胞、巨噬細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)來評價(jià)利用本實(shí)用新型的微流控芯片構(gòu)建的模擬腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移微環(huán)境的仿生模型的有效性。
[0033]5、進(jìn)行腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程的檢測
[0034]通過檢測腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記蛋白表達(dá)評價(jià)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的生成；通過細(xì)胞形態(tài)的觀察比較轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生長模式；通過腫瘤細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)標(biāo)記蛋白表達(dá)評價(jià)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞迀移到靶器官之后的變化；通過檢測靶器官損壞標(biāo)記蛋白的表達(dá)來評價(jià)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞是否已侵襲到靶器官中。
[0035]在本實(shí)用新型的具體實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞為支氣管上皮細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞，即使用本實(shí)用新型的微流控芯片構(gòu)建了一個(gè)模擬肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移微環(huán)境的仿生模型。
[0036]原理:本實(shí)用新型采用PDMS和帶有網(wǎng)孔的滲透膜材料，依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)、組織與組織間、器官與微環(huán)境間相互作用的特性以及流體力學(xué)原理，設(shè)計(jì)和制作一個(gè)能夠接近肺解剖結(jié)構(gòu)、模擬肺生理功能的多單元集成、多通道連接的高通量微流控芯片實(shí)驗(yàn)室。該實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何重建肺的解剖結(jié)構(gòu)，包括各級支氣管、肺泡在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)和肺間質(zhì)以及如何模擬肺的主要生理功能，即氣體交換。以一層帶有網(wǎng)孔的滲透膜替代呼吸運(yùn)動(dòng)時(shí)可促使擴(kuò)張的肺泡回縮的彈性纖維，通過在膜上下兩面分別支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的二維培養(yǎng)，模擬肺實(shí)質(zhì)和間質(zhì)，并構(gòu)成了氣血屏障，繼而在與膜平行方向分別通入氣體和液體供應(yīng)氧分與營養(yǎng)物質(zhì)，在與膜垂直方向的兩側(cè)連接兩個(gè)真空通道，模擬人體呼吸節(jié)律。當(dāng)真空通道泵入氣體時(shí)，滲透膜回縮，氣體通道氧氣泵入，肺泡擴(kuò)張，模擬肺臟吸氣功能；當(dāng)真空通道回抽氣體時(shí)，滲透膜拉伸，氣體通道氧氣泵出，肺泡收縮，模擬肺臟呼氣功能。至此，構(gòu)建了一個(gè)接近肺解剖結(jié)構(gòu)、能夠模擬肺主要生理功能的仿生肺芯片生理模型。在上述仿生芯片肺生理模型基礎(chǔ)上，依據(jù)絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮，將肺癌分別接種于支氣管上皮細(xì)胞區(qū)，構(gòu)建仿生芯片肺癌病理模型；依據(jù)肺癌轉(zhuǎn)移途徑及好發(fā)部位，在上述肺癌病理模型上搭建神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)室、骨細(xì)胞培養(yǎng)室、及肝細(xì)胞培養(yǎng)室分別模擬腦、骨、肝等肺癌最常轉(zhuǎn)移的靶器官，構(gòu)建肺癌不同轉(zhuǎn)移階段病理模型，再現(xiàn)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移全過程。
[0037]本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:
