專利名稱：體重調(diào)控物,相應(yīng)的核酸和蛋白質(zhì),及其診斷和治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及哺乳動物體重的控制，包括動物和人類的體重的控制，更具體 地說，涉及在此被鑒定為體重調(diào)控物的物質(zhì)及其在診斷和治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肥胖癥，其定義為相對無脂肪身體物質(zhì)來說體內(nèi)脂肪過多，與重要的精神和醫(yī)學(xué) 疾患相聯(lián)系，后者包括高血壓、血脂升高和II型或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。美國有 六百萬到一千萬人患有NIDDM，包括18%的65歲人口 [Harris等人，國際肥胖雜志(Int. J. Obes.) 11 :275-283(1987)]。約45%男性和70%女性NIDDM患者肥胖，減輕體重會顯著 改善或消除他們的糖尿病[Harris，糖尿病護(hù)理，14 (3) :639_648 (1991)]。如下所述，肥胖 癥和NIDDM明顯地遺傳，盡管相關(guān)基因尚未被確定。這種代謝相關(guān)病癥的分子遺傳基礎(chǔ)是 一個重要但知之甚少的問題。養(yǎng)料能量的吸收、貯藏和利用構(gòu)成一個對后生動物生存起決定作用的復(fù)雜自穩(wěn)態(tài) (homeostatic)系統(tǒng)。陸生動物在脂肪組織中貯存大量代謝燃料如甘油三酯，這對于在食物 匱乏期存活至關(guān)重要。維持一定水平的能量儲備但又不能持續(xù)改變生物體的大小和形狀， 這就需要在能量攝入和消耗之間達(dá)到平衡。然而，調(diào)節(jié)能量平衡的分子機(jī)制仍待闡明。分 離出傳導(dǎo)營養(yǎng)信息和調(diào)控能量平衡的分子對于理解健康與疾病條件下體重調(diào)節(jié)至關(guān)重要。個體的肥胖水平在很大程度上由遺傳決定。檢查同卵或異卵雙胞胎或受領(lǐng)養(yǎng) 者與其親生父母的體重與肥胖癥的相關(guān)率[concordancerate]，表明肥胖癥的遺傳性 (0. 4-0. 8)超過許多其它通常被認(rèn)為具有實(shí)在的遺傳成分的性狀，如精神分裂癥，酗酒和動 脈硬化[stunkard 等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N. Engl. J. Med.) 322 1483-1487 (1990)]。能 量消耗率的家系相似性也見于報(bào)道[Bogardus等人，糖尿病(Diabetes) 35 :1_5(1986)]。地 理隔離人群的遺傳分析顯示可能是相對少數(shù)基因決定著身體組份差別的30-50% [Moll等 人，美國人類遺傳學(xué)雜志[Am. J. Hum. Genet. ]49 1243-1255 (1991)]。然而，尚未有在普通 人群中作為肥胖癥病因的基因被遺傳定位于確定的染色體位置。肥胖癥的嚙齒類模型包括七個明顯的單基因突變。研究得最多的小鼠肥胖癥突 變是ob(肥胖)和db(糖尿病)基因。當(dāng)處于相同的遺傳品系背景時，ob和db的代謝和 行為表型不可區(qū)分，表明這些基因可能通過相同生理途徑起作用[Coleman等人，糖尿病學(xué) (Diabefologia)，14 141-148 (1978)]。每一種突變的純合小鼠都貪食并且代謝旺盛，出生 一月后即導(dǎo)致可見的肥胖表型。這些動物的體重趨向穩(wěn)定在60-70克(與對照小鼠的30-35 克相比)。ob和db動物表現(xiàn)許多其他的激素和代謝變化，故難以鑒定造成突變的主要缺陷 [Bray 等人，美國臨床營養(yǎng)雜志(Am. J. Clin. Nutr. ]，50 891-902 (1989)]。每種嚙齒類肥胖癥模型均伴有糖代謝的變化，與人的II型糖尿病類似。在某些 病例中，糖尿病嚴(yán)重程度部分依賴于背景小鼠系[Leifer，內(nèi)分泌學(xué)[Endocrinology] 124 912-922(1989)]。對于ob和db，同類系的C57BL/Ks小鼠患嚴(yán)重的糖尿病，最終β細(xì)胞壞死，胰島萎縮，造成相對的胰島素減少(insulinopenia)。相反，同類系的C57BL/6J ob和 db小鼠患暫時性胰島素抗性糖尿病，最終由β細(xì)胞肥大補(bǔ)償，這類似于人類II型糖尿病。除了患糖尿病，在其它方面ob和db小鼠的表型也類似于人類肥胖癥-突變小鼠 比瘦對照吃得多而且能量消耗少(正如胖人)。該表型與腹側(cè)正中下丘腦損傷的動物的表 型也很相似，表明兩種突變可能擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正常整合并響應(yīng)營養(yǎng)信息的能力。該 假說的支持證據(jù)來自神經(jīng)興奮的暫時抑制(parabiosis)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[Coleman，糖尿病學(xué)， 9 294-298 (1973)]，該結(jié)果表明ob小鼠缺乏一種循環(huán)飽足因子而db小鼠對ob因子的作用 有抗性(可能由于ob受體缺陷〕。由這些實(shí)驗(yàn)導(dǎo)出如下結(jié)論這些突變小鼠的肥胖癥可能 是由于假設(shè)的控制身體組份的反饋機(jī)制的傳入循環(huán)和/或整合中心的不同缺陷。利用分子和經(jīng)典遺傳標(biāo)記已將ob和db基因分別定位于近染色體6和中染色 體 4 [Bahary 等人，美國國家科學(xué)院刊[Proc. Nat. Acad. Sci. USA]，87 :8642_8646 (1990)； Friedman等人，Genomics, 11 1054-1062 (1991)]。兩種情況下，突變均定位于小鼠基因組 上與人類同模(syntenic with)的區(qū)域，表明若人類有ob和db同源物，它們可能分別定位 于人類染色體7q和lq。db基因的缺陷可能導(dǎo)致其它哺乳動物種的肥胖癥，在Zucker fa/ fa大鼠和棕色挪威[Brown Norway]+/+大鼠的遺傳雜交中，fa突變(大鼠染色體5)被在小 鼠中包圍db的相同座位包圍[Truett等人，美國國家科學(xué)院院刊，88 =7806-7809 (1991)]。由于許多因子似乎都影響體重，尚不可能預(yù)知體重主要取決于哪種因子，或更具 體地說，哪種自穩(wěn)定機(jī)制。因此，本發(fā)明的首要問題是提供體重調(diào)控因子，它能控制肥胖癥 和哺乳動物的脂肪含量。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，通過提供此處公開的肥胖癥(OB)多肽和編碼這些多肽的核酸分子， 解決動物，特別是哺乳動物的肥胖癥和脂肪含量的控制問題。本發(fā)明首次提供了用于調(diào)控， 即控制和調(diào)節(jié)體重和肥胖癥的分離到的多肽，以及編碼這些多肽的核酸序列，這些核酸序 列不僅能重組產(chǎn)生OB多肽，其本身也可用于體重調(diào)控。本發(fā)明的肥胖癥(OB)多肽有約145到約167個氨基酸，能調(diào)控動物，尤其是哺乳 動物的體重，并包括等位變異體或類似物及其具有相同生物活性的片段。可用重組法或化 學(xué)合成法制備這些多肽。此處優(yōu)選的OB多肽包括具有SEQ ID N0:2、4、5或6的氨基酸序 列的多肽或等位變異體或類似物，包括其片段。本發(fā)明的OB多肽的免疫原性片段包括=Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp -Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQ ID NO 18) ；Leu-His-Pro-IIe-Leu-Ser-Leu-Ser-Ly s-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala(SEQ ID NO: 19) ；Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-S er-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO 20)；和Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Se r-Leu-Gln-Asp-IIe-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys(SEQ ID NO :21)。人類OB多肽類似物包括具有SEQ ID NO :4和6的人類氨基酸序列的多肽，其中氨 基酸 53,56,71,85,89,92,95,98,110，118，121，122，126，127，128，129，132，139，157，159， 163和166 UfSSEQ ID NO :4的編號)的一個或多個被其它氨基酸替換，例如SEQ ID N0: 2給出的小鼠OB多肽的趨異(divergent)氨基酸，或丙氨酸。這種類似物還包括那些多肽， 其中(a) 53位的絲氨酸殘基被甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或蘇氨酸替換； (b) 98位的絲氨酸殘基被甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或蘇氨酸替換；(c) 92
10位的精氨酸殘基被天冬酰胺、賴氨酸、組氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 蛋氨酸或半胱氨酸替換。本發(fā)明的OB多肽類似物優(yōu)選地與SEQ ID N0:2、4、5或6給出的 人類OB多肽氨基酸序列有不小于百分之八十三的氨基酸序列同源性。本發(fā)明的另一些人類OB多肽類似物具有SEQ ID NO :4和6的氨基酸序列并且 (a) 一個或多個天冬氨酸殘基被谷氨酸替換；(b) 一個或多個異亮氨酸殘基被亮氨酸替換； (c) 一個或多個甘氨酸或纈氨酸殘基被丙氨酸替換；(d) 一個或多個精氨酸殘基被組氨酸 替換；(e) 一個或多個酪氨酸或苯丙氨酸殘基被色氨酸替換；(f) 121到128殘基的(對應(yīng) SEQ ID NO 4的編號)一個或多個被甘氨酸或丙氨酸替換；以及(g)54到60位或118到 166位(對應(yīng)SEQ ID NO :4的編號的一個或多個殘基被賴氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或脯氨酸 替換。本發(fā)明優(yōu)選的人類OB多肽截短類似物包括這樣一些，其中(對應(yīng)SEQ ID NO 4 的編號)(a) 121位到128位的一個或多個殘基缺失；(b)殘基1-116缺失；(c)殘基1_21 和54到167缺失；(d)殘基1-60和117到167缺失；(e)殘基1-60缺失；(f)殘基1-53 缺失；以及(g)次部分(subpart) (a)的類似物，其中殘基1_21缺失。