一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白膜，尤其涉及一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜。
【背景技術(shù)】
[0002]難治性視網(wǎng)膜病變是一類視網(wǎng)膜組織損傷或退行性疾病，包括老年黃斑變性、Stargardt病和視網(wǎng)膜色素變性等，在我國50歲以上人群中患病率達(dá)20%以上，已經(jīng)成為我國日益突出的主要致盲眼病，其共同病理特征為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE細(xì)胞)變性和死亡，導(dǎo)致失明。干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展使新的RPE細(xì)胞替代缺失或變性RPE細(xì)胞成為可能。
[0003]然而細(xì)胞移植后，即使應(yīng)用了免疫抑制劑，移植細(xì)胞也無法長期存活，臨床療效不顯著，現(xiàn)在仍無法廣泛推廣應(yīng)用。動物模型發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜下腔移植7天后存活率僅有約
0.01% (20萬個ES細(xì)胞來源的細(xì)胞移植后發(fā)現(xiàn)僅有數(shù)百個細(xì)胞存活)。
[0004]移植細(xì)胞難以存活的重要原因之一是:干細(xì)胞是在實驗室培養(yǎng)皿擴增的，一旦移植到體內(nèi)特定位點就有增殖困難。這是因為新環(huán)境充滿復(fù)雜的未知因素，移植的干細(xì)胞通常會死亡，或不能正確整合到周邊組織中。近期研究表明，水凝膠可促進(jìn)干細(xì)胞治療效果，但其主要成份是透明質(zhì)酸和甲基纖維素，仍存在異源性及降解的問題。因此開發(fā)新生物材料技術(shù)，成為提高干細(xì)胞治療效力的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，作為iPS-RPE的移植載體，以期促進(jìn)移植后細(xì)胞的貼附和存活，提高干細(xì)胞治療致盲性眼病的成功率。本發(fā)明還提供了由該層粘連蛋白膜制得的iPS-RPE細(xì)胞膜片，本發(fā)明還提供了所述層粘連蛋白膜在制備細(xì)胞載體中的用途。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，所述層粘連蛋白膜是通過交聯(lián)劑將層粘連蛋白在溶液中交聯(lián)后干燥而得的。
[0007]優(yōu)選地，所用的交聯(lián)劑為戊二醛。海綿狀膠原生物膜片的內(nèi)孔隙形成原理為其均質(zhì)漿液中的液體在冷凍交聯(lián)過程中形成的冰晶所決定，因為血清蛋白分子具有很強的粘稠性，高密度、高質(zhì)量膠原生物膜的化學(xué)制作思路以及操作困難之處在于如何將粘稠的物質(zhì)形成可流動性的均質(zhì)漿液，為此如何能將長膠原纖維從均質(zhì)漿液中析出形成高濃度的纖維本體是本發(fā)明的關(guān)鍵，添加戊二醛是本發(fā)明獨特的技術(shù)。
[0008]優(yōu)選地，所述戊二醛在所述溶液中的濃度為5mg/mL。
[0009]優(yōu)選地，所述交聯(lián)溫度為4°C，所述交聯(lián)時間為24小時。
[0010]優(yōu)選地，所述干燥溫度為50 0C，干燥時間為48小時。
[0011]優(yōu)選地，所述層粘連蛋白膜的孔隙大小為20?80微米。更優(yōu)選為20-60微米，最佳值為25微米。
[0012]本發(fā)明還提供了一種iPS-RPE細(xì)胞膜片，所述iPS-RPE細(xì)胞膜片是通過將iPS-RPE細(xì)胞接種于上述所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜層粘連蛋白膜上后培養(yǎng)而得的。
[0013]優(yōu)選地，在所述接種前，將所述層粘連蛋白膜先在濃度為70%?75%的乙醇溶液中浸泡，然后在DMEM中浸泡。在冷凍干燥程序中，膜片的滅菌消毒，以盡可能避免種植細(xì)胞后的由于膜片消毒不完全造成的污染問題。但膜片為自體血清來源的材料，高溫高壓及常規(guī)化學(xué)消毒方法易造成其降解。因此，本發(fā)明采用的措施為:將血清層粘蛋白膜先泡入乙醇溶液中24hr，再泡入DMEM中24hr后用于細(xì)胞的接種。酒精分子具有很強的滲透力，能穿過細(xì)菌表面的膜，進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，使構(gòu)成細(xì)菌生命基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)凝固，將細(xì)菌殺死。酒精的濃度不同，用途也會有所區(qū)別。本發(fā)明采用70%-75%的酒精用于消毒，這是因為過高濃度的酒精會在細(xì)菌表面形成一層保護膜，阻止其進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，難以將細(xì)菌徹底殺死；若酒精濃度過低，則雖可進(jìn)入細(xì)菌，但不能將其體內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，同樣也不能將細(xì)菌徹底殺死。這里乙醇溶液的濃度為體積濃度。
[0014]本發(fā)明還提供了所述層粘連蛋白膜在制備細(xì)胞載體中的用途。本發(fā)明所述層粘連蛋白膜可以作為干細(xì)胞粘附支撐物，制備iPS-RPE細(xì)胞膜片，將制備的iPS-RPE細(xì)胞膜片用于視網(wǎng)膜下腔移植，用于治療難治性視網(wǎng)膜病變，包括老年黃斑變性、Stargardt病和視網(wǎng)膜色素變性等。
[0015]本發(fā)明所述層粘連蛋白膜片能在3-6個月內(nèi)完全降解吸收。所述iPS-RPE細(xì)胞膜片可應(yīng)用于視網(wǎng)膜下腔注射的任何部位而且可以存活的細(xì)胞量較等量細(xì)胞懸液注射后高50%。所述iPS-RPE細(xì)胞膜片在防止或減少視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的退行性改變中具有一定的用途。所述iPS-RPE細(xì)胞膜片具有防止或減少視網(wǎng)膜膠質(zhì)瘢痕形成的用途。
[0016]本發(fā)明層粘連蛋白膜可以保存于水中，所述層粘連蛋白膜在水中的濃度優(yōu)選為1% -4%,更優(yōu)選為1.5-3%,最佳值為1.75-2%。這里所述百分值單位均為質(zhì)量/體積。