[0038](I)本實(shí)用新型的微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)，來更好的完成體內(nèi)生物學(xué)功能研宄；該微流控芯片用于檢測的試劑消耗量顯著低于傳統(tǒng)平臺。
[0039](2)細(xì)胞在本實(shí)用新型的微流控芯片平臺中培養(yǎng)具有良好的適應(yīng)性；微流控芯片的主要材料是PDMS，PDMS具有良好的生物相容性和高度的透氣性，氣體可以順暢通過PDMS，從而保證了芯片內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞與外媒的氣體交換。
[0040](4)傳統(tǒng)平臺上細(xì)胞生長的靜態(tài)宏觀環(huán)境與體內(nèi)細(xì)胞生存微小立體空間相差懸殊，微流控芯片體系則彌補(bǔ)了傳統(tǒng)平臺在這方面的缺陷，它具有更好的密閉性，因此細(xì)胞生存空間的大小與人體內(nèi)細(xì)胞生存的生理微空間更加相似，這種微小空間內(nèi)的原位在線檢測也進(jìn)一步增加了檢測結(jié)果的可信度。
[0041](5)本實(shí)用新型的微流控芯片平臺操作簡便，省時(shí)省力。
【附圖說明】
[0042]圖1顯示本實(shí)用新型的微流控芯片結(jié)構(gòu)的分解圖；
[0043]圖2顯示本實(shí)用新型的微流控芯片結(jié)構(gòu)的分解圖；
[0044]圖3顯示本實(shí)用新型的微流控芯片整體結(jié)構(gòu)的俯視圖；
[0045]圖4顯示本實(shí)用新型的微流控芯片的第一層基片結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖；
[0046]圖5顯示本實(shí)用新型的微流控芯片的第二層基片結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖；
[0047]圖6顯示本實(shí)用新型的微流控芯片的第三層基片結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖；
[0048]圖7顯示本實(shí)用新型的微流控芯片的多孔PDMS膜的側(cè)視圖；
[0049]圖8顯示利用H33342/PI染色檢測芯片中細(xì)胞活力，其中，A:16HBE細(xì)胞24H后的細(xì)胞形態(tài):HUVEC細(xì)胞24H后的細(xì)胞形態(tài)；C:16HBE細(xì)胞48H后的細(xì)胞形態(tài)；D:HUVEC細(xì)胞48H后的細(xì)胞形態(tài)；E:16HBE細(xì)胞H33342/PI染色；F:HUVEC細(xì)胞H33342/PI染色；
[0050]圖9顯示利用免疫染色檢測支氣管上皮細(xì)胞16HBE和血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的連接情況，其中，G:16HBE細(xì)胞中E-cadherin蛋白免疫染色:HUVEC細(xì)胞中E-cadherin蛋白免疫染色；
[0051]圖 10 顯不利用 Immunofluorescence cell tracker express1n assay 檢測肺癌細(xì)胞A549和支氣管上皮細(xì)胞16HBE的共定位情況，其中，A:16HBE細(xì)胞形態(tài)；B:16HBE與A549共培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)；C:16HBE細(xì)胞cell tracker染色；D:16HBE與A549共培養(yǎng)celltracker 染色；
[0052]圖11顯示利用免疫染色檢測肺癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的特異性蛋白的表達(dá)情況，其中，E:16HBE細(xì)胞CEA蛋白免疫染色；F: 16HBE與A549共培養(yǎng)CEA蛋白免疫染色；G:成纖維細(xì)胞中a-SMA蛋白免疫染色；H:CAF(癌相關(guān)成纖維細(xì)胞)中a-SMA蛋白免疫染色；1:巨噬細(xì)胞中⑶206蛋白免疫染色J:CAM(癌相關(guān)巨噬細(xì)胞)中⑶206蛋白免疫染色；
[0053]圖12顯示利用免疫染色檢測肺癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化marker的表達(dá)情況，其中，A:細(xì)胞免疫染色圖；B:光密度值統(tǒng)計(jì)圖；
[0054]圖13顯示利用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測肺癌細(xì)胞A549到遠(yuǎn)端組織的迀移情況；
[0055]圖14顯示利用顯微鏡觀察肺癌細(xì)胞A549在遠(yuǎn)端組織處的生長模式；
