專利名稱：用于基因療法和轉(zhuǎn)移的預(yù)防以及腫瘤的基因療法的藥劑的制作方法
惡性腫瘤疾患最常見(jiàn)的死因是器官轉(zhuǎn)移。而在原發(fā)性腫瘤的早期或中期階段，至少是能夠用外科切除的，但在轉(zhuǎn)移的情況下，這種切除的可能性就很小了。除少數(shù)例外不計(jì)，常規(guī)的化療和放射療法是有效的，雖然不是根治，不過(guò)那也只是達(dá)到轉(zhuǎn)移腫瘤臨床圖像的一時(shí)性改善而已。
結(jié)腸直腸癌屬于常見(jiàn)的腫瘤。而源于結(jié)腸直腸的肝轉(zhuǎn)移，則是結(jié)腸直腸癌患者經(jīng)常發(fā)生的死因。由于原發(fā)性腫瘤在外科切除后往往經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)疾病的一些癥狀，所以它們就成為痊愈的治療方案的可能目標(biāo)(JA.德萊本和JE.尼德胡伯下部胃腸道的癌癥——結(jié)腸癌，載于JE.尼德胡伯編“現(xiàn)代腫瘤療法”。M.O.圣·路易防護(hù)劑，426-431)。然而，肝轉(zhuǎn)移有可能治愈的外科切除僅有很小的百分率的病人是可能的，而且對(duì)化療來(lái)說(shuō)，雖然暫時(shí)顯示減輕，可是仍不能延長(zhǎng)壽命。因此，迫切需要的是改革治療方式。
研制十幾年的現(xiàn)行基因療法方案，根據(jù)其錯(cuò)綜復(fù)雜性，是一種具有反傳統(tǒng)的療法形式，它顯著地提高了可調(diào)整的范圍。這個(gè)方案是能夠在癌癥基因療法的領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用的，尤其是對(duì)于腫瘤有特異性的載體靶向或限制腫瘤組織的基因表達(dá)，而且特別適應(yīng)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因的各種類型腫瘤的薄弱的環(huán)節(jié)。
除了免疫學(xué)最新知識(shí)以外，迄追求的基因療法方案，正如已經(jīng)采用的常規(guī)方法一樣，幾乎只將侵潤(rùn)的腫瘤組織作為主攻對(duì)象。這里隱藏著一些腫瘤所不能徹底解決的疑難問(wèn)題，它表現(xiàn)在瘤內(nèi)壓增高，血液供應(yīng)受限，甚至還有人用一般方式將基因療法的轉(zhuǎn)移工具直接注射到瘤內(nèi)，沒(méi)有擊中要害。在多種轉(zhuǎn)移的情況下，有人指出，當(dāng)時(shí)系統(tǒng)或部位所需的載體藥量，甚至使周邊的正常組織比腫瘤細(xì)胞還容易受到感染。
本發(fā)明旨在改善腫瘤轉(zhuǎn)移和原發(fā)性腫瘤的預(yù)防和治療。
本發(fā)明是按照要求而實(shí)現(xiàn)的。按照本發(fā)明所研究出來(lái)的策略，是圍繞著腫瘤組織不易解決的難點(diǎn)，揭示以極易達(dá)到正常組織為主的靶向基因療法。該法的特征在于使正常器官組織直接在有可能轉(zhuǎn)移或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位具有防御能力，這種能力就是防止轉(zhuǎn)移發(fā)生和繼續(xù)生長(zhǎng)。同時(shí)也能防止未作手術(shù)的原發(fā)性腫瘤的繼續(xù)擴(kuò)展。這種孕育健康組織的策略大大不同于目前所采用的各種基因療法和非基因療法的方案。與系統(tǒng)的或腹膜內(nèi)用合成蛋白酶抑制劑之類的藥物相比(N.J.奈爾遜血管生成的抑制劑已進(jìn)入三期試驗(yàn)，自然癌癥研究所雜志，90，960-963)，基因療法的配方是有其優(yōu)點(diǎn)的，那就是它使局部靶器官中的有效物質(zhì)達(dá)到極高的濃度，還有一些優(yōu)點(diǎn)如副作用減少和可用多種抑制劑(見(jiàn)下文)。此外，就持續(xù)的基團(tuán)表達(dá)而言，應(yīng)用一次載體比長(zhǎng)期反復(fù)服用合成的物質(zhì)的費(fèi)用要合算得多，副作用也少。
以下臨床記錄是同上述方案相吻合的。
1.手術(shù)前或手術(shù)中在靶器官內(nèi)應(yīng)用載體，可以防止原發(fā)性腫瘤在手術(shù)時(shí)有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞脫落外滲。
2.在靶組織內(nèi)，連續(xù)幾年出現(xiàn)的抑制劑輔藥可以防止隱蔽的微轉(zhuǎn)移物的生長(zhǎng)，而且殺死它們，這主要用在高危組，如有淋巴結(jié)侵襲的需作手術(shù)的乳腺癌。
3.限制已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的或未作手術(shù)的原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)例1結(jié)腸直腸的肝轉(zhuǎn)移通過(guò)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的腺病毒傳送到肝實(shí)質(zhì)的基因療法。
結(jié)腸直腸癌在轉(zhuǎn)移時(shí)產(chǎn)生各種不同的蛋白酶(Protease)。這些蛋白酶是為了內(nèi)滲和外滲以及侵犯靶組織的需要。其中有各種金屬蛋白酶(MMPS)尤其是金屬蛋白酶-2(MMP-2)和金屬蛋白酶-9(MMP-9)，它們是管細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)(ECM)成分的降解的(M.J.杜飛和K.麥克卡賽癌癥的金屬蛋白酶間質(zhì)治療的預(yù)后標(biāo)記的靶向[綜述]，國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，12，1343-48)。被金屬蛋白酶-2和-9首先裂解的是作為基底膜主要成分的膠原蛋白IV(Kollagen IV)。出于這種考慮，人們研制了合成的蛋白酶抑制劑(Proteaseinhibitor)，該抑制劑在臨床上已經(jīng)投入使用，并且在某些情況下已達(dá)到臨床試驗(yàn)第三期(N.J.奈爾遜血管生成的抑制劑已進(jìn)入三期試驗(yàn)，自然癌癥研究所雜志，90，960-963)。
