一種高純度大米谷蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大米谷蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大米蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四種蛋白組成。其中的谷蛋白主要存在于二型蛋白體(PB-1I )，谷蛋白分子基本上由22KDa、37?39KDa、57KDa三個(gè)亞基組成。
[0003]研究表明，富含谷蛋白的大米蛋白具有降低膽固醇的良好功效，因此，大米谷蛋白的有效提取，將為我國(guó)大力開發(fā)功能性大米蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)，具有廣泛、深遠(yuǎn)的應(yīng)用意義。
[0004]傳統(tǒng)的方法大多是用稀堿提取谷蛋白，但堿法提取對(duì)氨基酸有破壞作用，同時(shí)存在抽出物中淀粉含量高，抽提液固比大，等電點(diǎn)沉淀要消耗大量酸，脫鹽純化難度大，提取液中的蛋白質(zhì)濃度低等缺點(diǎn)，且提取時(shí)需要消耗大量的堿和水，因而難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。盡管堿法提取蛋白的抽提率可達(dá)到90%以上，但是高堿條件下會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性和水解；美拉德反應(yīng)加劇，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)；提取物中非蛋白物質(zhì)含量增加，分離效果降低等許多不良反應(yīng)。此外，堿法提取還會(huì)引起蛋白一些性質(zhì)變化，破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，降低蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，甚至形成有毒物質(zhì)如Lysinoalnine等，損壞腎臟的功能。
[0005]有學(xué)者研究了小麥谷蛋白亞基的快速分離方法，他們利用70%的乙醇和50%的異丙醇去除了醇溶蛋白，然后在含50%異丙醇的Tris-HCl緩沖液中抽提谷蛋白，最后利用丙酮將谷蛋白沉淀析出。之后進(jìn)行了 SDS-PAGE分析，雖然醇溶蛋白的干擾減少了很多，但是清、球蛋白的雜帶還能顯示出，因此該方法并不是一種有效的提取谷蛋白的方法。由此，研究和改善大米谷蛋白分離提取和純化工藝，對(duì)于開發(fā)利用大米蛋白質(zhì)，促進(jìn)我國(guó)大米深加工，提尚糧食廣品附加值都具有深遠(yuǎn)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有用稀堿提取谷蛋白的方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性和水解，美拉德反應(yīng)加劇，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)的問題，提供一種高純度大米谷蛋白的提取方法。
[0007]本發(fā)明高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0008]一、將大米研磨成米粉；
[0009]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0010]三、將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；
[0011]四、對(duì)步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3?5次；
[0012]五、合并每次浸提收集的上清液，用濃度為8%?12% (w/v)的TCA溶液將上清液進(jìn)行蛋白沉淀；
[0013]六、用PBS緩沖液清洗沉淀3?5次，將清洗后的沉淀真空冷凍干燥，即得到大米谷蛋白。
[0014]步驟二中將米粉用正己烷脫脂3次的具體方法為:
[0015]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫?cái)嚢鑜h，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0016]B、向步驟A得到的沉淀中加入正己烷，混勻，室溫?cái)嚢鐸h，靜置Ih，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；其中步驟B中正己烷的體積與步驟A中正己烷的體積相同；
[0017]C、向步驟B得到的沉淀加入正己烷，混勻，室溫?cái)嚢杵鲾嚢鑜h，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；其中步驟C中正己烷的體積與步驟B中正己烷的體積相同；
[0018]D、將步驟C得到的沉淀于30°C水浴中晾干，得到脫脂米粉。
[0019]步驟四中對(duì)步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3次的具體方法為:
[0020]①向步驟三收集的沉淀中加入濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，沉淀與乳酸的比例關(guān)系是lg: 10?12mL，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0021]向步驟①收集的沉淀中加入與步驟①中相同體積的濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0022]向步驟②收集的沉淀中加入與步驟①中相同體積的濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩4h，離心后收集沉淀和上清；其中所述離心的條件均為:1 ?6°C，10000g，20min。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024]本發(fā)明是利用了谷蛋白的溶解特性而建立的方法。谷蛋白除了可以溶解于稀堿溶液，還可以溶解于稀酸溶液中。因此，本發(fā)明主要采用乳酸能打破谷蛋白內(nèi)的強(qiáng)鍵，不破壞氨基酸，同時(shí)還起到溶解谷蛋白的作用，并且采用TCA將乳酸溶解蛋白沉淀。這種方法可以有效避免美拉德反應(yīng)，減少損失，同時(shí)還省去了傳統(tǒng)稀堿提取時(shí)需要調(diào)PH的步驟。提取出的谷蛋白通過SDS-PAGE分析，無醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白的干擾，沒有蛋白雜帶，是一種簡(jiǎn)單、精確、經(jīng)濟(jì)、快速、高純、高效的大米谷蛋白提取方法，本發(fā)明方法所提取的谷蛋白純度可高達(dá)93.67%?96.16%，能夠充分得到高純度大米谷蛋白。可廣泛應(yīng)用于工業(yè)化大批量提取大米谷蛋白。