[0056]圖15顯示利用免疫染色來檢測遠(yuǎn)端組織中特征性蛋白的表達(dá)情況，其中，A:特征性蛋白免疫染色圖:光密度值統(tǒng)計(jì)圖；
[0057]其中，1:第一層PDMS基片；11:空氣通道；12:第一層液體入口 ；13:第一層液體出口 ；14:第一真空通道；15:第二真空通道；2:第二層PDMS基片；21:液體通道；22:第二層液體入口 ；23:第二層液體出口 ；211:第一連接通道；212:第二連接通道；213:第三連接通道；214:第一入口 ；215:第二入口 ；216:第三入口 ；3:第三層PDMS基片；31:第一細(xì)胞培養(yǎng)室；32:第二細(xì)胞培養(yǎng)室33:第三細(xì)胞培養(yǎng)室；4:第一多孔PDMS膜；5:第二多孔PDMS膜。
【具體實(shí)施方式】
[0058]通過參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本實(shí)用新型的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說明本實(shí)用新型，并不意味著限定本實(shí)用新型的范圍。
[0059]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061]實(shí)施例1 一種用于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移過程的微流控芯片
[0062]本實(shí)用新型的微流控芯片是由三層PDMS基片和兩層多孔PDMS膜相互交錯(cuò)不可逆的封接而成的一個(gè)密閉整體；第一層PDMS基片I上設(shè)有供空氣流通的空氣通道11、供液體進(jìn)出的第一層液體入口 12和第一層液體出口 13，分別位于空氣通道11兩側(cè)的第一真空通道14的上半部分和第二真空通道15的上半部分；第二層PDMS基片2上設(shè)有供液體流通的液體通道21、供液體進(jìn)出的第二層液體入口 22和第二層液體出口 23，分別位于液體通道21兩側(cè)的第一真空通道14的下半部分、第二真空通道15的下半部分，液體通道21的側(cè)邊上設(shè)有三條向外延伸的連接通道，分別為第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213，第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213的末端分別設(shè)有第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216 ;第三層PDMS基片3上設(shè)有供細(xì)胞培養(yǎng)的第一細(xì)胞培養(yǎng)室31、第二細(xì)胞培養(yǎng)室32、第三細(xì)胞培養(yǎng)室33 ;第一細(xì)胞培養(yǎng)室31、第二細(xì)胞培養(yǎng)室32、第三細(xì)胞培養(yǎng)室33分別位于第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213的下方，通過第一多孔PDMS膜5與第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213相通；第一真空通道14的上半部分、第二真空通道15的上半部分和第一真空通道14的下半部分、第二真空通道15的下半部分結(jié)構(gòu)相對應(yīng)形成結(jié)構(gòu)完整的第一真空通道14和第二真空通道15 ;第一層液體入口 12和第一層液體出口 13分別設(shè)置于空氣通道11的上下游且同側(cè)；第二層液體入口 22和第二層液體出口 23分別設(shè)置于液體通道21的上下游且同側(cè)，空氣通道11位于液體通道21的正上方，空氣通道11的開口與液體通道21的開口相對且通過第二多孔PDMS膜4隔開；空氣通道11覆蓋在液體通道21的上游端，第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213位于液體通道21的下游端。
[0063]第一多孔PDMS膜4和第二多孔PDMS膜5的厚度為10 μ m、孔徑為10 μ m。
[0064]空氣通道11和液體通道21的橫截面為長方形，尺寸為:高5mm、寬4mm ;通道14、15的橫截面為長方形，尺寸為:高7mm、寬2mm ;第一細(xì)胞培養(yǎng)室31、第二細(xì)胞培養(yǎng)室32、第三細(xì)胞培養(yǎng)室33的橫截面形狀為長方形，尺寸為:高1.5mm、寬1.5mm。
[0065]空氣通道11的長度為1mm ;液體通道21的長度為35mm ;第一連接通道211、第二連接通道212、第三連接通道213距離液體通道21的一端的距離是2.2mm。
[0066]第一層液體入口 12和第二層液體出口 13的距離是15mm ;第二層液體入口 22和第二層液體出口 23的距離是15mm。
[0067]第一連接通道211、第二連接通道212