專利名稱：一種磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物醫(yī)藥制造領(lǐng)域，涉及惡性腫瘤淋巴磁導(dǎo)向化療新載體，具體涉 及一種用于治療惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具有磁導(dǎo)向功能的新載體——磁性聚丙烯酸改 性碳納米管及其制備方法。
背景技術(shù)：
大量的臨床研究已經(jīng)證明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的轉(zhuǎn)移途徑之一，也是 影響其預(yù)后的重要因素。然而，盡管惡性腫瘤的診斷和綜合治療已取得長足進(jìn)步，多 數(shù)已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌癥患者生存期并未見明顯延長。其主要原因包括，放療和全身 化療對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用不理想且毒副作用大；根治性手術(shù)并不能完全阻止腫瘤早期 復(fù)發(fā)，可能是因為手術(shù)時隱灶的腫瘤細(xì)胞已侵犯或轉(zhuǎn)移至手術(shù)區(qū)外外科手術(shù)中可能 切斷淋巴管，分破轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，使腫瘤細(xì)胞逸漏到周圍組織；同時手術(shù)操作可能牽 扯或擠壓腫瘤，可使腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處播散；手術(shù)還可能遺漏含腫瘤細(xì)胞的細(xì)小淋巴結(jié) 及少數(shù)跳躍式轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，這些因素均可造成癌癥的術(shù)后復(fù)發(fā)。輔助化療對降低惡 性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要意義，但靜脈化療、區(qū)域性動脈灌注化療和局部植入化療使 藥物在體內(nèi)主要通過血液轉(zhuǎn)運，由于血流速度是淋巴流速的200 500倍，故局部淋巴 結(jié)中的藥物濃度極低，可見普通的輔助化療方式對惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移療效有限。
淋巴化療又稱淋巴結(jié)靶向化療、藥物性淋巴結(jié)清掃，是利用淋巴系統(tǒng)具有吞噬大 分子物質(zhì)和微粒的特性，將化療藥物與載體共價結(jié)合、物理包裹或吸附，改變藥物的 藥代動力學(xué)，保持藥物活性，構(gòu)成淋巴靶向給藥系統(tǒng)；利用淋巴回流較慢的特點，通 過淋巴耙向給藥系統(tǒng)維持局部藥物濃度平衡的方式緩釋化療藥，使區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)較長 時間維持抗癌藥物高濃度，從而有效殺傷淋巴系統(tǒng)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞；還可重新調(diào)整局部 淋巴結(jié)內(nèi)的免疫活性，恢復(fù)淋巴細(xì)胞功能，消滅殘存的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到減少腫瘤經(jīng)淋 巴途徑轉(zhuǎn)移，控制藥物進(jìn)入血循環(huán)，降低化療副反應(yīng)的目的。目前用于淋巴靶向的載 體有活性炭、脂質(zhì)體以及高分子偶聯(lián)前體藥物包括多糖如葡聚糖、甲殼胺和多肽類的 聚谷酰胺、聚天冬酰胺等。這些載體在淋巴化療中發(fā)揮了一定的作用，但仍有不盡人 意之處，如載藥量少、粒徑大小難以控制、靶向性差、不能作為示蹤劑以及對診斷無 幫助。研究表明，親淋巴物質(zhì)在淋巴循環(huán)中流動很快，皮下注射一般染料后5分鐘即可 在區(qū)域淋巴結(jié)檢測到相應(yīng)物質(zhì)。事實上，進(jìn)入毛細(xì)淋巴管的大分子物質(zhì)或微粒隨淋巴 液在淋巴管內(nèi)流動，除了少量經(jīng)淋巴靜脈通路直接進(jìn)入血循環(huán)外，其余大部分流向區(qū) 域淋巴結(jié)。這些進(jìn)入淋巴結(jié)的物質(zhì)， 一部分在竇間隙內(nèi)被攝取或被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)主動 吞噬，另一部分則經(jīng)輸出淋巴管行向上一站淋巴結(jié)，最后經(jīng)胸導(dǎo)管或右側(cè)淋巴導(dǎo)管進(jìn) 入血液。可見要提高靶向治療效果，必須使載藥的親淋巴載體在靶淋巴結(jié)中積聚足夠 多，再利用載體的緩釋特性，緩慢釋放藥物，從而達(dá)到延長藥物在靶淋巴結(jié)中的滯留 時間，提高局部藥物濃度的目的。磁靶向給藥系統(tǒng)是將藥物與磁性物質(zhì)配置在一個穩(wěn) 定系統(tǒng)中，通過外磁場作用將載體定位于靶區(qū)，其所含藥物定位釋放、集中在病變部 位而發(fā)揮作用。它是目前國內(nèi)外大力研究治療惡性腫瘤的一種新型藥物耙向系統(tǒng)。與 常規(guī)化療相比，磁性藥物聯(lián)合外磁場對腫瘤細(xì)胞的靶向性更強，不良反應(yīng)小，療效好。 淋巴化療和磁靶向治療具有共同的優(yōu)勢，既提高療效，又降低毒副反應(yīng)，若將兩者聯(lián) 合使用，其協(xié)同效應(yīng)是顯而易見的。