缺少21個氨基酸的 “信號”序列(例如SEQ ID NO 4的氨基酸1到21)的本發(fā)明的OB多肽和ob多肽類似物可 以具有N末端氨基酸或氨基酸序列，諸如(1)蛋氨酸，(2)甘氨酸-絲氨酸-組氨酸-蛋氨 酸序列(SEQ ID NO 38)，(3)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精 氨酸_甘氨酸_絲氨酸_組氨酸_蛋氨酸序列(SEQ ID NO 98)，(4)亮氨酸-谷氨酸-賴 氨酸_精氨酸_谷氨酸_丙氨酸_谷氨酸_丙氨酸序列(SEQ ID NO 26)，(5)谷氨酸-丙 氨酸_谷氨酸_丙氨酸序列(SEQ ID NO 27)，(6)亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸序列 (SEQID NO 28) ； (7)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘 氨酸-絲氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID NO 99)和(8)甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸序列。本發(fā)明的OB多肽衍生物有一個或多個連于其上的化學(xué)基元(moiety)，包括水溶 性聚合物如聚乙二醇。聚乙二醇衍生得到的衍生物可以是單、雙、三或四聚乙二醇化的，例 如N末端單聚乙二醇化的。本發(fā)明的ob多肽的優(yōu)選N末端單聚乙二醇化衍生物包括含有 SEQID NO 4的氨基酸殘基22到167或SEQ ID NO 6的殘基22到166的OB多肽，可選地 在21位有一個(聚乙二醇化)蛋氨酸。如上述，本發(fā)明提供的分離的核酸分子編碼OB多肽、等位變異體或類似物，包括 片段。特別提供的是用于保證OB多肽表達(dá)的DNA分子，該OB多肽在哺乳動物中有調(diào)控體 重的活性，所述DNA分子選自(a)SEQ ID NO 1和3給出的DNA分子或其片段；(b)與(a) 中定義的DNA分子雜交的DNA分子或其可雜交片段；和(c)編碼能表達(dá)上述任一 DNA分子 編碼的氨基酸序列的DNA分子。這種分子的示例是SEQ ID NO 22和24的人類基因組DNA 分子。本發(fā)明的優(yōu)選DNA分子編碼含有下列的氨基酸序列的多肽，(a)SEQ ID NO 2 ； (b) SEQ ID NO 2 的氨基酸 22 到 167 ； (c) SEQ IDNO 4 ； (d) SEQ ID NO 4 的氨基酸 22 到 167 ； (e)SEQ ID NO 5 ； (f) SEQ ID NO 5 的氨基酸 22 到 166 ；禾口 (g) SEQ ID NO 6 ；禾口 (h) SEQ ID NO 6的氨基酸22到166，以及具有前述N末端氨基酸或氨基酸序列的多肽。作為說明，優(yōu)選的DNA分子具有SEQ ID NO :3的蛋白質(zhì)編碼序列對應(yīng)的序列，具體地說，具有編碼氨基酸 22到167的序列對應(yīng)的序列。本發(fā)明還提供了可與本發(fā)明的DNA分子雜交的檢測標(biāo)記的核酸分子，包括可與OB 核酸非編碼區(qū)雜交的核酸分子，該非編碼區(qū)選自內(nèi)含子、5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)。本發(fā) 明還提供用于擴(kuò)增編碼ob多肽的人類基因組DNA的寡聚核苷酸引物，諸如SEQ ID NO 29 到32給出的寡聚核苷酸。本發(fā)明提供的載體包含本發(fā)明的上述DNA分子并優(yōu)選地具有表達(dá)載體的形式，該 表達(dá)載體含有經(jīng)操作連接表達(dá)控制序列的DNA分子。本發(fā)明的單細(xì)胞宿主細(xì)胞用本發(fā)明的 DNA分子或上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì) 胞、昆蟲細(xì)胞及組織培養(yǎng)的人類細(xì)胞。作為說明，這種宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、假單胞菌、芽 孢桿菌、鏈霉菌、酵母、CH0、R1. 1、B-W、L-M、C0S1、D0S7、BSC1、BSC40、BMT10 和 Sf9 細(xì)胞。此 處優(yōu)選的酵母宿主包括啤酒酵母、畢赤氏酵母、假絲酵母、漢遜氏酵母、球擬酵母。還提供了 哺乳動物細(xì)胞，它含有ob多肽編碼DNA序列，并經(jīng)體外修飾，利用包括將表達(dá)調(diào)節(jié)序列插到 ob多肽編碼序列有功能的近處的同源重組事件使ob多肽更多地表達(dá)。表達(dá)調(diào)節(jié)序列可以 是ob多肽表達(dá)，也可以不是，并能替代細(xì)胞中突變的ob多肽調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明提供的制備ob多肽的方法包括(a)如上述在利于ob多肽表達(dá)的條件下 培養(yǎng)細(xì)胞；和(b)回收表達(dá)的ob多肽。該操作方法也可伴有下述步驟(c)在Ni螯合柱上 層析多肽；和(d)凝膠過濾純化多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在(c)步之后(d)步之前，該方 法包括在強(qiáng)陽離子交換柱上層析ob多肽。本發(fā)明還提供對本發(fā)明的Ob多肽有特異性的標(biāo)記的及未標(biāo)記的單克隆和多克隆 抗體以及生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的不死細(xì)胞系。本發(fā)明的抗體制備方法包括(a)將ob 多肽結(jié)合到載體蛋白上；(b)用(a)步的OB多肽片段-載體蛋白結(jié)合物與佐劑混合，免疫 宿主動物；(c)由免疫的宿主動物獲取抗體。本發(fā)明提供用于測量樣本中OB多肽存在的方法，包括(a)在能夠形成包含抗體 和OB多肽的反應(yīng)復(fù)合物的條件下將懷疑含有OB多肽的樣本與特異性結(jié)合OB多肽的抗體 (優(yōu)選地結(jié)合在固體支持物上)接觸；(b)檢測樣本中含有抗體和OB多肽的反應(yīng)復(fù)合物的 形成，其中檢測到反應(yīng)復(fù)合物的形成意味著樣本中存在OB多肽。相應(yīng)地提供用于評價生物 樣本中反應(yīng)復(fù)合物形成的體外方法，包括(a)用上述方法檢測生物樣本中反應(yīng)復(fù)合物的 形成；和(b)評價形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，該反應(yīng)復(fù)合物的量對應(yīng)于生物樣本中OB多肽的 水平。當(dāng)檢測或診斷與本發(fā)明的OB多肽水平升降相聯(lián)系的疾病的存在時，做上述評價，將 檢測到的水平與正常受試者或受試者早些時候的OB多肽水平相比較。與正?；蛳惹八?相比OB多肽水平升高顯示與OB多肽水平上升相聯(lián)系的疾病，而與正常水平相比OB多肽水 平下降顯示與OB多肽水平下降相聯(lián)系的疾病。相應(yīng)地提供了用于對與哺乳動物中的OB多 肽水平上升或下降顯示與OB多肽水平下降相聯(lián)系的疾病的治療的體外方法，包括如上述 的評價從接受這種治療的哺乳動物受試者在不同時間點(diǎn)取得的一系列生物樣本中OB多肽 水平。本發(fā)明的藥物組合物包括上述OB多肽及藥用載體，可用于減輕動物體重的治療 中。本發(fā)明的另一些用于增加動物體重的治療方法的藥物組合物包括OB多肽的拮抗物，優(yōu) 選地選自結(jié)合并中和OB多肽活性的抗體，結(jié)合但不激活OB多肽受體的OB多肽片段以及OB多肽的小分子拮抗物。本發(fā)明還提供相應(yīng)地用于增加或減輕個體體重的改善體形的美容組 合物，這些組合物可用于改善個體體形的美容方法。這種美容組合物以適當(dāng)劑量對個體給 藥，足以將個體的體重調(diào)控到需要的水平。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子的應(yīng)用，以及可與編碼本發(fā)明的OB多肽的核酸 雜交的反義核酸分子，以生產(chǎn)可改變動物體重(例如基因療法)的藥品。還提供了本發(fā)明 的OB多肽或拮抗劑在生產(chǎn)用于改變動物體重的藥品上的應(yīng)用。該藥品可用來改變哺乳動 物的體重以治療糖尿病、高血壓和高膽固醇等病癥以及作為與治療該類疾病的藥品的組合 療法的一部分。此類藥品可用于如下治療方法，包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、 鼻腔、口腔或肺部給藥系統(tǒng)。這里給出的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的OB多肽主要由哺乳動物脂肪細(xì)胞分泌并且該多肽 起激素作用。這里的實(shí)施例表明OB多肽，此處又稱“瘠素(1印tin) ”，在大鼠、小鼠和人類血漿 中循環(huán)。瘠素不存在于ob/ob小鼠的血漿，以十倍高的濃度存在于db/db小鼠，以二十倍高 的濃度存在于fa/fa大鼠。最顯著的是，每日注射重組瘠素能顯著減輕ob/ob小鼠的身體 重量，明顯影響野生型小鼠的體重，對db/db小鼠無作用。另一方面，一個物種的Ob多肽在另一物種中具有生物活性。特別地，人的OB多肽 在小鼠中有活性。首先，本發(fā)明的調(diào)控物含有核酸分子，包括重組DNA分子(例如cDNA或包含cDNA 的載體或分離的基因組DNA)或克隆的基因(即分離的基因組DNA)，或其簡并變異體，它 們編碼本身作為此后定義的體重控制調(diào)控物的多肽，或保守的變異體或其片段，特別地這 類片段缺少信號肽(此處又稱成熟的OB多肽)，這些多肽具有圖IA至E(SEQID NO 2)，圖 3 (SEQ ID NO 4)，圖5 (SEQ ID NO 5)和圖6(SEQID NO 6)給出的氨基酸序列。在特定的 實(shí)施方案中，提供了鼠類和人類ob多肽的兩個變異體的氨基酸序列。兩種多肽均以谷酰胺 49缺失形式存在，這可能是由于mRNA拼接異常。不同物種的OB多肽可能高度同源，如圖4 所示，鼠類和人類OB多肽的同源性超過80%。這些核酸分子、重組DNA分子或克隆基因可能具有圖IA至E(SEQ ID NO 1)和圖 2A和B(SEQ ID NO :3)給出的核苷酸序列或與它們給出的DNA編碼序列互補(bǔ)。特別地，這 種DNA分子可能是cDNA或分離自染色體的基因組DNA。本發(fā)明的核酸分子也可能對應(yīng)DNA 的5'和3'兩側(cè)序列和內(nèi)含子DNA序列。相應(yīng)地，本發(fā)明也涉及一種核酸的鑒定，該核酸 具有選自圖IA至E (SEQ ID NO 1)和此處的圖2A和B (SEQ ID NO :3)，以及簡并變異體、等 位變異及相似同源分子的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸分子可以是DNA或RNA，包括其具有磷酸鍵或磷酸類似物鍵，例如硫 代磷酸鍵的合成變異體。單鏈和雙鏈序列均為本發(fā)明所需。本發(fā)明進(jìn)一步提供用作分子探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的引物的核酸分 子，即合成的或天然的寡聚核苷酸，其序列對應(yīng)于圖IA至E(SEQ ID N0:1)，圖2A和B(SEQ ID NO 3)和圖20A至C(SEQ ID NO 22和24)給出的序列的一部分；或是編碼序列的5' 和3'兩側(cè)序列；或基因組DNA的內(nèi)含子序列。特別地，本發(fā)明需要具有至少約10個核苷 酸的核酸分子，其中該核酸分子的一段序列對應(yīng)于圖IA至E(SEQ ID N0:1)、圖2A和B(SEQ ID NO 3)和圖20A至C(SEQ ID NO 22)的核苷酸序列中有相同數(shù)目核苷酸的核苷酸序列，
