合適模式包括經(jīng)口腔、皮下、透皮、經(jīng)粘膜、電離子透入、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜下、直腸等。
根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施例，提供了一種含有本發(fā)明的GSK3抑制劑化合物和藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合物。
合適的藥物學(xué)上可接受的賦形劑包括加工劑和藥物傳遞調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑，如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、單糖、二糖、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、羥基丙基-β-環(huán)糊精、聚乙烯基吡咯烷酮、低熔點(diǎn)蠟、離子交換樹脂等，以及其中兩種或多種的聯(lián)合體。在“Remingtong’sPharmaceutical Science”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，在此引入以供參考。
含有本發(fā)明GSK3抑制劑化合物的藥物組合物可以是任何適于預(yù)期施藥方法的形式，包括例如溶液、懸液或乳液等。通常在制備溶液、懸液和乳液中使用液相載體?？紤]在本發(fā)明的實(shí)施中使用的液相載體包括例如水、鹽水、藥物學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑，藥物學(xué)上可接受的油或脂等，以及其中兩種或更多種的混合物。液相載體可含有其它合適的藥物學(xué)上可接受的添加劑，如增溶劑、乳化劑、營養(yǎng)素、緩沖液、防腐劑、懸浮劑、增稠劑、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑等。合適的有機(jī)溶劑包括單羥基醇(如乙醇)，和多羥基醇(如二醇)。合適的油包括例如大豆油、椰子油、橄欖油、紅花油、棉籽油等。對(duì)于腸道外施藥，載體還可以是油性酯(如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯等)。本發(fā)明的組合物也可以是微粒、微膠囊、脂質(zhì)體包裹物等，和其中兩種或多種的聯(lián)合體的形式。
可經(jīng)口、胃腸外、舌下，通過吸入噴劑、直腸或外用給藥，以含有所需的常規(guī)無毒性的藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑和賦形劑的配成劑量單位的形式來施用本發(fā)明的化合物。外用也包括透皮施藥(如透皮貼片或電離子透入裝置)。本文所用的術(shù)語胃腸外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸液技術(shù)。
可注射的制劑(如無菌可注射水性或油質(zhì)懸液)可根據(jù)已知技術(shù)，用合適的分散或濕潤(rùn)劑、或懸浮劑配制。無菌可注射制劑還可以是在無毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，如1，3-丙二醇中的溶液。在可使用的可接受的載體和溶劑中有水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，常規(guī)使用無菌的不揮發(fā)性油作為溶劑或懸浮基質(zhì)。為了該目的，可使用任何無刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的單-或二甘油酯。另外，油酸等脂肪酸可用于制備可注射物中。
藥物直腸內(nèi)施用的栓劑可通過將藥物與合適的無刺激性賦形劑(如椰子油脂和聚乙二醇)混合來制備。該賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，而且將因此在直腸中融化并釋放藥物。
口腔施藥的固體劑量形式可包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒。在這些固體劑量形式中，可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。這些劑量形式還可包括(如正常實(shí)施中所用的)，除惰性稀釋劑以外的額外物質(zhì)，如硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑。就膠囊、片劑和丸劑而言，劑量形式還可含有緩沖劑。還可用腸衣制備片劑和丸劑。
口腔施藥的液體劑量形式可包括藥物學(xué)上可接受的含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑(如水)的乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑。這些組合物還可含有佐劑(如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、環(huán)糊精和甜味劑、調(diào)味劑和加香劑。
根據(jù)其它實(shí)施例，本發(fā)明提供了在人或動(dòng)物體內(nèi)抑制GSK3活性的方法，所述方法包含施給個(gè)體一定量的具有結(jié)構(gòu)(I)、(IV)或(V)的GSK3抑制劑化合物(或含有這些化合物的組合物)，其量在該個(gè)體內(nèi)能有效抑制GSK3活性。其它實(shí)施例提供了治療細(xì)胞或在人或動(dòng)物體內(nèi)治療GSK3-介導(dǎo)的疾病的方法，包含施給細(xì)胞或人或動(dòng)物一定量的本發(fā)明的化合物或組合物，其量在該細(xì)胞或個(gè)體內(nèi)能有效抑制GSK3的活性。優(yōu)選個(gè)體是人或非人動(dòng)物個(gè)體。GSK3活性的抑制包括與對(duì)照比較或與所期望的GSK3活性比較，GSK3活性可檢測(cè)的抑制。
本發(fā)明化合物的有效量一般包括通過任何本文所述試驗(yàn)，通過本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的其它GSK3激酶活性試驗(yàn)，或通過檢測(cè)在患GSK3-介導(dǎo)疾病的個(gè)體內(nèi)癥狀的減輕，檢測(cè)到的任何足夠引起抑制GSK3活性的量。
根據(jù)本發(fā)明可治療的GSK3-介導(dǎo)的疾病包括任何生物學(xué)或醫(yī)學(xué)疾病，其中涉及GSK3活性，或其中GSK3的抑制加強(qiáng)了信號(hào)通過一途徑傳遞，而這是要治療的疾病的特征性缺陷。異常GSK3活性可以是該情況或疾病的原因或特征。代表性GSK3-介導(dǎo)的疾病包括2型糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、肥胖、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、特別腦部缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌癥等。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)個(gè)體的成功治療可導(dǎo)致患醫(yī)學(xué)或生物學(xué)疾病的個(gè)體體內(nèi)癥狀減輕或緩和，如，疾病進(jìn)一步進(jìn)展停止，或疾病被預(yù)防。因此例如，對(duì)糖尿病的治療可使病人中葡萄糖或HbA1c水平下降。類似的，對(duì)阿耳茨海默氏病的治療可導(dǎo)致通過測(cè)量癡呆增強(qiáng)速率的下降，而檢測(cè)到疾病發(fā)展速率的減緩。