碳納米管(Carbon nanotube， CNT)是1991年日本科學(xué)家Iijima發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn) 為是碳原子形成的石墨片層巻成的無縫、中空的管體，分為單壁碳納米管(Single -walled carbon nanotubes, SWCNTs)禾口多壁碳纟內(nèi)米管(Multi-walled carbon n謹(jǐn)tubes, MWCNTs)兩種。由于具有優(yōu)越的力學(xué)、電磁學(xué)和化學(xué)性能，碳納米管是目前物理、化 學(xué)和材料科學(xué)最前沿的研究領(lǐng)域。近年來，功能化碳納米管在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已被用 作許多制劑，如藥物、抗原、DNA、疫苗、蛋白和基因載體。由于具有強磁響應(yīng)性，加 之碳納米管與許多高分子聚合物具有良好的相容性，磁性碳納米管(Magnetic carbon nanotube， mCNT)將成為一種很有潛力的多功能材料，用途十分廣泛，如制備便攜式 電子材料、磁力顯微鏡懸梁尖端、微流體裝置磁力攪拌器和納米流體裝置磁力閥門。 最有誘惑力的莫過于將其作為磁靶向藥物載體，在磁場作用下把藥物運送至體內(nèi)耙器 官或耙組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種惡性腫瘤淋巴磁導(dǎo)向化療新載體，具體涉及一種用于治 療惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具有磁導(dǎo)向功能的磁性聚丙烯酸改性碳納米管。
本發(fā)明將磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體用于惡性腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移治療，能 提高抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的治療效果，為惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供一種新的干預(yù)手段。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)
通過制備具有強吸附性和良好淋巴趨向性的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體，將載體吸附化療藥物，攜載進(jìn)入惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)緩慢釋放，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的有效濃度，實現(xiàn)惡性腫瘤淋巴磁導(dǎo)向化療的目的。
所述的多壁碳納米管經(jīng)過聚丙烯腈改性后，在酸性條件下水解得到含有大量羧基的聚丙烯酸改性的水溶性碳納米管，然后通過水相化學(xué)共沉淀方法制成磁性四氧化三鐵-聚丙烯酸改性多壁碳納米管復(fù)合體。本發(fā)明選擇長度和直徑合適的碳納米管用作淋巴化療的藥物載體，該納米藥物載體的直徑10-80nm，具有良好的淋巴趨向性能。
磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體吸附化療藥物后能有效地攜載至惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)，且緩慢釋放；在外磁場作用下，其使得淋巴結(jié)內(nèi)的藥物濃度顯著升高，
而血漿內(nèi)的藥物濃度明顯低下。
本發(fā)明的另一目的是提供所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法。
本發(fā)明包括下述步驟
1) 采用氣相共沉積法制備多壁碳納米管，通過丙烯腈乳液聚合，在酸性條件下水解得聚丙烯酸改性的水溶性碳納米管；所述水溶性碳納米管直徑10-80nm，優(yōu)選， ，
2) 采用水相化學(xué)共沉淀方法制成磁性四氧化三鐵-聚丙烯酸改性多壁碳納米管復(fù)合
體；
3) 采用體內(nèi)連續(xù)篩選接種法制備人惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的裸鼠模型，通過SD大鼠和人惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型檢驗磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的淋巴趨向性；