13或是與之互補(bǔ)的序列。更優(yōu)選地，該核酸序列有至少20個核苷酸。在本發(fā)明的一個實(shí)施方 案中，該寡聚核苷酸是探針，并作了檢測標(biāo)記，例如用放射性核素(諸如32P)或酶標(biāo)記。另一方面，本發(fā)明提供一種克隆載體，它含有編碼Ob多肽的本發(fā)明的核酸，和一 種細(xì)菌、昆蟲或哺乳動物表達(dá)載體，它含有編碼ob多肽的本發(fā)明的核酸分子，其經(jīng)操作連 接表達(dá)控制序列。相應(yīng)地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種宿主細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲 細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，其被適當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并且相應(yīng)地涉及上述結(jié)構(gòu)在制備本 發(fā)明的調(diào)控物中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合Ob多肽的抗體。此類抗體可以制得抗全長多肽或其 抗原性片段。一方面，此類抗體抑制ob多肽的功能(即體重和脂肪結(jié)構(gòu)的調(diào)控)活性。另 一方面，抗體可用來決定血漿或血清中循環(huán)ob多肽的水平。在另一方面，區(qū)域特異性抗體， 特別是單克隆抗體，可用作OB多肽結(jié)構(gòu)的探針。所有上述材料在此處均被試圖用作體重和脂肪結(jié)構(gòu)的調(diào)控物，并依此可用于不同 情況。特別地，本發(fā)明涉及診斷和治療應(yīng)用，以及某些農(nóng)業(yè)應(yīng)用，所有這些均依賴于此處定 義的調(diào)控物(包括核酸分子和肽類)的應(yīng)用。而且，當(dāng)肥胖癥或相反的極度瘦弱代表的不 良身體狀況可用本發(fā)明的一種或幾種調(diào)控物給藥來治療時，調(diào)控體重就具有特定的醫(yī)療應(yīng) 用和價值。因此，提出一種調(diào)控哺乳動物體重的方法，包括控制核酸編碼的蛋白質(zhì)的，該核酸 序列選自圖IA至E (SEQ ID NO 1)和序列，圖2A和B (SEQ ID NO 3)的序列和其簡并及等 位變異體。通過基因療法將所研究的核苷酸引入患者或宿主的脂肪細(xì)胞來控制或降低肥胖 癥，可以影響這種控制。相反，當(dāng)涉及過度體重減輕，如神經(jīng)性厭食，癌癥或愛滋病等情況存 在并正在治療時可試圖并尋求制備該核苷酸的拮抗劑，如反義分子并給藥。這些結(jié)構(gòu)可用 相似的方式引入核苷酸，直接導(dǎo)入脂肪細(xì)胞來造成這些變化。相應(yīng)地，

圖1A至E、3、5和6(SEQID NO :1，SEQ ID NO :4，SEQID NO 5 禾口 SEQ ID NO 6)定義的蛋白質(zhì)、保守的變異體、其活性片段和同源小分子可配制成藥物，用于為治療 用途的直接給藥，以降低或控制過多的體內(nèi)脂肪或體重增加。相應(yīng)地，可制備所述蛋白質(zhì)材 料的抗體或其它拮抗物如其片段，并類似地給藥以獲得相反的效果。相應(yīng)地，本發(fā)明更有利 于制備一種藥用組合物，它含有本發(fā)明的OB多肽，或可選地含有其拮抗物，并與藥用載體 或賦形劑相混合。另外，本發(fā)明的OB多肽可因其美容效果而施用，例如，通過減少脂肪儲備而改善 體形。為了其美容效果，OB多肽可單獨(dú)使用或與其它美容措施如手術(shù)聯(lián)合使用。本核苷酸及相應(yīng)肽類的診斷應(yīng)用擴(kuò)展至用核酸來鑒定其等位變異體的進(jìn)一步突 變，以研制一整套用于診斷和治療應(yīng)用的活性核苷酸材料。特別地，可鑒定所研究的核苷 酸的同源或異源突變，以更精確地將患者的狀況定量化來確定個體患肥胖癥的潛在危險。 特別地，異源突變在此處被視作與輕微或中等肥胖癥有關(guān)，而同源突變與更顯著的或嚴(yán)重 的肥胖狀況有關(guān)。用上述已確定的材料作標(biāo)準(zhǔn)可進(jìn)行相應(yīng)的DNA檢查，以協(xié)助對特定趨勢 的準(zhǔn)確長期預(yù)診，從而建議改變飲食或其它個人習(xí)慣或進(jìn)行直接的醫(yī)療干預(yù)來避免這些情 況。本發(fā)明的診斷用途可擴(kuò)展至測量細(xì)胞樣本或取自受試者的生物提取物(或樣本) 中本發(fā)明的調(diào)控物的存在與范圍，從而可證實(shí)這些受試樣本中的核酸(基因組DNA或mRNA)和/或蛋白質(zhì)水平。假定核苷酸活性增加及所得到的蛋白質(zhì)的存在反映了受試者抑制肥胖 癥的能力，檢查這些肥胖受試者的結(jié)果的醫(yī)生即可確定與本發(fā)明的核酸的存在和活性失調(diào) 不同的因素是肥胖現(xiàn)象的原因。相反，核酸和/或表達(dá)的蛋白質(zhì)水平降低可能表明必須提 高這些水平來治療這種肥胖現(xiàn)象，然后可實(shí)施適當(dāng)?shù)寞煼ā＿M(jìn)一步，圖IA至E和2A和B給出的所發(fā)現(xiàn)的核苷酸代表如上簡述的用于測量相 應(yīng)RNA的cDNA。類似地，可制備對應(yīng)于圖IA至E和3的多肽的重組蛋白質(zhì)材料并適當(dāng)?shù)貥?biāo) 記用于例如放射性免疫檢測來，例如，測量脂肪和/或OB蛋白的血漿水平，或者檢測組織例 如下丘腦上OB受體的存在與水平。更進(jìn)一步，本發(fā)明不僅試圖鑒定此處給出的核苷酸和對應(yīng)的蛋白質(zhì)，還試圖闡明 這些物質(zhì)的受體。在這種情況下，可制備圖IA至E，3，5，和/或6的多肽并用來篩選適當(dāng)?shù)?表達(dá)文庫來分離活性受體。然后可以克隆受體，再單獨(dú)用受體或與配體共用來篩選可能具 備對此處的調(diào)控物有相似活性的小分子。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及藥用組合物，它包括特定的調(diào)控物，優(yōu)選的是具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO 5禾P SEQ ID NO :6給出的序列的多肽，它們的抗體，相應(yīng)的 小分子激動劑或拮抗劑，或活性片段，它們被制成用于多種施用方式的適于治療的制劑。該 制劑可以包含藥用載體或者所需要的其它佐劑，其有效劑量范圍在不同情況下由醫(yī)生或臨 床醫(yī)師決定。相應(yīng)地，本發(fā)明的主要目的是提供在此定義的純態(tài)體重調(diào)控物，它表現(xiàn)出與哺乳 動物脂肪含量和肥胖癥控制與變化相關(guān)的某些特征與活性。本發(fā)明另一目的是提供檢測和測量此處提出的體重調(diào)控物的方法，對于某些其中 該調(diào)控物的水平的變化是或者可能是一種定性特征的病理情況，它可以作為一種有效診斷 和監(jiān)測的手段。本發(fā)明的另一目的是提供一種方法以及相關(guān)的檢測系統(tǒng)，用于篩選例如藥物、試 劑等物質(zhì)，這些物質(zhì)對于在哺乳動物中模仿或抑制本發(fā)明的調(diào)控物可能有效。本發(fā)明的另一目的是提供一種方法，該方法可以控制哺乳動物的脂肪含量和體 重，和/或治療某些以異常體重降低或升高為特征的病理情況。本發(fā)明的另一目的是制備遺傳構(gòu)建體以應(yīng)用于基因療法和/或相似療法的藥物 組合物，其中含有基于一種或幾種調(diào)控物、結(jié)合配體或可能控制其生產(chǎn)或模仿或拮抗其活 性的試劑。以下述說明性附圖為參考并結(jié)合下面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識到其它研究 目標(biāo)及其優(yōu)點(diǎn)。附圖簡述圖1 (A至E)顯示得自鼠類OB cDNA的核酸序列(SEQ IDNO 1)和推導(dǎo)的氨基酸序 列(SEQ ID NO :2)。39個堿基對的5'導(dǎo)肽之后是預(yù)計(jì)的167個氨基酸的開放閱讀框架和 約3. 7kb的3'未轉(zhuǎn)錄序列。(在前面提交的申請，序列號No. 08/347，563，提交日期1994 年11月30日和序列號08/438，431，提交日期1995年5月10日中，附加的58殘基5'非 編碼序列后來被證明是克隆偽跡。該偽跡不能定位于編碼區(qū)，圖1所給出的39殘基5'非 編碼區(qū)，或基因的3'非編碼區(qū)。)顯示了 3'不轉(zhuǎn)錄序列的共約2500堿基對。觀察以及 用SigSeq計(jì)算機(jī)程序分析所預(yù)計(jì)的氨基酸序列，顯示信號序列的存在(下劃線)。注意到cDNA的微觀不均勻性，約70 %的cDNA的第49位密碼子是谷酰胺密碼子，而30 %的不是(圖 5和6，見下)。該氨基酸是下劃線的，C57BL/6Job/ob小鼠(1J小鼠)中突變的精氨酸密碼 子也是下劃線的。圖2 (A和B)顯示來自人類OB cDNA的核酸序列(SEQ IDNO 3)。核苷酸編號從1 到701，起始位點(diǎn)在核苷酸46，終止于核苷酸550。圖3顯示由對應(yīng)于圖2A和B的核酸序列的人類OB基因推導(dǎo)出的全長氨基酸序列 (SEQ ID NO :4)。氨基酸編號1從到167。信號序列切割位點(diǎn)位于氨基酸21 (Ala)之后，故 成熟蛋白質(zhì)起自氨基酸22 (Val)止于氨基酸167 (Cys)。圖4顯示推導(dǎo)出的鼠類(SEQ ID NO 2)和人類(SEQ ID NO 4)氨基酸序列的比 較。推導(dǎo)的人類OB氨基酸序列與小鼠的高度同源。保守變化用虛線標(biāo)出，非保守變化由星 號標(biāo)出?？勺兊墓弱０访艽a子是下劃線的，C57BL/6J ob/ob (IJ)小鼠中無義突變位置也是 下劃線的?？偠灾?，在氨基酸水平上有83%的一致性，盡管22位密碼子纈氨酸(緊接信 號序列下游)和117位半胱氨酸之間僅發(fā)現(xiàn)8個替換。圖5顯示來自圖3給出的鼠類OB基因的全長氨基酸序列(SEQ IDNO :5)，但缺少 49位的谷酰胺。氨基酸編號從1到166。信號序列切割位點(diǎn)位于氨基酸21 (Ala)之后(因 而在谷酰胺49缺失之前)，故而成熟蛋白起于氨基酸22 (Val)止于氨基酸166 (Cys)。圖6顯示來自圖4給出的人類OB基因的全長氨基酸序列(SEQ IDNO 6)，但缺少 49位的谷酰胺。氨基酸編號從1到166。信號序列切割位點(diǎn)位于氨基酸21 (Ala)之后(因 而在49缺失之前)，故而成熟蛋白起于氨基酸22 (Val)止于氨基酸166 (Cys)。圖7(A)ob在鼠類染色體上位置的物理圖譜，和YAC與Pl克隆圖譜?！癕和N”對 應(yīng)Mul I和Not I限制位點(diǎn)。編號對應(yīng)于在計(jì)數(shù)的1606個減數(shù)分裂后代中ob區(qū)重組的 個體動物數(shù)。Met，Pax4, D6Rck39，D6Rckl3和Cpa指ob區(qū)上結(jié)合DNA探針的位置。用 D6Rckl3和Pax-4作探針分離出YAC，末端用小載體(vectorette) PCR和/或質(zhì)粒末端補(bǔ)救 (plasmid end rescue)回收進(jìn)而用于分離新的YAC。(B)得到的YAC庫(contig)，該庫中 一個YAC-Y902A09925-是嵌合體。每種用于確定重組動物的基因型的探針在括號中顯示。 (6)對應(yīng) YAC107 ； (5)對應(yīng) M16(+)(或 M16(pLUS)) ； (4)對應(yīng) adu(+) ； (3)對應(yīng) aad(pICL)； ⑵對應(yīng)53 (pICL)；和(1)對應(yīng)53⑴。(C)用選取的YAC末端探針分離到的噬菌體Pl克 隆的Pl庫。在用YAC YB6S2F12(末端(4))(此處又稱adu (+))遠(yuǎn)端分離到的Pl克隆中分 離得ob基因。圖8顯示用PCR擴(kuò)增并表征的第四外顯子捕獲實(shí)驗(yàn)的192個獨(dú)立分離物的溴乙錠 染色照片。圖9顯示懷疑攜帶ob的PCR擴(kuò)增克隆的溴乙錠染色照片。不攜帶偽跡的7個克 隆均用PCR再擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠用TBE電泳，溴乙錠染色。分子量標(biāo)記(最左邊未編碼 的泳道)是可購置的“1KB階梯”。泳道1-1D12克隆，含有“HIV序列”。泳道2-1F1克隆， ob區(qū)之外的新克隆。泳道3-1H3克隆。泳道4-2B2克隆，與IFl相同。泳道5-2G7克隆，含 有ob外顯子。泳道6-2G1克隆1，與IFl相同。泳道7-2H1克隆，不含插入序列。圖10顯示2G7克隆(SEQ ID NO 7)的序列，它包含一個編碼一部分OB基因的外 顯子。用來擴(kuò)增該外顯子的引物序列在圖中被加框(SEQ ID N0:8和9)。圖11顯示㈧用2G7引物和肌動蛋白引物對同一小鼠不同組織的mRNA的反轉(zhuǎn)