可聯(lián)合載體材料來產(chǎn)生單劑形式的活性組分量將根據(jù)治療的宿主和具體施藥模式而變化。然而可理解，任何具體病人的特定劑量水平將根據(jù)各種因素，包括使用的特定化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、施藥時(shí)間、施藥途徑、排泄率、藥物配伍和經(jīng)受治療的具體疾病的嚴(yán)重程度而定。對(duì)于給定情況的治療有效量可輕易的由常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，并在普通技術(shù)人員的技能和判斷能力的范圍內(nèi)。
對(duì)于本發(fā)明，治療有效量一般將是約0.1mg/kg/日到100mg/kg/日，優(yōu)選約1mg/kg/日到約20mg/kg/日，和最優(yōu)選的約2mg/kg/日到約10mg/kg/日本發(fā)明的GSK3抑制劑化合物，其可用單劑或多劑施用。
還可用脂質(zhì)體的形式施用本發(fā)明的化合物。如本領(lǐng)域已知的，脂質(zhì)體一般是衍生自磷脂或其它脂類物質(zhì)。脂質(zhì)體是由分散在水基質(zhì)中的單-或多層水合液狀晶體形成的。可用任何無毒性的，生理學(xué)上可接受的，并且是可代謝的能形成脂質(zhì)體的脂類。脂質(zhì)體形式的本組合物除了本發(fā)明的化合物以外，還可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，天然和合成的均可。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域已知的。見例如，Prescott編，細(xì)胞生物學(xué)方法，卷XIV，Academic Press，New York，N.W.，p.33以及下列等等(1976)。
雖然本發(fā)明的化合物可作為單一的活性藥物學(xué)試劑施用，它們也可與一種或多種在治療疾病中使用的其它藥劑聯(lián)用。對(duì)于治療2型糖尿病，代表性的可與本發(fā)明的化合物聯(lián)用的藥劑包括胰島素、曲格列酮、羅格列酮(rosiglitazone)、匹格列酮、格列甲嗪、甲福明、阿卡波糖等。對(duì)于治療阿耳茨海默氏病，代表性的可與本發(fā)明的化合物聯(lián)用的藥劑包括donepezil、他克林等。對(duì)于治療雙向性精神障礙，代表性的可與本發(fā)明的化合物聯(lián)用的藥劑包括鋰鹽、2-丙基戊酸鈉、卡巴米嗪等。對(duì)于治療中風(fēng)，代表性的可與本發(fā)明的化合物聯(lián)用的藥劑包括組織血纖維蛋白溶酶原激活劑。
當(dāng)其它活性試劑與本發(fā)明化合物聯(lián)用時(shí)，一般如PHYSICIANS’DESKREFERENCE(PDR)53rd版(1999)(在此引入以供參考)使用這些額外的活性試劑，或這些治療上有用的量是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。
可以推薦的最大臨床劑量或以較低的劑量施用本發(fā)明的化合物和其它治療上的活性藥劑。本發(fā)明組合物中活性化合物的水平是可變的，因此可根據(jù)施藥途徑、疾病嚴(yán)重程度和病人的反應(yīng)獲得所要的治療反應(yīng)。可將聯(lián)合體作為獨(dú)立組合物或作為含有這些藥劑的單劑施用。當(dāng)作為聯(lián)合體施用時(shí)，可將治療劑配制成獨(dú)立的、在相同時(shí)間或不同時(shí)間施給的組合物，或治療劑可作為單一組合物給藥。
聯(lián)系下列代表例，可更好的理解本發(fā)明的前述和其它部分。
實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)施例1表征和純化方法通過高效液相層析(HPLC)，用帶有2690分離模塊的Waters Millennium層析系統(tǒng)(Milford，Massachusetts)確定了本發(fā)明化合物的特征。分析柱是來自Alltech的Alltima C-18反相柱，4.6×250mm(Deerfield，Illinois)。使用梯度洗脫，通常用5％乙腈/95％水開始，并在40分鐘內(nèi)進(jìn)行到100％乙腈。所有溶劑均含有0.1％的三氟乙酸(TFA)。通過在220或254納米處的紫外光(UV)吸收檢測(cè)化合物。HPLC溶劑來自Burdick and Jackson(Muskegan，Michigan)，或fisherScientific(Pittsburgh，Pennsylvania)。在一些情況下，通過薄層層析(TLC)，使用襯有玻璃或塑料的硅膠板，如Baker-Flex Silica Gel lB2-F可彎曲片評(píng)估了純度。可在紫外光下目測(cè)TLC結(jié)果，或使用熟知的碘蒸汽和其它各種染色技術(shù)。
在Fisons VG Electrospray Mass Spectrometer上進(jìn)行質(zhì)譜分析。作為質(zhì)子化的母離子報(bào)道了所有的質(zhì)量。
用Varian 300MHz NMR(Palo Alto，California)進(jìn)行了核磁共振分析。光譜參照是TMS或已知的溶劑化學(xué)位移。在提高的溫度(即，75℃)下分析一些化合物樣品，來促使樣品溶解度提高。
可用元素分析(Desert Analytics，Tucson，Arizona)來評(píng)估本發(fā)明的一些化合物的純度。
在Laboratory Devices Mel-Temp apparatus(Holliston，Massachusetts)上測(cè)定了熔點(diǎn)。
用Flash40層析系統(tǒng)和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，Virginia)、Chromatotron徑向色譜裝置(Harrison Research，Palo Alto，California)、或通過HPLC使用-18反相柱進(jìn)行制備性分離。通常使用的溶劑是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯和三乙胺。
實(shí)施例23，5-二溴吡嗪-2-基胺的合成 將11.2毫升溴的38毫升乙酸溶液在15℃一邊攪拌一邊緩慢加到2-氨基吡嗪(9.5克，100毫摩爾)和三水合乙酸鈉(32.6克)的150毫升乙酸溶液中。加入需要約1-2小時(shí)，在暗處進(jìn)行。室溫下將混合物攪拌過夜。真空濃縮溶液，將棕色粘性殘余物一邊攪拌一邊倒入冰水(150毫升)中。加入20％氫氧化鈉水溶液，獲得pH8，用乙酸乙酯(4×75毫升)萃取。合并的有機(jī)層用水(2×50毫升)和鹽水(1×50毫升)洗滌，干燥并濃縮。柱層析(2∶1己烷和乙酸乙酯)純化粗產(chǎn)物，得到所需化合物。