按照本發(fā)明所研制的療法的基本思路，是使金屬蛋白酶的抑制物質(zhì)對(duì)肝的實(shí)質(zhì)進(jìn)行封鎖，以便抑制轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞外滲，防止外滲繼續(xù)侵入已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，而對(duì)有血管供應(yīng)的腫瘤，則利用抑制血管發(fā)育而將其結(jié)扎。首選的是金屬蛋白酶-2的組織抑制劑(TIMP-2)，正如所用的許多物質(zhì)一樣，這種抑制劑也是以生理學(xué)方式負(fù)責(zé)限制金屬蛋白酶在改組過(guò)程中的活力的。由于它連接在金屬蛋白酶-2上，所以金屬蛋白酶組織抑制劑-2可以抑制其活性。
建立試驗(yàn)的基團(tuán)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的第一代腺病毒(Erstgenerations-Adencviren)是用來(lái)作基因轉(zhuǎn)移載體的(K.勃蘭德和M.斯特勞斯基因轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)和基因療法的應(yīng)用，載于D.魯克保爾和D.甘頓[出版者]分子醫(yī)學(xué)手冊(cè)，第2卷，腫瘤疾患，斯普靈格，柏林，海德堡，紐約)。這些載體不能因缺少腺病毒E1-基因而進(jìn)行復(fù)制，它們高效地感染上皮細(xì)胞，并可在必要時(shí)大量地基因化。
a)為了證明體外肝細(xì)胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)，可用不同的傳染重復(fù)性(MOIs)和Ad-TIMP-2感染A2細(xì)胞(來(lái)自P53K.O.小鼠的肝細(xì)胞的細(xì)胞系)。Ad-TIMP-2的結(jié)構(gòu)已有人描述過(guò)(A.H.貝克爾，G.W.威爾金遜，R.M.亨伯利，G.姆爾菲和A.C.紐貝帶動(dòng)高水平人體金屬蛋白酶-9的表現(xiàn)和金屬蛋白酶-1和-2基因的組織抑制劑的重組腺病毒的發(fā)育其在兔子平滑肌細(xì)胞中和在人類MCF-7腺癌細(xì)胞中的傳染特點(diǎn)。間質(zhì)生物學(xué)15383-395)。在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制下，該病毒含有人類的TIMP-2互補(bǔ)DNA(cDNA)。經(jīng)過(guò)24小時(shí)或48小時(shí)后，達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)突出點(diǎn)(ZKU)。將10μl涂在10％的聚丙烯酰胺凝膠上，經(jīng)過(guò)電泳分離后再轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。要作免疫學(xué)證明，可應(yīng)用單克隆抗體(T2-101，圖1，迪阿諾瓦，漢堡，德國(guó))。
西方文獻(xiàn)指出，在Ad-TIMP-2感染細(xì)胞的突出點(diǎn)上有一個(gè)很強(qiáng)的TIMP-2帶，而在未感染病毒的和感染對(duì)照病毒的突出點(diǎn)上則無(wú)此帶。
b)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)的功能是利用反向酶譜來(lái)檢驗(yàn)的(A.H.貝克爾，G.W.威爾金遜，R.M.亨伯利，G.姆爾菲和A.C.紐貝帶動(dòng)高水平人體金屬蛋白酶-9的表達(dá)和金屬蛋白酶-1和-2基因的組織抑制劑的重組腺病毒的發(fā)育其在兔子平滑肌細(xì)胞中和在人類MCF-7腺癌細(xì)胞中的傳染特點(diǎn)。間質(zhì)生物學(xué)15383-395)。如a)所述，細(xì)胞受到感染。細(xì)胞培養(yǎng)突出點(diǎn)(ZKU)利用一個(gè)Amicon濃度計(jì)(Lexington，MA.U.S.A.)進(jìn)行濃縮。加入NaN3、Brij氏去污劑和CaCl2，以獲得0.1％、0.05％及5mM的最終濃度。樣品用不還原的緩沖液混合，置于10％的聚丙烯酰胺凝膠上，該凝膠含有1mg/ml的白明膠(豬皮I型，bloom300，SIFMA G2500)和107ng/ml的活性金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白質(zhì)(腫瘤發(fā)生，Cambridge，MA.U.S.A)。電泳后，將十二烷基磺酸鈉(SDS)通過(guò)醞釀2小時(shí)在2.5％的三硝基甲苯(Triton x100)中與凝膠分離。凝膠過(guò)夜在50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖劑(Tris HCl)，pH8.0，50mM NaCl，10nM CaCl2，0.05％Brij氏去污劑-35和0.02％NaN3中在溫度37℃下醞釀成熟。凝膠用0.5％Coomassie亮藍(lán)(Brilliantblau)(SIGMA R250，戴森霍芬，德國(guó))染色，并具有凝膠酶抑制劑的活性，然后金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)在消光背景下顯出深色。這種反向酶譜表明凝膠酶抑制劑的活性只存在于Ad-TIMP-2突出點(diǎn)所感染的細(xì)胞，而未感染的或感染對(duì)照病毒的細(xì)胞突出點(diǎn)上則無(wú)此現(xiàn)象。