4) 通過超聲水浴將磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體與化療藥物混合進(jìn)行物理吸附，制成具特定粒徑的攜載有化療藥物的磁性納米復(fù)合體，超聲水浴的條件為40kHz ， 30分鐘；
5) 檢驗動物體內(nèi)磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體攜載化療藥物磁靶向至耙淋巴結(jié)的藥代動力學(xué)；
6) 通過體內(nèi)、外實驗，檢驗磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體吸附化療藥物后抗惡性腫瘤細(xì)胞增殖和抗惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的效果。
本發(fā)明將磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體用于惡性腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移治療在體外試驗中，磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體吸附化療藥物顯現(xiàn)出較單用化療藥物強的腫瘤細(xì)胞抑制率，而單純磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的細(xì)胞毒性很??；體內(nèi)實驗證實，磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體吸附化療藥物能有效治療惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；在外磁場作用下，這一作用更加明顯。
通過體外B超、CT或超聲內(nèi)鏡等輔助設(shè)備定位后進(jìn)行腫瘤穿刺，將己吸附化療藥物的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體注入實體腫瘤內(nèi)，由于腫瘤實體內(nèi)存在著豐富的淋巴管，依靠其自身的淋巴系統(tǒng)強滲透滯留效應(yīng)，磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體進(jìn)入腫瘤淋巴管系統(tǒng)內(nèi)緩慢釋放藥物，同時在磁場的精確定位下，攜載有化療藥物的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)內(nèi)緩慢控釋此藥物，使化療藥物能夠長時間達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的有效濃度，起到淋巴磁導(dǎo)向化療的作用。
本發(fā)明經(jīng)實驗證實，所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體能有效吸附化療藥物至淋巴系統(tǒng)內(nèi)，能夠在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)緩慢釋放化療藥物，且具有良好的磁場定位效應(yīng)，能明顯抑制淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞的增殖。


圖1是聚丙烯酸改性多壁碳納米管的合成路徑圖。
圖2是原始多壁碳納米管和磁性聚丙烯酸改性的多壁碳納米管透射電鏡圖。圖3是人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的裸鼠模型及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病理染色，
其中，A為接種5周后，爪墊部位原發(fā)瘤；B為轉(zhuǎn)移的胭窩淋巴結(jié)；C為淋巴結(jié)中
央?yún)^(qū)內(nèi)見小團(tuán)狀癌細(xì)胞；D為淋巴結(jié)內(nèi)見單個癌細(xì)胞。 圖4是淋巴結(jié)黑染情況，
其中，A為黑染的胭窩淋巴結(jié)；B為黑染的髂動脈旁淋巴結(jié)；C為黑染淋巴結(jié)的
鏡下觀。
圖5淋巴結(jié)內(nèi)吉西他濱濃度隨時間變化曲線。圖6血漿內(nèi)吉西他濱濃度隨時間變化曲線。圖7腫瘤細(xì)胞抑制率，
其中，GEM:吉西他濱；mMWNT:磁性聚丙烯酸改性碳納米管；mMWNT-GEM :磁性聚丙烯酸改性碳納米管吸附吉西他濱。
圖8不同時間段BxPC-3和SW1990細(xì)胞增殖指數(shù)變化情況，其中，PI細(xì)胞增殖指數(shù)；Control對照；GEM吉西他濱；mMWNT磁性聚丙烯酸改性碳納米管；mMWNT-GEM磁性聚丙烯酸改性碳納米管吸附吉西他濱。圖9各組淋巴結(jié)免疫組化陽性指數(shù)比較，
其中，A組生理鹽水(NS)組(對照組)；B組m匿NT組；C組GEM單藥組；D組低濃度mMWNT-GEM不加磁場組；E組低濃度mMWNT-GEM加磁場組；F組高濃度mMWNT-GEM加磁場組。
圖10各組淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，