HPLC8.7分鐘(98％純)；MSMH+＝251.8 C4H3Br2N3＝250.8g/mol實(shí)施例33-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基胺的合成 在二溴吡嗪胺(1克，3.95毫摩爾)的苯(25毫升)溶液中加入Pd(PPh3)4(230毫克，0.02毫摩爾)、碳酸鈉(840毫克，7.9毫摩爾)在4毫升水中的溶液和二氯苯基硼酸(830毫克，4.3毫摩爾)在1毫升乙醇中的溶液。劇烈振搖回流混合物過夜。濃縮溶液，吸收入乙酸乙酯(50毫升)和水(20毫升)中。分離有機(jī)層，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水層。用水(1×25毫升)和鹽水(1×30毫升)洗滌合并的有機(jī)物，干燥并濃縮。柱層析(4∶1己烷和乙酸乙酯)純化粗產(chǎn)物，得到所需的作為唯一異構(gòu)體的化合物。
HPLC13.6分鐘(98％純)；MSMH+＝317.9 C10H6BrCl2N3＝316.9g/mol實(shí)施例4(1Z)-1-氮雜-1-[3-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基]-2-甲基-2-硫雜丙-1-烯的合成 在二甲亞砜(1.6毫升，22.3毫摩爾)的無水二氯甲烷(16毫升)溶液中，-78℃在氮?dú)庀碌渭尤谆撬狒?3.6毫升，20.8毫摩爾)，形成白色沉淀。在其中加入溴化氨基吡嗪(4.7克，14.9毫摩爾)的二氯甲烷(30毫升)和二甲基亞砜(15毫升)的溶液，將得到的溶液溫至室溫，攪拌1小時(shí)。用1N氫氧化鈉淬滅反應(yīng)混合物，在0℃攪拌15分鐘。用二氯甲烷(3×30ml)萃取溶液，并用水(2×30ml)、鹽水(30ml)洗滌有機(jī)層，干燥并濃縮。
實(shí)施例53-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪的合成 在硫亞胺的二氯甲烷(15毫升)溶液中在0℃加入間-氯過苯甲酸(5.1克，29.8毫摩爾)的15毫升二氯甲烷溶液。室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)，然后加入2毫升二甲硫，攪拌另10分鐘?？焖龠^濾溶液，得到亞硝基衍生物的澄清溶液。將該溶液冷至0℃，冒泡通臭氧20分鐘，用飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌得到的溶液，干燥，濃縮并用柱層析純化，得到硝基化合物。
HPLC15.2分鐘(88％純)；MSMH+＝347.7 C10H4BrCl2＝346.9g/mol實(shí)施例6{2-[(3-氨基-4-硝基苯基)氨基]乙基}[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))胺(12.3毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。80℃攪拌反應(yīng)混合12小時(shí)。真空濃縮粗混合物，進(jìn)行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態(tài)的標(biāo)題化合物。
HPLC13.0分鐘(99％純)；MSMH+＝465.2 C17H14Cl2N8O4＝464.0g/mol實(shí)施例7[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]{2-[(4-硝基苯基)氨基]乙基}胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(5-硝基(2-吡啶基))胺(11.3毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。80℃攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)。真空濃縮粗混合物，進(jìn)行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態(tài)標(biāo)題化合物。
HPLC14.0分鐘(99％純)；MSMH+＝450.9 C17H13Cl2N7O4＝449.0g/mol實(shí)施例84-[(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)氨基]苯基腈 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入6-[(2-氨基乙基)氨基]吡啶-3-腈(10.0毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。反應(yīng)混合物在80℃攪拌12小時(shí)。真空濃縮粗混合物，進(jìn)行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)得到淡黃色固態(tài)標(biāo)題化合物。
HPLC12.9分鐘(90％純)；MSMH+＝430.2 C18H13Cl2N7O2＝429.0g/mol實(shí)施例9甲基{2-[(4-硝基苯基)氨基]乙基}胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(20毫克，0.057毫摩爾)的DMF(1毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)甲基(5-硝基(2-吡啶基))胺(12.0毫克，0.06毫摩爾)和二異丙基乙基胺(40微升，0.228毫摩爾)。反應(yīng)混合物在80℃攪拌12小時(shí)。真空濃縮粗混合物，進(jìn)行柱層析(5％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到淡黃色固態(tài)標(biāo)題化合物。
HPLC14.3分鐘(95％純)；MSMH+＝464.2 C18H15Cl2N7O4＝463.0g/mol實(shí)施例10N-乙?；?N-[3-(2，4-二氯苯基)-6-溴吡嗪-2-基]乙酰胺的合成回流3-(2，4-二氯苯基)-5-溴吡嗪-2-基胺(200毫克，0.63毫摩爾)的乙酸酐(3毫升)溶液2天。真空濃縮混合物，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例11N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]乙酰胺的合成 在N-乙?；?N-[3-(2，4-二氯苯基)-6-溴吡嗪-2-基]乙酰胺(57毫克，0.14毫摩爾)的DMF(2毫升)溶液中加入(2-氨基乙基)(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))胺(28毫克，0.141毫摩爾)、叔丁醇鈉(20毫克，0.21毫摩爾)、BINAP(38毫克，0.06毫摩爾)和乙酸鈀(10毫克，0.04毫摩爾)。80℃攪拌反應(yīng)混合物過夜。冷卻溶液至室溫，收集于乙酸乙酯和水中。分離層，用水和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥，濃縮并純化得到標(biāo)題產(chǎn)物。