c)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的產(chǎn)生是通過(guò)腫瘤細(xì)胞和通過(guò)凝膠酶譜測(cè)定證明的。如b)所述，將不同細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)突出點(diǎn)(ZKU)收集起來(lái)，加以調(diào)節(jié)。按照b)中描述的方法，進(jìn)行酶譜測(cè)定，只有金屬蛋白酶-2不參加。結(jié)果顯示白明膠有裂解的溶解帶，在深色背景下可用肉眼看清。在許多細(xì)胞系中，LS174結(jié)腸腫瘤細(xì)胞所表現(xiàn)的金屬蛋白酶-2的活性最強(qiáng)。
d)要證明禿鼠血液中重組的人類TIMP-2，可將不同劑量的Ad-TIMP-2經(jīng)靜脈內(nèi)注射到禿鼠尾靜脈。在各時(shí)間段采血，獲得血清。樣品利用TIMP-2ELISAs(德國(guó)專利號(hào)2618，阿邁沙姆，勃赫勒，勃?jiǎng)诙魇餐?，德?guó))對(duì)TIMP-2成分進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示TIMP-2表現(xiàn)出對(duì)所用的病毒量有依賴性，TIPM-2-濃度為45μg/m，劑量為3×1010pfus(形成噬菌區(qū)的單位)。TIMP-2的血清濃度在2周后穩(wěn)定下來(lái)。這一結(jié)果說(shuō)明，TIMP-2經(jīng)靜脈內(nèi)注射到血液中是受到封鎖的。
e)要檢驗(yàn)基因轉(zhuǎn)移到肝的范圍，可將腺病毒注射到禿鼠尾靜脈。三天后殺死動(dòng)物，再將肝臟置于液氮內(nèi)冷凍。為了對(duì)TIMP-2作免疫組織化學(xué)檢查，應(yīng)用一個(gè)對(duì)人類TIMP-2的單克隆鼠的抗體(110，T2-101，圖1，迪阿諾瓦，漢堡，德國(guó))。再以FITC結(jié)合綿羊抗鼠抗體作繼發(fā)性抗體。染色結(jié)果顯示TIMP-2的表現(xiàn)在劑量為3×1010pfu時(shí)有40％的肝細(xì)胞，而在劑量為6×1010pfu時(shí)則有大于80％的肝細(xì)胞。類似的基因轉(zhuǎn)移率在應(yīng)用Ad-β半乳糖以及隨后應(yīng)用X-半乳糖染色而獲得證明。
f)在LS174導(dǎo)致的肝轉(zhuǎn)移的靜脈內(nèi)應(yīng)用Ad-TIMP-2的效果，可以用下列實(shí)驗(yàn)證明。腺病毒的應(yīng)用是在轉(zhuǎn)移誘發(fā)前1天或10天后。通過(guò)應(yīng)用2×106LS174細(xì)胞到動(dòng)物脾臟來(lái)達(dá)到轉(zhuǎn)移的誘發(fā)。轉(zhuǎn)移誘發(fā)5周后，將動(dòng)物殺死，同時(shí)測(cè)定腫瘤重量。在預(yù)防性試驗(yàn)方案中，于零日將Ad-TIMP-2或Ad-β半乳糖對(duì)照病毒以3×1010pfu的劑量注入尾靜脈，大約可使40％肝細(xì)胞感染。3天后在上述脾內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞的地方獲得轉(zhuǎn)移誘發(fā)。4周后試驗(yàn)結(jié)束，測(cè)定肝瘤的體積。這說(shuō)明不論在未治療的對(duì)照組還是在用對(duì)照病毒的治療組大多數(shù)動(dòng)物均發(fā)生了轉(zhuǎn)移，肝臟幾乎消耗殆盡，而用Ad-TIMP-2治療的動(dòng)物以肉眼看來(lái)則多無(wú)腫瘤(圖1未治療的動(dòng)物[左]，用Ad-β半乳糖治療的動(dòng)物[中]和用Ad-TIMP-2治療的動(dòng)物[右])。
定量評(píng)價(jià)的結(jié)果是，在試驗(yàn)組所得到的腫瘤重量的平均值的比例關(guān)系為1∶20(Ad-TIMP-2Ad-β半乳糖或未治療組，圖2，點(diǎn)表示一些動(dòng)物，短橫表示平均值)。Ad-金屬蛋白酶組織抑制劑-2(Ad-TIMP-2)組的用肉眼看不到腫瘤的動(dòng)物中，經(jīng)組織病理學(xué)檢查只發(fā)現(xiàn)一些孤立的微轉(zhuǎn)移物。因此，可以斷定，以基因療法為媒介的金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)通過(guò)肝細(xì)胞的分泌大大限制了禿鼠模型中的結(jié)腸直腸腫瘤轉(zhuǎn)移的數(shù)量或體積。這個(gè)發(fā)現(xiàn)確實(shí)驚人，而且說(shuō)明MMP-2有一種不可替代的重要功能。因?yàn)樵跀⑹龇桨笗r(shí)提到大約只有40％的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移，顯然它在這里是一種高效療法，據(jù)推測(cè)肯定是通過(guò)有效物質(zhì)在局部的高濃度對(duì)多種水平(外滲、侵潤(rùn)和血管發(fā)生)都具有抗轉(zhuǎn)移作用。在二次試驗(yàn)中，治療載體是在轉(zhuǎn)移誘發(fā)一周之后應(yīng)用的。在這種情形下，比起最初載體的用量來(lái)，療效要小。但治療組(TIMP-2)和對(duì)照組(Ad-β半乳糖或未治療者)之間的差別卻有極大意義。
