一種用于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移過程的仿生微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于臨床應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種用于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移過程的仿生微流控芯片。本實用新型的微流控芯片可以動態(tài)監(jiān)測腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程，定義腫瘤細胞的迀移模式，為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]癌細胞轉(zhuǎn)移是包括肺癌在內(nèi)的所有癌癥死亡的主要原因，屬于基礎(chǔ)研宄者和臨床學(xué)者的最大挑戰(zhàn)之一。癌細胞轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生理過程，通常包括主位點腫瘤病變增殖、腫瘤細胞脫離、腫瘤細胞迀移、溢出并在第二器官處形成轉(zhuǎn)移性的腫瘤細胞團。具有轉(zhuǎn)移性表型的腫瘤細胞表現(xiàn)出以下性質(zhì):細胞移動性增強、降解基底膜組分的能力增強、向周圍細胞迀移的能力增強、穿透淋巴管或者血管的能力增強、在第二位點自主增殖的能力增強。然而，腫瘤細胞迀移具有高度器官選擇性、該過程涉及腫瘤細胞和宿主器官之間的相互作用。到目前為止，器官特異性的腫瘤轉(zhuǎn)移的精確機制還未完全研宄清楚。
[0003]肺癌是世界上癌癥死亡的最主要因素，癌癥細胞轉(zhuǎn)移到遠處的器官是肺癌死亡的主要起因。臨床結(jié)果顯示，肺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移到腦組織、骨組織和肝臟組織中。更好的了解肺癌轉(zhuǎn)移模式對于制定針對肺癌病人的治療策略是非常關(guān)鍵的。因此，發(fā)展一種在體外能夠模擬肺癌轉(zhuǎn)移體內(nèi)微環(huán)境的體外細胞培養(yǎng)模型是亟待解決的問題。
[0004]了解肺癌細胞轉(zhuǎn)移的病理學(xué)需要在整個具有生理活性的肺和遠處器官的環(huán)境下研宄具有生理活性的癌癥細胞和組織的功能。然而，目前存在的用于評價正常生理和疾病過程的動物模型是十分昂貴的，并且實驗周期很長，同時還存在多種倫理爭議。更為重要的是，上述動物模型不能很好的控制轉(zhuǎn)移的肺癌細胞的定位和趨向性，從而導(dǎo)致不能正確的反應(yīng)人類體內(nèi)肺癌細胞轉(zhuǎn)移的生理狀態(tài)。近年來，一種體外3D細胞培養(yǎng)模型得到了越來越廣泛的應(yīng)用。上述體外3D細胞培養(yǎng)模型已經(jīng)被用于多種腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的共培養(yǎng)。這些模型可以容易控制條件去研宄旁分泌信號對不同類型細胞之間的影響。發(fā)明人在現(xiàn)有的3D細胞培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上進行升級和改造，開發(fā)了可以用于模擬體內(nèi)肺癌轉(zhuǎn)移微環(huán)境的仿生微流控芯片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本實用新型提供了一種用于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移過程的微流控芯片。該微流控芯片中可以將不同細胞進行共培養(yǎng)，動態(tài)監(jiān)測上游腫瘤細胞向下游靶器官轉(zhuǎn)移的過程，為臨床制定腫瘤治療方案提供基礎(chǔ)。
[0006]本實用新型的上述微流控芯片采用了如下設(shè)計方案:
[0007]本實用新型的微流控芯片是由三層PDMS基片和兩層多孔PDMS膜相互交錯不可逆的封接而成的一個密閉整體；第一層PDMS基片I上設(shè)有供空氣流通的空氣通道11、供液體進出的第一層液體入口 12和第一層液體出口 13，分別位于所述空氣通道11兩側(cè)的第一真空通道14的上半部分和第二真空通道15的上半部分；第二層PDMS基片2上設(shè)有供液體流通的液體通道21、供液體進出的第二層液體入口 22和第二層液體出口 23，分別位于所述液體通道21兩側(cè)的所述第一真空通道14的下半部分、所述第二真空通道15的下半部分，所述液體通道21的側(cè)邊上設(shè)有三條向外延伸的連接通道，分別為第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213，所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213的末端分別設(shè)有第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216 ;第三層PDMS基片3上設(shè)有供細胞培養(yǎng)的第一細胞培養(yǎng)室31、第二細胞培養(yǎng)室32、第三細胞培養(yǎng)室33 ;所述第一細胞培養(yǎng)室31、所述第二細胞培養(yǎng)室32、所述第三細胞培養(yǎng)室33分別位于所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213的下方，通過第一多孔PDMS膜5與所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213相通；所述第一真空通道14的上半部分、所述第二真空通道15的上半部分和所述第一真空通道14的下半部分、所述第二真空通道15的下半部分結(jié)構(gòu)相對應(yīng)形成結(jié)構(gòu)完整的所述第一真空通道14和所述第二真空通道15 ;所述第一層液體入口 12和所述第一層液體出口 13分別設(shè)置于所述空氣通道11的上下游且同側(cè)；所述第二層液體入口 22和所述第二層液體出口 23分別設(shè)置于所述液體通道21的上下游且同側(cè)，所述空氣通道11位于所述液體通道21的正上方，所述空氣通道11的開口與所述液體通道21的開口相對且通過第二多孔PDMS膜4隔開；所述空氣通道11覆蓋在所述液體通道21的上游端，所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213位于所述液體通道21的下游端。
[0008]進一步，所述多孔PDMS膜的厚度為10 μ m、孔徑為10 μ m。
