本發(fā)明屬于食品化學和食品加工領(lǐng)域，具體涉及一種半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法及其產(chǎn)品和應用。

背景技術(shù)：

美拉德反應(Maillard Reaction)，又稱非酶褐變或羰氨反應，是還原糖(碳水化合物)與氨基酸/蛋白質(zhì)在常溫或加熱時發(fā)生的一系列復雜的反應，最終生成棕色甚至黑色的高分子類黑精(或稱擬黑素)。美拉德反應過程一般可歸納為初始階段、中間階段和高級階段3個階段。在初始階段，酮糖可與氨基化合物生成酮糖基胺，而酮糖基胺可以經(jīng)過海恩氏(Heyns)分子重排異構(gòu)成2-氨基-2-脫氧葡萄糖，也被稱作Heyns重排產(chǎn)物(HRP)。

在醇化后的煙草中已發(fā)現(xiàn)多種HRP，其總含量占烤煙干重的2％左右，并且被證實為煙草香氣重要的貢獻者。煙葉在自然醇化過程中，氨基糖類先增加，約2年時間達到最高，然后開始下降，氨基糖類的變化趨勢與烤煙感官品質(zhì)變化趨勢比較吻合，積累水平達到最高時，煙葉品質(zhì)最好，因而是煙葉自然醇化進程的一個重要指標。大量研究證明HRP是重要的香味中間體，可改善吸味，圓和煙氣，增加甜香和烘烤香，極具在卷煙加香中的應用潛能。

HRP不僅具有完全美拉德反應產(chǎn)物(MRPs)在卷煙中的加香效果，而且穩(wěn)定性較強，使其有望以獨特的優(yōu)勢代替部分MRPs添加至卷煙產(chǎn)品中。據(jù)現(xiàn)有的報道，由于美拉德反應十分復雜，產(chǎn)物繁多，反應過程不好控制，造成部分產(chǎn)品加香效果不理想。影響美拉德反應的因素有溫度、時間、溶劑、pH值、濕度等，也和參與反應的糖和氨基酸等有很大關(guān)系。由于煙草加香所用香料正常使用的溫度較高，所需香氣并非是常溫時具有的香氣。在卷煙的燃吸過程中煙頭最高溫度可達700～800℃，在這樣的高溫下，完全美拉德反應產(chǎn)物MRPs將分解，自身香氣已不易被聞到。因此，加香的作用是使其裂解的產(chǎn)物能起到消除煙雜氣，增加香煙吸味，從而達到提高煙葉質(zhì)量的目的。完全美拉德反應產(chǎn)物在卷煙生產(chǎn)和儲存過程中極易發(fā)生揮發(fā)性香氣物質(zhì)的損失，導致加香作用不能達到預期目標。針對性地制備某些HRP中間體，作為外源香味前體補充添加到煙絲中，能夠提高煙葉可用性、方便葉組配方、改善卷煙評吸品質(zhì)。

國內(nèi)外許多煙草企業(yè)和科研機構(gòu)都積極開展了HRP的合成研究以及在卷煙加香方面的應用研究。在目前已有技術(shù)中，HRP主要在有機溶劑中加熱回流制備，通常選擇甲醇作為有效的反應溶劑。甲醇作為反應溶劑應用于工業(yè)化生產(chǎn)具有較高的生產(chǎn)成本且不安全。甲醇易燃易爆且具有較強的毒性，完全不適用于HRP的工業(yè)化生產(chǎn)。工業(yè)化的美拉德反應過程一般在高溫水相體系下進行，該條件下HRP一旦形成迅速發(fā)生脫水、降解等重重疊疊的次級反應，根本不可能穩(wěn)定制備到目標HRP，即使是實驗室水平的微量分析都很難捕獲到這些反應中間體。因此有待出現(xiàn)一種水相合成HRP的工藝，實現(xiàn)其安全制備。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明提供了半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

半胱氨酸示蹤法水相制備煙用香料前體的方法，將1～10重量份的氨基酸和10重量份的酮糖溶解于100～500重量份的水中，調(diào)整該混合溶液的pH至6.5～8.5，在70～140℃下進行低溫美拉德反應，采用冰浴冷卻終止反應，經(jīng)低溫濃縮得到所述煙用香料前體；其中，選定條件下最適反應時間的確定采用半胱氨酸示蹤法，具體步驟如下：