16錄-PCR(RT-PCR)分析。用寡聚dT作引物反轉(zhuǎn)錄的IOOng總RNA來進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)用于 合成第一條cDNA鏈。PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行35輪94°C變性1分鐘；55°C雜交1分鐘；72°C擴(kuò) 展2分鐘，每一輪還有1分鐘的第二次自擴(kuò)展。RT-PCR產(chǎn)物溶于2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠用 1 X TBE緩沖液走膠。(B)用PCR標(biāo)記的2G7作探針對小鼠不同器官的mRNA的Northern 印跡。IOyg的每種組織的總RNA在帶有甲醛的瓊脂糖凝膠上電泳。探針于65°C Rapid Hybe ( · Amersham)中雜交。曝光1小時后可見自顯影信號。本實(shí)驗(yàn)給出的是24小時曝光 的結(jié)果。圖12㈧從每種列出的小鼠品系的脂肪細(xì)胞(白脂肪組織)RNA的RT-PCR反應(yīng)物 的溴乙錠染色。用寡聚dT和逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄每種樣本的總RNA(IOOng)，得到的單鏈cDNA 用2G7引物(下帶)或肌動蛋白引物(上帶)PCR擴(kuò)增。2G7和肌動蛋白引物在同一 PCR 反應(yīng)中。產(chǎn)物在瓊脂糖TBE凝膠上走膠。(B)對應(yīng)于(A)的Northern分析。每種所述 品系的IOyg脂肪細(xì)胞(白脂肪組織)RNA走膠，如上述圖IlB用PCR標(biāo)記2G7探針探測。 C57BL/6J ob/ob (IJ)系與少脂肪同窩仔相比，白脂肪RNA中2G7mRNA水平可見約20倍增 長。在SM/Ckc-+Daeob2Vob2T (2J)小鼠的2G7 RNA即使曝光兩個星期后用RT-PCR和Northern 實(shí)驗(yàn)也沒有檢測信號。給出的是24小時自顯影曝光。同一濾膜用肌動蛋白探針雜交(圖 底部)圖13是另外的2J動物與對照動物的Northern分析，證實(shí)了 2J動物中不存在ob mRNA。如圖11和12進(jìn)行Northern分析。此時對照RNA是ap2，一種脂肪特異性轉(zhuǎn)錄物。 ap2帶的密度并無意義。圖14比較了點(diǎn)突變區(qū)C57BL/6J(正常)和C57BL/6J ob/ob (IJ)小鼠的DNA序列， 該點(diǎn)突變可導(dǎo)致將早熟終止密碼子(無義突變)引入突變cDNA。ob/ob小鼠有C —T突變， 改變了 105位的精氨酸殘基。該堿基變化由自動DNA測序儀的輸出給出。用來自5'和3' 不翻譯區(qū)的引物對兩種品系(+/+和ob/ob)的白脂肪RNA進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR產(chǎn)物用凝膠 純化，再用沿編碼序列的兩條鏈的引物手工或用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems. Ins.) 373型自動測序儀直接測序。圖15㈧所列出的兩種小鼠品系的基因組DNA的Southern印跡。用所示限制酶限 制消化約5yg DNA (由肝、腎或脾制備的基因組DNA)。然后將DNA在1 %瓊脂糖TBE凝膠 上電泳，再用PCR標(biāo)記的2G7探測。用Bgl II的限制消化顯示SM/Ckc-+Daeob2Vob2T(2J)DNA 中增加了約(至多)9KB Bgl II片段的大小。用其它任何限制酶均檢測不到RFLP?；蚪M DNA的初步限制定位顯示多形性Bgl II位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約7KB。沒有任何其它受 試酶超過mRNA起始位點(diǎn)。⑶SM/Ckc-+Daeob2Vob2T系中Bgl II多形性的分離。同類系SM/ Ckc-+Dacob2J/ob2J(2J)群體中同一代的6個肥胖和5個瘦的后代通過對(A)給出的Bgl II 多形性評分測定基因型。所有表型肥胖的動物對多形性Bgl II片段的大等位基因均同源。 “對照”泳道DNA制備自與SM/Ckc-+Daeob2Vob2T群體中分開喂養(yǎng)的不相關(guān)SM/Ckc-+Dae+/+小 鼠°圖16是所述物種的EcoRI消化的基因組DNA的Southern印跡，用的是OB cDNA作 探針(S卩，ZOO印跡)。即使在中度嚴(yán)謹(jǐn)雜交后每個哺乳動物樣本中都可檢測出雜交信號。 本實(shí)驗(yàn)的貓DNA輕微降解。受限D(zhuǎn)NA在1 %瓊脂糖TBE凝膠上走膠，再轉(zhuǎn)移到imobilon膜 上探測。濾膜在65°C雜交，65°C用2XSSC/0. 2% SDS漂洗兩次共20分鐘，用Kodak(柯達(dá))(羅徹斯特，紐約州)X-OMAT膠片曝光3天。圖 17 顯示載體 pET_15b (Novagen) (SEQ ID NO 11 禾口 12)的表達(dá)克隆區(qū)。圖18顯示對重組成熟鼠類ob與His-tag的融合(A)和成熟人類OB與His-tag的 融合(B)的His結(jié)合樹脂(Ni)柱洗脫物的分析。分別用載體PETM9和pETH14轉(zhuǎn)化細(xì)菌。 在最佳條件下引入ImMIPTG，轉(zhuǎn)化細(xì)菌能生產(chǎn)100-300μ g/ml OB融合蛋白，該蛋白主要在 包涵體中。包涵體用6M鹽酸胍或脲溶解后，融合蛋白(存在于裂解上清液)加到IOml IX 結(jié)合緩沖液與脲中的His-結(jié)合樹脂(Ni)柱上。逐步用5ml等份的20 μ Μ，60 μ M和300 μ M 咪唑，最后用洗脫緩沖液(sturp buffer)洗柱。在15%丙烯酰胺凝膠上對等份樣品分析 OB多肽融合物是否存在。每條泳道含有相當(dāng)于100 μ 1細(xì)菌提取物的物質(zhì)。圖19 (A) OB RNA的體外翻譯。人類OB cDNA亞克隆到pGEM載體中。將質(zhì)粒線性 化，用Sp6聚合酶合成正鏈RNA。當(dāng)貓胰微粒體膜存在或不存在時翻譯體外合成的RNA。體 外翻譯后見到約18KD的初級翻譯產(chǎn)物。在反應(yīng)物中加入微粒體膜后有比初級翻譯產(chǎn)物小 約2KD的另一翻譯產(chǎn)物出現(xiàn)。缺少編碼的信號序列的白介素-1 α RNA翻譯產(chǎn)物的大小當(dāng)加 入微粒體膜時不變。這些數(shù)據(jù)顯示有功能的信號序列的存在。(B)當(dāng)?shù)鞍酌窴存在與不存 在時的體外翻譯。蛋白酶處理使18KD的初級翻譯產(chǎn)物完全蛋白水解，而16KD的經(jīng)處理的 形式不受影響。用0. TRIT0N-X100將微粒體可滲透化(permeabilization)使處理過的 形式對蛋白酶敏感。這些結(jié)果表明產(chǎn)物翻譯到微粒體的腔內(nèi)。圖20 (A至E)人類OB基因序列(SEQ ID NO 22和24)。(F)鼠類OB基因的示意 圖。(G)人類OB基因的示意圖。(F)與(G)中起始與終止密碼子下劃線。并無證據(jù)顯示人 類基因中存在與小鼠第一內(nèi)含子同源的第一內(nèi)含子存在，但也不能排除其存在。圖21顯示一種用來實(shí)現(xiàn)畢赤氏酵母中OB重組表達(dá)的克隆方案的示意圖。(A)帶 有α-交配因子信號序列的OB表達(dá)載體。(B)重組融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖，包括顯示XhoI 位點(diǎn)和推測的ΚΕΧ-2和STE-13切割位點(diǎn)的氨基酸序列(SEQ ID NO 26)和ΚΕΧ-2切割后存 在的N末端富余氨基酸(SEQ ID N0:27)。(C)生產(chǎn)成熟OB的另一種方案，涉及制備一種 構(gòu)建體、其氨基酸序列對應(yīng)于緊靠成熟ob多肽序列(SEQ ID NO :28)的XhoI切割位點(diǎn)和 ΚΕΧ-2切割位點(diǎn)。圖22在畢赤氏酵母中另一表達(dá)方案。(A)帶有His-tag的OB融合物表達(dá)載體，取 自α _交配因子信號序列(SEQ ID Ν0:33)控制下的ρΕΤ表達(dá)系統(tǒng)。(B)帶有His-tag的 重組OB融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖，它包括α -交配因子信號序列、假設(shè)的ΚΕΧ-2和STE-13切 割位點(diǎn)，His-tag和凝血酶切割位點(diǎn)，它可產(chǎn)生帶有3個富余N末端氨基酸殘基的0B。圖23 (A)轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母中鼠類OB (兩種微異源性形式，即含有及缺失Gln49)表 達(dá)的PAGE分析。預(yù)測的約16KD的帶可見于轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)液(泳道2與泳道3)，而不見于 未轉(zhuǎn)化酵母的培養(yǎng)液(泳道1)。(B)在羧甲基纖維素(一種弱陽離子交換劑)上部分純化 的重組OB多肽的PAGE分析。約16KD的帶明顯見于柱的級分3和4，用250mM NaCl洗脫。 泳道1-上樣的樣品，泳道2-流過(flowthrough)，泳道3-5-用250mM NaCl洗脫的級分。圖24顯示在小鼠血漿中循環(huán)的OB蛋白。(A)小鼠血的免疫沉淀。0. 5ml的小鼠 血漿用未偶聯(lián)的瓊脂糖(S印harose)預(yù)清理，再與偶聯(lián)到瓊脂糖4B小珠上的免疫純化抗OB 抗體溫育過夜。免疫沉淀在15% SDS-PAGE凝膠上分開，轉(zhuǎn)移并用抗OB抗體作Western印 跡。該蛋白以約16KD分子量遷移到與酵母中表達(dá)的成熟小鼠ob蛋白相同的位置。該蛋白
