專利名稱：肺炎鏈球菌的核酸和蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子，該核酸和/或蛋白質(zhì)作為抗原/免疫原的用途和在檢測(cè)/診斷中的用途，以及篩選作為潛在抗-微生物靶的蛋白質(zhì)/核酸序列的方法。
肺炎鏈球菌常被稱為肺炎球菌，它是一種重要的致病微生物。在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家，肺炎鏈球菌感染在人類疾病中始終占有重要地位，有關(guān)專家已對(duì)此進(jìn)行過評(píng)述(Fiber,G.R.，科學(xué)，265:1385-1387(1994))。據(jù)信在世界范圍內(nèi)，該微生物是急性呼吸道感染最常見的致病菌，估計(jì)每年可導(dǎo)致1百萬名兒童死亡，其中的大多數(shù)為發(fā)展中國家的兒童(Stansfield,S.K.，兒科傳染病，6:622(1987))。在美國，有人提出(Breiman等，Arch.Intern.Med.,150:1401(1990))肺炎球菌仍是細(xì)菌性肺炎最常見的致病菌，在兒童，老年人和患有易感染疾病，如無脾癥，心臟病，肺病和腎病，糖尿病，酒精中毒的患者，或患有免疫抑制疾病(如AIDS)的患者中，細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率特別高。這些人群患肺炎球菌敗血癥和(因此患)腦膜炎的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此死于肺炎球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)較大。肺炎球菌也是中耳炎和鼻竇炎的致病菌，在發(fā)達(dá)國家的兒童中這兩種病一直是流行感染，并且?guī)砗艽蟮幕ㄙM(fèi)。
最近，青霉素-抗性肺炎球菌的出現(xiàn)使得對(duì)有效預(yù)防肺炎球菌感染之策略的需要日趨迫切。據(jù)報(bào)道，在美國12個(gè)州的13家醫(yī)院中，6.6％的肺炎球菌分離株對(duì)青霉素具有抗性，一些分離株也對(duì)其它抗生素，包括第三代環(huán)孢菌素具有抗性(Schappert,S.M.，國家疾病防治中心/健康狀況統(tǒng)計(jì)中心的人口和健康狀況統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，214:1(1992))。在某些醫(yī)院，青霉素抗性的比例更高(達(dá)20％)(Breiman等，美國醫(yī)學(xué)會(huì)志，271:1831(1994))。由于肺炎球菌的青霉素抗性是在青霉素保持較好療效幾十年之后的近期突然出現(xiàn)的，因此這些發(fā)現(xiàn)令人恐慌。
鑒于上述理由，必須致力于改良預(yù)防，控制，診斷或治療肺炎球菌疾病的方法。
已采用多種方法提供預(yù)防肺炎球菌感染所用的疫苗。根據(jù)微生物周圍的多糖莢膜結(jié)構(gòu)可將其分為不同的血清型(至少90種)，由此產(chǎn)生多個(gè)難題。針對(duì)單個(gè)血清型的疫苗對(duì)其它血清型無效，這意味著疫苗必須包括所有血清型的多糖抗原才能在大多數(shù)情況下有效。有人發(fā)現(xiàn)當(dāng)莢膜多糖(各自決定著血清型，并且是主要的保護(hù)性抗原)被純化并用作疫苗時(shí)，不能在兩歲以下的兒童體內(nèi)可靠地誘導(dǎo)保護(hù)性抗體應(yīng)答，而該年齡組恰恰是侵害性肺炎球菌感染和腦膜炎的發(fā)病率最高的人群。
使用莢膜抗原方法的改良依靠多糖與蛋白質(zhì)的綴合，從而特別地通過賦予應(yīng)答依賴于T-細(xì)胞的特征而獲得增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。該方法已被用于開發(fā)例如抗流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的疫苗。然而，有關(guān)多重多糖疫苗和基于綴合物的疫苗的花費(fèi)仍是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。
第三種方法是尋找其它具有成為候選疫苗之潛力的抗原組分，這構(gòu)成了本發(fā)明的基礎(chǔ)。使用特別開發(fā)的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，我們已經(jīng)能鑒定出一組肺炎球菌蛋白質(zhì)抗原，所述抗原與細(xì)菌外膜相結(jié)合或者能被分泌。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了肺炎鏈球菌的蛋白質(zhì)或多肽，其具有選自表1所示的序列。
第二方面，本發(fā)明提供了肺炎鏈球菌的蛋白質(zhì)或多肽，其具有選自表2所示的序列。
所提供的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是基本上純的形式。例如，可以是基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式。
如本文所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可用作抗原物質(zhì)。所述物質(zhì)可以是“抗原性的”和/或“免疫原性的”。通常，“抗原性的”是指蛋白質(zhì)或多肽能被用于產(chǎn)生抗體，或者實(shí)際上能在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)抗體應(yīng)答。“免疫原性的”是指蛋白質(zhì)或多肽能在受試者體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此，在后一種情況下，蛋白質(zhì)或多肽不僅能產(chǎn)生抗體應(yīng)答，還能產(chǎn)生不基于抗體的免疫應(yīng)答。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的同系物或衍生物也可用于本發(fā)明的上下文，即用作抗原性的/免疫原性的物質(zhì)。因此，本發(fā)明還包括例如具有一個(gè)或多個(gè)添加，缺失，取代等的蛋白質(zhì)或多肽。另外，可以用一種氨基酸取代另一種相似“類型”的氨基酸。例如，用一種疏水氨基酸取代另一種疏水氨基酸。
可以使用程序(如CLUSTAL程序)比較氨基酸序列。該程序可比較氨基酸序列，并通過適當(dāng)時(shí)在任一序列中插入間隔找到最佳序列對(duì)比。可以計(jì)算最佳序列對(duì)比的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸類型的保守性)。諸如BLASTx的程序會(huì)對(duì)比最長的一段相似序列并指定符合值。因此，可以得到比較結(jié)果，在其中可以發(fā)現(xiàn)幾個(gè)相似性區(qū)域，它們各自具有不同的評(píng)分值。本發(fā)明希望進(jìn)行這兩種類型的同一性分析。
對(duì)同系物和衍生物而言，與本文所述蛋白質(zhì)或多肽的同一性程度較不重要，重要的是同系物或衍生物應(yīng)該保持原始蛋白質(zhì)或多肽的抗原性或免疫原性。然而，提供與本文所述蛋白質(zhì)或多肽具有至少60％相似性的同系物或衍生物(如上文所討論)較為合適，優(yōu)選提供具有至少70％相似性的同系物或衍生物，更優(yōu)選提供具有至少80％相似性的同系物或衍生物，最優(yōu)選提供具有至少90％或甚至95％相似性的同系物或衍生物。
在另一種方法中，同系物或衍生物可以是融合蛋白，其中摻入的組成成分通過例如有效地標(biāo)記所需蛋白質(zhì)或多肽而使純化變得更容易。必需除去“標(biāo)記物”，或者，事實(shí)上融合蛋白自身應(yīng)該保留足夠的抗原性以使其有用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽，或其同系物或衍生物的抗原性/免疫原性片段。
就本文所述蛋白質(zhì)或多肽，或其同系物或衍生物的片段而言，情況略有不同。眾所周知，可以篩選抗原蛋白質(zhì)或多肽以鑒定表位區(qū)域，即負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)或多肽的抗原性或免疫原性的區(qū)域。進(jìn)行這種篩選的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，因此，本發(fā)明的片段應(yīng)該包括一個(gè)或多個(gè)所述表位區(qū)域，或者與所述區(qū)域足夠相似以保留其抗原性/免疫原性。因此，對(duì)于本發(fā)明的片段而言，同一性程度可能是不相關(guān)的，因?yàn)樗鼈兛梢耘c本文所述的蛋白質(zhì)或多肽，同系物或衍生物的特定部分100％相同。同樣，主要的問題是片段必須保留抗原性/免疫原性。
因此，對(duì)于由蛋白質(zhì)或多肽衍生得到的同系物，衍生物和片段而言，重要的是它們應(yīng)具有其所衍生自的所述蛋白質(zhì)或多肽的至少部分抗原性/免疫原性。
可使用基因克隆技術(shù)提供基本上純的本發(fā)明蛋白質(zhì)。所述技術(shù)公開于例如Sambrook等，分子克隆，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)。