其中，A組生理鹽水(NS)組(對照組)；B組mMWNT組；C組GEM單藥組；D組低濃度mMWNT-GEM不加磁場組；E組低濃度mMWNT-GEM加磁場組；F組高濃度mM麗T-GEM加磁場組。
具體實施例方式
實施例1制備磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體試劑與原料
1. 多壁碳納米管(MWNTs):通過氣相共沉積法制備而成，購自深圳市納米港有限公司，純度95%以上，直徑10 80nm;
2. 四水合氯化亞鐵(FeCl2'4H20):購自Sigma-Aldrich (上海)貿(mào)易有限公司；
3. 六水合氯化鐵(FeCl3'6H20):購自Sigma-Aldrich (上海)貿(mào)易有限公司；
4. 十二烷基對苯磺酸鈉(SDBS):購自Sigma-Aldrich (上海)貿(mào)易有限公司；
5. 丙烯腈(AN):純度〉99%，購自Fluka試劑有限公司；
6. 偶氮二異丁腈(AIBN):純度〉98%，購自上?；瘜W(xué)試劑廠；
7. 鹽酸、甲醇和NaH2P0,均購自上海化學(xué)試劑廠；
8. 去離子水復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系提供。制備聚丙烯腈改性多壁碳納米管
典型反應(yīng)過程為，在50ml去離子水中分別加入1. Og SDBS和0. 5g NaH2P04，待SDBS和NaH2P04完全溶解后，再加入O. lgMWNTs,室溫下水浴超聲(12W， 55Hz)處理lh后，再強力攪拌分散20h。然后加入2.0g細(xì)(其中溶解了0.25gAIBN)，并繼續(xù)攪拌0. 5h。通氮氣除氧0. 5h后升溫至7(TC反應(yīng)0. 5h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，并在200ml甲醇中沉淀。沉淀物用孔徑0.45um的PVDF微孔濾膜過濾，并用甲醇和去離子水洗滌，以除去SDBS。產(chǎn)物在40'C真空烘箱中干燥過夜，得聚丙烯腈改性的多壁碳納米管和聚丙烯腈均聚物的混合物。
制備聚丙烯酸改性多壁碳納米管(PM-g-MWNTs)
取0.5g上述產(chǎn)物加入到50ml濃鹽酸中，加熱回流8h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用孔徑
0. 45.m的PVDF微孔濾膜過濾分離，并用甲醇和去離子水各洗滌4 5遍，以除去聚丙烯腈均聚物，然后4(TC真空干燥過夜。得到黑色的聚丙烯酸改性的多壁碳納米管粉末。具體過程如圖l所示。
制備磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體
在50ml去離子水中，加入O. 5gSDBS，完全溶解后，加入25mg PAA-g-MWNTs，室溫下水浴超聲(12W， 55Hz)60min后，再強力攪拌分散20h。然后加入FeCl2'4H20 10. 7mg、FeCl3'6H20 29. lmg (Fe"和Fe"摩爾比1:2，理論Fe304的量12. 5mg)。通氮氣0. 5h，除去體系中的氧氣，機械攪拌(約300rpm)。將體系溫度升至6(TC，加入氨水0.5ml，維持體系溫度在6(TC反應(yīng)2h，然后將體系溫度升至9(TC反應(yīng)0. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物磁鐵分離，去離子水和甲醇各洗滌5遍，產(chǎn)物最后用去離子水分散得到穩(wěn)定分散的黑色懸浮液。
實施例2制備人惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型細(xì)胞株和實驗動物
1. BxPC-3人胰腺癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞研究所；
2. BALB/C-nu/nu裸小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)材料
1. 1640培養(yǎng)液購自Gibco-BRL公司；
2. 胰蛋白酶購自華美生物科技有限公司；
3. PBS液的配制；
4. 小牛血清華美生物科技有限公司產(chǎn)品；
5. 細(xì)胞培養(yǎng)板及細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning Costar公司；
6. 細(xì)胞培養(yǎng)皿和細(xì)胞凍存管購自Nunc公司。建立人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型
采用常規(guī)的體內(nèi)連續(xù)篩選接種法建立人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型
91. 裸小鼠爪墊皮下部位接種取BxPC-3細(xì)胞(5X107個)接種于BALB/C-nu/nu裸小鼠左側(cè)爪墊內(nèi)側(cè)皮下部位。無特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)，6 7周后取同側(cè)胭窩、腹股溝、髂動脈旁和腎門等處轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。
2. 體外原代培養(yǎng)擴增轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的腫瘤細(xì)胞。
3. 傳代培養(yǎng)和細(xì)胞純化。
4. 將上述步驟中擴增的腫瘤細(xì)胞接種于裸小鼠爪墊皮下，方法同步驟1 3，重復(fù)上述過程3輪。
5. 人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型的建立取經(jīng)過上述3輪篩選后的人胰腺癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞系接種于裸小鼠左側(cè)爪墊內(nèi)側(cè)皮下，5周后凡左側(cè)胭窩有黃豆大小淋巴結(jié)者為合格動物模型待用。
實施例3磁性聚丙烯酸改性碳納米管的淋巴趨向性實驗實驗動物
1. SD大鼠雌雄各半，4 5周齡，體重100 150g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，常規(guī)詞養(yǎng)。
2. 人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型按上述方法建立。磁性聚丙烯酸改性碳納米管對大鼠淋巴結(jié)的示蹤性能對照實驗
取大鼠分4組，每只大鼠左后肢爪墊皮下內(nèi)側(cè)注射給藥O. lml，磁性聚丙烯酸改性碳納米管混懸液分3個濃度，以磁性活性炭為對照，分別于3個時間點觀察注射局部及淋巴引流路徑上不同部位淋巴結(jié)的黑染程度，并取黑染的淋巴結(jié)行病理染色。
結(jié)果顯示，磁性聚丙烯酸改性碳納米管對各站淋巴結(jié)的黑染程度與其濃度呈一定的量效關(guān)系，濃度越大，淋巴結(jié)的黑染程度越深，且黑染率也越高。磁性聚丙烯酸改性碳納米管具有良好的淋巴結(jié)示蹤性，黑染部位主要位于淋巴結(jié)邊緣部分，見圖4。磁性聚丙烯酸改性碳納米管對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的示蹤性能實驗
取磁性聚丙烯酸改性的碳納米管混懸液0.05ml，注射于人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型左側(cè)爪墊內(nèi)側(cè)皮下，觀察注射局部及淋巴引流路徑上不同部位淋巴結(jié)的黑染程度，并取黑染的淋巴結(jié)行病理染色。
結(jié)果顯示，磁性聚丙烯酸改性碳納米管對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)具有良好的示蹤性，即使直徑只有l(wèi) 2mm的微小淋巴結(jié)也能被黑染，使肉眼清晰可見。淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移灶并不影
10響磁性聚丙烯酸改性碳納米管對下一站淋巴結(jié)的黑染。黑染的淋巴結(jié)在顯微鏡下表現(xiàn)為微粒載體聚集于轉(zhuǎn)移灶周圍。
實施例4磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體攜載化療藥物磁靶向至耙淋巴結(jié)的體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗
試劑吉西他濱購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。
實驗儀器1.高效液相色譜儀日本島津LC-10AD型高效液相色譜儀；
2. 電子分析天平JA-1003,上海天平儀器廠；
3. 圓形銣鐵硼稀土永磁鐵。
實驗動物SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。方法
1. 藥物配制稱取30mg吉西他濱，將其加入磁性聚丙烯酸改性碳納米管混懸液(理論上每毫升含PAA-g-MWNTs 25mg、納米Fe304 12. 5mg和PVP 15mg)，室溫下40kHz超聲混勻30minX2次。
2. 大鼠分為三組，吉西他濱單藥設(shè)為對照， 一組于實驗前l(fā)天在左側(cè)胭窩淋巴結(jié)體表投影處縫扎永磁體，另一組不用永磁體。以吉西他濱量計算，按體重15mg/kg給藥，分別注射于每只大鼠左后肢爪墊皮下。然后分8個時間點，即注射后6、 12、 24、 48、72、 120、 192和240h取每只大鼠左側(cè)胭窩淋巴結(jié)，并從股靜脈取血。
3. HPLC法測定淋巴結(jié)和血槳內(nèi)的吉西他濱藥物濃度。結(jié)果顯示，
1. 磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體同期其有良好的淋巴趨向性，攜載化療藥物至淋巴結(jié)，因此淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度較高，維持時間較長；在外磁場作用下，淋巴結(jié)內(nèi)的藥物濃度更高，維持時間更長，見圖5。
2. 磁性聚丙烯酸改性碳納米管在提高淋巴結(jié)內(nèi)化療藥物濃度的同時，其血漿內(nèi)的藥物濃度明顯低下，見圖6。
實施例5磁性聚丙烯酸改性碳納米管體外抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)實驗細(xì)胞株SH990、 BxPC-3人胰腺癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞研究所；細(xì)胞培養(yǎng)材料1. 1640培養(yǎng)液購自Gibco-BRL公司；
2. 胰蛋白酶購自華美生物科技有限公司；
3. PBS液的配制；
4. 小牛血清華美生物科技有限公司產(chǎn)品；
5. 細(xì)胞培養(yǎng)板及細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning Costar公司；
6. 細(xì)胞培養(yǎng)皿和細(xì)胞凍存管購自Nunc公司。
7. 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT): Sigma公司產(chǎn)品；
8. 碘化丙啶Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)胞抑制實驗
1. 分為四組，無藥組設(shè)為正常對照，吉西他濱、磁性聚丙烯酸改性碳納米管、和磁性聚丙烯酸改性碳納米管吸附吉西他濱組。MTT法測定細(xì)胞抑制率和細(xì)胞生長曲線。
2. 流式細(xì)胞儀檢測上述組別的細(xì)胞周期分布、增殖指數(shù)和凋亡率。
結(jié)果顯示，磁性聚丙烯酸改性碳納米管本身對腫瘤細(xì)胞的毒性較小，但能增強化療藥物的細(xì)胞毒作用，可能與碳納米管對細(xì)胞膜的強穿透性有關(guān)。
實施例6磁性聚丙烯酸改性碳納米管作為藥物載體體內(nèi)抗惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的
研究
實驗動物人胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型按上述方法建立。
1. 藥物配制按實施例4的方法配制，精確稱取吉西他濱，將其加入磁性聚丙烯酸改性碳納米管混懸液(理論上每毫升含PAA-g-MWNTs 5mg、納米Fe304 2 . 5mg和PVP 3mg)，室溫下40kHz超聲混勻30minX2次，GEM最終濃度為3mg/ml。
2. 裸鼠模型隨機分為6組，A組生理鹽水(NS)組(對照組)；B組mMWNT組；C組GEM單藥組;D組低濃度mMWNT-GEM不加磁場組；E組低濃度mMWNT-GEM加磁場組；F組高濃度raMWNT-GEM加磁場組。每組分別于第1、 8天各給藥一次，每次0. 05ml藥物注射于裸小鼠左后肢皮下。第15天觀察治療后療效。檢測血白細(xì)胞、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和肌酐等指標(biāo)。摘取各組左側(cè)胭窩淋巴結(jié)，測量淋巴結(jié)大小，對淋巴結(jié)進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)檢查，CK免疫組織化學(xué)染色，TUNEL法檢測淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
表1是動物實驗分組情況。表l
組別所給藥物磁場數(shù)量(n)
A組NS (NaCl)無6
B組mM謂T無6
C組GEM無6
D組 NT-GEM無6
E組mMWNT-GEM有6
F組mMWNT-GEM有6
結(jié)果顯示，
1. 治療后淋巴結(jié)的體積和重量均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2. CK免疫組化染色結(jié)果顯示磁性聚丙烯酸改性碳納米管作為化療藥物載體后，抗轉(zhuǎn)移 淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞的效果明顯，見圖9。
3. TUNEL法檢測淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示磁性聚丙烯酸改性碳納米管作為化療 藥物載體后，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加，外磁場作用后，效果更加顯 著，見圖IO。
表2是各組裸鼠胭窩淋巴結(jié)體積和重量比較，其中，A組生理鹽水(NS)組(對照 組)；B組mMWNT組；C組GEM單藥組；D組低濃度mMWNT-GEM不加磁場組；E組低 濃度mMWNT-GEM加磁場組；F組高濃度mMWNT-GEM加磁場組。
表2
組別體積(mm3)重量(g)
A組22. 63±10. 200.0172±0. 0088
B組25.62±17. 520.0207±0.0147
c組28. 40 ±10. 660. 0234±0.0120
D組11. 17±4. 440. 0097 ±0. 0043
E組15. 67±4. 470. 0155±0. 0067
F組9. 53 ±4. 460. 0108±0. 0058
權(quán)利要求
