、第三連接通道213相互平行。
[0068]第一真空通道14與空氣通道11的距離是2mm;第二真空通道15與空氣通道11的距離是2_。
[0069]本實用新型的微流控芯片上所有通道是設置于基片上的溝槽；本實用新型的微流控芯片上的細胞培養(yǎng)室是設置于基片上的凹槽。
[0070]實施例2實施例1中的微流控芯片的制備
[0071]實施例1中的微流控芯片的制備方法包括以下步驟:
[0072](I)用計算機輔助設計軟件CAD繪制上述微流控芯片中的微通道、微結構圖；將圖打印在SU-8膠片(Microchem，型號為2075)上作為掩膜，采用標準光刻工藝制作模具，標準光刻工藝為本領域技術人員熟知；
[0073](2)將PDMS (Dow Corning，貨號:0007883528)和固化劑按質量比10:1混勻，在真空干燥箱抽真空之后澆涂在步驟(I)制備的模具表面，80°C烘烤Ih;
[0074](3)冷卻后緩慢將PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相應位置鉆出入口、出口，然后切割成合適大小；
[0075](4)多孔PDMS膜制作是PDMS和固化劑按質量比15:1混勻，勻膠機3000rpm，I分鐘，抽真空之后澆涂在步驟(I)制備的模具表面，65°C烘制過夜；冷卻后緩慢將PDMS在模板上撕下，備用。
[0076]實施例3模擬體內(nèi)肺癌細胞轉移微環(huán)境的仿生模型的構建
[0077]1、微流控芯片中肺癌細胞的2D培養(yǎng)
[0078](I)微流控芯片使用紫外線照射殺菌，多孔PDMS膜上包被有BME，具體包被過程為:對芯片進行預處理，以利細胞更好的附著在芯片多孔膜表面。按1:10比例稀釋BME (Cultrex basement membrane extract, R&D Systems, McKinley Place, MN, USA)，充分混合后用微量加樣器注入微流控芯片的樣本入口，孵箱過夜等待膠凝固。
[0079](2)將微流控芯片翻轉，即第三層PDMS基片朝上。將懸浮的單核細胞收集到離心管中，100rpm離心5分鐘，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基制備細胞懸液。將單核細胞懸液通過第二層液體入口 22注入到液體通道21中，使其以13個/Cm2的密度種植到多孔膜PDMS膜上，之后使用注射泵以24mm/h的容積流速將PMA培養(yǎng)基(100ng/ml)通過第二層液體入口22注入到微流控芯片中，多余培養(yǎng)基通過第二層液體出口 23排除。將微流控芯片傾斜以允許細胞移動到液體通道21的一邊。將芯片傾斜向一側30度，以使單核細胞沉降到中央培養(yǎng)通道的一側，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)。48h后的單核細胞被刺激為巨噬細胞。
[0080](3)刺激單核細胞變成MO巨噬細胞后，將PMA培養(yǎng)基更換成正常培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基)O
[0081](4)將人類肺成纖維細胞種植以14個/cm2的密度種植到MO巨噬細胞生長的位置(待細胞增殖至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，加入新鮮的培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，100rpm離心5分鐘，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，制成成纖維細胞懸液。將肺成纖維細胞WI38以14個細胞/cm2的細胞密度接種到巨噬細胞的同側，使其附著到多孔膜表面，置于37°C、5% CO2孵箱靜態(tài)條件下培養(yǎng)4小時。
[0082](5)將微流控芯片回復到水平狀態(tài)，將血管內(nèi)皮細胞懸液通過第二層液體入口 22注入到液體通道21中，使其以14個/cm 2的密度種植到多孔PDMS膜上，粘附在液體通道21的另一邊。
[0083](6)待芯片多孔膜下側細胞均貼壁生長后，翻轉芯片從上側通過第一層液體入口12以14個細胞/cm 2的細胞密度將支氣管上皮細胞16HBE注入芯片，靜態(tài)使其附著在膜表面4小時后，小心從第一層液體出口 13將培養(yǎng)基輕輕地從上部通道抽吸，繼續(xù)通過第一層液體入口 12連續(xù)泵入混合培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)。將培養(yǎng)基通過第一層液體出口 13排除。
[0084](7)待上述細胞長滿后，將肺癌細胞懸液通過第一層液體入口 12注入到空氣通道11中，使其以13個/CHi2的密度種植到多孔PDMS膜上接種到芯片上層支氣管上皮細胞區(qū)，靜置4h使其貼附。將培養(yǎng)基通過第一層液體出口 13排除。
[0085]2、微流控芯片中腦組織細胞、骨組織細胞、肝組織細胞的3D培養(yǎng)
[0086](I)將星形膠質細胞、成骨細胞和肝細胞(購自中國科學院上海生科院細胞中心)使用胰酶消化，使其重懸在冰預冷的細胞基底膜提取物混合物中(購自R&D)，分別將細胞懸液與BME等體積混合。