因此，第三方面，本發(fā)明提供了核酸分子，其含有下列序列或由下列序列組成(ⅰ)表1所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ⅱ)與(ⅰ)中的任一序列互補(bǔ)的序列；(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)中的序列編碼相同蛋白質(zhì)或多肽的序列；(ⅳ)與(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列；(ⅴ)編碼表1所限定蛋白質(zhì)的同系物，衍生物或片段的序列。
第四方面，本發(fā)明提供了核酸分子，其含有下列序列或由下列序列組成(ⅰ)表2所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ⅱ)與(ⅰ)中的任一序列互補(bǔ)的序列；(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)中的序列編碼相同蛋白質(zhì)或多肽的序列；(ⅳ)與(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列；(ⅴ)編碼表2所限定蛋白質(zhì)的同系物，衍生物或片段的序列。
本發(fā)明的核酸分子包括多個(gè)這種序列和/或片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得本發(fā)明包括本文所例舉的新的特定核酸分子的新變體。本發(fā)明包括這種變體。所述變體可以是天然變體，例如由于菌株變異而產(chǎn)生的變體。例如，包括添加，取代和/或缺失。另外，特別是當(dāng)使用微生物表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，人們希望通過利用表達(dá)所用特定生物體中已知的偏好使用的密碼子來改造核酸序列。因此，本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括合成的或非-天然的變體。
上文所用術(shù)語“RNA等同物”表示給定的RNA分子具有的序列與給定DNA分子的序列互補(bǔ)(允許在RNA遺傳密碼中用“U”替代“T”)。
當(dāng)比較核酸序列以測(cè)定同源性或同一性程度時(shí)，可以使用例如BESTFIT和GAP(皆得自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)軟件包)BESTFIT程序比較兩個(gè)序列，產(chǎn)生最相似區(qū)段的最佳序列對(duì)比。GAP能使序列沿著其全長進(jìn)行對(duì)比，并通過適當(dāng)時(shí)在任一序列中插入間隔找到最佳序列對(duì)比。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)討論核酸序列的同一性時(shí)，適于通過沿著全長序列進(jìn)行序列對(duì)比來比較序列。
優(yōu)選基本上相同的序列與所述序列具有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選具有至少75％的序列同一性，更優(yōu)選具有至少90％或至少95％的序列同一性。在某些情況下，序列同一性可以是99％或以上。
優(yōu)選地，術(shù)語“基本上相同”表示相對(duì)于所述序列與現(xiàn)有技術(shù)的核酸序列的同一性程度而言，所述序列與本文所述任一序列的同一性程度更高。
然而，應(yīng)該指出當(dāng)本發(fā)明的核酸序列編碼至少部分新基因產(chǎn)物時(shí)，本發(fā)明范圍內(nèi)包括編碼基因產(chǎn)物或其新的部分的所有可能的序列。
核酸分子可以是分離的形式或重組的形式。可以將其摻入載體，載體可被摻入宿主。所述載體和適當(dāng)?shù)乃拗鳂?gòu)成本發(fā)明的另一方面。
因此，例如，通過使用基于本文所提供的核酸序列的探針，可以鑒定肺炎鏈球菌的基因。使用限制性酶可以切下這些基因，將其克隆至載體，再將載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主以進(jìn)行表達(dá)。
通過使用與核酸分子的部分序列互補(bǔ)的適當(dāng)探針，可以從肺炎鏈球菌中得到本發(fā)明的核酸分子。可使用限制性酶或超聲處理技術(shù)得到適當(dāng)大小的片段以用作探針。
或者，可使用PCR技術(shù)擴(kuò)增所需的核酸序列。因此，可使用本文提供的序列資料設(shè)計(jì)兩個(gè)引物用于PCR，從而使包括完整基因或其片段的所需序列被靶向，隨即被高水平地?cái)U(kuò)增。
引物一般至少為15至25個(gè)核苷酸長。
另一種方法是使用化學(xué)合成，該方法可以實(shí)行自動(dòng)化?？梢曰瘜W(xué)合成相對(duì)較短的序列，再相互連接形成較長的序列。
使用本文所述的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)已鑒定出另一組得自肺炎鏈球菌的蛋白質(zhì)。它們是肺炎鏈球菌的已知蛋白質(zhì)，但以前無人將它們鑒定為抗原蛋白質(zhì)。該組蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及編碼它們的DNA序列示于表3。這些蛋白質(zhì)或其同系物，衍生物和/或片段也可用作抗原/免疫原。因此，另一方面，本發(fā)明提供了具有選自表1-3所示序列之序列的蛋白質(zhì)或多肽或其同系物，衍生物和/或片段作為免疫原/抗原的用途。
另一方面，本發(fā)明提供了免疫原性/抗原性的組合物，該組合物含有一種或多種具有選自表1-3所示序列之序列的蛋白質(zhì)或多肽或其同系物或衍生物，和/或它們中的任一個(gè)的片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性/抗原性的組合物是疫苗，或者可用于診斷試驗(yàn)。
就疫苗而言，它可包括適當(dāng)添加的賦形劑，稀釋劑，佐劑等。多個(gè)具體實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的。
也可以使用表1-3所示的核酸序列制備所謂的DNA疫苗。因此，本發(fā)明也提供了含有一種或多種本文所定義的核酸序列的疫苗組合物。本領(lǐng)域中已有人描述過DNA疫苗(例見Donnelly等，免疫學(xué)年評(píng)，15:617-648(1997))，熟練技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域所述技術(shù)生產(chǎn)和使用本發(fā)明的DNA疫苗。
如上所述，在檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法中，可以使用本文所述的蛋白質(zhì)或多肽，其同系物或衍生物，和/或它們中的任一個(gè)的片段。檢測(cè)受試者體內(nèi)存在的抗所述蛋白質(zhì)的抗體，以此為基礎(chǔ)建立上述方法。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與至少一種本文所述的蛋白質(zhì)或其同系物，衍生物或片段接觸的步驟。優(yōu)選樣品為生物樣品，如得自待測(cè)受試者的組織樣品或血樣或唾液。
在另一種方法中，可使用本文所述的蛋白質(zhì)，或其同系物，衍生物和/或片段產(chǎn)生抗體，反過來，所述抗體可用于檢測(cè)抗原，因而可檢測(cè)肺炎鏈球菌。所述抗體構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體可以是單克隆或多克隆抗體。
當(dāng)將本文所述的蛋白質(zhì)，或其同系物，衍生物或片段注射至適當(dāng)動(dòng)物宿主(如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，綿羊，山羊或猴)體內(nèi)時(shí)，通過刺激抗體生成即可使動(dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體。必要時(shí)，可同時(shí)使用佐劑和蛋白質(zhì)。眾所周知的佐劑包括弗氏佐劑(完全和不完全佐劑)和氫氧化鋁。然后，利用抗體與本文所述蛋白質(zhì)的結(jié)合即可純化抗體。
單克隆抗體可由雜交瘤產(chǎn)生。通過融合骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生所需抗體的脾細(xì)胞以形成無限增殖的細(xì)胞系即可形成雜交瘤。因此，可使用眾所周知的Kohler&Milstein技術(shù)(自然，256(1975))或在此技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改動(dòng)的技術(shù)。
目前，生產(chǎn)與特定多肽/蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆和多克隆抗體的技術(shù)已是本領(lǐng)域的成熟技術(shù)。有關(guān)討論可參見標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)課本，例如Roitt等，免疫學(xué)，第2版(1989),Churchill Livingstone，倫敦。
除了完整的抗體外，本發(fā)明還包括該抗體的衍生物，所述衍生物能與如本文所述的蛋白質(zhì)等結(jié)合。因此，本發(fā)明包括抗體片段和合成構(gòu)建體。抗體片段和合成構(gòu)建體的例子可參見Dougall等，Tibtech 12372-379(1994年9月)。