[0017]總之，本發(fā)明提供一種使用自體血清層粘連蛋白為材料制作高濃度、高密度、微/無開放孔隙的可降解的層粘連蛋白膜的制備方法。可用于視網(wǎng)膜下腔移植干細(xì)胞，提供細(xì)胞黏附的著力點，提高細(xì)胞存活率，進(jìn)而治療難治性視網(wǎng)膜病變。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜以及由該膜制得的iPS-RPE細(xì)胞膜片，所述層粘連蛋白膜可以促進(jìn)損傷退變的視網(wǎng)膜細(xì)胞在提供的膠原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的組織，同時干擾非序的成纖維細(xì)胞的增生形成瘢痕。本發(fā)明提高了自體血清層粘連蛋白生物材料的力學(xué)性能，可以在視網(wǎng)膜下腔移植，克服了現(xiàn)有技術(shù)因力學(xué)性能弱，免疫原性高，難以降解而使干細(xì)胞移植后存活率低的缺陷，有效修復(fù)病變的組織，提供新的治療方法和思路，減少病人的痛苦。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明所述iPS-RPE細(xì)胞膜片的制備及使用流程圖。
【具體實施方式】
[0020]為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021]實施例1
[0022]本發(fā)明所述層粘蛋白的制備方法的一種實施例，所述制備方法如下:
[0023]同基因大鼠心臟取血，放置lOmin，100rpm離心20min，棄沉淀，留上層血清，去除乳糜粒，分離出血清層粘蛋白；凝膠層析提純血清層粘蛋白，DEAE纖維素陰離子交換層析純化血清層粘蛋白并濃縮，得到所述層粘蛋白。將濃縮后的血清層粘蛋白移入培養(yǎng)皿中靜置于4攝氏度冰箱中至脫除氣泡為止。
[0024]本發(fā)明所述輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜的制備方法的一種實施例，所述制備方法如下:
[0025]向上述制備的層粘蛋白溶液中加入戊二醛，所述戊二醛在所述溶液中的濃度為5mg/mL，再置入4攝氏度冰箱中交聯(lián)24hr ;然后放入50攝氏度烘干箱中烘干48hr后取出，得到所述層粘蛋白膜。將所述層粘蛋白膜用蒸餾水沖洗干凈密封于冰箱中備用。
[0026]本發(fā)明所述iPS-RPE細(xì)胞膜片的制備方法的一種實施例，所述制備方法如下:
[0027]將上述制備的層粘蛋白膜先泡入體積濃度為70%的乙醇溶液中24hr，再泡入DMEM中24hr后用于iPS-RPE細(xì)胞的接種；在經(jīng)過上述處理后的層粘蛋白膜上種植iPS-RPE細(xì)胞，每2-3天更換培養(yǎng)液。2周后細(xì)胞開始黏附層粘連蛋白膜，形成典型的鵝卵石樣單層色素上皮膜，此時更換無血清培養(yǎng)液，4周后細(xì)胞完全黏附于層粘連蛋白膜，得到所述iPS-RPE細(xì)胞膜片。
[0028]使用激光顯微切割系統(tǒng)將iPS-RPE細(xì)胞膜片切成移植所需大小和形狀，在視網(wǎng)膜下腔移植，如圖1所示。
[0029]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項】
1.一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述層粘連蛋白膜是通過交聯(lián)劑將層粘連蛋白在溶液中交聯(lián)后干燥而得的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所用的交聯(lián)劑為戊二醛。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述戊二醛在所述溶液中的濃度為5mg/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述溶液是水。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述交聯(lián)溫度為4°C，所述交聯(lián)時間為24小時。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述干燥溫度為50°C，干燥時間為48小時。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜，其特征在于，所述層粘連蛋白膜的孔隙大小為20?80微米。8.一種iPS-RPE細(xì)胞膜片，其特征在于，所述iPS-RPE細(xì)胞膜片是通過將iPS-RPE細(xì)胞接種于如權(quán)利要求1-6任一所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜上后培養(yǎng)而得的。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的iPS-RPE細(xì)胞膜片，其特征在于，在所述接種前，將所述層粘連蛋白膜先在濃度為70%?75%的乙醇溶液中浸泡，然后在DMEM中浸泡。10.權(quán)利要求1-7任一所述的輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜在制備細(xì)胞載體中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種輔助iPS-RPE移植的層粘連蛋白膜以及由該膜制得的iPS-RPE細(xì)胞膜片，所述層粘連蛋白膜可以促進(jìn)損傷退變的視網(wǎng)膜細(xì)胞在提供的膠原支架上移行、分化、再生,形成自身相同的組織，同時干擾非序的成纖維細(xì)胞的增生形成瘢痕。本發(fā)明提高了自體血清層粘連蛋白生物材料的力學(xué)性能,可以在視網(wǎng)膜下腔移植，克服了現(xiàn)有技術(shù)因力學(xué)性能弱，免疫原性高，難以降解而使干細(xì)胞移植后存活率低的缺陷，有效修復(fù)病變的組織，提供新的治療方法和思路，減少病人的痛苦。
【IPC分類】A61L27/50, A61L27/22
【公開號】CN105013010
【申請?zhí)枴緾N201510398770
【發(fā)明人】劉奕志, 鄭穎豐
【申請人】中山大學(xué)中山眼科中心
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月7日