g)兩種實(shí)驗(yàn)方案的動(dòng)物肝臟經(jīng)過(guò)組織學(xué)上的修整后，對(duì)腫瘤參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)、凋落(Apoptose)、擴(kuò)散及血管發(fā)生的范圍進(jìn)行了研究。
要確定血管發(fā)生、擴(kuò)散和凋落，可制作肝的石蠟切處，并以下列抗體完成染色證明血管時(shí)，可用CD31抗體(達(dá)科，漢堡，德國(guó))，而測(cè)定擴(kuò)散細(xì)胞的百分率時(shí)，則用MIB-1(Ki-67)抗體(dia505，迪阿諾瓦)。利用含生物素的第二種抗體以及一種馬-小蘿卜-結(jié)合的抗生物素蛋白(Avidin)(達(dá)科)加以證明。為了證明凋落，可應(yīng)用一個(gè)標(biāo)記凋落的螢光素原位凋落箱(In-fergen，牛津，英國(guó)，TUNEL法)。去掉石蠟后的切片先用蛋白酶K進(jìn)行處理。最初染色用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，并以結(jié)合在螢光素上的抗狄戈辛作指示器分子(Reporfer Molekul)。用Propidiumiodid作對(duì)照色。在蘇木精/伊紅染色的切片上，給有絲分裂進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)動(dòng)物在計(jì)數(shù)時(shí)有10個(gè)顯微鏡視野，用X400放大倍數(shù)(MIB，有絲分裂，CD31)或油侵物鏡(X1000，TUNEL)的卡爾·蔡司螢光顯微鏡(Axioskop，Carl Zeiss，耶拿，德國(guó))，并且求出平均值。在一些治療組內(nèi)，均要計(jì)算攜帶腫瘤動(dòng)物的所有數(shù)據(jù)的平均值，而為了統(tǒng)計(jì)分析可應(yīng)用學(xué)生測(cè)試法。以Ad-TIMP-2治療的動(dòng)物和沒(méi)有治療或以對(duì)照病毒治療的動(dòng)物的比較表明，這是很有意義的，甚至是非常有意義的，因?yàn)樗档土藬U(kuò)散率和血管數(shù)字并且提高了凋落率。
本發(fā)明的其他運(yùn)用方式涉及載體、增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因、跨膜支撐和靶器官。
載體(Vektoren)首先，隱蔽的轉(zhuǎn)移是存在的，要重新激活它們經(jīng)過(guò)多年的潛伏期之后才有可能，而且在手術(shù)前預(yù)防轉(zhuǎn)移時(shí)，轉(zhuǎn)移的基因的長(zhǎng)期表現(xiàn)最為重要。應(yīng)用第一代腺病毒的療效只限短暫的數(shù)周。接受免疫防御反應(yīng)的人對(duì)此是可以負(fù)責(zé)的。這似乎決定于腺病毒基因的休止表達(dá)(Y.楊等人利用病毒抗原的細(xì)胞免疫來(lái)限制E1-缺失的腺病毒的基因療法。美國(guó)自然科學(xué)院會(huì)議錄，91，4407-4411)。減少免疫遺傳極有希望的方案是轉(zhuǎn)移來(lái)自治療載體的一切有密碼的腺病毒的基因組段(H.H.陳等人缺少一切病毒基因的腺病素載體在肌肉中的持久性，美國(guó)自然科學(xué)院會(huì)議錄，94，1645-1650)。同時(shí)，這些病毒的運(yùn)載能力有很大提高，以致有載體的地方就有較多的轉(zhuǎn)基因，使轉(zhuǎn)移連續(xù)激活，處處都可能成為一個(gè)攻擊點(diǎn)。這種攜帶金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)的所謂依賴性輔助劑(HD，helper dependent)的空洞的或最小的腺病毒(Minimal-Adenoviren)也許能顯示出生長(zhǎng)期防止器官的轉(zhuǎn)移。其他有長(zhǎng)期持續(xù)的異體基因表達(dá)的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒(Refrovirus)和腺相關(guān)病毒(AAVs)。兩種病毒都不是免疫原，而且是以必要的方式(逆轉(zhuǎn)錄病毒)或以潛在的方式(腺相關(guān)病毒)匯集到宿主細(xì)胞的基因組的。人們還在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)靶細(xì)胞復(fù)制的必要性和高價(jià)滴定病毒懸浮物增殖的難題的時(shí)候，現(xiàn)代腺相關(guān)病毒載體(AAV-Vektoren)已經(jīng)作為蛋白酶抑制劑的基因轉(zhuǎn)移來(lái)到了中期。此外，極有前途的載體是慢病毒(Lentiviren)的雜種結(jié)構(gòu)以及單純性皰疹病毒，它們對(duì)神經(jīng)元有高度親和力，因此特別適合于大腦轉(zhuǎn)移和惡性膠質(zhì)瘤的治療。
在非病毒性載體系統(tǒng)中，脂質(zhì)體(Liposomen)是很顯著的。
本發(fā)明優(yōu)先采用一種形式是改變病毒的表面結(jié)構(gòu)，使載體有可能重建目標(biāo)。只要有一個(gè)適宜的配體在病毒的棘上表現(xiàn)出來(lái)，就有可能使固定的正常組織起到靶向的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。這是能夠辦到的。所以，例如通過(guò)肝素領(lǐng)域的結(jié)合，可將肝素實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有靶向的腺病毒。