抗體片段包括例如Fab,F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(這些片段在Roitt等[文獻(xiàn)同上]中討論)。可修飾Fv片段以產(chǎn)生已知為單鏈Fv(scFv)分子的合成構(gòu)建體。該分子包括與Vh和Vl區(qū)共價(jià)連接的肽接頭，它對(duì)分子的穩(wěn)定性有所貢獻(xiàn)?？梢允褂玫钠渌铣蓸?gòu)建體包括CDR肽，它們是含有抗原-結(jié)合決定簇的合成肽。也可使用模擬肽，這些分子通常是構(gòu)象受限的有機(jī)環(huán)，它能模擬CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)，并包括能與抗原相互作用的側(cè)鏈。
合成構(gòu)建體包括嵌合分子。因此，例如，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括人源化(或靈長動(dòng)物化)抗體或其衍生物。人源化抗體的例子是具有人構(gòu)架區(qū)和嚙齒動(dòng)物高變區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法可參見例如Morrison等，PNAS,81,6851-6855(1984)和Takeda等，自然，314,452-454(1985)。
合成構(gòu)建體還包括含有其它組成成分的分子，所述其它成分可為分子提供一些除抗原結(jié)合特性之外的所需特性。例如，所述組成成分可以是標(biāo)記物(例如熒光或放射性標(biāo)記)。或者，也可以是藥物活性劑。
抗體或其衍生物可用于檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌。因此，另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與抗體接觸的步驟，所述抗體能結(jié)合一種或多種本文所述的蛋白質(zhì)，或其同系物，衍生物和/或片段。
另外，可使用所謂的“親和體”。這些親和體是選自α-螺旋細(xì)菌受體結(jié)構(gòu)域之組合文庫的結(jié)合蛋白(Nord等)。因此，可使用組合文庫法選擇能與不同靶蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的小蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
顯然，可使用本文所述的核酸序列檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌。因此，另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與至少一種本文所述的核酸序列接觸。優(yōu)選樣品為生物樣品，如得自待測(cè)受試者的組織樣品或血樣或唾液。在用于本發(fā)明的方法之前，可對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。因此，例如，可處理樣品以提取DNA。然后可使用基于本文所述核酸序列(通常為該序列的片段)的DNA探針檢測(cè)肺炎鏈球菌的核酸。
在其它方面，本發(fā)明提供了(a)免疫接種受試者以防肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，或其衍生物，同系物或片段，或本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟；(b)免疫接種受試者以防肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括給受試者施用本文所定義的核酸分子的步驟；(c)預(yù)防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，或其衍生物，同系物或片段，或本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟；(d)預(yù)防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，所述方法包括給受試者施用本文所定義的核酸分子的步驟；(e)用于檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，或其同系物，衍生物或片段，或本發(fā)明的抗原性組合物；和(f)用于檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一種或多種本文所定義的核酸分子。
即使我們已鑒定出一組重要的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是抗微生物療法的潛在靶標(biāo)。然而仍必需測(cè)定每個(gè)蛋白質(zhì)是否是微生物存活所必需的。因此，本發(fā)明也提供了測(cè)定本文所述蛋白質(zhì)或多肽是否為潛在的抗微生物靶標(biāo)的方法，所述方法包括拮抗，抑制或要不然干擾所述蛋白質(zhì)的功能或表達(dá)，并測(cè)定肺炎鏈球菌是否仍舊存活。
滅活蛋白質(zhì)的適當(dāng)方法是實(shí)行選定的基因敲除，即阻止蛋白質(zhì)的表達(dá)并測(cè)定是否會(huì)導(dǎo)致致死性改變。進(jìn)行所述基敲除的適當(dāng)方法描述于Li等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(P.N.A.S.),94:13251-13256(1997)和Kolkman等，178:3736-3741(1996)。
最后一方面，本發(fā)明提供了能拮抗，抑制或要不然干擾本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的功能或表達(dá)的藥劑用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌感染。
如上所述，我們已使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)作為鑒定蛋白質(zhì)的工具，所述蛋白質(zhì)是與表面相結(jié)合的，被分泌或輸出的蛋白質(zhì)，因此可用作抗原。
已深入研究了細(xì)菌中分泌/輸出蛋白質(zhì)所必需的遺傳信息。在大多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)輸出需要前體蛋白的N-末端存在信號(hào)肽，以將其導(dǎo)向質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器。轉(zhuǎn)運(yùn)當(dāng)中或轉(zhuǎn)運(yùn)之后，通過與膜結(jié)合的信號(hào)肽酶除去信號(hào)肽。最后，通過序列而不是前導(dǎo)肽本身來確定蛋白質(zhì)的定位(即蛋白質(zhì)是被分泌，還是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)或是結(jié)合至細(xì)胞壁上)。
我們對(duì)位于表面或被輸出的蛋白質(zhì)特別感興趣，因?yàn)樗鼈兛赡苁强乖梢杂糜谝呙?，用作診斷試劑或用新的化合物分子進(jìn)行治療的靶。因此，我們?cè)谌樗崛榍蚓?Lactococcus lactis)中研究出一種篩選載體-系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)可鑒定和分離編碼輸出蛋白質(zhì)的基因。下文將提供代表性的例子，顯示如何鑒定和表征得自肺炎鏈球菌的給定的新的表面結(jié)合蛋白質(zhì)。篩選載體摻入缺乏其自身輸出信號(hào)的葡萄球菌核酶基因nuc作為分泌報(bào)道基因。葡萄球菌核酶是天然分泌的熱-穩(wěn)定性單體酶，它可以在革蘭氏陽性細(xì)菌中被有效表達(dá)和分泌(Shortle，基因，22:181-189(1983)；Kovacevic等，細(xì)菌學(xué)雜志，162:521-528(1985)；Miller等，細(xì)菌學(xué)雜志，169:3508-3514(1987)；Liebl等，細(xì)菌學(xué)雜志，174:1854-1861(1992)；LeLoir等，細(xì)菌學(xué)雜志，176:5135-5139(1994)；Poquet等，細(xì)菌學(xué)雜志，180:1904-1912(1998))。
最近，Poquet等((1998)，文獻(xiàn)同上)描述了一種篩選載體，其摻入缺乏其自身前導(dǎo)信號(hào)的nuc基因作為報(bào)道基因，以鑒定革蘭氏陽性細(xì)菌中的輸出蛋白質(zhì)，該載體已應(yīng)用于乳酸乳球菌。除了含有促進(jìn)大腸桿菌和某些其它革蘭氏陰性細(xì)菌中的復(fù)制的ColE1復(fù)制子外，該載體(pFUN)還含有在寬宿主范圍的革蘭氏陽性細(xì)菌中起作用的pAMβ1復(fù)制子?？墒褂幂d體中存在的唯一克隆位點(diǎn)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄和翻譯融合物，所述融合物是在克隆的基因組DNA片段和不含其自身信號(hào)分泌前導(dǎo)序列的截短nuc基因的開放閱讀框之間產(chǎn)生的。nuc基因是理想的報(bào)道基因，因?yàn)槭褂煤?jiǎn)單而敏感的平板試驗(yàn)即可容易地檢測(cè)到核酶的分泌分泌核酶的重組菌落產(chǎn)生粉色暈圈，而對(duì)照菌落仍為白色(Shortle,1983，文獻(xiàn)同上；Le Loir等，1994，文獻(xiàn)同上)。