HPLC3.3分鐘(98％純)；MSMH+＝476.1 C19H18Cl2N8O3＝477.3g/mol實(shí)施例12
N-(2-{[6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)(叔丁氧基)羧酰胺的合成 在3-(2，4-二氯苯基)-5-溴-2-硝基吡嗪(1.4克，4.0毫摩爾)的DMF(10毫升)溶液中加入Boc-乙二胺(960毫克，6.0毫摩爾)和DIPEA(1.5毫升)。80℃攪拌溶液過夜。冷卻溶液至室溫，收集于乙酸乙酯和水中。分離層并用水和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥，濃縮并純化得到標(biāo)題產(chǎn)物。
HPLC12.9分鐘(95％純)；MSMH+＝428.0 C17H19Cl2N5O4＝427.0g/mol實(shí)施例13[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基](2-氨基乙基)胺的合成 在N-(2-｛［6-(2，4-二氯苯基)-5-硝基吡嗪-2-基]氨基}乙基)(叔丁氧基)羧酰胺(170毫克，0.39毫摩爾)的乙醇(2毫升)溶液中加入5％鈀碳和肼(250毫克，7.9毫摩爾)，70℃攪拌。冷卻溶液至室溫，用乙醇稀釋，過濾除去鈀碳，真空濃縮。將相應(yīng)的胺吸收入10％TFA的二氯甲烷溶液(2毫升)，35℃攪拌6小時(shí)。真空濃縮溶液，提供所需化合物。
HPLC6.0分鐘(99％純)；MSMH+＝298.0 C12H13Cl2N5＝297.0g/mol實(shí)施例14[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺的合成 根據(jù)實(shí)施例6所述的方法從[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基](2-氨基乙基)胺和6-氯-3-硝基-2-吡啶基胺制備本化合物。
HPLC8.9分鐘(98％純)；MSMH+＝435.2 C17H16Cl2N8O2＝434.0g/mol實(shí)施例15N-[5-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-3-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]-2-(甲基氨基)乙酰胺的合成 在[5-氨基-6-(2，4-二氯苯基)吡嗪-2-基]{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺(30毫克，0.068毫摩爾)的THF(2毫升)溶液中加入肌氨酸(26毫克，0.138毫摩爾)、HBTU(104.5毫克，0.2756毫摩爾)和DIPEA(60微升)，80℃攪拌過夜。冷卻混合物至室溫，濃縮并收集于乙酸乙酯和水中。分離層，用水和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥，濃縮并純化獲得標(biāo)題化合物。
HPLC7.2分鐘(98％純)；MSMH+＝506.3 C20H18Cl2N8O3＝505.1g/mol實(shí)施例16用無細(xì)胞試驗(yàn)篩選GSK3抑制性活性將本發(fā)明的嘧啶和吡啶化合物溶于DMSO，測(cè)試對(duì)人GSK3β的抑制(人GSK3β的核苷酸序列存于GenBank登錄號(hào)L33801)。在Hughes等，Eur.J.Biochem，203305-11(1992)(在此引入以供參考)中描述了GSK3β的表達(dá)。
將1等份的300微升底物緩沖液(30mM tris-HCl，10mM MgCl2，2mM DTT，3μg/ml GSK3β)和0.5μM生物素化的預(yù)磷酸化的SGSG-連接的CREB肽(ChironTechnologies PTY Ltd.，Clayton，Australia)加到96孔聚丙烯微量滴定板的各孔中去。每孔加入3.5微升含有要試驗(yàn)的各種可變濃度的化合物的DMSO或星形孢菌素(一種已知的激酶抑制劑，用作陽性對(duì)照)，或陰性對(duì)照(即，僅加入DMSO)，并充分混合。然后，加入每孔50微升1μM未標(biāo)記的ATP和1-2×107cpmγ33P-標(biāo)記的ATP，來引發(fā)反應(yīng)，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行三小時(shí)。
當(dāng)反應(yīng)在進(jìn)行時(shí)，通過與每孔300微升含有1％牛血清清蛋白的PBS一起在室溫下培育至少1小時(shí)，封閉被鏈霉親和素包裹的Labsystems″Combiplate8″捕捉板(Labsystems，Helsinki，F(xiàn)inland)。然后抽吸除去封閉溶液，用100微升/孔中止試劑(50μM ATP/20mM EDTA)填充捕捉板。
當(dāng)三小時(shí)酶反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將一式三份100微升等份的各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到含有中止溶液的三個(gè)孔，三塊捕捉板上每塊1孔中，并將孔內(nèi)容物充分混合。室溫下1小時(shí)后，抽吸倒空捕捉板的孔，用PBS和12管Corning 430474 ELISA板洗滌器洗5次。最后，將200微升Microscint-20閃爍液加到板的各孔中。用板密封劑涂布各板，然后在搖床上搖30分鐘.在Packard TopCount閃爍計(jì)數(shù)器(Meridian，Connecticut)中對(duì)各捕捉板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將結(jié)果標(biāo)為化合物濃度的函數(shù)。
然后根據(jù)該試驗(yàn)，篩選本發(fā)明化合物的對(duì)GSK3的抑制劑的活性。實(shí)施例3-14的化合物顯示了對(duì)該無細(xì)胞試驗(yàn)中GSK3的1μM或更低的IC50。
因此，這些結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物顯示對(duì)GSK3的抑制劑活性。
實(shí)施例17用基于細(xì)胞的糖元合成酶試驗(yàn)篩選GSK3抑制劑活性將CHO-HIRC細(xì)胞維持在10厘米組織培養(yǎng)板的Ham’s F12培養(yǎng)液/10％透析過的胎牛血清中。收集來自匯合的10厘米平板的細(xì)胞，并分散到6孔組織培養(yǎng)板的6個(gè)孔中，最終體積是2毫升培養(yǎng)液。使細(xì)胞37℃生長(zhǎng)24小時(shí)。然后在不含胎牛血清的Ham’s F12培養(yǎng)液中洗滌三次，最終使細(xì)胞在2毫升無血清的培養(yǎng)液中，37℃再生長(zhǎng)24小時(shí)。