增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(Enhancer/Promotoren)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子是可以利用的，這是因?yàn)樗鼈冇袝r(shí)對(duì)受保護(hù)的正常組織有活性。其中，大多數(shù)情況屬于器官實(shí)質(zhì)。個(gè)別的是，抗腫瘤轉(zhuǎn)基因的一種表現(xiàn)也能通過(guò)器官以下有代表性的細(xì)胞而具有意義，例如下面將要談到的膠原蛋白的分泌就是通過(guò)成纖維細(xì)胞的。
另外一種方式是應(yīng)用啟動(dòng)子，它們?cè)谔砑赢愺w物質(zhì)之后才被激活。對(duì)于這些啟動(dòng)子，如與四環(huán)素有關(guān)的啟動(dòng)子成分或有甾類化合物反應(yīng)的成分，人們可能只是分散地進(jìn)行孕育或者在轉(zhuǎn)移最危險(xiǎn)的時(shí)刻進(jìn)行選擇。
轉(zhuǎn)基因(Transgene)1.金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)是治療LS174-細(xì)胞所誘發(fā)的轉(zhuǎn)移的合適的蛋白質(zhì)，為TIMP-2所控制，TIMP-2屬于與腫瘤細(xì)胞入侵關(guān)系最密切的蛋白酶。但其他細(xì)胞系也產(chǎn)生其他MMPs，而且也反映出蛋白酶模式中的人類腫瘤。靶器官的細(xì)胞外間質(zhì)的構(gòu)造是隨著腫瘤細(xì)胞蛋白酶的要求的不同而不同的。因此，除TIMP-2以外，一個(gè)普通適用的方案必須也將其他蛋白酶抑制物質(zhì)，如TIMP-1、纖溶酶原激活物質(zhì)抑制酶-1(PAI-1)或PAI-2包括在內(nèi)。天然產(chǎn)生的抑制物在結(jié)構(gòu)上的變化會(huì)導(dǎo)致效率的提高或某些副作用的減少。這種變化在于縮短分子或者通過(guò)DNA的某些基的交換和順序的變更。例如通過(guò)分離TIMP-2分子的一個(gè)終端(C-末端)部分就能成功地分離其所不需要的蛋白酶-激活功能。
2.抑制細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)(ECM)降解的一個(gè)方案是增強(qiáng)或改變它們。在這里能將特殊的細(xì)胞間質(zhì)的天然方式產(chǎn)生的成分充分表現(xiàn)出來(lái)。其中，各種膠原蛋白(Kollagen)、纖維結(jié)合素(Fi-bronekfin)、層粘連蛋白(Laminin)及其產(chǎn)物的基因，是用于合成細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)的非蛋白成分的。此外，細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)的成分，一般不是在有關(guān)的器官中表現(xiàn)出來(lái)的，而是在不同地點(diǎn)表現(xiàn)出來(lái)的，因而使轉(zhuǎn)移的器官的特異性發(fā)生變化。還有，對(duì)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，作為一個(gè)不可逾越的障礙的不裂解或難裂解的物質(zhì)，也可以表現(xiàn)出來(lái)。
實(shí)例2長(zhǎng)期以來(lái)，人所共知在肝硬化時(shí)要比肝臟正常時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)少得多。究其原因是由于防止了轉(zhuǎn)移細(xì)胞向纖維組織的擴(kuò)展。這個(gè)結(jié)論也可利用在治療上，通過(guò)其基因的轉(zhuǎn)移而推廣到肝的正常組織，使其微解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生基因變化，從而形成有限度的人工肝硬化/纖維化，以免轉(zhuǎn)移細(xì)胞的擴(kuò)展。膠原蛋白IV是基底膜的主要成分。這種物質(zhì)是不能存在于肝細(xì)胞和竇狀隙之間的。只有少數(shù)的膠原蛋白組織散布其間。膠原蛋白含量的細(xì)微增加，就會(huì)有很敏感地限制轉(zhuǎn)移的能力。
載體結(jié)構(gòu)由膠原蛋白原纖維的三股螺旋(Tripelhelix)基因化而成的兩個(gè)多肽鏈，從一個(gè)最小-腺病毒棱形載體中被克隆出來(lái)。對(duì)強(qiáng)激活反應(yīng)劑(tet-Aktivator-vesponsiver)和強(qiáng)力霉素(Doxycyclin)有依賴性的啟動(dòng)子用作啟動(dòng)子，以便調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的大小。于是，強(qiáng)激活劑就進(jìn)入了梭形質(zhì)粒。應(yīng)用一個(gè)任意充填的系統(tǒng)可以制造出最小-腺病毒(＝HDAD-tetColl)。
載體試驗(yàn)通過(guò)禿鼠注射LS174細(xì)胞來(lái)誘發(fā)肝轉(zhuǎn)移。對(duì)依賴性輔助劑HDAD-tetcol擴(kuò)展的方法與實(shí)例1類似。利用效果相同。
3.另一防止腫瘤細(xì)胞侵犯和游動(dòng)的方法，是增強(qiáng)細(xì)胞和細(xì)胞之間以及細(xì)胞和間質(zhì)之間的粘著性。舉例來(lái)說(shuō)，有的與蛋白質(zhì)類凝血激酶(Clandin)和閉塞素(Occludin)有密切的接合，有的同主要蛋白鈣粘素(Cadhevin)、整合蛋白(Integrine)有橋粒式(Desmosomen)和粘著式接合，它們是先同細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)的成分發(fā)生變化的，還有免疫球蛋白的超族(Superfamilie)、選擇蛋白(Selectine)和粘蛋白(Muzine)。