因此，以下將參照代表性的實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例將詳細(xì)描述本文所述的蛋白質(zhì)，多肽和核酸序列是如何被鑒定為抗原靶的。
在本文中，我們描述了3個(gè)報(bào)道載體的構(gòu)建，以及它們?cè)谌樗崛榍蚓杏糜阼b定和分離編碼分泌的或表面結(jié)合蛋白質(zhì)的肺炎鏈球菌基因組DNA片段的用途。
以下將參照實(shí)施例描述本發(fā)明，不應(yīng)將實(shí)施例看成是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中參照的附圖為

圖1顯示出大量DNA疫苗試驗(yàn)的結(jié)果；和圖2顯示出另一些DNA疫苗試驗(yàn)的結(jié)果。
按下述方法構(gòu)建pTREX載體。通過退火2個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸并用Tfl DNA聚合酶延伸，可產(chǎn)生這樣的人工DNA片段，所述片段含有推定的RNA穩(wěn)定化序列，翻譯起始區(qū)(TIR)，用于插入靶基因的多克隆位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。有義和反義寡核苷酸在其5’末端分別含有NheⅠ和BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)以便于克隆。將該片段克隆至pUC19NT7的XbaⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)之間，pUC19NT7是pUC19的衍生物，它含有得自pLET1的T7表達(dá)盒(Wells等，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志，74:629-636(1993))，該表達(dá)盒被克隆于EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間。所得構(gòu)建體被稱為pUCLEX。通過用HindⅢ切割，使其成為平端，再用EcoRⅠ切割以除去pUCLEX的整個(gè)表達(dá)盒，然后克隆至pIL253的EcoRⅠ和SacⅠ(平端)位點(diǎn)，產(chǎn)生載體pTREX(Wells和Schofield，代謝，遺傳學(xué)和應(yīng)用最新進(jìn)展-NATO ASISeries,H 98:37-62(1996))。推定的RNA穩(wěn)定化序列和TIR得自大腸桿菌T7噬菌體序列，并在一個(gè)核苷酸位置上被修飾以增強(qiáng)Shine Dalgarno(SD)基元與乳酸乳球菌核糖體16s RNA的互補(bǔ)性(Schofield等私人通信，劍橋大學(xué)病理學(xué)系)。
將表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性(隨后稱之為P7)的乳酸乳球菌MG1363染色體DNA片段克隆至表達(dá)盒中存在的EcoRⅠ和BglⅡ位點(diǎn)之間，產(chǎn)生pTREX7。以前，曾使用啟動(dòng)子探測(cè)載體pSB292(Waterfield等，基因，165:9-15(1995))分離出該活性啟動(dòng)子區(qū)域。根據(jù)廠商的說明，使用VentDNA聚合酶，經(jīng)PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。
然后按下述構(gòu)建pTREP1載體。通過退火2個(gè)重疊的部分互補(bǔ)的合成寡核苷酸，并根據(jù)廠商說明用測(cè)序酶進(jìn)行延伸即可產(chǎn)生這樣的人工DNA片段，該片段含有轉(zhuǎn)錄終止序列，正向pUC測(cè)序引物，啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)區(qū)域和通用的翻譯終止序列。有義和反義(pTREPF和pTREPR)寡核苷酸在其5’末端分別含有EcoRV和BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)以便于克隆至pTREX7。轉(zhuǎn)錄終止序列源自芽孢桿菌青霉素酶基因，已證實(shí)它在乳球菌屬中同樣有效(Jos等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，50:540-542(1985))。據(jù)認(rèn)為該序列是必需的，因?yàn)榻?jīng)觀察靶基因在pTREX載體中的表達(dá)有缺陷，有人認(rèn)為這是起始區(qū)隱蔽的啟動(dòng)子活性所致(Schofield等，私人通信，劍橋大學(xué)病理學(xué)系)。包括正向pUC引物測(cè)序可以直接測(cè)定克隆DNA片段的序列。包括編碼3個(gè)不同構(gòu)架中的終止密碼子的翻譯終止序列可以防止載體基因和克隆DNA片段之間產(chǎn)生翻譯融合物。首先，用EcoRⅠ消化pTREX7載體，根據(jù)廠商說明，使用T4 DNA聚合酶(NEB)的5’-3’聚合酶活性使其成為平端。然后用BglⅡ消化經(jīng)EcoRⅠ消化并平端化的pTREX7載體，以除去P7啟動(dòng)子。用EcoRV和BamHⅠ消化由退火的合成寡核苷酸衍生的人工DNA片段，克隆至經(jīng)EcoRⅠ(平端)-BglⅡ消化的pTREX7載體，產(chǎn)生pTREP。然后將被稱為P1的乳酸乳球菌MG1363染色體啟動(dòng)子克隆至pTREP表達(dá)盒中存在的EcoRⅠ和BglⅡ位點(diǎn)之間，形成pTREP1。使用啟動(dòng)子探測(cè)載體pSB292分離該啟動(dòng)子，并通過Waterfield等(1995)，文獻(xiàn)同上進(jìn)行鑒定。起初，根據(jù)廠商說明，使用VentDNA聚合酶經(jīng)PCR擴(kuò)增P1啟動(dòng)子片段，并且作為EcoRⅠ-BglⅡ DNA片段被克隆至pTREX。通過限制性酶消化從pTREX1中除去含有EcoRⅠ-BglⅡ P1啟動(dòng)子的片段，并用于克隆至pTREP(Schofield等，私人通信，劍橋大學(xué)病理學(xué)系)。(b)PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(S.aureus)nuc基因使用金黃色葡萄球菌nuc基因的核苷酸序列(EMBL數(shù)據(jù)庫登記號(hào)為V01281)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增所用的合成寡核苷酸引物。設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增nuc基因的成熟形式(被稱為nucA)，通過用蛋白酶裂解分泌型前肽(被稱為Snase B)N-末端的19至21個(gè)氨基酸即可產(chǎn)生nucA(Shortle,(1983)，文獻(xiàn)同上)。設(shè)計(jì)3個(gè)有義引物(nucS1,nucS2和nucS3，附錄Ⅰ)，每個(gè)引物在與nuc基因不同的讀碼框中具有平端限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點(diǎn)EcoRV或SmaⅠ。另外，分別在有義和反義引物的5’末端摻入BglⅡ和BamHⅠ以便克隆至經(jīng)BamHⅠ和BglⅡ切割的pTREP1。所有引物的序列示于附錄Ⅰ。聯(lián)合使用各個(gè)有義引物和上述反義引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增3個(gè)編碼核酶基因成熟形式(NucA)的nuc基因DNA片段。使用金黃色葡萄球菌基因組DNA模板，Vent DNA聚合酶(NEB)和廠商推薦的條件，經(jīng)PCR擴(kuò)增nuc基因片段。起初于93℃變性2分鐘，接著以93℃變性45秒，50℃退火45秒和73℃延伸1分鐘循環(huán)30次，最后于73℃延伸5分鐘。使用Wizard清洗柱(Promega)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以除去未摻入的核苷酸和引物。(c)構(gòu)建pTREP1-nuc載體使用標(biāo)準(zhǔn)條件，用BglⅡ和BamHⅠ消化b部分中所述的純化的nuc基因片段，連接至經(jīng)BamHⅠ和BglⅡ切割并去磷酸化的pTREP1，產(chǎn)生pTREP1-nuc1,pTREP1-nuc2和pTREP1-nuc3系列的報(bào)道基因載體。使用由廠商提供的試劑和緩沖液或使用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行普通的分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook和Maniatis,(1989)，文獻(xiàn)同上)。在各個(gè)pTREP1-nuc載體中，表達(dá)盒含有轉(zhuǎn)錄終止序列，乳球菌啟動(dòng)子P1，唯一的克隆位點(diǎn)(BglⅡ,EcoRV或SmaⅠ)，接著是成熟形式的nuc基因和第二個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。應(yīng)注意在此構(gòu)建體中故意將nuc基因的翻譯和分泌所需序列排除在外。這類元件只有通過經(jīng)適當(dāng)消化的外源DNA片段(相當(dāng)于靶細(xì)菌)來提供，所述片段可被克隆至緊接nuc基因上游的唯一限制性位點(diǎn)。