在該時(shí)間終點(diǎn)，在各孔中加入20微升溶于DMSO的化合物，并在37℃培育。20分鐘后，除去培養(yǎng)液，在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞一次，然后在培養(yǎng)板中用液氮迅速冷凍。然后在每孔存在140微升裂解緩沖液(50mM Tris pH7.8；1mM EDTA，100mMXaF，25微克/毫升亮抑蛋白酶肽，1mM DTT，1mM PMSF)的條件下，在冰上融化細(xì)胞。從板上刮下細(xì)胞，凍在干冰上的Eppendorf管中。然后融化裂解液，并在干冰上重新凍結(jié)。
在重新融化后，14,000g離心裂解液15分鐘。然后取出上清液，存于冰上。將各上清液(45微升)加到45微升反應(yīng)緩沖液(65mM Tris pH7.8；26mM EDTA，32.5mMKF，9.3mM UDP-葡萄糖；11mg/ml糖原；500nCi/ml14C-UDP-葡萄糖)中，并將另45微升加到45微升反應(yīng)緩沖液/20mM葡萄糖-6-磷酸中。30℃培育反應(yīng)物30分鐘，然后在2厘米方形31ET層析紙(Whatman)上點(diǎn)樣。用66％乙醇洗滌濾紙2次費(fèi)時(shí)20分鐘，在丙酮中簡(jiǎn)單漂洗，并在室溫下干燥1小時(shí)。
將濾紙加到5毫升閃爍液中，在液體閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。將總糖元合成酶在任何裂解液中是活性的百分?jǐn)?shù)表示成為100X(cpm-葡萄糖-6-磷酸)/(cpm+葡萄糖-6-磷酸)。對(duì)于5種不同濃度的化合物和單用DMSO一式兩份測(cè)定這些值，然后對(duì)濃度的對(duì)數(shù)標(biāo)出這些值。通過對(duì)標(biāo)出的點(diǎn)擬合一條S形曲線，確定了能刺激糖元合成酶活性至其最高水平的50％的化合物濃度。最高水平的定義是當(dāng)試驗(yàn)化合物的濃度增大至超過EC50時(shí)，糖元合成酶活性不變化的水平。
實(shí)施例18對(duì)τ蛋白磷酸化抑制性的篩選A.用GSK3表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞和τ表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建將COS細(xì)胞置于T25組織培養(yǎng)瓶中的高葡萄糖MEM培養(yǎng)液/5％胎牛血清中。收集來自匯合的T25瓶的細(xì)胞，以80,000細(xì)胞/孔接種于Corning6-孔組織培養(yǎng)板中，最終體積是每孔2毫升培養(yǎng)液。使細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)48小時(shí)。然后用不含胎牛血清的Opti-MEM洗滌兩次，最終將細(xì)胞保留在1毫升Opti-MEM中。
將編碼τ蛋白的多核苷酸亞克隆入在SV40早啟動(dòng)子的控制下的質(zhì)粒pSG5中，來產(chǎn)生τ表達(dá)質(zhì)粒。在Goedert等，EMBO J，8(2)393-399(1989)，在此引入以供參考，一般描述了編碼τ蛋白的cDNA的克隆。通過將編碼GSK3β的多核苷酸亞克隆入pCG(它是Giese等，Gene&Development，9995-1008(1995)和Matthias等，Nucleic Acid Research，176418(1989)(都在此引入以供參考)所述的ApEVRF衍生物)，制備了GSK3表達(dá)質(zhì)粒。
在1.5毫升的Eppendorf管中制備了下列溶液溶液A對(duì)各轉(zhuǎn)染，將2微克DNA(τ表達(dá)質(zhì)粒)和0.7微克DNA(GSK3表達(dá)質(zhì)粒)稀釋于100微升Opti-MEM(Gibco BRL)中；溶液B對(duì)于各轉(zhuǎn)染，將8微升Lipofectamine試劑稀釋于100微升Opti-MEM中。合并這兩種溶液，溫和振蕩，并在室溫下培育45分鐘，使得形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。對(duì)于各轉(zhuǎn)染，將0.8毫升Opti-MEM加到該復(fù)合物的試管中。溫和振蕩該稀釋好的溶液，鋪在漂洗過的細(xì)胞上。將細(xì)胞與復(fù)合的DNA/Lipofectamine在CO2培養(yǎng)箱中37℃培育6小時(shí)。培育后，在各孔加入1毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)液(高葡萄糖MEM)和20％FBS，并在37℃培育過夜。用新鮮的完全培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染開始的18小時(shí)后替換培養(yǎng)基，使細(xì)胞在37℃再生長(zhǎng)48小時(shí)。
B.τ磷酸化抑制試驗(yàn)收集前2小時(shí)，將溶于DMSO的2微升試驗(yàn)化合物(GSK3抑制劑)加到各孔中，37℃培育。2小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，在板上用干冰迅速冷凍細(xì)胞，并儲(chǔ)藏在-70℃。在200微升裂解液(TritonX-100，20mM Tris pH7.5，137mM NaCl，15％甘油，25微克/毫升亮抑蛋白酶肽，1微克/毫升胃酶抑素-A，1μMPMSF，21微克/ml抑蛋白酶肽，50mM NaF，50mMβ-甘油磷酸酯，15mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉)的存在下，在冰上融合細(xì)胞。將各孔的內(nèi)容物14,000g，4℃離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。這時(shí)可將裂解液儲(chǔ)藏于-20℃。
C.ELISA檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的磷酸化τ用5微克/毫升溶于含有CA++和Mg++的PBS(每孔100微升)單克隆抗-磷酸化τ(AT8，Polymedco，Inc.)包裹Immulon4薄膜(Dunatech)。4℃培育過夜后，用洗滌緩沖液(含有0.05％Tween20的PBS)洗滌薄膜兩次，用含有1％BSA，5％正常小鼠血清和0.05％Tween20的PBS在室溫下封閉1小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌薄膜5次。在各孔中加入用含有1％BSA，0.1％NaN3的PBS110稀釋的裂解液(100微升)，在室溫下培育1小時(shí)。洗滌后，在各孔中加入100微升溶于PBS的0.5微克/毫升生物素化的單克隆抗-(未磷酸化的)τ(HT7，Polymedco，Inc.)。將薄膜洗滌5次，加入綴合HRP的鏈霉親和素，室溫培育30分鐘，并用洗滌緩沖液充分洗滌。用TMB底物(Pierce)顯色，通過加入等體積的0.8M的硫酸，中止反應(yīng)。在ELISA平板閱讀儀上，用450納米濾色片對(duì)薄膜讀數(shù)。通過對(duì)標(biāo)出的數(shù)據(jù)擬合出一條S形曲線，測(cè)定將τ磷酸化抑制到最高水平的50％的化合物濃度(即，IC50)。