[0087](2)將微流控芯片置于37°C環(huán)境中靜置30min使BME膠化。通過第二層液體入口22將培養(yǎng)基注入微流控芯片中，連續(xù)泵入，于此同時，將第二層液體出口 23封住，使多余的培養(yǎng)基從第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216排出。
[0088](3)將微流控芯片放置于濕度為95%、二氧化碳濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(真空泵參數(shù)為 phys1logical cyclic strain (10% at 0.2Hz)。孵育時間 24h，進行后續(xù)實驗。
[0089]實施例4模擬體內(nèi)肺癌細胞轉移微環(huán)境的仿生模型的有效性檢測
[0090]評價實施例3構建的模擬體內(nèi)肺癌細胞轉移微環(huán)境的仿生模型的有效性，通過以下實驗來完成:
[0091]1、細胞活力的檢測
[0092]檢測方法:在芯片系統(tǒng)中吸去通道中培養(yǎng)液，將PBS注入芯片通道內(nèi)，清洗不同處理組的細胞2次；之后泵入H33342 (1:100)染色15分鐘，PBS溶液清洗2次；后泵入PI染色(1:200) 5分鐘，PBS溶液清洗2次；在顯微鏡下，觀察在相應激發(fā)光激發(fā)下的熒光強度并照相記錄。
[0093]2、肺癌細胞和支氣管上皮細胞共定位的檢測
[0094]細胞示蹤劑C7000CM_DiL將肺癌細胞標記為紅色:芯片接種前將肺癌細胞重懸于C7000CM_DiL 工作液中(I μ g/μ L) 37°C孵育 5min，4°C放置 15min。
[0095]3、人類支氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的生長模式的觀察
[0096]使用E鈣粘蛋白的免疫染色檢測微流控芯片中支氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞連接的緊密性。E鈣粘蛋白免疫染色過程如下:
[0097]a、使用PBS沖洗微流控芯片中膜兩側的支氣管上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞；
[0098]b、使用4%多聚甲醛固定細胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分鐘，PBS溶液清洗2次。
[0099]C、將封閉血清稀釋液注入芯片培養(yǎng)池中，放入濕盒內(nèi)，37°C孵育I小時。用新鮮配制的5% BSA稀釋羊封閉血清原液，按照1:100的比例稀釋，用振蕩器混勻；
[0100]d、使用終濃度為2 μ g/mL的E鈣粘蛋白抗體(Abcam)稀釋液孵育2h ；
[0101]e、使用Alexa 594偶聯(lián)的二抗孵育Ih ；
[0102]f、使用終濃度為10 μ g/mL的DAPI染色，時間為15min ;使用熒光顯微鏡照相。
[0103]4、檢測肺癌細胞、與癌相關成纖維細胞、巨噬細胞的特征
[0104]使用免疫染色的方法檢測腫瘤細胞標記蛋白CEA的表達、成纖維細胞標記蛋白a -SMA的表達、巨噬細胞標記蛋白⑶206的表達，標記結果使用免疫熒光顯微鏡呈現(xiàn)。
[0105]免疫染色過程如下:
[0106]a、使用PBS清洗微流控芯片中肺癌細胞、成纖維細胞、巨噬細胞；
[0107]b、使用4%多聚甲醛固定細胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分鐘，PBS溶液清洗2次；
[0108]C、將封閉血清稀釋液注入芯片培養(yǎng)池中，放入濕盒內(nèi)，37°C孵育I小時；用新鮮配制的5% BSA稀釋羊封閉血清原液，按照1:100的比例稀釋，用振蕩器混勻；
[0109]e、使用抗人CEA蛋白的抗體(1: 100, abeam)，抗人a -SMA蛋白的抗體(1:200，Santa Cruz)、抗人⑶206 蛋白的抗體(1:50，abeam)孵育 2h ;
[0110]f、使用Alexa 488或者594偶聯(lián)的二抗孵育Ih ;使用終濃度為10 μ g/mL的DAPI染色，時間為15min ;使用熒光顯微鏡照相。
[0111]2、實驗結果:
[0112]2.1細胞活力的結果:細胞活力95%以上(圖8)。
[0113]2.2immunofluorescence cell tracker express1n assay 結果表明肺癌細胞A549和支氣管上皮細胞16HBE共定位(圖10)。
[0114]2.3E-cadherin蛋白免疫染色，實驗結果表明支氣管上皮細胞16HBE和血管內(nèi)皮細胞HUVEC相互連接緊密(圖9)。
[0115]2.4肺癌細胞中CEA表達；成纖維細胞中表達a-SMA，巨噬細胞中表達⑶206，證明了肺癌細胞與間質細胞相互作用導致間質細胞活化，成纖維細胞轉化為癌相關成纖維細胞α -SM,巨噬細胞轉化為癌相關巨噬細胞表達⑶206(圖11)。
[0116]實施例5利用模擬體內(nèi)肺癌細胞轉移微環(huán)境的仿生模型監(jiān)測肺癌細胞轉移過程
[0117]1、步驟
[0118]1.1肺癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化(EMT)的檢測
[0119]通過檢測上皮-間質轉化(EMT)標志物蛋白:Ε鈣粘蛋白、N鈣粘蛋白、Snaill、Snail2的表達來評價肺癌細胞是否發(fā)生了上皮-間質轉化。
[0120]免疫標記過程如下:
[0121]a、使用PBS清洗