1、一種磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體，其特征是采用磁性聚丙烯酸改性碳納米管為載體，該載體吸附化療藥物，制成磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體。
2、 按權(quán)利要求1所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體，其特征是所 述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管的直徑為10-S0nm。
3、 權(quán)利要求1所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法，其 特征在于通過下述步驟，本發(fā)明包括下述步驟1) 采用氣相共沉積法制備多壁碳納米管，通過丙烯腈乳液聚合，在酸性條件 下水解得聚丙烯酸改性的水溶性碳納米管；2) 采用水相化學(xué)共沉淀方法制成磁性四氧化三鐵-聚丙烯酸改性多壁碳納米 管復(fù)合體；3) 采用體內(nèi)連續(xù)篩選接種法制備人惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的裸鼠模型，通過 SD大鼠和人惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移裸鼠模型檢驗磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物 載體的淋巴趨向性；4) 通過超聲水浴將磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體與化療藥物混合進(jìn) 行物理吸附，制成具特定粒徑的攜載有化療藥物的磁性納米復(fù)合體，5) 檢驗動物體內(nèi)磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體攜載化療藥物磁靶向 至靶淋巴結(jié)的藥代動力學(xué)；6) 通過體內(nèi)、外實驗，檢驗磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體吸附化療 藥物后抗惡性腫瘤細(xì)胞增殖和抗惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的效果。
4、 按權(quán)利要求3所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法， 其特征在于所述的納米管藥物載體為直徑10-80nm。
5、 按權(quán)利要求3所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法， 其特征在于所述的納米管藥物載體直徑為40nm。
6、 按權(quán)利要求3所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法，其特征在于所述的超聲水浴的條件為40kHz， 30分鐘。
7、 按權(quán)利要求3所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體的制備方法， 其特征在于所述的化療藥物是吉西他濱。
8、 權(quán)利要求1所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體在制備抗惡性腫 瘤細(xì)胞增殖藥物中的用途。
9、 權(quán)利要求1所述的磁性聚丙烯酸改性碳納米管藥物載體在制備抗惡性腫 瘤淋巴轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬分子生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種磁性聚丙烯酸改性碳納米管及其制備方法。本發(fā)明將多壁碳納米管經(jīng)聚丙烯腈改性后，在酸性條件下水解得含有大量羧基的聚丙烯酸改性的水溶性碳納米管，通過水相化學(xué)共沉淀法制成磁性四氧化三鐵-聚丙烯酸改性多壁碳納米管復(fù)合體，直徑10-80nm，具有良好的淋巴趨向性能和強磁響應(yīng)性，經(jīng)實驗證實，所述的藥物載體能有效吸附化療藥物至淋巴系統(tǒng)內(nèi)，能夠在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)緩慢釋放化療藥物，且具有良好的磁場定位效應(yīng)，能明顯抑制淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。為惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供一種新的干預(yù)手段，
文檔編號A61K47/34GK101461944SQ200910045160
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者倪泉興, 傅德良, 近 徐, 東 楊, 峰 楊, 汪長春, 胡建華, 虞先浚, 忱 金, 江 龍 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院