實(shí)施例19測(cè)試GSK3抑制劑保護(hù)原代海馬細(xì)胞抵抗谷氨酸鹽興奮性中毒的能力從胚胎期18-19天的大鼠中剖分到海馬。將組織收集在Hibernate TM培養(yǎng)液(Gibco BRL)中，切成大約1毫米的小塊。用Papain DissociationSystem(Worthington Biochemical Corporation)解離組織。分離后，將細(xì)胞重新懸浮于由Neurobasal TM(Gibco BRL)，2％B27補(bǔ)充液(GibcoBRL)，L-谷氨酰胺和抗生素的無血清培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于用聚-L-賴氨酸涂布的35毫米組織培養(yǎng)板上(濃度為每培養(yǎng)皿7.5×104細(xì)胞)。37℃在5％CO2中培育10-14天后，漂洗細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液喂養(yǎng)。第二天，在培養(yǎng)液中以最終濃度為1nM和100μM之間加入本發(fā)明的代表性化合物。加入化合物4到8小時(shí)后，從細(xì)胞中除去培養(yǎng)液，儲(chǔ)存在37℃。將培養(yǎng)物用含有10μM甘氨酸的HEPES緩沖平衡的鹽溶液(HBSS)漂洗培養(yǎng)物兩次。Grabb和Choi，J Neuroscience，191657-62(1999)。然后使培養(yǎng)物在室溫下接觸溶于同樣的HBSS的200μM谷氨酸。接觸后，用該緩沖液漂洗三次培養(yǎng)物，然后轉(zhuǎn)到它們?cè)瓉項(xiàng)l件下的，含有化合物的培養(yǎng)液中。接觸谷氨酸20-24小時(shí)后，用HBSS漂洗培養(yǎng)物，接觸酞酚藍(lán)10分鐘。該染料被死細(xì)胞吸收。漂洗培養(yǎng)物，然后在4％聚甲醛中固定30分鐘。通過相差顯微鏡對(duì)活的和死的(藍(lán)色核)大神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，并拍照。用該方法，已顯示本發(fā)明的化合物能顯著降低谷氨酰胺誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的能力。
實(shí)施例20對(duì)糖尿病嚙齒動(dòng)物的效力的評(píng)估(葡萄糖耐受試驗(yàn))口服給藥的化合物配方對(duì)于口服強(qiáng)飼，通常將試驗(yàn)化合物在施藥1天前配制成水溶液或在1％羧甲基纖維素/0.1％tween-80(都來自Sigma Chem.，MO)中的懸液。將一些早期化合物根據(jù)與下文相同的程序，配制成15％Captisol(一種改良的環(huán)化糊精，CyDex，Co.，IL)的溶液。對(duì)于水溶液，將干燥和凍干的試驗(yàn)化合物粉末溶于蒸餾水，并通過旋轉(zhuǎn)和超聲充分混合。如需要，用1N NaOH或1N HCl調(diào)節(jié)試驗(yàn)溶液的pH，并最終通過裝有0.2微米的乙酸纖維素酯膜(Millipore Co.，MA)注射器，來過濾除菌。對(duì)于口服懸液，用1％羧甲基纖維素/0.1％tween-80的新鮮懸液與試驗(yàn)化合物粉末混合，并充分超聲，如需要，如上所述調(diào)節(jié)pH，并旋轉(zhuǎn)，直到粒度均一，并＜10微米。
糖尿病小鼠葡萄糖耐受試驗(yàn)從Jackson Labs(Bar Harbor，ME)獲得8周齡的Obese db/db(雌C57BlKs/J)小鼠，并在1-2周后用于效力測(cè)試。在試驗(yàn)日的早晨，在清早除去食物(施用葡萄糖丸前7-8小時(shí))。對(duì)尾末端使用局部麻醉劑(EMLA Creme，Astra Pharm.，MA)，剪斷尾巴尖取得50-100微升血樣，并收集在含有5微升500U/ml肝素鈉(Elkins-Sinn，NJ)的eppendorf管中，然后分離血漿。在該日的各個(gè)間隔時(shí)間(總的是6-8個(gè)時(shí)間點(diǎn))獲得樣品。隨機(jī)將小鼠編入處理組，在施用葡萄糖4.5小時(shí)前首先口腔施用試驗(yàn)化合物(0.2ml體積)，然后在通過口腔強(qiáng)飼(oGTT)或腹膜內(nèi)注射施用0.2毫升50％葡萄糖(Abbott Lab，IL)之前0.5小時(shí)再次施用化合物。在葡萄糖施用2小時(shí)后取得最終血樣后，將食物再投給小鼠。
基礎(chǔ)高血糖癥和胰島素血癥的調(diào)控一般將試驗(yàn)化合物以多日，多劑方案或作為單個(gè)丸劑經(jīng)口施給db/db小鼠(見上)或ZDF大鼠(Genetic Models，Inc.；Indianapolis，IN)。ZDF大鼠是在8周齡時(shí)收到的，并在1-2周后用于效力試驗(yàn)。在施藥30分鐘前移去食物，并施用一顆試驗(yàn)化合物丸劑(劑量范圍在1-8毫克/毫升之間)如上所述，在后2-3小時(shí)中的1-6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血樣。取血樣后，將食物放回鼠籠。
主要終點(diǎn)從血漿和/或血樣測(cè)量了葡萄糖和胰島素。從全血，用One-Touch葡糖計(jì)(Lifescan Co.，CA)，和從血漿，用Beckman葡萄糖分析儀測(cè)量葡萄糖水平。一般葡萄糖結(jié)果反映了小鼠的血液值和大鼠研究的血漿值。根據(jù)供應(yīng)商的方法，用ELISA(Crystal Chem.Co.，IL)測(cè)量了胰島素水平。
結(jié)果定量可用mg/dL葡萄糖或ng/ml胰島素，或用曲線下方的面積(AUC)表示對(duì)血漿葡萄糖(取自正常血糖基線100mg/dL上方)和胰島素(取自正常血液胰島素基線1ng/ml上方)的效力。一般，當(dāng)用AUC表示時(shí)，實(shí)際上將結(jié)果表示成減少的AUC([(載體對(duì)照AUC-試驗(yàn)組的AUC)/載體對(duì)照AUCX100])。與安慰劑對(duì)照組比較，這些表達(dá)提供了對(duì)葡萄糖分解提高和/或基礎(chǔ)高血糖血癥或胰島素儲(chǔ)藏的減少的數(shù)量級(jí)的單一定量表達(dá)。
結(jié)果本發(fā)明的代表性化合物在體外顯示了良好的效力，而且當(dāng)用captisol配制時(shí)并皮下施給小鼠(30mg/kg)時(shí)，在體內(nèi)顯示高生物可用性和組織滲透性。觀察到就在葡萄糖耐受試驗(yàn)之前，基礎(chǔ)高血糖血癥的顯著降低，和在用葡萄糖攻擊后，葡萄糖分解的顯著改善。如果用測(cè)定血液葡萄糖曲線下方面積(AUC)來定量葡萄糖反應(yīng)，可觀察到從-60分鐘到+120分鐘，與對(duì)照組比較，AUC減少了45-50％。這可與由曲格列酮(以每天60或100毫克/公斤口服施藥至少數(shù)天)得到的效力媲美。還觀察到在處理的動(dòng)物中，胰島素水平顯著低于對(duì)照小鼠中的水平。