(1)按選定比例將氨基酸和酮糖溶解于水中，調(diào)整該混合溶液的pH，將所得溶液平均分為5～10份，分別倒入美拉德反應瓶中，在相同的選定溫度下進行第一階段低溫美拉德反應，在15～130min內(nèi)反應不同時間后采用冰浴冷卻終止反應；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應液中加入等量的示蹤劑半胱氨酸，各份反應液在相同條件下進行第二階段高溫美拉德反應，采用冰浴冷卻終止反應，得到變溫美拉德反應液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應反應時間的關(guān)系曲線，根據(jù)吸光度值最低點對應的反應時間，確定相應條件下的最適反應時間。

本方法基于半胱氨酸作用于Heyns重排產(chǎn)物可以有效阻止其進一步反應形成呈色物質(zhì)的機理，在低溫美拉德反應過程中的不同反應時間添加半胱氨酸示蹤劑，接著發(fā)生高溫美拉德反應，比較其在高溫美拉德反應中的色澤抑制效果，從而確定Heyns重排產(chǎn)物形成的臨界反應時間，在該臨界條件下低溫水相制備中間體，所得中間體即為所述煙用香料前體。

所述氨基酸為丙氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸及其鹽中的至少一種；所述酮糖為赤蘚酮糖、木酮糖、果糖中的至少一種。

步驟(2)中，示蹤劑半胱氨酸的投加量為步驟(1)中氨基酸投加量的0.5～10％。投加量過小會導致美拉德反應體系色澤抑制效果不明顯，投加量過多會導致剩余半胱氨酸與還原糖反應，降低半胱氨酸的利用率，影響對變溫美拉德反應色澤的判斷，同時成本上升。

所述第二階段高溫美拉德反應中，各份反應液的pH調(diào)節(jié)至6.5～8.5；反應的溫度為120～160℃，反應時間為60～200min。

本發(fā)明還提供了一種由上述方法制備得到的產(chǎn)品，該產(chǎn)品不僅具有完全美拉德反應產(chǎn)物在卷煙中的加香效果，而且穩(wěn)定性較強。

本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述方法制備得到的產(chǎn)品在卷煙中的應用。該產(chǎn)品作為外源香味前體補充添加到煙絲中，能夠提高煙葉可用性、方便設(shè)計葉組配方、改善吸味，圓和煙氣，增加甜香和烘烤香，顯著改善卷煙的評吸品質(zhì)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)現(xiàn)有公開的技術(shù)中，HRP主要在無水甲醇中長時間加熱合成，這種方法污染嚴重、毒性較大、而且成本較高，無法滿足現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的需要。而本發(fā)明所述HRP的制備技術(shù)是以水作為溶劑、半胱氨酸作為示蹤劑，通過低溫美拉德反應水相制備HRP，大大降低了生產(chǎn)成本，滿足現(xiàn)代工業(yè)所提出的綠色發(fā)展的設(shè)計要求，完全可以應用于卷煙產(chǎn)品或者食品中。

(2)以半胱氨酸為示蹤劑、通過測定變溫美拉德反應產(chǎn)物的色澤來判斷HRP在水溶液中形成的臨界條件，是重要的理論創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新，并且僅采用分光光度計即可完成整個測定工作，無需標準品及其他試劑或設(shè)備，操作簡單、成本低廉，具有較強的應用價值。

(3)水相低溫制備美拉德反應中間體的方法是以現(xiàn)有美拉德反應香精的加工工藝為基礎(chǔ)的技術(shù)創(chuàng)新，本發(fā)明水相低溫制備HRP的技術(shù)可在低成本條件下直接應用于實際生產(chǎn)，具有較強的實際應用價值。

附圖說明

圖1為實施例1中變溫美拉德反應溶液吸光度值與第一階段低溫美拉德反應時間的關(guān)系曲線圖；

圖2為實施例1制備的煙用香料前體的表征結(jié)果圖，其中，(a)為總離子流色譜圖，(b)為質(zhì)譜圖；

圖3為實施例1中變溫美拉德反應溶液吸光度值與第一階段低溫美拉德反應時間的關(guān)系曲線圖；

圖4為實施例1制備的煙用香料前體的表征結(jié)果圖，其中，(a)為總離子流色譜圖，(b)為質(zhì)譜圖。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，結(jié)合實施例進一步闡明發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實施例。

實施例1

將5kg丙氨酸和10kg木酮糖溶解于500kg水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.5，在70℃下進行低溫美拉德反應，采用以下步驟確定上述條件下的最適反應時間：

(1)按上述比例將丙氨酸和木酮糖溶解于水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.5，將溶液平均分為9份，分別倒入美拉德反應瓶中，在70℃下加熱進行第一階段低溫美拉德反應，分別在10、15、20、25、30、35、40、45和50min后采用冰浴冷卻終止反應；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應液中加入0.6kg半胱氨酸，并調(diào)節(jié)反應液pH至7.5，然后升溫至120℃進行第二階段高溫美拉德反應120min，采用冰浴冷卻終止反應，得到變溫美拉德反應液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應反應時間的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，變溫美拉德反應液吸光度最低點對應的反應時間為35min，即木酮糖-丙氨酸體系的HRP在水相中形成的臨界時間35min，即可確定相應條件下制備煙用香料前體的最適時間為35min。

在所選條件及最適時間下制備Heyns重排產(chǎn)物反應液，進一步經(jīng)低溫濃縮即可得到固體煙用香料前體。

將所得固體煙用香料前體溶于水后通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)對其進行分析，得到總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖如圖2所示，其中，圖2(a)為得到的總離子流色譜圖，圖2(b)為得到的質(zhì)譜圖。根據(jù)圖2(b)質(zhì)譜圖的離子碎片信息可知，離子碎片為分子離子脫水或脫羧基形成，推斷其分子離子峰MH⁺為222，該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為221，分子式為C₈H₁₅O₆N，確定該物質(zhì)為木酮糖-丙氨酸體系的中間體HRP。

實施例2

將20kg天冬氨酸和60kg木酮糖溶解于800kg水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至8.0后，在120℃下加熱發(fā)生美拉德反應，采用以下步驟確定上述條件下的最適反應時間：

(1)按上述比例將丙氨酸和木酮糖溶解于水中，調(diào)節(jié)混合溶液pH至8.0，將溶液平均分為5份，分別倒入美拉德反應瓶中，在120℃下加熱進行第一階段低溫美拉德反應，分別在20、25、30、35和40min后采用冰浴冷卻終止反應；

(2)分別在步驟(1)所得到的各份反應液中加入2.0kg半胱氨酸，并調(diào)節(jié)反應液pH至8.0，然后升溫至150℃進行第二階段高溫美拉德反應200min，采用冰浴冷卻終止反應，得到變溫美拉德反應液；

(3)分別測定步驟(2)所得到的各份變溫美拉德反應溶液在波長420nm下的吸光度值，描繪所得吸光度值與步驟(1)中相應反應時間的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，變溫美拉德反應液吸光度最低點對應的反應時間為30min，即木酮糖-天冬氨酸體系的HRP在水相中形成的臨界時間30min，即可確定相應條件下制備煙用香料前體的最適時間為30min。

在所選條件及最適時間下制備Heyns重排產(chǎn)物反應液，進一步經(jīng)低溫濃縮即可得到固體煙用香料前體。

將所得固體煙用香料前體溶于水后通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)對其進行分析，得到總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖如圖4所示，其中，圖4(a)為得到的總離子流色譜圖，圖4(b)為得到的質(zhì)譜圖。根據(jù)圖4(b)質(zhì)譜圖的離子碎片信息可知，離子碎片為分子離子脫水或脫羧基形成，推斷其分子離子峰MH⁺為266，該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為265，分子式為C₉H₁₅O₈N，確定該物質(zhì)為木酮糖-天冬氨酸體系的中間體HRP。

實施例中使用的水為蒸餾水，氨基酸和酮糖使用食品級，其余化學試劑均為分析純，高效液相色譜-質(zhì)譜分析實驗所用化學試劑均為色譜純。高效液相色譜-質(zhì)譜檢測條件為：用于分析的分離柱是C18反向高效液相色譜柱，使用的流動相是超純水與乙腈，進樣后用流動相進行梯度洗脫，流速為0.3mL/min，柱溫是45℃。質(zhì)譜分析選擇的離子方式為ESI+，毛細管電壓為3.5kV，錐孔電壓為20V，離子源溫度為100℃，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為700L/h，錐孔氣流流速為50L/h，碰撞能量是6V，檢測器電壓是1800V。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。