實(shí)例3已經(jīng)有人指出，E-鈣粘素(E-Cadherin)是用于上皮細(xì)胞的相互作用的，而它的耗損卻由原發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移細(xì)胞來(lái)維持(W.畢什麥爾，E-鈣粘素就是腫瘤(侵入)的抑制基因生物論文集，1797-99)。E-鈣粘素的表達(dá)一方面是通過(guò)正常細(xì)胞導(dǎo)至同腫瘤細(xì)胞相粘著，防止其游動(dòng)，而另一方面則是促使正常細(xì)胞之間的粘著。
載體結(jié)構(gòu)建立第一代腺病毒，這種病毒在勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子的控制下攜帶E-鈣粘素基因Ad-勞氏肉瘤病毒-E-鈣粘素。
體外試驗(yàn)要作機(jī)能試驗(yàn)，可用Ad-勞氏肉瘤病病毒-E-鈣粘素，使A2細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。粘著的增加是通過(guò)測(cè)定持續(xù)時(shí)間來(lái)求得的，這需要有胰蛋白酶(Trypsin)裂解細(xì)胞。
載體試驗(yàn)通過(guò)注射LS174細(xì)胞誘發(fā)禿鼠的肝轉(zhuǎn)移。Ad-勞氏肉瘤病毒-E-鈣粘素的轉(zhuǎn)移方法與實(shí)例1類似。利用效果相同。
具有膜撐順序的轉(zhuǎn)基因在本發(fā)明的意義上應(yīng)用自殺基因(Suizigene)是為了孕育正常組織的，因此它們必須裝備有膜撐順序，以便在細(xì)胞外能夠生效，而且在細(xì)胞外能毒化所應(yīng)用的藥物前體(prodrug)。
實(shí)例4在HNF清蛋白-啟動(dòng)子的控制下，自殺基因嘧啶脫氨[基]酶(GytosinDesaminae)的基因要具有膜撐順序，所以在轉(zhuǎn)染后有固定膜表現(xiàn)出來(lái)。這種盒式表現(xiàn)是在一種腺相關(guān)病毒梭形質(zhì)粒(AAV-Shuffle Plasmid)中被克隆出來(lái)的，并且在應(yīng)用任意輔助劑系統(tǒng)中制造出腺相關(guān)病毒(＝AAV-HNF-Alb-CD-Tm)。
體外試驗(yàn)用腺相關(guān)病毒-HNFAlb-CD-Tm使A2細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)將藥物前體5-FC給與細(xì)胞培養(yǎng)突出點(diǎn)(ZKU)。現(xiàn)在將S-FC通過(guò)固定膜中的鈣粘素運(yùn)至有細(xì)胞毒性的S-FU處。24小時(shí)后將突出點(diǎn)收集起來(lái)，而且給與細(xì)胞系LS174以及靜止的原發(fā)性肝細(xì)胞。再過(guò)72小時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定凋落范圍。
體外試驗(yàn)載體應(yīng)用和療效求法與實(shí)例1類似。
靶器官鑒于在腺病毒系統(tǒng)給藥時(shí)肝所表現(xiàn)的突出的易感染性以及治療結(jié)腸直腸轉(zhuǎn)移時(shí)在臨床上的重大意義，本發(fā)明利用上述疾病模型研制了這個(gè)方法。該模型也可以應(yīng)用到其他腫瘤疾患。最常見(jiàn)的疾病征象是乳腺癌在切除原發(fā)性腫瘤后潛伏達(dá)10年之久而在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)迄今未愈以致向肝、肺、骨骼和大腦的轉(zhuǎn)移，還有氣管癌時(shí)對(duì)大腦的轉(zhuǎn)移和前列腺癌時(shí)對(duì)骨骼的轉(zhuǎn)移。
此外，有些原發(fā)性腫瘤，根據(jù)進(jìn)一步研究是原發(fā)性的，但未做手術(shù)，如常見(jiàn)的惡性膠質(zhì)瘤和肝細(xì)胞癌。按照上述原則，可想而知這是一種延長(zhǎng)壽命的措施，在這里不過(guò)是為了保護(hù)周邊的正常組織而已。


圖1為通過(guò)系統(tǒng)應(yīng)用Ad-TIMP-2來(lái)防止肝轉(zhuǎn)移。在零日將3×1010pfu的Ad-TIMP-2或Ad-β半乳糖注入禿鼠尾靜脈。三天后在動(dòng)物脾內(nèi)注射LS174結(jié)腸癌細(xì)胞以誘發(fā)肝轉(zhuǎn)移。原位照片顯示5周后未治療的動(dòng)物(左)、用Ad-β半乳糖治療的動(dòng)物(中)和用Ad-TIMP-2治療的動(dòng)物(右)。
圖2所述方法請(qǐng)參見(jiàn)圖1。5周后將動(dòng)物殺死測(cè)定腫塊。點(diǎn)代表一些動(dòng)物，短橫表示平均值。
權(quán)利要求
1.用于腫瘤疾患的基因療法的預(yù)防和治療的藥劑，其中包括—就基因轉(zhuǎn)移工具的意義而言的載體，—增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，—轉(zhuǎn)基因，對(duì)此至少有所提出的一種成分傳至正常組織中孕育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于腫瘤疾患的基因療法的預(yù)防和治療的藥劑的應(yīng)用，包括—就基因轉(zhuǎn)移工具的意義而言的載體，—增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，—轉(zhuǎn)基因，對(duì)此至少有所提出的一種成分傳至正常組織中孕育。
3.一種基因轉(zhuǎn)移載體的應(yīng)用，包括用增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的手術(shù)結(jié)扎方式的一種轉(zhuǎn)基因，并通過(guò)正常組織的傳遞去制造腫瘤疾患的基因療法的預(yù)防和治療的藥劑。