18不見于C57BL/6J ob/ob小鼠，相對于野生型小鼠在C57BLB/Ks db/db小鼠血漿中增加10 倍。有人提示db小鼠過量生產(chǎn)OB蛋白，僅次于(secondary to)其抵抗作用。(B)肥胖大 鼠中OB水平增加。肥胖大鼠之所以肥胖是由于大鼠染色體5上的隱性突變。遺傳數(shù)據(jù)表 明db小鼠中突變的相同基因上有缺陷。肥胖大鼠與不肥胖的(或瘦的)同窩仔的血漿免 疫沉淀后進(jìn)行western印跡。在突變動物中見到OB循環(huán)水平上升20倍。(C)小鼠血漿中 OB蛋白的定位。在ob小鼠100 λ血漿中加入遞增量的重組小鼠蛋白并免疫沉淀。western 印跡的信號強(qiáng)度與野生型小鼠100λ血漿的相比，見到與重組蛋白量增加相伴的信號強(qiáng)度 線性增加，表明免疫沉淀時抗體過量。在野生型血漿樣品和帶有2ng重組蛋白的樣品中也 見到相似信號，表明小鼠血漿中循環(huán)水平約20ng/ml。(D)脂肪組織提取物中的OB蛋白。從 db和野生型小鼠制備小鼠脂肪組織的細(xì)胞質(zhì)提取物。western印跡顯示從db小鼠制備的 提取物中16KD蛋白質(zhì)水平升高。圖25顯示在人體血漿中OB蛋白以不同水平循環(huán)。(A)人體血漿的western印跡。 血漿樣品取自6位不肥胖的志愿者。免疫沉淀與western印跡顯示有免疫活性的16KD蛋 白的存在，大小與酵母中表達(dá)的重組146氨基酸人蛋白相同。6個樣品中可見到蛋白質(zhì)水平 的變化。(B)人類ob的ELISA (酶聯(lián)免疫測試)。微滴定板用免疫純化的抗人類OB抗體包 被。在板上加已知量的重組蛋白，用免疫純化的生物素化抗ob抗體檢測。414nm吸收對已 知濃度OB作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示該測試能夠檢測至少lng/ml的人類OB 蛋白。(C)人體血漿中OB蛋白的定量。用來自6名瘦志愿者的100 λ血漿和B圖版用過的 標(biāo)準(zhǔn)作ELISA免疫測試。見到OB蛋白水平變化范圍為HPl中的2ng/ml到HP6中的15ng/ ml。這些數(shù)據(jù)與圖版A中的western印跡數(shù)據(jù)相符。圖26顯示OB蛋白形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵。(A)還原條件與非還原條件下 的western印跡。通過在樣品緩沖液中添加或不添加還原劑來重復(fù)鼠類和人類血漿的 western印跡。當(dāng)樣品緩沖液中不含β _巰基乙醇時，db血漿的免疫沉淀明顯以16KD和 32KD的分子質(zhì)量遷移。在緩沖液中加入β-巰基乙醇，32KD部分消失(見圖24)。小鼠蛋 白在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)時也得到該結(jié)果。這種情況下，小鼠OB蛋白遷移到二聚體的 位置。還原條件下，純化的重組小鼠蛋白明顯以16KD分子量遷移、表明32KD分子形式是一 個或兩個分子間二硫鍵的結(jié)果。還原與非還原條件下(數(shù)據(jù)未給出)體內(nèi)表達(dá)與巴斯德畢 赤氏酵母中表達(dá)的人蛋白均以16KD分子量遷移。(B)酵母中表達(dá)的人蛋白含有一個分子 內(nèi)的二硫鍵。分泌的蛋白在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時通常能形成正確構(gòu)象。 146氨基酸的成熟人類蛋白在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)，用包括IMAC和凝膠過濾的兩步純 化步驟從酵母培養(yǎng)基中純化出來。在用溴化氰切割前后對純化的重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。 溴化氰在蛋氨酸殘基羧基端切割。重組酵母蛋白的分子質(zhì)量為16，024士3Da(計(jì)算的分子 質(zhì)量=16，024Da)。溴化氰在蛋白質(zhì)序列上氨基酸75，89和157的蛋氨酸后切割。測得質(zhì) 量為8435. 6Da的溴化氰片段對應(yīng)于Cys-117和Cys_167之間二硫鍵連接的氨基酸90-157 和158-167 (計(jì)算的分子質(zhì)量=8434. 5Da) ·N. D.=未檢測到(note detected)。圖27顯示了有生物活性的重組蛋白的制備。對應(yīng)于145氨基酸的成熟小鼠OB的 核苷酸序列克隆到PET 15b表達(dá)載體中。該pET載體在克隆的序列上游插入多聚組氨酸 (His-tag)，故能有效地用固定化金屬親和層析(IMAC)純化。細(xì)菌裂解后，重組細(xì)菌蛋白先分配在不溶性膜級分中。膜級分用鹽酸胍溶解后裝入IMAC柱。按所示用濃度遞增的咪唑 逐步洗脫蛋白。洗脫的蛋白重折疊后用凝血酶處理去除His-tag，描述如下?？扇艿鞍椎慕K 產(chǎn)率是45ng每ml細(xì)菌培養(yǎng)物。圖28顯示OB蛋白的生物效應(yīng)。食物攝入的時間進(jìn)程(圖版A-C)和體重(圖版 D-F)。一組10個動物接受了或者每日腹腔內(nèi)注射OB蛋白，劑量為5mg/kg/天(實(shí)心方塊)， 每日注射PBS(實(shí)心圓)或無處理(實(shí)心三角)。治療組包括C57B1/6J ob/ob小鼠(圖版 A和D)，C57B1/Ks db/db小鼠(圖版B和E)以及CBA/J+/+小鼠(圖版C和F)。每日測量 小鼠的食物攝入量，如所示每三到四天間隔記錄體重。(以克為單位的體重比例對野生型 小鼠和ob以及db小鼠不同)。接受蛋白的ob小鼠第一次注射后食物攝入量下降，過4天 后穩(wěn)定在假注射水平的約40% (ρ < 0. 001)。這些動物的體重平均減少1. 3克/天，三星 期后穩(wěn)定于起始體重的約60%的水平(ρ < 0.0001)。db小鼠中未表現(xiàn)蛋白的效果。CBA/ J小鼠中在早先兩個時間點(diǎn)(P <0.02)中觀察到對體重小而顯著的影響。每次測量的標(biāo)準(zhǔn) 差由一條形描繪，這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)置信度見于表1。圖29顯示成對飼養(yǎng)ob小鼠的結(jié)果。(A) —組4個C57B1/6J ob/ob小鼠飼喂與 接受重組蛋白的那組ob小鼠消費(fèi)量相同量的食物，過5，8和12天后計(jì)算兩組的體重減少。 食物限量的小鼠(斜線條)比接受蛋白的ob小鼠(實(shí)心條)減輕的體重要少(Ρ<0·02)。 該結(jié)果顯示OB蛋白的體重減輕效果是由于食物攝入和能量消耗。(B) —個接受處理的ob 小鼠的照片。給出的是兩只C57B1/6J ob/ob小鼠。左邊的小鼠接受PBS，體重65克，即起 始體重。右邊的小鼠每日接受重組OB蛋白注射。該動物的起始體重也是65克，蛋白注射 3星期后體重為38克。(C)受處理與未受處理的ob小鼠的肝。給出的是受處理的與未受 處理的C57B1/6J ob/ob小鼠。接受PBS的小鼠的肝看來就胖，重5. 04克。接受重組蛋白 的小鼠的肝外觀正常，重2. 23克。圖30顯示ob與脂肪組織的原位雜交。用Sp6和T7聚合酶與毛地黃毒苷 (Digoxigenin)體外標(biāo)記有義和反義ob RNA0將八周大C57B1/Ks小鼠(標(biāo)記為野生型) 和C57B1/KS db/db小鼠(標(biāo)記為db)附睪脂肪墊的脂肪組織石蠟包埋切片，與用標(biāo)記的 RNA雜交。圖中脂滴為細(xì)胞內(nèi)未染色的囊泡。細(xì)胞質(zhì)為細(xì)胞邊緣的一圈薄緣，與細(xì)胞膜不可 分。只有用反義探針在野生型切片中才能檢測到視場(field)中所有脂肪細(xì)胞的雜交，并 且db/db動物組織切片中見到(雜交)水平大大增加。圖31顯示OB RNA體內(nèi)和體外在脂肪細(xì)胞中表達(dá)。八種不同來源的總RNA(10微 克)走電泳作印跡并與ob探針雜交。首先，利用膠原酶消化后細(xì)胞浮力的不同來純化脂肪 細(xì)胞。OB RNA只存在于脂肪細(xì)胞成分。泳道S顯示基管成分，泳道A顯示脂肪細(xì)胞成分。 另外，OB RNA在泳道U未分化的3T3-442前脂肪細(xì)胞中不表達(dá)。從這些細(xì)胞系分化的脂肪 細(xì)胞清楚地顯示可檢測水平的OB mRNA (泳道D)。圖32顯示OB RNA在所有脂肪組織沉積物中表達(dá)。所有檢驗(yàn)過的脂肪組織沉積 物均表達(dá)ob RNA。腹股溝脂肪墊RNA水平有些低，盡管不同實(shí)驗(yàn)中信號水平有變化。(圖 31A)泳道(1)附睪(2)腹股溝(3)小腹(4)子宮周圍脂肪墊。褐色脂肪也表達(dá)低水平的 0BRNA。(圖31B)動物圈養(yǎng)于4°C一周，褐色脂肪中的OB表達(dá)水平不變，但是受冷誘導(dǎo)的褐 色脂肪特異性O(shè)CP UNA的豐度卻增加了 5倍。圖33描繪了 db/db與硫代葡糖金處理過的小鼠中OB RNA的表達(dá)。db/db與硫
20代葡糖金(GTG)處理過的小鼠的子宮周圍脂肪墊的總RNA經(jīng)電泳與Northern印跡。已知 單獨(dú)劑量給藥的GTG能誘導(dǎo)特定的下丘腦損傷而導(dǎo)致肥胖。(A) —月大CBA雌性小鼠用 GTG (0. 2mg/g)處理，結(jié)果受處理小鼠比對照小鼠(< 5g)增加了 > 20g。(B) OB探針與db/ db和GTG處理的小鼠的RNA雜交顯示ob RNA相對于對照RNA (肌動蛋白或GAPDH)豐度上 增加20倍。圖34顯示人類RNA的Northern印跡分析。如圖所示含有IOmg人類脂肪組織(FAT， 圖版A)的總RNA和2mg其它人類組織(圖版B)的polyA+RNA的Northern印跡與人類ob 或人類β -肌動蛋白探針雜交。對脂肪組織含RNA見到約4. 5kb的強(qiáng)信號。與polyA+RNA的 雜交在心(HE)和胎盤(PL)顯示可檢測信號，而在腦(BR)，胸(LU)Jf (Li)，骨胳肌(SM)，、 腎(KI)和胰(PA)中未檢測到0BRNA。每種情況下均給出放射自顯影曝光長度。值得注意 的是，胎盤RNA中見到的低分子量帶的產(chǎn)生原因(例如選擇拼接，RNA降解)未知。圖35顯示含有人類OB基因和8個微型衛(wèi)星標(biāo)記(microsatelIitemarker的YAC 結(jié)構(gòu)區(qū)(contig)。描繪了由 SEGMAP/3. 29 版[Green 等人，PCR 方法應(yīng)用(PCR Methods ApplicU :77-90 (1991)]導(dǎo)出的含有人類OB基因的染色體7區(qū)域基于YAC的STS-含量圖。 19個單一性排列的STS(見表3)列于上部。8個微型衛(wèi)星特異性STS用星號標(biāo)出(見表 4)。還給出對應(yīng)于Pax4和OB基因的STS以及相對于該結(jié)構(gòu)區(qū)(contig)的著絲粒(CEN)和 7q端粒(TEL)上預(yù)計(jì)的位置。43個YAC克隆每一個均由水平條形描繪，左邊給出名稱，估 計(jì)的YAC大小(以kb為單位，用脈沖電場凝膠電泳測量)給在括號里。STS在YAC中的存 在用描黑的圈在適當(dāng)位置標(biāo)出。當(dāng)STS對應(yīng)YAC插入序列末端時，則在其來源的YAC的首 端(靠近STS名稱)和末端用方塊圍住對應(yīng)的圈。對于七個底部的YAC(在水平虛線下)， 未能檢測到一個或多個預(yù)計(jì)會存在(基于建立的STS順序)的STS (通過用相應(yīng)STS特異 性PCR檢測至少兩次檢測每個YAC證實(shí)而得)，這用適當(dāng)位置的空心圓表示。大多數(shù)YAC從 人-倉鼠雜種細(xì)胞得到的文庫[Green等人，基因組學(xué)，25:170-183 (1995)]中分離得到，并 給出其庫名。其余的YAC從總?cè)祟惢蚪M文庫中分離得，表3給出其原來的文庫位置。三 個通過FISH分析找到的YAC(yffSS 691，yffSS 999，yffSS 2935)的名字加框以與7q31. 3對 應(yīng)(map)。該結(jié)構(gòu)區(qū)以“未經(jīng)計(jì)算”的形式給出，其中YAC大小沒有用來估計(jì)克隆重疊或STS 間隔，因而所有STS以等距形式給出。在“計(jì)算過的”形式中，YAC大小用來估計(jì)隔開每對相 鄰STS的相對距離以及克隆重疊程度，全部YAC結(jié)構(gòu)區(qū)看上去僅跨約2Mb。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種在此被稱為Ob多肽或瘠素的蛋白的說明及發(fā)現(xiàn)，編碼該蛋白的 核酸，包括其簡并變異體，例如加入了用于在某個特定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的最適密碼子，該蛋 白表現(xiàn)控制哺乳動物體重的能力。所研究的核酸代表對應(yīng)于小鼠和人類OB多肽的編碼序 列，推想可能在調(diào)節(jié)體重與肥胖中起關(guān)鍵作用。此處的列出的數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的核酸的多 肽產(chǎn)物被表達(dá)它的細(xì)胞分泌，該多肽作為激素起作用。其他的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示OB多肽在治療 攜帶ob基因突變的小鼠的肥胖癥中十分有效。另外，OB多肽的高單次劑量或中等連續(xù)劑 量影響正常(野生型)小鼠的體重減少。另外，此處的實(shí)施例表明OB多肽，又稱“瘠素”，在大鼠，小鼠和人血漿中循環(huán)。瘠 素不見于ob/ob小鼠的血漿，在db/db小鼠血漿中以10倍濃度存在，在fa/fa大鼠中以20 倍濃度存在。最明顯的是每日注射重組瘠素顯著降低ob/ob小鼠的體重，明顯影響野生型