雖然已說明并描述了本發(fā)明的優(yōu)選例，可理解的是，可進(jìn)行各種改變，而不違背本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種化合物，其特征在于，該化合物具有下式 其中X和Y分別選自氮、氧和可任選取代的碳；A1和A2是可任選取代的芳基或雜芳基；R1、R2、R3和R4分別選自氫、羥基、和可任選取代的低級(jí)烷基、環(huán)狀低級(jí)烷基、烷基氨基烷基、低級(jí)烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、芳基和雜芳基；R1’、R2’、R3’和R4’分別選自氫和可任選取代的低級(jí)烷基；R5、R6分別選自氫、羥基、鹵素、羧基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亞酰胺基、亞脒基、氰基和取代或未取代的低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、雜芳基羰基、雜芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲?；?、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺?；?、磺酰氨基、亞磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、雜芳基氨基、雜芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、氨基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、脒基、環(huán)烷基、環(huán)酰氨基、環(huán)硫代酰氨基、環(huán)脒基、雜環(huán)脒基、環(huán)亞酰胺基、雜環(huán)亞酰胺基、胍基、芳基、聯(lián)芳基、雜芳基、雜聯(lián)芳基、雜環(huán)基、雜環(huán)烷基、芳基磺?；头蓟酋０被?；和其藥物學(xué)上可接受的鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，X和Y中至少一個(gè)是氮。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，X和Y之一是氮，而X和Y中另一個(gè)是可任選取代的碳。
4.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，X和Y之一是氮，而X和Y中另一個(gè)是氧。
5.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，X和Y都是氮。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，A1和A2中至少一個(gè)是具有3-10個(gè)環(huán)上碳原子和可任選的一個(gè)或多個(gè)環(huán)上雜原子的芳環(huán)。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，A1和A2中至少一個(gè)可以是任選取代的碳環(huán)芳基、芳氨基或芳氧基。
8.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，A1和A2中至少一個(gè)是任選取代的雜芳基。
9.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，A1和A2中至少一個(gè)選自取代或未取代的苯氨基、苯氧基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、吡嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯并噻唑基、苯并吡啶基和苯并咪唑基。
10.如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，A1和A2中至少一個(gè)被至少一個(gè)，不多于三個(gè)取代基團(tuán)取代。
11.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，所述取代基分別選自硝基、氨基、氰基、鹵素、硫代酰氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亞脒基、胍基、磺酰氨基、羧基、甲?；?、低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)芳烷基羰基、低級(jí)雜芳烷基羰基、烷硫基，氨基烷基和氰基烷基。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R1、R2、R3和R4的至少一個(gè)選自氫、未取代或取代的低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷基、雜環(huán)氨基烷基和低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷基。
13.如權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，R1、R2、R3和R4的至少一個(gè)是低級(jí)烷基氨基低級(jí)烷基。
14.如權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，R1、R2和R3是氫，而R4選自氫、甲基、乙基、氨基乙基、二甲基氨基乙基、吡啶基乙基、哌啶基、吡咯烷基乙基、哌嗪基乙基和嗎啉基乙基。
15.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R5和R6的至少一個(gè)選自取代和未取代的芳基、雜芳基和聯(lián)芳基。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其特征在于，R5和R6的至少一個(gè)是取代或未取代的下式的基團(tuán) 其中R10、R11、R12、R13和R14分別選自氫、硝基、氨基、氰基、鹵素、硫代酰氨基、羧基、羥基和可任選取代的低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基烷基、鹵代低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷硫基、烷基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、雜芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、氨基羰基、低級(jí)烷基氨基羰基、氨基芳烷基、低級(jí)烷基氨基烷基、芳基、雜芳基、環(huán)雜烷基、芳烷基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、芳基羰氧基烷基、烷基羰氧基烷基、雜芳基羰氧基烷基、芳烷基羰氧基烷基、和雜芳烷基羰氧基烷基。
17.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R10、R11、R13和R14是氫，而R12是選自鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、嗎啉代基、哌啶子基和氰基。
18.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R11、R13和R14是氫，R10和R12分別選自鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、鹵代低級(jí)烷基、嗎啉代基、哌啶子基和氰基。