4.關(guān)于腫瘤疾患的基因療法的預(yù)防和治療的方法，其特征在于包括下列一種藥劑—就基因轉(zhuǎn)移工具的意義而言的載體，—增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，—轉(zhuǎn)基因，對(duì)此至少有所提出的一種成分傳至正常組織中孕育，對(duì)于需要預(yù)防或治療腫瘤進(jìn)行處理的患者，載體傳遞時(shí)基本上采用正常細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，其是利用啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子通過(guò)一些轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)的，那些轉(zhuǎn)錄因子在正常組織中有活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，含有巨細(xì)胞病毒即CMV啟動(dòng)子或猿猴病毒40即SV40啟動(dòng)子或勞氏肉瘤病毒即RSV啟動(dòng)子或肝特異性啟動(dòng)子如清蛋白啟動(dòng)子或肺特異性啟動(dòng)子或大腦組織特異性啟動(dòng)子或骨骼特異性啟動(dòng)子或者在有可能轉(zhuǎn)移的靶器官中或發(fā)生原發(fā)性腫瘤的器官中具有活性的那些啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，包括加入可應(yīng)用物質(zhì)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子后即可被激活的物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5和7的藥劑，其中涉及一種對(duì)四環(huán)素有依賴性或?qū)︾揞惣に赜幸蕾囆缘膯?dòng)子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有下列物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因—限制腫瘤生長(zhǎng)的，—破壞腫瘤的，—防止腫瘤侵入正常組織的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有金屬蛋白酶抑制劑的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和10的藥劑，含有標(biāo)記下列抗腫瘤的轉(zhuǎn)基因TIMP-1或TIMP-2。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有標(biāo)記下列蛋白酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因TIMP-3或TIMP-4或PAI-1或PAI-2。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的藥劑，含有改變了的轉(zhuǎn)基因，其抗腫瘤的效果因這種改變而增強(qiáng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥劑，含有以C-末端為主體的TIMP-2作為有關(guān)的轉(zhuǎn)基團(tuán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的藥劑，含有細(xì)胞外間質(zhì)的轉(zhuǎn)基團(tuán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥劑，至少包含有兩個(gè)多肽鏈的膠原蛋白或纖維結(jié)合素或?qū)诱尺B蛋白或其產(chǎn)物是用于合成細(xì)胞外間質(zhì)物質(zhì)的非蛋白成分的基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的藥劑，含有一種變得難以裂解或不能裂解的細(xì)胞外間質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有標(biāo)記粘著分子的轉(zhuǎn)基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥劑，其中有關(guān)的粘著分子是類凝血激酶或閉塞素或鈣粘素或整合蛋白或來(lái)自免疫球蛋白的超族系列的選擇蛋白或粘蛋白。
20.用于腫瘤疾患的預(yù)防和治療的治療的藥劑，包括抗腫瘤的轉(zhuǎn)基因或同一順序，而該順序具有一種膜撐順序。
21.一種用于制造腫瘤疾患的預(yù)防和治療的藥劑的基因移動(dòng)工具的應(yīng)用，包括抗腫瘤的轉(zhuǎn)基因或同一順序，而該順序具有膜撐順序。