21小鼠的體重，對db/db小鼠無作用。另一方面，一個物種的OB多肽在另一物種中有生物活性。具體地說人類OB多肽 在小鼠中有活性。在首要方面，本發(fā)明意圖鑒別起哺乳動物體重調(diào)控物作用的物質(zhì)。具體地說，本發(fā) 明涉及如何分離、純化和測序小鼠與人體中某些對應(yīng)于OB基因的核酸或其編碼區(qū)，以及這 些核酸表達(dá)的相應(yīng)多肽，本發(fā)明因而包括對具有圖IA至E(SEQ ID NO 1)和圖2A和B(SEQ ID NO 3)給出的核苷酸順序的核酸及其簡并變異體，等位基因及片段的發(fā)現(xiàn)，它們均有調(diào) 控體重和肥胖的活性。該核酸跟OB基因的對應(yīng)預(yù)示它在諸如肥胖癥以及其它以體重失常 作為一種貢獻(xiàn)因素的病癥和功能失調(diào)等情況會有顯著作用。本發(fā)明包括由本發(fā)明的核酸表 達(dá)的蛋白質(zhì)，特別是由圖IA至E(SEQ ID N0:2)，圖3(SEQ ID N0:4)，圖5(SEQ ID NO :5)禾口 圖6(SEQ ID N0:6)給出的蛋白質(zhì)，以及保守變異體，活性片段和同源小分子。如前所述，體重調(diào)控物肽類或其結(jié)合物或其它配體或模擬或拮抗它們或控制其生 產(chǎn)的試劑，可制備成藥物組合物，連同適當(dāng)載體用多種方式以有效的強(qiáng)度施用給病人，用于 治療體重的不正常波動和肥胖，它們本身或作為諸如癌癥或愛滋病等不良病況的一部分。 可采用許多給藥手段，包括口服，鼻腔或其它形式透過粘膜給藥，腸胃給藥技術(shù)如皮下、靜 脈、腹腔注射，導(dǎo)管插入等等。識別因子或其亞單位的平均量可以變化，具體的量要基于有 資格的醫(yī)生或獸醫(yī)的推薦和處方。與上述相應(yīng)，可以制備一個用于篩選能有效模仿或拮抗體重調(diào)控物活性的潛在藥 物的檢驗(yàn)系統(tǒng)?？蓪Ⅲw重調(diào)控物引入試驗(yàn)系統(tǒng)，也可將待測藥物引入得到的細(xì)胞培養(yǎng)物中， 然后觀察培養(yǎng)物，來研究僅由于加入待試藥物或由于加入一定量的已知體重調(diào)控物的作用 導(dǎo)致的細(xì)胞活性改變。如前述，這里描述的OB基因的分子克隆導(dǎo)致鑒定了一系列在分子水平上調(diào)控哺 乳動物體重的物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的調(diào)控物對于診斷和治療肥胖癥、與癌癥相關(guān)的體重降 低等營養(yǎng)失調(diào)以及治療與肥胖癥有關(guān)的病癥如高血壓，心臟病、II型糖尿病等有重要的意 義。另外，若要調(diào)控家養(yǎng)動物的體重，基因產(chǎn)物也有潛在的農(nóng)業(yè)用途。最后，若本發(fā)明的一 種或幾種調(diào)控物是分泌型分子，則可用它們來在生化上用表達(dá)克隆技術(shù)分離其受體。下面 的具體參考OB基因的討論也可一般地應(yīng)用到構(gòu)成本發(fā)明的一部分的一系列調(diào)控物，因而 這些討論具有廣泛的深度與廣度。如上述，可用轉(zhuǎn)基因手段評價OB多肽的功能活性。為此可采用轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 用分離到的ob基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，包括對應(yīng)于野生型候選者基因的病毒載體或粘粒克 隆(或噬菌體克隆)。可用公開的方法將粘粒引入轉(zhuǎn)基因小鼠[Jaenisch，科學(xué)(Science)， 240 1468-1474 (1988)]。將該構(gòu)建體被引入由C57BL/6J ob/ob的Fl后代與DBA互交得到 的受精卵。這些互交要用C57BL/6J ob/ob卵巢移植體來產(chǎn)生Fl動物。用DBA/2J小鼠作 反品系(coimterstrain)，是由于它們有非刺鼠皮顏色，這在使用卵巢移植體時有用。為確 定粘粒轉(zhuǎn)基因動物中ob位點(diǎn)的基因型，可用緊密連鎖RFLP或包圍突變而在后代株中有多 形性的微型衛(wèi)星測定動物類型。當(dāng)某個特定構(gòu)建體使基因型肥胖的F2動物(用RFLP分析 評分(score))變瘦并且不患糖尿病則表現(xiàn)出了互補(bǔ)。這種情況下，最終確定互補(bǔ)將需要把 攜帶轉(zhuǎn)基因的ob/ob或db/db動物與ob/ob或db/db卵巢轉(zhuǎn)植體交配。在該雜交中，所有 不攜帶轉(zhuǎn)基因的N2動物均肥胖并表現(xiàn)胰島素抗性/糖尿病，而不攜帶轉(zhuǎn)基因的N2動物將是瘦的并且在血漿中含有正常葡萄糖與胰島素濃度。在遺傳意義上，轉(zhuǎn)基因是阻遏突變。另外，當(dāng)OB基因以反義方向在野生型動物中表達(dá)時可通過檢查其表型效應(yīng)來檢 驗(yàn)它。該方法中，野生型等位基因的表述受阻遏，導(dǎo)致突變型表型。形成RNA ^RNA雙螺 旋(反義_有義)使mRNA不能得到正常處理，導(dǎo)致部分或全部失去野生型基因作用。該 技術(shù)可用在組織培養(yǎng)物中抑制TK合成，在果蠅中產(chǎn)生Kruppel突變的表型，在小鼠中產(chǎn)生 Shivever 突變的表型，Izant 等人，細(xì)胞(Cell) 36 1007-1015 (1984) ；Green 等人，生化年 鑒(Annu Rev. Biochem,)，53 :569_597 (1988) ；Katsuki 等人，科學(xué)，241 :593_595 (1989)。該 方法有一重要優(yōu)點(diǎn)，即僅需一小部分基因表達(dá)即可有效抑制全部同源mRNA的表達(dá)。該反義 轉(zhuǎn)基因?qū)⑹芸赜诒旧淼膯幼踊蛟谡_細(xì)胞類型中表達(dá)且置于SV40多聚A位點(diǎn)上游的另 一啟動子。該轉(zhuǎn)基因可用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠也可與卵巢轉(zhuǎn)植體交配來檢驗(yàn)ob 雜合體是否對反義結(jié)構(gòu)的作用更敏感。長遠(yuǎn)看來，闡明OB基因產(chǎn)物(0B多肽或蛋白質(zhì))的生化功能對于鑒定影響其活性 的激動劑和抑制劑小分子是有用的。本專利說明書中通篇使用的各種術(shù)語的定義舉例如下。術(shù)語“體重調(diào)控物”，“調(diào)控物”，“調(diào)控物(復(fù)數(shù))”和其它任何沒有專門列出的變 化在此均可通用，在本申請書和權(quán)利要求書中通篇用來指核苷酸和蛋白物質(zhì)，后者包括單 個或多個蛋白。更特別地，前述術(shù)語的范圍也包括含有此處討論及圖IA至E (SEQ ID NO 1)和圖2A和B (SEQ ID NO :3)給出的序列的核苷酸和DNA。相似地，具有本處討論以及圖 IA至E(SEQ ID NO 2)和圖3(SEQ ID NO 4)給出的氨基酸序列數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明 所需，還有相關(guān)于此處以及權(quán)利要求中的材料提出的各種活性。相應(yīng)地，也試圖表現(xiàn)基本等 價或改變活性的核苷酸，包括基本同源的類似物和等位變異體。同樣也試圖表現(xiàn)基本等價 或改變活性的蛋白質(zhì)，包括例如用定點(diǎn)誘變或生產(chǎn)調(diào)控物的宿主中偶發(fā)突變得到的特意修 飾的蛋白質(zhì)。若組合物中按蛋白質(zhì)、DNA、載體(依據(jù)A、B所屬的種類)計(jì)算至少75%是“A”則說 含“A”(A是單個蛋白質(zhì)、DNA分子、載體、重組宿主細(xì)胞等)的組合物中基本不含“B” ( “B” 包含一種或多種污染物蛋白、DNA分子、載體等，但不包含A的消旋異構(gòu)體形式)。優(yōu)選地， 組合物中按A+B的重量算“A”占至少90%，最優(yōu)選地占至少99%的重量。也優(yōu)選基本不含 污染物的組合物，基僅含分子量單一的物質(zhì)，并具有感興趣的物質(zhì)的活性或特征。OB 多肽術(shù)語“蛋白質(zhì)”指天然存在的多肽，“多肽”在這里可對于ob基因產(chǎn)物及其變異體 交替使用。術(shù)語“成熟蛋白質(zhì)”或“成熟多肽”專門指信號序列(或融合基因伙伴)被去除 的OB基因產(chǎn)物。如上述，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的ob多肽含有例如SEQ IDNO :2，4，5和6等 給出的氨基酸序列，包括用保守氨基酸替換修飾的蛋白及其有生物活性的片段，類似物和 衍生物。術(shù)語“生物活性”此處指多肽的一種特定作用，包括但不限于專一性結(jié)合物如受體， 抗體或其它識別分子；在分子水平上激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；和/或在體內(nèi)誘導(dǎo)由天然ob多肽 介導(dǎo)的生理作用(或用拮抗劑抑制它)。OB多肽，包括片段類似物，衍生物，可通過人工合 成制備，例如用熟知的固相或溶液相多肽合成技術(shù)。優(yōu)選地采用固相合成技術(shù)。此外，可用 熟知的基因工程技術(shù)制備本發(fā)明的OB多肽，描述見下。另一實(shí)施方案中，可以從生物流體例如血漿、血清、尿等，優(yōu)選地從過度表達(dá)該多肽的受試者，如患有OB受體突變或與“肥胖” 相關(guān)突變的肥胖病癥的胖人，取人的血漿，血清或尿等，用免疫親和純化方法純化OB多肽。OB多肽片段在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明注意到天然存在的OB多肽片段可能有重要性。肽序列 含有許多位點(diǎn)，例如精氨酸殘基通常是蛋白水解切割的目標(biāo)。全長多肽有可能在一個或多 個這樣的位點(diǎn)被切割，形成生物活性片段。這些有生物活性的片段可能激活或抑制OB多肽 減輕體重的功能活性。OB多肽的類似物本發(fā)明特別地試圖制備OB肽的類似物，其特征為具有OB多肽的一種生物活性，例 如結(jié)合ob肽的特定結(jié)合物如OB受體。在一個實(shí)施方案中，該類似物激動OB活性，即其功 能與ob肽相似。優(yōu)選地，OB激動物比天然蛋白更有效。例如，OB激動物類似物與OB受體 結(jié)合的親合力更高或體內(nèi)半衰期更長或二者兼有。然而，沒有天然蛋白質(zhì)有效的OB肽激動 劑類似物也為本發(fā)明涉及。在另一實(shí)施方案中，類似物拮抗OB活性。例如，與OB受體結(jié)合 但不誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)的OB類似物能競爭性抑制天然OB結(jié)合受體，因而降低體內(nèi)OB活性。這 種OB拮抗物也可能表現(xiàn)與ob肽不同的性質(zhì)，例如體內(nèi)半衰期更長(或更短)，與OB受體結(jié) 合的親合性更大(或更小)或二者兼有。在一個實(shí)施方案中，OB肽的類似物是通過將多肽上對結(jié)構(gòu)或功能并非必需的位置 上的氨基酸替換掉而被修飾的OB肽。例如，既然人類OB肽在小鼠中有生物活性，將人與鼠 氨基酸序列相比得到的趨異氨基酸殘基替換會很可能得到有用的OB肽類似物。例如，人的 53位或98位或二者的絲氨酸殘基(見圖4描繪的未處理的肽序列)被替換成例如甘氨酸， 丙氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或蘇氨酸。相似地，92位的精氨酸殘基(圖4)可替換為 例如天冬酰胺，賴氨酸，組氨酸，谷酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸或半胱 氨酸。仍參考圖4，人類OB肽上能被替換的其它氨基酸有118位的組氨酸，121位的色氨酸， 122位的丙氨酸，126位的谷氨酸，127位的蘇氨酸，128位的亮氨酸，132位的甘氨酸，139位 的甘氨酸，159位的色氨酸，和166位的甘氨酸。在另一實(shí)施方案中，可能將121至128位 (見圖4)的一個或多個殘基替換成例如甘氨酸或丙氨酸或?qū)⒊?23位的絲氨酸或125位的 亮氨酸之外的某些殘基替換掉。另一實(shí)施方案中，OB多肽類似物，優(yōu)選地是人類OB肽類似物，是多肽的截短形式。 例如已表明49位谷酰胺殘基并非必需，可從中去掉。相似地，也可能將121-128位的某些 或全部趨異氨基酸殘基去除。另外，本發(fā)明試圖提供一種對生物活性必需的氨基酸序列最 短的OB類似物，例如用結(jié)合OB特異性抗體能力，抑制天然OB多肽活性能力或激活天然OB 肽活性的能力來檢驗(yàn)OB片段活性即可確定這一點(diǎn)。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種截 短OB多肽，包含有117和167位(見圖4)半胱氨酸殘基形成的二硫鍵形成的環(huán)結(jié)構(gòu)。另 一實(shí)施方案中，截短類似物對應(yīng)以22殘基(它跟在假定的信號肽切割位點(diǎn)之后)到53殘 基(該氨基酸殘基緊靠一柔性環(huán)區(qū)之前，該環(huán)區(qū)由OB多肽的限制性蛋白水解及質(zhì)譜分析檢 測到。見Cohen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(ProteinScience), 4 1088 (1995)]的氨基酸。另一實(shí)施 方案中，截短類似物對應(yīng)從61殘基(該殘基緊跟在OB多肽限制性蛋白水解/質(zhì)譜分析檢 測到的柔性環(huán)區(qū)之后]到116殘基(該殘基緊靠第一個半胱氨酸殘基之前)的氨基酸。在 另一實(shí)施方案中，截短類似物對應(yīng)從61殘基到167殘基的氨基酸。
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此外，從54到60殘基的假定柔性環(huán)的一個或多個殘基也被替換。例如，一個或多 個殘基可替換成甘氨酸，谷氨酸或與例如聚合物交聯(lián)的半胱氨酸(優(yōu)選的是賴氨酸)，因?yàn)?柔性環(huán)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)衍生化的優(yōu)選位點(diǎn)。備選地，柔性環(huán)位置的殘基可以替換成更不易蛋 白水解但仍保留柔性結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基，例如一個或多個脯氨酸。在另一實(shí)施方案中試圖 替換成可進(jìn)一步衍生的氨基酸殘基使其更不易降解。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員即可理解前述片段大小均是近似值，前述截短類似物的一 端或兩端，或該多肽或其片段的內(nèi)部可以含有或缺失1到大約5個氨基酸，不同的是二硫鍵 環(huán)類似物中半胱氨酸殘基必須保留。在接近生理?xiàng)l件下用圓二色檢測重組肽發(fā)現(xiàn)鼠類OB肽含50% α -螺旋，人類OB 多肽含約60% α-螺旋。相應(yīng)地，另一實(shí)施方案中，氨基酸殘基可被替換，形成的OB多肽， 類似物形成或更傾向于形成更穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)。例如，若將天然OB多肽的氨基酸殘基 替換成GlU，Ala，LeU，HiS，Trp則易形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地采用保守的氨基酸替換。例 如將29，30，44，61，76，100和/或106殘基(見圖4)的天冬氨酸替換成谷氨酸(Glu)；異 亮氨酸替換成亮氨酸，甘氨酸或纈氨酸或任何趨異氨基酸替換成丙氨酸(例如人類OB多肽 53位的絲氨酸替換成苯丙氨酸)，精氨酸或賴氨酸替換成組氨酸，以及酪氨酸和/或丙氨酸 替換成色氨酸。提高α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例，或更重要地，提高α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性會使OB 類似物有更高活性，更強(qiáng)的結(jié)合親和性或更長的半衰期。在一特定實(shí)施方案中，OB肽對應(yīng) 氨基酸殘基22到53的部分的螺旋形成能力增大了。另一實(shí)施方案中，氨基酸殘基61-116 的螺旋形成能力或穩(wěn)定性增大。另一實(shí)施方案中，對應(yīng)氨基酸117至167的二硫鍵環(huán)結(jié)構(gòu) 的螺旋形成能力增大。在不止一個上述結(jié)構(gòu)域的α-螺旋潛力或穩(wěn)定性增大的OB類似物 也為本發(fā)明涉及。另一實(shí)施方案中，生成的截短OB多肽類似物加入了能形成結(jié)構(gòu)(例如形 成螺旋)的氨基酸殘基以補(bǔ)償多肽片段缺乏穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的傾向?？梢酝ㄟ^例如胃蛋白酶消化體重調(diào)控物蛋白材料制得類似物的片段。其它類似 物，例如突變蛋白，可通過將體重調(diào)控物肽編碼序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誘變來制得。表現(xiàn)“體重調(diào)控 物活性”的類似物，例如小分子，無論它起促進(jìn)作用還是抑制作用，均可用已知體內(nèi)和/或體 外檢驗(yàn)鑒定出來。OB多肽的小分子類似物和肽類似物ob多肽(優(yōu)選的是人類OB多肽)的結(jié)構(gòu)可用本領(lǐng)域已知的多種方法分析?？?用親水性分析來確定蛋白質(zhì)序列(例如Hopp等人，美國國家科學(xué)院院刊，78 =3824(1981) 0 親水性圖譜可用來鑒定OB多肽的疏水區(qū)與親水區(qū)、這樣可以顯示埋在折疊多肽內(nèi)部的 區(qū)域和多肽外部可接近的區(qū)域。另外，也可作二級結(jié)構(gòu)分析[例如，Chou等人，生物化學(xué) (Biochem.) 13 =222(1974)]來鑒定OB多肽上可能的特定二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。用本領(lǐng)域可得 到的計(jì)算機(jī)軟件程序可實(shí)現(xiàn)對預(yù)計(jì)或確定的結(jié)構(gòu)的操作，包括二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過提供來源豐富的重組OB多肽，本發(fā)明能定量確定多肽的結(jié)構(gòu)。特別地，已有 足夠材料作核磁共振(NMR)、紅外(IR)、拉曼、紫外(UV)尤其是圓二色(CD)譜分析。特別 是NMR提供了對溶液中分子強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)分析，溶液更接近分子的天然環(huán)境[Marion等人， 生物化學(xué)與生物物理研究公報(bào)(Biochim. Biophys Res. Comm.) 113 967-974 (1983) ；Bar 等 人，磁共振雜志(J. Magn. Reson.)65 =355-360(1985) ；Kimura等人，美國國家科學(xué)院院刊， 77 :1681-1685(1980)。也可用其它結(jié)構(gòu)分析方法，包括但不限于X射線晶體學(xué)[Engstom，
25生化實(shí)驗(yàn)生物學(xué)(Biochem. Exp. Biol), 11 :7_13 (1974)]。另一實(shí)施方案中，檢驗(yàn)OB多肽類似物以確定它是否與對天然OB多肽或其特定片 段有特異性的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)程度提供了有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)同源性或相似性，或 與用來產(chǎn)生片段特異性抗體的多肽部分相對應(yīng)的區(qū)域可接近程度的資料。篩選OB類似物本領(lǐng)域已知多種篩選方法來篩選多肽類似物?？色@得多種化學(xué)品文庫。相應(yīng)地， 本發(fā)明試圖篩選這些文庫，例如經(jīng)多年研究生成的合成復(fù)合物文庫，天然復(fù)合物文庫和組 合文庫，下文有詳細(xì)描述，來尋找OB多肽類似物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明試圖篩選這些 文庫來尋找能結(jié)合抗OB多肽抗體尤其是抗人類OB多肽抗體的復(fù)合物。另一方面，一旦鑒 定出OB受體(見下文)，任何本領(lǐng)域已知的篩選技術(shù)均可用來篩選OB抗體激動劑或拮抗 物。本發(fā)明試圖篩選小分子配體或配體類似物和模仿物，以及篩選結(jié)合并激動或拮抗體內(nèi) 激活OB受體的天然配體。了解受體的一級序列以及該序列與已知功能的蛋白質(zhì)的相似性，可提供關(guān)于該蛋 白質(zhì)的激動劑與拮抗物的初步線索。例如用X射線晶體學(xué)、中子散射、核磁共振光譜和其它 確定結(jié)構(gòu)的技術(shù)確定該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征可進(jìn)一步幫助鑒定與篩選拮抗物。這些技術(shù)使激 動劑與拮抗物的設(shè)計(jì)或鑒定更加合理。另一方法用重組噬菌體產(chǎn)生大的文庫。利用“噬菌體法” [Scott等人，科學(xué)， 249 386-390(1990) ；Cwirla 等人，美國國家科學(xué)院院刊 87 6378-6382 (1990) ；Devlin 等 人，科學(xué)，249:404-406(1990)]，可構(gòu)建很大的文庫(IO6-IO8化學(xué)實(shí)體)。