在擁有啟動(dòng)子方面，pTREP1-nuc載體與Poquet等，(1998)，文獻(xiàn)同上所述的pFUN載體不同，pFUN載體可用于通過直接在乳酸乳球菌中直接篩選Nuc活性來鑒定乳酸乳球菌的輸出蛋白質(zhì)。由于pFUN載體在nuc開放閱讀框的上游不含有啟動(dòng)子，因此，除了提供Nuc的翻譯起始和分泌所需的那些元件外，克隆基因組DNA片段還必須提供轉(zhuǎn)錄信號(hào)。這一限制可防止分離與啟動(dòng)子遠(yuǎn)離的基因，例如多順反子操縱子內(nèi)的基因。此外，無法保證得自其它種細(xì)菌的啟動(dòng)子能被乳酸乳球菌識(shí)別并在其中起作用。某些啟動(dòng)子處于天然宿主而不是乳酸乳球菌的嚴(yán)格調(diào)控之下。相反，pTREP1-nuc系列載體中P1啟動(dòng)子的存在能確保無啟動(dòng)子的DNA片段(或含有在乳酸乳球菌中無活性的啟動(dòng)子序列的DNA片段)仍能被轉(zhuǎn)錄。(d)篩選肺炎鏈球苗中的分泌型蛋白質(zhì)用限制性酶Tru9Ⅰ消化分離自肺炎鏈球菌的基因組DNA。之所以使用識(shí)別序列5’-TTAA-3’的此酶是因?yàn)樗苡行懈罡缓珹/T的基因組，并能產(chǎn)生優(yōu)選大小范圍(通常平均為0.5-1.0kb)內(nèi)的隨機(jī)基因組DNA片段。之所以優(yōu)選此大小范圍是因?yàn)榇藭r(shí)P1啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄新基因序列的可能性更大。然而，在所有的情況下P1啟動(dòng)子不都是必需的，因?yàn)楹芏噫溓蚓膯?dòng)子可以在乳酸乳球菌中被識(shí)別。從肺炎鏈球菌基因組DNA的部分Tru9Ⅰ消化物中純化不同大小范圍的DNA片段。由于Tru9Ⅰ限制性酶產(chǎn)生了交錯(cuò)的末端，因此不得不先使DNA片段成為平端，然后再與經(jīng)EcoRV或SmaⅠ切割的pTREP1-nuc載體連接。通過使用Klenow酶的5’-3’聚合酶活性進(jìn)行部分補(bǔ)平酶反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)此目的。簡(jiǎn)單地說，將經(jīng)Tru9Ⅰ消化的DNA溶解于添加有T4 DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs；NEB)(1X)和33μM各種所需dNTP(此處為dATP和dTTP)的溶液中(總體積通常為10-20μl)。加入Klenow酶(每μg DNA加1個(gè)單位Klenow酶(NEB))，25℃保溫反應(yīng)15分鐘。通過于75℃保溫混合物20分鐘以終止反應(yīng)。然后加入經(jīng)EcoRV或SmaⅠ消化的pTREP-nuc質(zhì)粒DNA(通常為200-400ng)。再在混合物中添加400個(gè)單位的T4 DNA連接酶(NEB)和T4 DNA連接酶緩沖液(1X)，于16℃保溫過夜。直接在100％乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)中沉淀連接混合物，并用于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363(Gasson,1983)?；蛘?，pTREP-nuc載體的基因克隆位點(diǎn)也含有BglⅡ位點(diǎn)，該位點(diǎn)可用于克隆例如經(jīng)Sau3AⅠ消化的基因組DNA片段。
在腦心浸制瓊脂上培養(yǎng)乳酸乳球菌的轉(zhuǎn)化子菌落，基本上按Shortle,1983，文獻(xiàn)同上和Le Loir等，1994，文獻(xiàn)同上所述，通過甲苯胺藍(lán)-DNA-瓊脂覆層(0.05M Tris pH9.0,10g瓊脂/l,10g NaCl/l,0.1mM CaCl2,0.03％wt/vol鮭精DNA和90mg甲苯胺藍(lán)O染料)檢測(cè)分泌核酶(Nuc+)的克隆。然后將平板置于37℃保溫2小時(shí)，分泌核酶的克隆顯示出容易鑒別的粉色暈圈。從Nuc+重組乳酸乳球菌克隆中分離質(zhì)粒DNA，使用附錄Ⅰ中所述的NucSeq測(cè)序引物測(cè)定DNA插入片段一條鏈的序列，所述引物的序列直接穿過DNA插入片段。從肺炎鏈球菌中分離編碼輸出蛋白質(zhì)的基因使用核酶篩選系統(tǒng)已鑒定出大量據(jù)推測(cè)可編碼肺炎鏈球菌的輸出蛋白質(zhì)的基因序列。以下將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析以除去人為假象。使用大量參數(shù)分析用篩選系統(tǒng)鑒定出的序列。
1．使用軟件程序Sequencher(Gene Codes公司)和DNA Strider(Marck，核酸研究，16:1829-1836(1988))分析所有推定的表面蛋白質(zhì)的前導(dǎo)/信號(hào)肽序列。細(xì)菌信號(hào)肽序列享有共同的設(shè)計(jì)，其特征在于短的帶正電N-末端(N區(qū)域)后面緊接著一段疏水殘基(中央部分-h區(qū)域)，接著是含有裂解位點(diǎn)且更具極性的C-末端部分(c-區(qū)域)?？梢允褂媚芾L制出推定蛋白質(zhì)的親水性分布圖，并能容易地鑒定前導(dǎo)肽序列代表性的非常與眾不同的疏水部分(h-區(qū)域)的計(jì)算機(jī)軟件。另外，需檢查序列中是否存在潛在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno基元)，該位點(diǎn)是推定的nuc報(bào)道基因融合蛋白的翻譯起始所必需的。
2．使用公開的數(shù)據(jù)庫[包括SwissProt和GenBank翻譯的OWL-proteins]將所有推定的表面蛋白質(zhì)序列與所有蛋白質(zhì)/DNA序列相匹配。這樣即可鑒定與已知基因或具有一些功能的基因同系物相似的序列。由此可推測(cè)使用LEEP系統(tǒng)鑒定出的一些基因的功能，并且可以毫無疑義地確定該系統(tǒng)可用于鑒定和分離表面結(jié)合蛋白質(zhì)的基因序列。我們應(yīng)該也能證實(shí)這些蛋白質(zhì)實(shí)際上就是表面結(jié)合蛋白質(zhì)而不是人為假象。LEEP系統(tǒng)已被用于鑒定疫苗和治療所用的新的基因靶。
3．一些基因已被鑒定的蛋白質(zhì)不具有典型的前導(dǎo)肽序列，與數(shù)據(jù)庫中的任何DNA/蛋白質(zhì)序列也不具有同源性。實(shí)際上，這些蛋白質(zhì)能顯示出本發(fā)明篩選方法的主要優(yōu)點(diǎn)，即分離不典型的表面相關(guān)蛋白質(zhì)，而在所有前述篩選方法或基于序列同源性檢索的方法中，卻無法做到這一點(diǎn)。
在所有情況下，起初只得到部分基因序列。在所有情況下，參照TIGR肺炎鏈球菌數(shù)據(jù)庫(www@tigr.org)可得到全長基因。因此，通過使起初得到的部分序列與數(shù)據(jù)庫相匹配，即可鑒定出全長基因序列。如本文所述，通過這種方法清楚地鑒定出3組基因，即一組編碼以前未曾鑒定的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)的基因，另一組編碼與得自多種來源的已知蛋白質(zhì)表現(xiàn)出一些同源性的蛋白質(zhì)的基因，第三組編碼已知的但不是已知抗原的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)的基因。
Zhang,D.,Yang,X.,Berry,J.Shen,C.,McClarty,G和Brunham,R.C.(1997)，“用主要外膜蛋白基因進(jìn)行DNA免疫能誘導(dǎo)針對(duì)沙眼衣原體(小鼠肺炎)感染的獲得性免疫力”，感染和免疫，176,1035-40。
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然而，已經(jīng)說過蛋白質(zhì)的其它特征也能影響可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)和呈遞。在設(shè)計(jì)寡核苷酸的過程中，應(yīng)在編碼所需蛋白質(zhì)的基因中排除編碼這些特征的DNA序列。這些特征包括1．LPXTG細(xì)胞壁錨著基元。
2．LXXC脂蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
3．疏水性的C-末端結(jié)構(gòu)域。
4．當(dāng)不存在N-末端信號(hào)肽或LXXC時(shí)，應(yīng)除去終止密碼子。
5．當(dāng)不存在疏水性C-末端結(jié)構(gòu)域或LPXTG基元時(shí)，應(yīng)除去終止密碼子。