【附圖說明】
[0025]圖1為實(shí)施例1中3次提取的谷蛋白電泳圖；圖2為實(shí)施例1經(jīng)三步提取大米谷蛋白的提取率；圖3為堿法提取的谷蛋白電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0027]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0028]一、將大米研磨成米粉；
[0029]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0030]三、將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；
[0031]四、對(duì)步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白3?5次；
[0032]五、合并每次浸提收集的上清液，用濃度為8%?12% (w/v)的TCA溶液將上清液進(jìn)行蛋白沉淀；
[0033]六、用PBS緩沖液清洗沉淀3?5次，將清洗后的沉淀真空冷凍干燥，即得到大米谷蛋白。
[0034]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中將大米研磨成米粉的具體方法為:用粉碎機(jī)粉碎新鮮大米，每次15-20S，總共30-40次。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0035]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟二中將米粉用正己烷脫脂的具體方法為:
[0036]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫?cái)嚢鑜h，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0037]B、重復(fù)步驟A2?4次，將收集的沉淀于30°C水浴中晾干，得到脫脂米粉。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0038]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟三中將脫脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的具體方法為:
[0039]A、將脫脂米粉與去離子水按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀；
[0040]B、將步驟A的沉淀加入與步驟A中相同體積的去離子水，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀；
[0041]C、將步驟B的沉淀加入與步驟A中相同體積的去離子水，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩4h，離心后收集沉淀，即為去除了清蛋白的沉淀；
[0042]D、然后將去離子水換為濃度為5% (w/v)的NaCl溶液，每次加的5% (w/v)NaCl溶液體積與步驟A中去離子水體積相同，重復(fù)進(jìn)行步驟A?C，收集沉淀，即為去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；
[0043]E、然后將去離子水換為58% (v/v)的正丙醇溶液，每次加的58%的正丙醇溶液體積與步驟A中去離子水體積相同，重復(fù)進(jìn)行步驟A?C，收集沉淀，即為去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述離心的條件均為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0044]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟四中對(duì)步驟三得到的沉淀用濃度為0.8%?1.2% (w/v)的乳酸浸提谷蛋白的具體方法為:
[0045]①向步驟三收集的沉淀中加入質(zhì)量濃度為I %的乳酸溶液，沉淀與乳酸的比例關(guān)系是lg: 10?12mL，混勻，25°C 130rpm水浴振蕩8h，離心后收集沉淀和上清；
[0046]重復(fù)步驟①2?4次，每次離心后均收集沉淀和上清，其中所述離心的條件均為:I?6°C，10000g，20min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0047]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟五中用TCA溶液將浸提得到的上清液進(jìn)行蛋白沉淀的具體方法為:
[0048]將步驟四中收集得到的上清液加入濃度為8%?12 % (w/v)的TCA溶液，上清液與TCA溶液的體積比為1:3?5，避光條件下于O?4°C冰浴15?20min ;然后離心棄掉上清液，取沉淀，其中所述離心的條件為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0049]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟六中用PBS緩沖液清洗沉淀的具體方法為:
[0050]將步驟五中每次收集的沉淀與PBS緩沖液混合，于25°C 130rpm振蕩0.5h，離心后收集沉淀，所述PBS緩沖液為0.05M且pH6.5的磷酸鹽緩沖液，每次使用的量與每次使用I %乳酸的量相等，其中所述離心的條件為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0051]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟六中真空冷凍凍干的條件為:真空度< 15Pa，冷阱溫度為50°C?60°C，樣品溫度為_30°C?-20°C，凍干時(shí)間為20h?24h。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0052]為驗(yàn)證本發(fā)明的效果，進(jìn)行以下試驗(yàn):
[0053]實(shí)施例1:
[0054]本實(shí)施例高純度大米谷蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0055]—、將大米研磨成米粉:用粉碎機(jī)粉碎新鮮大米，每次20s，總共30次；
[0056]二、將米粉用正己烷脫脂3次，得到脫脂米粉，具體方法為:
[0057]A、將米粉與正己燒按照lg: