殺蟲核酸和蛋白質(zhì)及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供展現(xiàn)出植物寄生線蟲和/或昆蟲控制特性的包含編碼某些殺蟲多肽的核苷酸分子的組合物，并且具體來說是針對(duì)控制已知感染作物植物物種的線蟲和昆蟲的植物寄生害蟲物種。本文公開了用于控制害蟲的方法，其中在標(biāo)靶植物害蟲的飲食中提供毒性蛋白。本發(fā)明還提供組合物如核酸、蛋白質(zhì)以及含有所述核酸和蛋白質(zhì)組合物的植物和細(xì)菌細(xì)胞、植物以及種子，以及用于識(shí)別、檢測(cè)以及分離本發(fā)明的組合物的方法和試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供由含有編碼本發(fā)明的殺蟲多肽的多核苷酸分子的重組種子產(chǎn)生作物的方法。
【專利說明】殺蟲核酸和蛋白質(zhì)及其用途
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求均2011年2月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/441，697和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/441，709的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]本申請(qǐng)所附的序列表包含在通過USPTO EFS-Web以電子方式并且與本申請(qǐng)的提交同時(shí)遞交的計(jì)算機(jī)可讀文件“38-21 (57560) SEQUENCE LISTING_ST25.txt”之內(nèi)。所述文件為105千字節(jié)(在MS-Windows中測(cè)量)、在2012年I月19日上創(chuàng)建并且以引用的方式并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及這樣的新穎多核苷酸和蛋白質(zhì)組合物:它們?cè)谠谥参镏斜磉_(dá)和或產(chǎn)生時(shí)賦予針對(duì)植物病原性線蟲和害蟲侵染的抗性。所述多核苷酸和蛋白質(zhì)可以在植物和細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，并且所述植物細(xì)胞可以再生成轉(zhuǎn)基因(重組)植物、植物組織、植物部分以及種子。源自于這類植物、植物材料以及種子的含有可檢測(cè)的量的這類多核苷酸和蛋白質(zhì)的組合物包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及用于控制作物植物的植物病原性線蟲和昆蟲害蟲的組合物和方法。
[0006]發(fā)明背景
[0007]日益增長(zhǎng)的人口將需要從量日益減少的可耕土地上的作物植物生產(chǎn)更多食物、食料以及纖維。已知若干種類型的昆蟲和線蟲會(huì)減小產(chǎn)自植物的作物的產(chǎn)量。植物害蟲損害植物部分，包括根、發(fā)育的花芽、花、葉、莖以及種子，這導(dǎo)致產(chǎn)量下降。
[0008]用于控制植物害 蟲的傳統(tǒng)方法使用化學(xué)控制劑和構(gòu)建作物與它們的野生型親緣物種之間的種間雜種來作為抗性種質(zhì)來源?；瘜W(xué)害蟲控制劑雖然是有效的，但具有若干缺點(diǎn)。許多化學(xué)控制劑的制造成本高，并且化學(xué)控制劑被表征為污染物，這是因?yàn)樗鼈冇捎趯?duì)微生物降解具有抗性而在環(huán)境中長(zhǎng)存?；瘜W(xué)控制劑要求農(nóng)務(wù)制劑，這對(duì)農(nóng)民而言由于暴露于化學(xué)劑制劑而增大了安全性風(fēng)險(xiǎn)。化學(xué)劑制劑必須每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)施用至少一次，并且經(jīng)常是多于一次，從而增大了與這些組合物相關(guān)的碳足跡。采用植物生物技術(shù)害蟲控制劑的方法和組合物也是用于例如通過使植物表達(dá)在被一種特定的標(biāo)靶害蟲攝入時(shí)通常對(duì)所述害蟲產(chǎn)生選擇性毒性的一種或多種害蟲控制劑來控制植物害蟲的有效手段。與化學(xué)劑不同，生物技術(shù)方法已被證實(shí)是環(huán)保的、在農(nóng)民使用時(shí)沒有安全性風(fēng)險(xiǎn)、并且在碳足跡影響和農(nóng)民利用的易用性方面是經(jīng)濟(jì)的。然而，僅有很少的用于控制這類害蟲的這類生物技術(shù)組合物和方法的實(shí)例，并且在控制植物病原性線蟲方面已顯示出功效的任何生物技術(shù)方法的任何實(shí)例甚至更少。因此，存在對(duì)這樣的新型組合物和方法的需求:這些組合物和方法是用于保護(hù)植物免受這種害蟲侵染，一般是出于維持并且增加產(chǎn)自這類組合物的作物的產(chǎn)量的目的，并且是用于持續(xù)并且提供食物、食料以及纖維以用于日益增加的人口。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本文提供多核苷酸分子，所述多核苷酸分子編碼如在以下各項(xiàng)中所示的示例性殺蟲多肽:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:22, SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQID NO:46,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60。特別是涵蓋這樣的多肽:所述多肽所具有的氨基酸序列與如在前述蛋白質(zhì)序列中的任一個(gè)中所示的殺蟲蛋白質(zhì)(多肽)序列展現(xiàn)出至少約45%至約99.9%的同一性(45與99.9之間的任何百分比)，并且展現(xiàn)出與這些序列中的任一個(gè)實(shí)質(zhì)上相當(dāng)?shù)?生物功能上相當(dāng)?shù)?殺蟲活性。展現(xiàn)出必要的殺蟲活性的這些多肽序列的片段意圖在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這類多核苷酸可以直接從宿主細(xì)胞提取和/或獲得或者通過各種合成手段來人工制備，并且在任一情況中皆被視為是重組多核苷酸。
[0011]本文提供含有編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列區(qū)段的多核苷酸，所述多核苷酸可以可操作地連接至啟始指定宿主細(xì)胞中的序列區(qū)表達(dá)的異源啟動(dòng)子，從而導(dǎo)致在所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生或制造殺蟲蛋白質(zhì)。所述啟動(dòng)子可以包括植物可表達(dá)的啟動(dòng)子、在一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌物種中起作用的啟動(dòng)子以及酵母功能性啟動(dòng)子或其組合。植物可表達(dá)的啟動(dòng)子可以包括本領(lǐng)域所已知的任何數(shù)量的啟動(dòng)子，包括但不限于玉米鹿糖合成酶I啟動(dòng)子、玉米醇去氫酶I啟動(dòng)子、玉米集光復(fù)合物啟動(dòng)子、玉米熱休克蛋白啟動(dòng)子、豌豆小亞基RuBP羧化酶啟動(dòng)子、Ti質(zhì)粒甘露堿合成酶啟動(dòng)子、Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶啟動(dòng)子、矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶啟動(dòng)子、豆富甘氨酸蛋白I啟動(dòng)子、馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白(patatin)啟動(dòng)子、凝集素啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、FMV啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子啟動(dòng)子以及S E9小亞基RuBP羧化酶啟動(dòng)子。
[0012]提供用作探針和/或引物的分離的多核苷酸區(qū)段，所述多核苷酸可以長(zhǎng)約20至約1000個(gè)連續(xù)核苷酸或者是在 20個(gè)與1000個(gè)之間的連續(xù)核苷酸的任何長(zhǎng)度，并且與如在以下各項(xiàng)中的任一個(gè)中所示的相同長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸或前述多核苷酸序列中的任一個(gè)的互補(bǔ)序列展現(xiàn)出至少約90%的同一性:SEQ ID NO:U SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ IDNO:19, SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:3U SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:5USEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61 以及 SEQ ID NO:63。
[0013]在本發(fā)明的另一方面，編碼上文所示的殺蟲多肽中的任一個(gè)的多核苷酸于重組表達(dá)盒中提供。所述表達(dá)盒可以提供于載體中以便用于復(fù)制、維持和轉(zhuǎn)移編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白質(zhì)的核酸組分。本發(fā)明的載體至少含有編碼如上文所示的多肽的序列區(qū)。載體包括質(zhì)粒、桿狀病毒、人工染色體、病毒體、粘粒、噬菌粒、噬菌體或病毒載體。
[0014]宿主細(xì)胞可以是任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，包括但不限于微生物細(xì)胞(微生物)，如土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)細(xì)菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞，如畢赤酵母或酵母菌物種酵母細(xì)胞；或植物細(xì)胞。以上描述的載體可以提供于轉(zhuǎn)基因微生物宿主細(xì)胞中。所述轉(zhuǎn)基因微生物宿主細(xì)胞包括原核或真核宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因原核宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞而轉(zhuǎn)基因真核宿主細(xì)胞是植物或真菌/酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞包括重組細(xì)菌，包括蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌、土壤桿菌、根瘤菌或假單胞菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物宿主細(xì)胞包括單子葉或雙子葉植物細(xì)胞并且可以包括來自下文所示的植物群(Group of Plants或Plant Group)的任何植物細(xì)胞。在微生物細(xì)胞是植物細(xì)胞的情況下，細(xì)胞可以獲得自選自由任何以下各項(xiàng)組成的組的任何植物、來自這樣一種植物的植物組織、植物部分或種子:包括但不限于大麥、豆子、青花菜、卷心菜、油菜(油菜籽)、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鷹嘴豆、大白菜、咖啡、玉米(包括甜玉米)、三葉草、棉花、葫蘆、黃瓜、落葉樹(包括但不限于香蕉樹、柑橘樹、桉樹、堅(jiān)果樹(包括但不限于山核桃木樹、長(zhǎng)山核桃樹和胡桃樹)、櫟樹(包括但不限于槲樹、針櫟樹和星毛櫟樹)、橄欖樹、棕櫚樹(包括椰子樹)、楊樹、香楓樹以及所有前述樹的根莖)、茄子、常青樹(包括但不限于花旗松)、亞麻、大蒜、葡萄、草(包括但不限于苜蓿、牧場(chǎng)草、柳枝稷和草坪草)、啤酒花、韭蔥、生菜、小米、甜瓜(包括但不限于香瓜、哈密瓜和西瓜)、燕麥、洋蔥、豌豆、花生、胡椒、木豆、松樹(包括火炬松、輻射松和南方松)、馬鈴薯、南瓜、蘿卜、水稻、黑麥、紅花、灌木、高粱、大豆、菠菜、筍瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、甘薯、茶葉、煙草、番茄、小黑麥或小麥。上述各項(xiàng)在本文中被稱為植物群(“Group of Plants”或“Plant Group”)。
[0015]重組植物、植物組織、植物部分或種子含有本發(fā)明的多核苷酸并且從這類多核苷酸表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。所述植物部分是葉子、莖花、萼片、果實(shí)、根或種子。還涵蓋產(chǎn)自本發(fā)明的重組植物的產(chǎn)品，并且所述產(chǎn)品可以包括以下各項(xiàng)中的至少任何一個(gè):重組植物的油、粉、棉絨以及種子。本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質(zhì)以可檢測(cè)的量存在于植物和植物產(chǎn)品 中，并且在作物領(lǐng)域中并且在本文提及的各種實(shí)施方案中至少適合用作用于追蹤貿(mào)易和商業(yè)過程中含有所述多核苷酸和蛋白質(zhì)的種子和植物組織的存在的標(biāo)記物。
[0016]本文提供在或從生物樣品中檢測(cè)出和/或分離編碼本發(fā)明的殺蟲多肽的多核苷酸分子的方法，其中所述方法的步驟包括:(i)選擇這樣一對(duì)寡核苷酸引物:它們當(dāng)在與含有所述多核苷酸的生物樣品一起用于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)產(chǎn)生編碼所有或代表性量的本發(fā)明的殺蟲多肽的擴(kuò)增子；(ii)從所述多核苷酸產(chǎn)生所述擴(kuò)增子；(iii)檢測(cè)和/或分離所述擴(kuò)增子；以及(iv)生成對(duì)應(yīng)于所述擴(kuò)增子的核苷酸序列信息以便識(shí)別和確認(rèn)編碼所有或代表性量的殺蟲多肽的多核苷酸分子的區(qū)段的存在(或不存在)?；蛘撸鰴z測(cè)和/或分離步驟可以通過以下方式來實(shí)行:提供源自于足夠長(zhǎng)度的編碼殺蟲多肽的DNA或RNA的多核苷酸探針，所述多核苷酸探針在特定的或在嚴(yán)格的雜交條件下與編碼本發(fā)明的殺蟲多肽的這種多核苷酸雜交。
[0017]本文提供控制或殺死標(biāo)靶鱗翅目害蟲、鞘翅目害蟲或植物病原性線蟲害蟲種群的方法，并且所述方法包括使所述害蟲種群與殺蟲有效量的如上文所示的多肽相接觸?！镑[翅目害蟲種群”包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、宿帶夜蛾(Mamestra configurata)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、苜猜綠夜蛾(Hypena scabra)、煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、黃地老虎(Agrotis subterranea)、一星粘蟲(Pseudaletia unipuncta)、灰地老虎(Agrotisorthogonia)、歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、胳澄螟蛾(Amyelois transitella)、玉米根草螟(Crambus caliginosellus)、稻切葉野螟(Herpetogramma Iicarsisalis)、向日葵飛蛾(Homoeosoma electellum)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellu)、蘋果蠹蛾(Cydia pomonella)、葡萄衆(zhòng)果蛾(Endopiza viteana)、梨小食心蟲(Grapholitamolesta)、向目葵卷葉蛾(Suleima helianthana)、小菜蛾(Plutella xylostella)、紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、東方蠻爐(Blattaorientalis)、亞洲蟑螂(Blatella asahinai)、德國(guó)蟑螂(Blattella germanica)、掠帶蟑螂(Supella 1ngipalpa)、美洲大蠊(Periplaneta americana)、褐斑大蠊(Periplaneta brunnea)、馬德拉蜚爐(Leucophaea maderae)、棉葉波紋夜蛾(Alabamaargillacea)、果樹黃卷蛾(Archips argyrospila)、玫瑰黃卷蛾(A.rosana)、二化螟(Chila suppressalis)、稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根草螟(Crambuscaliginosellus)、草螟(C.teterrellus)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、小鹿桿草螟(D.saccharalis)、棉斑實(shí)蛾(Earias insulana)、翠紋鉆夜蛾(E.vittella)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、玉米穗蛾(H.zea)、煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、稻切葉野螟(Herpetogramma Iicarsisalis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)、桔潛蛾(Phyllocnistis citrella)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、菜粉蝶(P.rapae)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜紋夜蛾(S.1itura)、草地貪夜蛾(S.frugiperda)、番煎斑潛蠅(Tuta absoluta) □ “鞘翅目害蟲種群”包括墨西哥棉鈴象(Anthonomus grandis)、稻水象ψ (Lissorhoptrus oryzophilu)、糧倉(cāng)玉米象(Sitophilus granaries)、米象(Sitophilusoryzae)、三葉草葉象(Hypera punctata)、玉米隱_象(Sphenophorus maidis)、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera)、北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)、斑點(diǎn)黃瓜甲蟲(Diabrotica undecimpunctatahowardi)、玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)、十字花科條跳甲(Phyllotretacruciferae)、葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea)、禮足負(fù)泥蟲(Oulema melanopus)、向日葵葉甲(Zygogramma exclamationis)、墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis)、日本金龜(Popillia japonica)、北方圓頭犀金龜(Cyclocephala boreali)、南方圓頭犀金龜(Cyclocephala immaculata)、歐洲金龜(Rhizotrogus majalis)、具毛觸角金龜(Phyllophaga crinita)、胡蘿卜金龜(Ligyrus gibbosus)、梳爪叩甲屬(Melanotusspp.)、寬胸叩頭蟲屬(Conoderus spp.)、金針蟲屬(Limonius spp.)、細(xì)胸扣甲屬(Agriotes spp.)、金針蟲屬(Ctenicera spp.)、Aeolus spp.、偽金針蟲屬(Eleodes spp)?！爸参锊≡跃€蟲種群”包 括大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)(大豆胞囊線蟲)、甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊線蟲)、禾谷胞囊線蟲(Heteroderaavenae)、馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)、馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)、玉米短體線蟲(Pratylenchus zeae)(根結(jié)線蟲)、爪卩圭根結(jié)線蟲(Meloidogynejavanica)、最短尾短體線蟲(Pratylenchus brachyurus)(根結(jié)線蟲)、北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)。
[0018]用于控制這類植物害蟲感染的一種替代方法包括將害蟲抑制量的本發(fā)明的殺蟲多肽提供給對(duì)所述多肽敏感的害蟲，從而控制所述害蟲。所述害蟲是昆蟲或線蟲。所述昆蟲可以是在分類學(xué)目?jī)?nèi)的任何昆蟲，包括鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目或毛翅目(下文中是“昆蟲目”)。線蟲可以來自被稱為以下的任何線蟲屬:標(biāo)槍屬(Acontylus)、粒屬(Anguina)、
【權(quán)利要求】
1.一種編碼殺蟲多肽的多核苷酸分子， a)其中所述殺蟲多肽任選地選自由以下各項(xiàng)組成的組: i)具有如在以下各項(xiàng)中的任一個(gè)中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì):SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ； ?)展現(xiàn)出與如在以下各項(xiàng)中的任一個(gè)中所示的氨基酸序列約45%至約99.9%相同的氨基酸區(qū)段的蛋白質(zhì):SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ IDNO:60 ;或 iii)展現(xiàn)出與如在i)或ii)中所示的所述蛋白質(zhì)的殺蟲活性實(shí)質(zhì)上相當(dāng)?shù)?生物功能上相當(dāng)?shù)?殺蟲活性的如在i)或ii)中所示的所述蛋白質(zhì)的片段； b)其中所述多核苷酸分子提供于重組表達(dá)盒中； c)其中所述多核苷酸分子提供于轉(zhuǎn)基因或重組宿主細(xì)胞中； i)其中所述宿主細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的組:土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhi zobium)以及植物細(xì)胞； ii)其中所述植物細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的組:苜蓿、香蕉、大麥、豆子、青花菜、卷心菜、油菜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鷹嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三葉草、棉花、葫蘆、黃瓜、花旗松、茄子、桉樹、亞麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭蔥、生菜、火炬松、小米、甜瓜、堅(jiān)果、燕麥、橄欖、洋蔥、觀賞植物、棕櫚、牧場(chǎng)草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松樹、馬鈴薯、白楊、南瓜、輻射松、蘿卜、油菜籽、水稻、根莖、黑麥、紅花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、筍瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香楓、甘薯、柳枝稷、茶葉、煙草、番茄、小黑麥、草坪草、西瓜以及小麥植物細(xì)胞； d)其中所述核苷酸分子提供于選自在c)i)中所示的組的重組植物中；并且 e)其中所述多核苷酸分子存在于重組植物的一部分中，所述植物部分選自由以下各項(xiàng)組成的組:葉子、莖花、萼片、果實(shí)、根或種子；并且 i)其中由所述重組植物產(chǎn)生產(chǎn)品，并且所述產(chǎn)品包 含可檢測(cè)的量的所述多核苷酸分子，所述產(chǎn)品選自 由以下各項(xiàng)組成的組:油、粉、棉絨以及種子。
2.一種殺蟲多肽: a)選自由以下各項(xiàng)組成的組:SEQID N0:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:.14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38, SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及SEQ ID NO:60 ； b)具有與在以下各項(xiàng)中所示的任一蛋白質(zhì)展現(xiàn)出約45%至約99.9%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQID NO:46, SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ;并且 c)展現(xiàn)出與如在a)或b)中所示的所述多肽實(shí)質(zhì)上相當(dāng)?shù)?生物功能上相當(dāng)?shù)?殺蟲活性的如在a)和b)中所示的所述多肽的殺蟲片段。
3.—種控制植物的殺蟲感染的方法，所述方法任選地包括提供殺蟲多肽，所述殺蟲多肽: a)選自由以下各項(xiàng)組成的組:SEQID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:.14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38, SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及SEQ ID NO:60 ； b)具有與在以下各項(xiàng)中所示的任一蛋白質(zhì)展現(xiàn)出約45%至約99.9%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ； c)展現(xiàn)出與如在a)或b)中所示的所述多肽實(shí)質(zhì)上相當(dāng)?shù)?生物功能上相當(dāng)?shù)?殺蟲活性的如在a)和b)中所示的所述多肽的殺蟲片段； d)如在a)、b)或c)中任一項(xiàng)中所示的被提供給對(duì)所述多肽敏感的害蟲，從而控制所述害蟲； e)以殺蟲有效量被提供 給對(duì)所述殺蟲多肽敏感的植物害蟲，從而控制所述害蟲； 其中所述害蟲是昆蟲或線蟲； 其中所述昆蟲選自由以下任何昆蟲目組成的組:鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、纟嬰翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風(fēng)目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)以及毛翅目(Trichoptera)； 其中所述線蟲是選自由以下各項(xiàng)組成的組的線蟲:標(biāo)槍屬(Acontylus)、粒屬(Anguina)、劍咽屬(Aorolaimus)、無側(cè)尾腺口屬(Aphasmatylenchus)、滑刃屬(Aphelenchoides)、真滑刃屬(Aphelenchus)、Atalodera、叢墊刃屬(Atylenchus)、培克屬(Bakernema)、刺屬(Belonolaimus)、短維屬(Brachydorus)、傘滑刃屬(Bursaphelenchus)、壞死屬(Cacopaurus)、卡盧斯屬(Caloosia)、桿矛屬(Carphodorus)、環(huán)屬(Criconema)、小環(huán)屬(Criconemella)、隱皮屬(Cryphodera)、莖屬(Ditylenchus)、維屬(Dolichodorus)、Eutylenchus、球胞囊屬(Globodera)、細(xì)小屬(Gracilacus)、螺旋屬(Helicotylenchus)、半輪屬(Hemicriconemoides)、鞘屬(Hemicycliophora)、胞囊屬(Heterodera)、潛根屬(Hirschmanniella) > Histotylenchus> M (Hoplolaimus)、Hoplotylus、長(zhǎng)針屬(Longidorus)、巨針屬(Macrotrophurus)、擬根結(jié)屬(Meloidodera)、根結(jié)屬(Meloidogyne)、默林屬(Merlinius)、桑咽屬 Morulaimus)、珍珠屬(Nacobbus)、偽粒屬(Nothanguina)、偽墊刃屬(Nothotylenchus)、擬長(zhǎng)針屬(Paralongidorus)、擬毛刺屬(Paratrichodorus)、擬尾屬(Paratrophurus)、擬墊刃屬 Paratylenchus)、盾移棲屬(Peltamigratus)、擬短體屬(Pratylenchoides)、短體屬(Pratylenchus)、平滑墊刃屬(Psilenchus)、擬穿孔屬(Radopholoides)、穿孔屬(Radopholus)、細(xì)桿滑刃屬(Rhadinaphelenchus)、盤旋屬(Rototylenchus)、擬盤旋屬(Rotylenchoides)、盤旋屬(Rotylenchus)、長(zhǎng)矛胞囊屬(Sarisodera)、盾屬(Scutellonema)、球?qū)?Sphaeronema)、亞粒屬(Subanguina)、擬端墊刃屬(Telotylenchoides)、端墊刃屬(Telotylenchus)、刺墊刃屬(Trichotylenchus)、胖線屬(Trophonema)、營(yíng)養(yǎng)小墊刃屬(Trophotylenculus)、大尾屬(Trophurus)、矮化屬(Tylenchorhynchus)、半穿刺屬(Tylenchulus)、墊刃屬(Tylenchus)、Tylodorus、劍屬(Xiphinema)以及接合墊刃屬(Zygotylenchus)線蟲； 其中所述殺蟲有效量的所述殺蟲多肽提供于所述害蟲的飲食中； 其中所述殺蟲有效量的所述殺蟲多肽提供于重組植物、植物部分或所述植物或植物部分的產(chǎn)品中； 其中所述殺蟲有效量的所述殺蟲多肽以局部制劑的形式提供給植物、植物部分或種子，并且所述制劑包括包含所述多肽的細(xì)菌細(xì)胞、孢子或伴孢晶體；并且 其中所述細(xì)菌細(xì)胞、孢子或伴孢晶體是自芽孢桿菌物種獲得。
4.一種方法，其: a)檢測(cè)生物樣品中編碼殺蟲蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述殺蟲蛋白質(zhì)具有與在以下各項(xiàng)中所示的任一蛋白質(zhì)展現(xiàn)出約45%至約99.9%氨基酸序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:.2,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:.26,SEQ ID NO: 30,SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:.50、SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62 以及 SEQ ID N0:64 其中所述方法包括以下步驟: i)選擇這樣一對(duì)引物:當(dāng)與所述多核苷酸一起用于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，它們形成編碼所述殺蟲蛋白質(zhì)的所有或殺蟲有效的部分的擴(kuò)增子； ii)從所述多核苷酸產(chǎn)生所述擴(kuò)增子； iii)檢測(cè)所述擴(kuò)增子；以及 iv)從所述擴(kuò)增子生成DNA序列信息以便確認(rèn)所述殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列同一性； b)檢測(cè)生物樣品中選自由以下各項(xiàng)組成的組的殺蟲蛋白質(zhì):SEQID NO:2,SEQ ID NO:.6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQID NO:54, SEQ ID NO:58以及SEQ ID NO:60，所述方法包括以下步驟: i)使所述樣品與特異性結(jié)合所述殺蟲蛋白質(zhì)或源自于其的肽或表位的抗體相接觸；以及 ii)檢測(cè)所述抗體與所述殺蟲蛋白質(zhì)、源自于其的肽或表位的結(jié)合；以及 c)從包含編碼所述殺蟲蛋白質(zhì)的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因種子產(chǎn)生作物，所述殺蟲蛋白質(zhì)選自由以下各項(xiàng)組成的組: i)選自由以下各項(xiàng)組成的組的序列中的任一個(gè):SEQID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:10,SEQID NO: 14,S EQ ID NO: 18,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ； ii)具有與在選自由以下各項(xiàng)組成的組的序列中的任一個(gè)中所示的氨基酸序列展現(xiàn)出約45%至約99.9%同一性的氨基酸序列的殺蟲蛋白質(zhì):SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQID NO:10, SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO: 42,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:，54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ；以及 iii)在a)和b)中所示的任何蛋白質(zhì)的殺蟲片段； 其中所述方法進(jìn)一步包括以下步驟: A)種植所述種子； B)從由所述種子生長(zhǎng)出的植物產(chǎn)生作物；以及 O收獲所述作物；并且 其中至少約50%的所述作物種子包含所述多核苷酸。
5.一種對(duì)線蟲和/或鱗翅目昆蟲侵染具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、種子或植物部分，其包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
6.一種商品產(chǎn)品(或生物樣品)，其包含如權(quán)利要求5所述的植物、種子或植物部分，并且進(jìn)一步任選地包含可檢測(cè)的量的: a)包含在以下各項(xiàng)中的任一個(gè)中所示的蛋白質(zhì)的氨基酸組成的多肽:SEQID NO:2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ;或 b)編碼以下各項(xiàng)的多肽中的任一個(gè)的多核苷酸:SEQID NO:2, SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14、SE Q ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ； 其中對(duì)所述商品(或生物樣品)中的a)的所述多肽或b)的所述多核苷酸的檢測(cè)確定了所述商品(或生物樣品)中所述轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、種子或植物部分的存在。
7.一種從包含任選地編碼以下各項(xiàng)的多核苷酸分子的種子產(chǎn)生作物的方法: a)展現(xiàn)出選自由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列的殺蟲多肽:SEQID NO:2, SEQ IDNO:6,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQID NO:54, SEQ ID NO:58 以及 SEQ ID NO:60 ； b)具有與選自由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列展現(xiàn)出至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的殺蟲多肽:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 14,SEQID NO:18, SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58 以及 SEQ IDNO:60 ;或 c)(a)或(b)的所述多肽的殺蟲片段； 其中所述方法包括以下步驟:種植所述種子；從由所述種子生長(zhǎng)出的植物產(chǎn)生作物；以及收獲所述作物；并且 其中至少約50%的所述作物包含含有所述多核苷酸分子的種子。
8.一種組合物，其在農(nóng)業(yè)上可接受的載劑中包含如權(quán)利要求2所述的殺蟲多肽，并且進(jìn)一步包含重組蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞提取物、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞勻漿、細(xì)胞溶胞物、細(xì)胞上清液、細(xì)胞濾液或細(xì)胞集結(jié)粒；其中所述組合物包含害蟲抑制量的所述多肽并且被配制為粉末、粉劑、球粒、顆粒、噴霧、乳液、膠體或溶液； 其中所述組合物是通過對(duì)包含所述多肽的重組蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、冷凍干燥、均質(zhì)化、提取、過濾、離心、沉降或濃縮來制備的，并且所述組合物包含約I重量％至約99重量％的所述多肽。
9.如權(quán)利要求6所述的商品產(chǎn)品(或生物樣品)，其中可檢測(cè)到所述多肽的水平為至少約(i)每一百份這種商品產(chǎn)品(或生物樣品)含一份或(ii)每克鮮重的這種商品產(chǎn)品(或生物樣品)含一納克。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103763916SQ201280008644
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月11日
【發(fā)明者】D·J·鮑恩, G·J·邦克斯, C·查伊, J·W·皮特金, T·J·賴德爾, E·J·斯特曼, U·R·蘇庫魯, B·范斯科約克, S·弗拉辛斯基 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司