[0009]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，所述空氣通道11和所述液體通道21的橫截面為長方形，尺寸為:高5mm、寬4mm ;所述第一真空通道14、第二真空15的橫截面為長方形，尺寸為:高7mm、寬2mm ;所述第一細胞培養(yǎng)室31、所述第二細胞培養(yǎng)室32、所述第三細胞培養(yǎng)室33的橫截面形狀為長方形，尺寸為:高1.5mm、寬1.5mm。
[0010]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，所述空氣通道11的長度為1mm;所述液體通道21的長度為35mm ;所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213距離所述液體通道21的一端的距離是2.2mm。
[0011]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，所述第一層液體入口 12和所述第一層液體出口 13的距離是15mm ;所述第二層液體入口 22和所述第二層液體出口 23的距離是15mm0
[0012]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，所述第一連接通道211、所述第二連接通道212、所述第三連接通道213相互平行。
[0013]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，所述第一真空通道14與所述空氣通道11的距離是2mm ;所述第二真空通道15與所述空氣通道11的距離是2mm。
[0014]本實用新型的微流控芯片上所有通道是設(shè)置于基片上的溝槽；本實用新型的微流控芯片上的細胞培養(yǎng)室是設(shè)置于基片上的凹槽。
[0015]構(gòu)成微流控芯片上下兩層基材的材料可以是PDMS (聚二甲基硅氧烷)、PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)、PC(聚碳酸酯)、COC樹脂、ABS(丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物)、玻璃、石英或銅。在本實用新型的具體實施方案中，所述基材I和基材2的制備材料選用PDMS。
[0016]本實用新型的微流控芯片的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0017](I)制備具有上述微流控芯片中微通道和微結(jié)構(gòu)的SU-8陽模；
[0018](2)以步驟(I)制備的SU-8陽模為模板，以PDMS為原料復(fù)制，制備成第一層PDMS基片、第二層PDMS基片、第三層PDMS基片；
[0019](3)制備兩張上述微流控芯片中的多孔PDMS膜；
[0020](4)將步驟(2)制備的所述第一層PDMS基片、所述第二層PDMS基片、所述第三層PDMS基片和步驟(3)制備的兩張所述多孔PDMS膜相互交錯放置封接而成。
[0021]進一步，在本實用新型的具體實施方案中，本實用新型的微流控芯片的制備方法如下:
[0022](I)用計算機輔助設(shè)計軟件CAD繪制上述微流控芯片中的微通道、微結(jié)構(gòu)圖；將圖打印在SU-8膠片(Microchem，型號為2075)上作為掩膜，采用標(biāo)準(zhǔn)光刻工藝制作模具，標(biāo)準(zhǔn)光刻工藝為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知；
[0023](2)將PDMS (Dow Corning，貨號:0007883528)和固化劑按質(zhì)量比10:1混勻，在真空干燥箱抽真空之后澆涂在步驟(I)制備的模具表面，80°C烘烤Ih ;
[0024](3)冷卻后緩慢將PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相應(yīng)位置鉆出入口、出口，然后切割成合適大?。?br>[0025](4)多孔PDMS膜制作是PDMS和固化劑按質(zhì)量比15:1混勻，勻膠機3000rpm，I分鐘，抽真空之后澆涂在步驟(I)制備的模具表面，65°C烘制過夜；冷卻后緩慢將PDMS在模板上撕下，備用。
[0026]Su-8光刻技術(shù):新型的化學(xué)增幅型負像SU-8光刻膠克服了普通光刻膠采用UV光刻深寬比不足的問題，十分適合于制備高深寬比微結(jié)構(gòu)，因此SU-8膠是一種負性、環(huán)氧樹脂型、近紫外線光刻膠。它在近紫外光(365nm-400nm)范圍內(nèi)光吸收度很低，且整個光刻膠層所獲得的曝光量均勻一致，可得到具有垂直側(cè)壁和高深寬比的厚膜圖形；它還具有良好的力學(xué)性能、抗化學(xué)腐蝕性和熱穩(wěn)定性；SU-8在受到紫外輻射后發(fā)生交聯(lián)，是一種化學(xué)擴大負性膠，可以形成臺階等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的圖形；且SU-8膠不導(dǎo)電，在電鍍時可以直接作為絕緣體使用。由于它具有較多優(yōu)點，SU-8膠正被逐漸應(yīng)用于MFMS、芯片封裝和微加工等領(lǐng)域。直接采用SU-8光刻膠來制備深寬比高的微結(jié)構(gòu)與微零件是微加工領(lǐng)域的一項新技術(shù)。
[0027]使用本實用新型的微流控芯片監(jiān)測體內(nèi)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程的操作步驟如下:
[0028]1、實質(zhì)模擬:將上皮細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)于微流控芯片中的多孔PDMS膜4接觸空氣的一面。
[0029]2、間質(zhì)模擬:將血管內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞(例如成纖維細胞、單核細胞)共培養(yǎng)于微流控芯片中多孔PDMS膜4接觸液體的一面。
[0030]3、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移靶器官模擬:將腦組織細胞、骨組織細胞、肝組織細胞分別在微流控芯片中細胞培養(yǎng)室31、32、33中進行3D培養(yǎng)。
[0031]4、進行體外構(gòu)建的肺癌轉(zhuǎn)移微環(huán)境的有效性檢測
[0032]通過檢測細胞的活力，血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞連接的緊密性，腫瘤細胞誘導(dǎo)的癌相關(guān)成纖維細