22.用于腫瘤疾患的預(yù)防和治療的方法，其中有一種被轉(zhuǎn)移的抗腫瘤的轉(zhuǎn)基因或同一順序，而該順序具有膜撐順序。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的藥劑，含有自殺基因或用其他方式的化療有效的基因作為有關(guān)的轉(zhuǎn)基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的藥劑，其中有關(guān)的轉(zhuǎn)基因?yàn)榘奏っ摪盵基]酶或同一活性部分的順序或硝基還原酶或同一部分的順序。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，其中的載體為病毒。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的藥劑，其中的病毒為第一代腺病毒或腺相關(guān)病毒或最小-腺病毒或人血清病毒即HSV或慢病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥劑，其中的病毒為慢病毒/最小腺病毒的雜種。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的藥劑，其中的載體為一非人類的哺乳動(dòng)物的腺病毒。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，其中的載體不是病毒。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的藥劑，其中的載體為脂質(zhì)體成分或應(yīng)用的是載體蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求25和29的藥劑，其中的表面改變是使一特異性基因轉(zhuǎn)移到正常組織。
32.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種最小腺病毒和TIMP-2。
33.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種最小腺病毒和以C-末端為主體的TIMP-2。
34.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種腺相關(guān)病毒和TIMP-2。
35.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種第一代腺病毒和TIMP-2。
36.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種慢病毒/最小腺病毒的雜種和TIMP-2。
37.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種腺相關(guān)病毒和以C-末端為主體的TIMP-2。
38.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種最小腺病毒和E-鈣粘素。
39.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種腺相關(guān)病毒和E-鈣粘素。
40.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有一種最小腺病毒，并至少有膠原蛋白的兩個(gè)多肽鏈。
41.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，涉及基因轉(zhuǎn)移到肝組織。
42.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，涉及肝轉(zhuǎn)移的治療和預(yù)防。
43.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，涉及大腦腫瘤的治療。
44.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，涉及肺轉(zhuǎn)移的治療。
45.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有HNF清蛋白-增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、腺相關(guān)病毒和TIMP-1。
46.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有因異體物質(zhì)而激活的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，以及至少有膠原蛋白的兩上多肽鏈。
47.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有肝特異性啟動(dòng)子、腺相關(guān)病毒和金屬蛋白酶抑制劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求1的藥劑，含有肝特異性啟動(dòng)子、最小腺病毒和金屬蛋白酶抑制劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求1和9的藥劑，含有肝特異性啟動(dòng)子和最小腺病毒。
50.根據(jù)權(quán)利要求1和9的藥劑，含有肝特異性啟動(dòng)子和腺相關(guān)病毒。
51.根據(jù)權(quán)利要求1和9的藥劑，含有肝特異性啟動(dòng)子和慢病毒/最小腺病毒的雜種。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療的藥劑。其主要內(nèi)容關(guān)系到基因療法的載體以及具有增強(qiáng)子/啟動(dòng)子成分和轉(zhuǎn)基因的DNA順序。藥劑的個(gè)別成分的選擇是要保證它們?cè)杏谟锌赡芑蛞呀?jīng)遭受侵襲的器官的正常組織,以抵卸入侵的腫瘤細(xì)胞。這樣就能防止轉(zhuǎn)移部位的產(chǎn)生,誘發(fā)現(xiàn)有部位的萎縮或限制原發(fā)性腫瘤的侵犯。
文檔編號(hào)A61K38/39GK1367704SQ00808901
公開(kāi)日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2000年5月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者K·布朗特, A·巴克, M·斯特勞斯 申請(qǐng)人:K·布朗特