為感興趣的各個(gè)基因設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)腜CR引物，當(dāng)設(shè)計(jì)這些引物時(shí)，應(yīng)從基因中除去編碼上述特征的任何和所有區(qū)域。引物被設(shè)計(jì)成具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦肝稽c(diǎn)，其后緊接著保守的Kozak核苷酸序列(在大多數(shù)情況下(注意，除了在極少數(shù)情況下，例如ID59)使用的是GCCACC。Kozak序列有利于真核核糖體識(shí)別起始序列)和位于所需基因插入物上游的ATG起始密碼子。例如，使用BamHⅠ位點(diǎn)的正向引物以GCGGGATCCGCCACCATG起始，后面接著所需基因5’末端的一小段序列。設(shè)計(jì)反向引物以與正向引物相容，并在大多數(shù)情況下與5’末端的NotⅠ限制性位點(diǎn)(該位點(diǎn)是TTGCGGCCGC)相容(注意，除了在極少數(shù)情況下，例如ID59，用XhoⅠ位點(diǎn)替代NotⅠ)。PCR引物下列PCR引物被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增所需的截短基因。ID5正向引物5′CGGATCCGCCACCATGGGTCTAATTGAAGACTTAAAAAATCAA 3′反向引物5′TTGCGGCCGCCAATGCTAGACTAAACACAAGACTCA 3′ID59正向引物5′CGCGGATCCATGAAAAAAATCTATTCATTTTTAGCA 3′反向引物5′CCCTCGAGGGCTACTTCCGATACATTTTAAACTGTAGG3′ID51正向引物5′CGGATCCGCCACCATGAGTCATGTCGCTGCAAATG 3′反向引物5′TTGCGGCCGCATACCAAACGCTGACATCTACG 3′ID29正向引物5′CGGATCCGCCACCATGCAAAAAGAGCGGTATGGTTATG3′反向引物5′TTGCGGCCGCACCCCCATTCTTAATCCCTT 3′ID50正向引物5′CGGATCCGCCACCATGGAGGTATGTGAAATGTCACGTAAA 3′反向引物5′TTGCGGCCGCTTTTACAAAGTCAAGCAAAGCC 3′克隆從得自國家典型培養(yǎng)物保藏中心的4型肺炎鏈球菌菌株11886中分離基因組DNA，以此為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增插入物以及具有上述特征的側(cè)翼序列。用適當(dāng)限制性酶切割PCR產(chǎn)物，使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)將其克隆至pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)。培養(yǎng)經(jīng)適當(dāng)作圖的所需基因克隆，使用Plasmid Mega試劑盒(Qiagen)大規(guī)模分離質(zhì)粒(＞1.5mg)。通過對(duì)各個(gè)構(gòu)建體的每個(gè)大規(guī)模制品的5’克隆接頭的約700個(gè)堿基對(duì)進(jìn)行限制性圖譜分析和測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)基因的成功克隆和維持。菌株證實(shí)在克隆和攻擊的方法中使用4型菌株，該菌株的肺炎鏈球菌基因組已被測(cè)序。4型肺炎鏈球菌菌株11886的均質(zhì)實(shí)驗(yàn)室菌株凍干安瓿得自國家典型菌種保藏中心。打開安瓿，用0.5ml胰胨豆胨肉湯(0.5％葡萄糖，5％血液)重新懸浮培養(yǎng)物。在10ml胰胨豆胨肉湯(0.5％葡萄糖，5％血液)中傳代培養(yǎng)懸浮液，于37℃靜止保溫過夜。在5％血液瓊脂平板上劃線此培養(yǎng)物以檢查污染物并證實(shí)存活，在血液瓊脂斜面上劃線，使用其余培養(yǎng)物制備20％甘油原種。將斜面培養(yǎng)物送至公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)中心，經(jīng)證實(shí)血清型為4型。
在5％血液瓊脂平板上劃線NCTC11886的甘油原種，于37℃在CO2氣罐中保溫過夜。制備新鮮的劃線培養(yǎng)物并證實(shí)奧普托欣敏感性。肺炎球菌攻擊經(jīng)小鼠傳代肺炎球菌培養(yǎng)物1次，從感染動(dòng)物的血液中收集肺炎球菌，在肉湯中培養(yǎng)至預(yù)定的活菌數(shù)約為109cfu/ml，然后冷凍，從而制備出4型肺炎鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)接種冷凍培養(yǎng)物。制備的流程圖如下劃線肺炎球菌培養(yǎng)物并證實(shí)其身份↓在上述平板上培養(yǎng)4-5個(gè)菌落的過夜培養(yǎng)物↓用動(dòng)物傳代肺炎球菌培養(yǎng)物(腹膜內(nèi)注射心取血收集)
↓培養(yǎng)經(jīng)動(dòng)物傳代的肺炎球菌的過夜培養(yǎng)物↓由經(jīng)動(dòng)物傳代的過夜培養(yǎng)物培養(yǎng)全天培養(yǎng)物(至預(yù)定的光密度)并于-70℃冷凍-這是標(biāo)準(zhǔn)的極限↓融化一等份標(biāo)準(zhǔn)的接種物以進(jìn)行存活計(jì)數(shù)↓使用標(biāo)準(zhǔn)接種物以測(cè)定有效劑量(稱之為毒力檢測(cè)試驗(yàn))↓使用有效劑量的標(biāo)準(zhǔn)接種物進(jìn)行隨后所有的攻擊用PBS將一等份標(biāo)準(zhǔn)的接種物稀釋500倍，并用于接種小鼠。
使用鹵代烷輕度麻醉小鼠，然后將劑量為1.4×105cfu的肺炎球菌施用于每個(gè)小鼠的鼻腔，小鼠的正常呼吸將有利于攝入肺炎球菌，讓小鼠背朝下躺著等待恢復(fù)。肺炎鏈球菌疫苗試驗(yàn)通過給6周齡的CBA/ca小鼠(Harlan,UK)施用DNA而在小鼠中進(jìn)行疫苗試驗(yàn)。將待免疫接種的小鼠分成6組，每組用重組pcDNA3.1+質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫接種，所述質(zhì)粒DNA中含有所需的特定靶基因序列。將總共100μg溶于Dulbecco PBS(Sigma)中的DNA肌內(nèi)注射至兩腿的前脛骨肌(每條腿50μl)。4周后使用相同的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。為了進(jìn)行比較，在所有疫苗試驗(yàn)中都包括對(duì)照組。這些對(duì)照組或者是未經(jīng)免疫的動(dòng)物，或者是按與上述相同的時(shí)間進(jìn)程僅施用了非重組pcDNA3.1+DNA(假免疫)的動(dòng)物。第二次免疫接種3周后，用致死劑量的肺炎鏈球菌血清型4(菌株NCTC11886)鼻內(nèi)攻擊所有小鼠組。通過在5％血液瓊脂平板上平鋪接種經(jīng)連續(xù)稀釋的接種物來監(jiān)測(cè)所施用細(xì)菌的數(shù)目。鼻內(nèi)免疫接種的問題是在一些小鼠中，接種物從鼻孔中象吹泡似地冒出來，在結(jié)果表中已注意到這個(gè)問題，并且在計(jì)算時(shí)已將此問題考慮在內(nèi)。較不明顯的問題是每只小鼠可能吞下了一部分接種物。假定對(duì)每只小鼠而言，被吞下去的量是相同的，在接種過程中將達(dá)到平均。然而，所使用的樣品較少，這一問題將對(duì)一些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生顯著影響。在注射后3或4天，殺死攻擊后仍存活的所有小鼠。在感染過程中，監(jiān)測(cè)被攻擊的小鼠中與肺炎鏈球菌誘導(dǎo)-疾病的發(fā)作相關(guān)的癥狀發(fā)展情況。典型的癥狀依次包括立毛，逐漸增加的隆起體態(tài)，眼里流出排泄物，嗜睡和不愿動(dòng)。后期的癥狀通常與瀕死狀態(tài)的產(chǎn)生一致，剔除瀕死狀態(tài)的小鼠以使它們不再遭受痛苦。據(jù)認(rèn)為這些小鼠瀕臨死亡，使用剔除時(shí)間確定存活時(shí)間用以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小鼠死亡時(shí)，存活時(shí)間被當(dāng)成是經(jīng)監(jiān)測(cè)認(rèn)為小鼠仍舊活著的最后的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果的解釋如果被克隆并用于上述攻擊實(shí)驗(yàn)的任何DNA序列能產(chǎn)生對(duì)抗攻擊的保護(hù)作用，即為陽性結(jié)果。能產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的保護(hù)作用(置信水平為95％(p＜0.05))的DNA序列，和使用Mann-Whitney發(fā)現(xiàn)的勉強(qiáng)或接近顯著的保護(hù)作用，或顯示出一些保護(hù)性特征，例如有一只或多只無關(guān)的小鼠或因?yàn)槭状纬霈F(xiàn)死亡的時(shí)間延長，被認(rèn)為是保護(hù)作用。當(dāng)我們認(rèn)為一些結(jié)果被使用鼻內(nèi)感染的相關(guān)問題再得模糊不清時(shí)，接近顯著或非顯著的結(jié)果被認(rèn)為是潛在的陽性結(jié)果是可以接受的。結(jié)果試驗(yàn)1-6(見圖1)
*-當(dāng)按此劑量免疫時(shí)，有一小部分象吹泡似地被冒出，因此可能未接受全部接種物。T-在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)終止，沒有感染癥狀。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字-不考慮所采用的不完全劑量的存活時(shí)間。P值1指的是與未經(jīng)免疫的對(duì)照相比的顯著性試驗(yàn)。P值2指的是與pcDNA3.1+免疫的對(duì)照相比的顯著性試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)1-其它組無一比對(duì)照有顯著更長的存活時(shí)間。未經(jīng)免疫和pcDNA3.1對(duì)照組的存活時(shí)間沒有顯著的不同。ID5的一個(gè)小鼠是無關(guān)的結(jié)果，ID5的平均存活時(shí)間被延長，但不顯著。