19.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜芳基。
20.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R10、R11、R13和R14是氫，而R12是雜環(huán)烷基。
21.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R10、R11、R12、R13和R14的至少一個(gè)是鹵素，而R10、R11、R12、R13和R14的剩下基團(tuán)是氫。
22.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R10、R11、R12、R13和R14的至少一個(gè)選自嗎啉代基、哌啶子基，而R10、R11、R12、R13和R14的剩下基團(tuán)是氫。
23.如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R5和R7中的至少一個(gè)選自氯苯基、二氯苯基、氟苯基、二氟苯基、溴苯基、二氯氟苯基、三氟甲基苯基、氯氟苯基、溴氯苯基、溴氟苯基、乙基苯基、甲基氯苯基、乙基氯苯基、咪唑基苯基、氰基苯基、嗎啉代苯基和氰基氯苯基。
24.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是取代的烷基，選自芳烷基、羥基烷基、氨基烷基、氨基芳烷基、羰基氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、芳基羰基氨基烷基、芳烷基羰基氨基烷基、氨基烷氧基烷基和芳基氨基烷基。
25.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是取代的氨基，選自烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳基烷基氨基、芳基羰基氨基、烷硫基羰基氨基、芳基磺?；被?、雜芳基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、雜芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基和雜芳烷基羰基氨基。
26.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6選自未取代或取代的氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基和烷基氨基烷氧基羰基。
27.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6選自脒基、胍基、環(huán)酰亞氨基、雜環(huán)酰亞氨基、環(huán)酰氨基、雜環(huán)酰氨基、環(huán)硫代酰氨基和雜環(huán)低級(jí)烷基。
28.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6選自芳基。
29.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是雜芳基。
30.如權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，R6選自取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、吡咯基吡啶基、苯并噻唑基、苯并吡啶基、苯并三唑基和苯并咪唑基。
31.一種組合物，其特征在于，該組合物含有一定量的當(dāng)施給人或動(dòng)物個(gè)體時(shí)能有效調(diào)節(jié)GSK3活性的權(quán)利要求1所述的化合物，和藥物學(xué)上可接受的載體。
32.一種在人或動(dòng)物體內(nèi)抑制GSK3活性的方法，其特征在于，該方法包括施給人或動(dòng)物個(gè)體權(quán)利要求31所述的組合物。
33.一種處理細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括對(duì)所述細(xì)胞施用一定量的權(quán)利要求1所述的化合物，來有效抑制細(xì)胞中的GSK3活性。
34.一種在人或動(dòng)物體內(nèi)治療GSK3一介導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于，對(duì)所述人或動(dòng)物施用一定量的權(quán)利要求31所述的組合物，來有效抑制所述個(gè)體中的GSK3活性。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，通過以下施藥模式口服、皮下、透皮、透粘膜、電離子透入、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、頰內(nèi)、舌下、鼻內(nèi)和直腸施藥，來施用所述組合物。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述GSK3-介導(dǎo)的疾病選自糖尿病、阿耳茨海默氏病、肥胖癥、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷癥和癌癥。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，該方法還包含施給個(gè)體一種或多種額外的活性藥劑。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述GSK3-介導(dǎo)的疾病是糖尿病，而所述額外的活性藥劑選自胰島素、曲格列酮、羅格列酮、匹格列酮、格列甲嗪和甲福明。
39.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物用作藥物。
40.權(quán)利要求1所述的化合物在生產(chǎn)用于治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、肥胖癥、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙或癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
提供了用于在體外抑制糖元合成酶激酶(GSK3)的活性，和在體內(nèi)治療GSK3介導(dǎo)疾病的，新穎的基于雙環(huán)的化合物，組合物和方法。本發(fā)明的方法、化合物和組合物可單用，或和其它用于治療GSK3活性介導(dǎo)的疾病，如用于治療糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病、動(dòng)脈硬化心血管疾病、原發(fā)性高血壓、多囊卵巢綜合征、X綜合征、缺血、外傷性腦損傷、雙向性精神障礙、免疫缺陷或癌癥等的藥物學(xué)上活性的藥劑聯(lián)用。
文檔編號(hào)A61K31/497GK1434807SQ00818941
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月17日
發(fā)明者J·M·努斯, S·拉穆西 申請(qǐng)人:希龍公司