試驗(yàn)2-與未經(jīng)免疫的對(duì)照組相比，ID59免疫組的存活時(shí)間顯著更長。
試驗(yàn)5-與對(duì)照相比，ID59免疫組的存活時(shí)間平均約長10小時(shí)，但該結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不是很顯著。
試驗(yàn)6-與未經(jīng)免疫的對(duì)照組相比，ID51免疫組不具有顯著更長的存活時(shí)間(p=＜36.0)，然而，經(jīng)免疫組中有2個(gè)無關(guān)的小鼠。疫苗試驗(yàn)7和8(見圖2)
*-當(dāng)按此劑量免疫時(shí)，有一小部分象吹泡似地被冒出，因此可能未接受全部接種物。T-在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)終止，沒有感染癥狀。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字-不考慮所采用的不完全劑量的存活時(shí)間。P值1指的是與未經(jīng)免疫的對(duì)照相比的顯著性試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)7-ID29免疫組首次出現(xiàn)死亡的時(shí)間延長。
試驗(yàn)8-與未經(jīng)免疫的對(duì)照組相比，ID50免疫組具有顯著更長的存活時(shí)間。
附錄Ⅰ-寡核苷酸引物nucS1BglⅡ Eco RV5′-cgagatctgatatctcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucS2BglⅡ SmaⅠ5′-gaagatcttccccgggatcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucS3BglⅡ Eco RV5′-cgagatctgatatccatcacaaacagataacggcgtaaatag-3′nucRBamHⅠ5′-cgggatccttatggacctgaatcagcgttgtc-3′NucSeq5′-ggatgctttgtttcaggtgtatc-3′pTREPF5′-catgatatcggtacctcaagctcatatcattgtccggcaatggtgtgggctttttttgttttagcggataagttatccgcta-3＇pTREPR5′-gcggatcccccgggcttaattaatgtttaaacactagtcgaagatctcgcgaattctcctgtgtgaaattgttatccgcta-3＇pUCF5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′VR5′-tcaggggggcggagcctatg-3′V15′-tcgtatgttgtgtggaattgtg-3′V25′-tccggctcgtatgttgtgtggaattg-3′
表1ID41200bpATGAGAAATATGTGGGTTGTAATCAAGGAAACCTATCTTCGACATGTCGAGTCATGGAGTTTCTTCTTTATGGTGATTTCGCCGTTCCTCTTTTTAGGAATCTCTGTAGGAATTGGGCATCTCCAAGGTTCTTCTATGGCTAAAAATAATAAAGTGGCAGTAGTGACAACAGTGCCATCTGTAGCAGAAGGACTGAAGAATGTAAATGGTGTTAACTTCGACTATAAAGACGAAGCAAGTGCCAAAGAAGCAATTAAAGAAGAAAAATTAAAAGGTTATTTGACCATTGATCAAGAAGATAGTGTTCTAAAGGCAGTTTATCATGGCGAAACATCGCTTGAAAATGGGAATTAAATTTGAGGTTACAGGTACACTCAATGAACTGCAAAATCAGCTTAATCGTTCAACTGCTTCCTTGTCTCAAGAGCAGGAAAAACGCTTAGCGCAGACAATTCAATTCACAGAAAAGATTGATGAAGCCAAGGAAAATAAAAAGTTTATTCAAACAATTGCAGCAGGTGCCTTAGGATTCTTTCTTTATATGATTCTGATTACCTATGCGGGTGTAACAGCTCAGGAAGTTGCCAGTGAAAAAGGCACCAAAATTATGGAAGTCGTTTTTTCTAGCATAAGGGCAAGTCACTATTTCTATGCGCGGATGATGGCTCTGTTTCTAGTGATTTTAACGCATATTGGGATCTATGTTGTAGGTGGTCTGGCTGCCGTTTTGCTCTTTAAAGATTTGCCATTCTTGGCTCAGTCTGGTATTTTGGATCACTTGGGAGATGCTATCTCACTGAATACCTTGCTCTTTATTTTGATCAGTCTTTTCATGTACGTAGTCTTGGCAGCCTTCCTAGGATCTATGGTTTCTCGTCCTGAGGACTCAGGGAAAGCCTTGTCGCCTTTGATGATTTTGATTATGGGTGGTTTTTTTGGAGTGACAGCTCTAGGTGCAGCTGGTGACAATCTCCTCTTGAAGATTGGTTCTTATATTCCCTTTATTTCGACCTTCTTTATGCCGTTTCGAACGATTAATGACTATGCGGGGGGAGCAGAAGCATGGATTTCACTTGCTATTACAGTGATTTTTGCGGTGGTAGCAACAGGATTTATCGGACGCATGTATGCTAGTCTCGTTCTTCAAACGGATGATTTAGGGATTTGGAAAACCTTTAAACGTGCCTTATCTTATAAATAGMRNMWVVIKETYLRHVESWSFFFMVISPFLFLGISVGIGHLQGSSMAKNNKVAVVTTVPSVAEGLKNVNGVNFDYKDEASAKEAIKEEKLKGYLTIDQEDSVLKAVYHGETSLENGIKFEVTGTLNELQNQLNRSTASLSQEQEKRLAQTIQFTEKIDEAKENKKFIQTIAAGALGFFLYMILITYAGVTAQEVASEKGTKIMEVVFSSIRASHYFYARMMALFLVILTHIGIYVVGGLAAVLLFKDLPFLAQSGILDHLGDAISLNTLLFILISLFMYVVLAAFLGSMVSRPEDSGKALSPLMILIMGGFFGVTALGAAGDNLLLKIGSYIPFISTFFMPFRTINDYAGGAEAWISLATTVIFAVVATGFIGRMYASLVLQTDDLGIWKTFKRALSYKZIDS1125bpCCTGGGAAAGTCTTGAAAATTATGATAGAATGGTGGAAGGAAAAATTCAGGAGAGTAGTAGTGACTCAAAATGTTGAAAGTCTTCTCGTATCCATTGTAATCAGTGCATACAATGAAGAAAAATATCTGCCTGGTCTAATTGAAGACTTAAAAAATCAAACCTATCCTAAAGAGGATATTGAAATTCTATTTATAAATGCTATGTCCACAGATGGGACCACAGCTATCATTCAGCAATTTATAAAGGAAGATACAGAGTTTAACTCAATTAGATTGTATAACAATCCTAAGAAAAATCAAGCTAGTGGTTTTAACCTGGGAGTTAAACATTCTGTAGGGGACCTTATTTTAAAAATTGATGCTCATTCAAAAGTTACTGAGACTTTTGTAATGAACAATGTGGCTATTATTCAACAAGGTGAATTTGTCTGTGGGGGGCCTAGACCGACGATTGTCGAAGGAAAAGGAAAATGGGCAGAGACCTTGCATCTTGTTGAGGAAAATATGTTTGGCAGTAGCATTGCCAATTATCGAAATAGTTCTGAGGATAGATATGTTTCTTCTATTTTTCATGGAATGTATAAACGAGAGGTTTTCCAGAAGGTTGGTTTAGTAAATGAGCAACTTGGCCGAACTGAAGATAATGATATTCATTATAGAATTCGAGAATATGGTTATAAAATCCGCTATAGCCCAAGTATTCTATCTTATCAGTATATTCGACCAACATTCAAGAAAATGCTGCATCAAAAGTATTCAAATGGTTTGTGGATTGGCTTGACAAGTCATGTTCAGTTTAAGTGTTTATCATTATTTCACTATGTTCCTTGTTTATTTGTTTTGAGTCTTGTGTTTAGTCTAGCATTGTTACCGATCACATTCGTATTCATAACTTTACTATTAGGTGCCTATTTTCTACTTTTGTCATTACTCACTTTGCTGACTTTATTAAAACATAAAAATGGATTTCTAATTGTGATGCCCTTTATTTTATTTTCCATTCACTTTGCTTATGGCCTTGGGACGATTGTAGGTTTAATTAGAGGATTTAAATGGAAGAAGGAGTACAAGAGAACAATAATTTATTTGGATAAAATAAGCCAAATAAATCAAAATATGCTATAAPGKVLKIMIEWWKEKFRRVVVTQNVESLLVSIVISAYNEEKYLPGLIEDLKNQTYPKEDIEILFINAMSTDGTTAIIQQFIKEDTEFNSIRLYNNPKKNQASGFNLGVKHSVGDLILKIDAHSKVTETFVMNNVAIIQQGEFVCGGPRPTIVEGKGKWAETLHLVEENMFGSSIANYRNSSEDRYVSSIFHGMYKREVFQKVGLVNEQLGRTEDNDIHYRIREYGYKIRYSPSILSYQYIRPTFKKMLHQKYSNGLWIGLTSHVQFKCLSLFHYVPCLFVLSLVFSLALLPTTFVFITLLLGAYFLLLSLLTLLTLLKHKNGFLIVMPFILFSIHFAYGLGTIVGLIRGFKWKKEYKRTIIYLDKISQINQNMLZID11696bpATGATGAAAGAACAAAATACGATAGAAATCGATGTATTTCAATTAGTTAAAAGCTTGTGGAAACGCAAGCTAATGATTTTAATAGTGGCACTTGTGACAGGTGCGGGGGCTTTTGCATATAGCACTTTTATTGTTAAGCCAGAATATACGAGTACCACGCGAATTTACGTAGTGAATCGCAATCAAGGAGACAAGCCGGGGTTGACAAATCAGGATTTGCAGGCAGGAACTTATCTGGTAAAAGACTACCGTGAGATTATCCTTTCGCAGGATGTTTTGGAGGAAGTTGTTTCTGATTTGAAACTAGATTTGACGCCAAAAGGTTTGGCTAATAAAATTAAAGTGACAGTACCAGTTGATACCCGTATTGTCTCTATTTCAGTTAATGATCGAGTTCCTGAAGAGGCAAGCCGTATCGCTAACTCTTTGAGAGAAGTAGCTGCTCAAAAAATTATCAGTATTACTCGTGTTTCTGACGTGACAACACTGGAGGAGGCAAGGCCGGCGATATCCCCGTCTTCGCCAAATATTAAACGCAATACACTAATTGGTTTTTTGGCAGGGGTGATTGGAACTAGTGTTATAGTTCTTCATCTTGAACTTTTGGATACTCGTGTGAAACGTCCGGAAGATATCGAAAATACATTGCAGATGACACTTTTGGGAGTTGTGCCAAACTTGGGTAAGTTGAAATAGMMKEQNTIEIDVFQLVKSLWKRTKLMTLIVALVTGAGAFAYSTFIVKPEYTSTTRIYVVNRNQGDKPGLTNQDLQAGTYLVKDYREIILSQDVLEEVVSDLKLDLTPKGLANKIKVTVPVDTRIVSISVNDRVPEEASRIANSLREVAAQKIISITRVSDVTTLEEARPAISPSSPNIKRNTLIGFLAGVIGTSVIVLHLELLDTRVKRPEDIENTLQMTLLGVVPNLGKLKZIDI9555bpATGGTAAAAGTAGCAGTTATATTAGCTCAGGGCTTTGAAGAAATTGAAGCCTTGACAGTTGTAGATGTCTTGCGTCGAGCCAATATCACATGTGATATGGTTGGTTTTGAAGAGCAAGTAACGGGTTCGCATGCAATCCAAGTAAGAGCAGATCATGTCTTTGATGGAGATTTATCAGACTATGATATGATTGTTCTTCCTGGAGGTATGCCTGGTTCTGCACATTTACGTGATAATCAGACCTTGATTCAAGAATTGCAAAGCTTCGAGCAAGAAGGGAAGAAACTAGCAGCCATTTGTGCGGCACCAATTGCCCTCAATCAAGCAGAGATATTGAAAAATAAGCGATACACTTGTTATGACGGCGTTCAAGAGCAAATCCTTGATGGTCACTACGTCAAGGAAACAGTAGTGGTAGATGGTCAGTTGACAACCAGTCGGGGTCCTTCAACAGCCCTTGCCTTTGCCTACGAGTTGGTGGAGCAACTAGGAGGGGACGCAGAGAGTTTACGAACAGGAATGCTCTATCGAGATGTCTTTGGTAAAAATCAGTAAMVKVAVILAQGFEEIEALTVVDVLRRANTTCDMVGFEEQVTGSHAIQVRADHVFDGDLSDYDMIVLPGGMPGSAHLRDNQTLIQELQSFEQEGKKLAAICAAPIALNQAEILKNKRYTCYDGVQEQILDGHYVKETVVVDGQLTTSRGPSTALAFAYELVEQLGGDAESLRTGMLYRDVFGKNQZID27306bpGTGGTAGGGATGGTAGAACCAAACCTAGAAAGCCTTATAAAAGATCTTTACAATCATGCTCGACATGATTTGAGTGAAGATTTAGTTGCTGCTCTCCTAGAGACTACTAAAAAACTGCCTACTACAAATGAGCAATTGCAGGCAGTTCGTCTCTCAGGCCTGGTCAATCGTGAATTGCTCCTA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權(quán)利要求
1．肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)或多肽，其具有選自表1所示序列的序列。
2．肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)或多肽，其具有選自表2所示序列的序列。
3．權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)或多肽，它以基本上純的形式被提供。
4．與權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的基本上相同的蛋白質(zhì)或多肽。
5．權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)或多肽的同系物或衍生物。
6．表1-3中所定義的蛋白質(zhì)或多肽的抗原性和/或免疫原性片段。
7．核酸分子，其含有下列序列或由下列序列組成(ⅰ)表1所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ⅱ)與(ⅰ)中的任一序列互補(bǔ)的序列；(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)中的序列編碼相同蛋白質(zhì)或多肽的序列；(ⅳ)與(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列；(ⅴ)編碼表1所定義蛋白質(zhì)的同系物，衍生物或片段的序列。
8．核酸分子，其含有下列序列或由下列序列組成(ⅰ)表2所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ⅱ)與(ⅰ)中的任一序列互補(bǔ)的序列；(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)中的序列編碼相同蛋白質(zhì)或多肽的序列；(ⅳ)與(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)中的任一序列基本上相同的序列；(ⅴ)編碼表2所定義蛋白質(zhì)的同系物，衍生物或片段的序列。
9．具有選自表1-3所示序列之序列的蛋白質(zhì)或多肽、或其同系物、衍生物和/或片段用作免疫原和/或抗原的用途。
10．免疫原性和/或抗原性的組合物，該組合物含有一種或多種具有選自表1-3所示序列之序列的蛋白質(zhì)或多肽或其同系物或衍生物、和/或它們中的任一個(gè)的片段。
11．權(quán)利要求10所述的免疫原性和/或抗原性組合物，該組合物是疫苗，或者可用于診斷試驗(yàn)。
12．權(quán)利要求11所述的疫苗，其含有一種或多種選自賦形劑、稀釋劑、佐劑等的其它組分。
13．疫苗組合物，其含有一種或多種如表1-3所定義的核酸序列。
14．一種檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與至少一種如表1-3所定義的蛋白質(zhì)或多肽或其同系物、衍生物或片段接觸的步驟。
15．一種抗體，所述抗體能與如表1-3所定義的蛋白質(zhì)或多肽或其同系物、衍生物或片段結(jié)合。
16．權(quán)利要求15所定義的抗體，所述抗體是單克隆抗體。
17．一種檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與至少一種如權(quán)利要求15或16所定義的抗體接觸的步驟。
18．檢測(cè)/診斷肺炎鏈球菌的方法，所述方法包括使受試樣品與至少一種如權(quán)利要求7或8所定義的核酸序列接觸的步驟。
19．一種測(cè)定如表1-3所定義的蛋白質(zhì)或多肽是否是潛在的抗微生物靶的方法，所述方法包括滅活所述蛋白質(zhì)或多肽并測(cè)定肺炎鏈球菌是否仍然存活。
20．能拮抗、抑制或要不然干擾如表1-3所定義的蛋白質(zhì)或多肽的功能或表達(dá)的藥劑用于制備藥物的用途，所述藥物可用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌感染。
全文摘要
本發(fā)明描述了新的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)以及編碼它們的核酸序列。還描述了它們?cè)谝呙绾秃Y選方法中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1318103SQ99810978
公開日2001年10月17日 申請(qǐng)日期1999年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月27日
發(fā)明者R·W·F·勒佩吉, J·M·威爾斯, S·B·漢尼福, P·M·漢斯布羅 申請(qǐng)人:微生物技術(shù)有限公司