再一種方法主 要是化學(xué)方法，例子有Geysen法[Geysen等人，分子免疫學(xué)(Molecular Immunology) 23 709-715(1986) ;Geysen 等人，免疫方法雜志(J. Immunologic Method)102 259-274(1987)]和最近的 Fodor 法，F(xiàn)odor 等人，科學(xué)，251 :767_773 (1991)。Furka，等 人，14屆國際生物化學(xué)大會，卷5，提要FR :013 (1988) ；Furka，國際肽蛋白研究雜志，37 487-493(1991)] ；Houghton(美國專利 4，631，211 號，1986 年 12 月出版)；和 Rutter 等人 (美國專利5，010，175號，1991年4月23日出版)描述了生產(chǎn)經(jīng)檢驗(yàn)是激動劑或拮抗物的 肽類的混合物的一些方法。另一方面，一些合成文庫(Needels等人，美國國家科學(xué)院院刊，90 10700-10704(1993)) ；Lan等人，國際發(fā)明出版物W092/00252號，二者均在此引入作為參 考]等可用來篩選本發(fā)明的OB受體的配體。對這些文庫，不必真的克隆OB受體就能用表 達(dá)受體的細(xì)胞檢驗(yàn)受體拮抗物。此外，可進(jìn)行可溶性配體結(jié)合那些表達(dá)重組形式OB受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞 的檢驗(yàn)。可溶性配體可由現(xiàn)成的重組或合成OB多肽提供。可對表達(dá)OB受體的重組細(xì)胞進(jìn)行篩選，或備選地用例如上述重組生產(chǎn)純化的受 體蛋白。例如，標(biāo)記的，可溶的或增溶的OB受體，包括分子的配體結(jié)合部分，結(jié)合配體的能 力可用來篩選文庫，描述見上述參考文獻(xiàn)。OB多肽的衍生物通常本蛋白(其中術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括“多肽”，除非有其它說明)可通過在蛋白 質(zhì)部分連上一個或多個化學(xué)部分來衍生?；瘜W(xué)修飾的衍生物可進(jìn)一步配制用于動脈內(nèi)，腹 腔內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)，口服，鼻腔，直腸，口腔，舌下，肺部，局部，透皮(transdermal)或其它給藥途徑。已發(fā)現(xiàn)在某些情況下化學(xué)修飾有生物活性的蛋白質(zhì)有附加的優(yōu)點(diǎn)，例如 提高了治療用蛋白的穩(wěn)定性和循環(huán)時間以及降低了免疫原性。見美國專利4，179，337號， Davis等人，1979年12月18日出版。綜述見Abuchowski等人“可溶性聚合物-酶加合物”， 酶的藥物應(yīng)用(Enzymes as Drugs) 367-383 頁，Holcenberg 與 Roberts 編，Wiley 國科科學(xué) 出版社，紐約，紐約州(1987)。描述蛋白修飾與融合蛋白的綜述文章見Francis，生長因子 研究(Focus on Grondh Factors)，3 :4_10 (1992)。衍生用化學(xué)基元適用于衍生化的化學(xué)基元可選自水溶性聚合物。所選聚合物應(yīng)溶于水，以使結(jié)合 上的蛋白質(zhì)不會在含水環(huán)境如生理環(huán)境下沉淀。優(yōu)選地，若制備終產(chǎn)物用于治療，聚合物應(yīng) 是醫(yī)藥上可接受的。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員選取所需聚合物時應(yīng)注意以下幾點(diǎn)如聚合物/蛋白 質(zhì)結(jié)合物能否用于治療，若能，所需劑量，循環(huán)時間，對蛋白水解的抗性等。對于本處蛋白質(zhì) 與肽，可用這里提供的檢驗(yàn)來確證它們。聚合物分子水溶性聚合物可選自，例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡 聚糖聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二茂烷，聚1，3，6_三環(huán)氧乙烷，乙烯/馬來酸酐共 聚物，聚氨基酸(同聚物或隨機(jī)共聚物)，和葡聚糖或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙 烯甘油同聚物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物，聚氧乙烯化聚醇和聚乙烯醇。聚乙二醇 丙醛可能會因其在水中的穩(wěn)定性而在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。聚合物分子量可為任意值，可分支或不分支。對于聚乙二醇，優(yōu)選的分子量在約 2KDa到約IOOKDa之間(術(shù)語“約”表明在聚乙二醇制備過程中，有些分子分子量比上述分 子量大，有些分子的分子量小)，處理與制造時方便。根據(jù)所需治療條件(例如所需持續(xù)釋 藥的時間，如果有的話，對生物活性的作用，處理時的方便性，抗原性的大小或有無以及聚 乙二醇對治療蛋白或類似物的其它已知作用)可以采用其它大小的分子。聚合物/蛋白質(zhì)比這樣連上的聚合物分子數(shù)會有變化，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以弄清這對功能的影響。 我們可以用相同或不同的化學(xué)基元單衍生或雙衍生，三衍生，四衍生或提供一些衍生的組 合。聚合物分子在反應(yīng)混合物中的濃度可變，聚合物分子對蛋白質(zhì)(或肽)分子的比例也 可變。通常最佳比例(相對反應(yīng)效率而言，反應(yīng)不再存在過剩的未反應(yīng)蛋白質(zhì)或聚合物) 的決定因素有例如所需的衍生程度(例如單，雙，三衍生等)所選聚合物的分子量，聚合物 是否分支，反應(yīng)條件等?；瘜W(xué)基元與蛋白質(zhì)的連接聚乙二醇分子(或其它化學(xué)基元)連到蛋白上時要考慮到對蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu) 或抗原結(jié)構(gòu)域的影響。對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說有許多連接方法，例如EP0401384引入此處 作為參考(將PEG偶聯(lián)到G-CSF上)。又見Malik等人，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)(Exp. Hematol.) 20 1028-1035(1992)(報(bào)道用tresyl氯化物進(jìn)行的GM-CSF聚乙二醇化)。例如，聚乙二醇可通 過反應(yīng)基團(tuán)如游離的氨基或羧基共價連到氨基酸殘基上。反應(yīng)基團(tuán)即那些可連上激活的聚 乙二醇分子的基團(tuán)。具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基，具 有游離羧基的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C末端氨基酸氨基酸殘基。巰 基也可用作連接聚乙二醇分子的反應(yīng)基團(tuán)。用于醫(yī)療目的優(yōu)選的是連到氨基上，例如連到
27N末端或賴氨酸基團(tuán)上。如果需要結(jié)合受體就應(yīng)避免連接到結(jié)合受體重要的殘基上。N末端化學(xué)修飾的蛋白人們可能特別需要N末端化學(xué)修飾的蛋白。用聚乙二醇作為本組合物的說明，可 選用不同聚乙二醇分子(根據(jù)分子量，分支等)，反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子對蛋白質(zhì)(或 肽)分子的比例，要執(zhí)行的聚乙二醇化反應(yīng)的類型，以及得到所選N末端聚乙二醇化蛋白的 方法?？梢詮拇罅烤垡叶蓟鞍追肿又屑兓疦末端聚乙二醇化材料來獲取N末端聚乙二 醇化制備物(即若有必要將該部分與其它單聚乙二醇化部分分開)。可通過還原性烷基化 利用對某一特定蛋白質(zhì)可用來衍生化的不同類型一級氨基(賴氨酸與末端)的差別反應(yīng)性 實(shí)現(xiàn)選擇性N末端化學(xué)修飾。適當(dāng)反應(yīng)條件下能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)N末端與含羥基的聚合物基本 上選擇性的衍生。例如，在某一 PH下反應(yīng)，利用賴氨酸殘基ε-氨基與蛋白質(zhì)N末端殘基 α -氨基的PKa差別，選擇性N末端聚乙二醇化蛋白質(zhì)。通過這樣的選擇性衍生可以控制水 溶性聚合物連到蛋白質(zhì)上與聚合物的偶聯(lián)主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的N末端，其它反應(yīng)基團(tuán)例 如賴氨酸側(cè)鏈氨基沒有發(fā)生顯著修飾。利用還原性烷基化，水溶性聚合物可為上述類型并 僅有一個與蛋白質(zhì)偶合的反應(yīng)性醛基。可用含有單個反應(yīng)醛基的聚乙二醇丙醛。與OB多肽相關(guān)聯(lián)的核酸如下述，本發(fā)明涉及編碼多肽的核酸及相關(guān)聯(lián)的OB基因5' ,3'和內(nèi)含子的基因 組非編碼序列。因此，根據(jù)本發(fā)明可采用本領(lǐng)域的常規(guī)分子生物學(xué)，微生物學(xué)和重組DNA技 術(shù)。文獻(xiàn)中有這些技術(shù)的詳述。見例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，冷泉港 出版社，冷泉港，紐約(1989) ；Glover編，DNA克隆實(shí)用方法，卷I和II，MRL出版有限公司， 牛津，聯(lián)合王國(1985) ；Gaif編，寡聚核苷酸合成，牛津大學(xué)出版社(1984) ；Hames等人編， 核酸雜交。斯普林格出版社(1985) ；Hames等人編，轉(zhuǎn)錄與翻譯，牛津大學(xué)出版社(1984)； Freshney編，動物細(xì)胞培養(yǎng)，牛津大學(xué)出版社(1986)；固定化細(xì)胞和酶，TRL出版社(1986)； Perbal，分子克隆實(shí)用指南，Wiley紐約(1984)。與本發(fā)明尤其相關(guān)的是基于熟知的聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的對基因或核酸的分離，克隆，測序，分析與定性?！皬?fù)制子”是任何在體內(nèi)作為DNA復(fù)制的自主單位起作用的，即能受自身控制而復(fù) 制的遺傳元件(例如質(zhì)粒，染色體，病毒)?！拜d體”是一個復(fù)制子，例如質(zhì)粒，噬菌體或粘粒，可連上另一段DNA使連上的片段 得以復(fù)制。“盒”指一段可在特點(diǎn)限制位點(diǎn)插入載體的DNA。DNA片段編碼一段感興趣的多肽， 盒與限制位點(diǎn)被設(shè)計(jì)成使盒插進(jìn)正確的閱讀框架來轉(zhuǎn)錄與翻譯。“異源"DNA指不是天然存在于細(xì)胞中或細(xì)胞的染色體位點(diǎn)上的DNA。優(yōu)選地，異源 DNA包括對細(xì)胞來說是外來的基因。若外源或異源DNA引入細(xì)胞，則該細(xì)胞被該DNA “轉(zhuǎn)染”了。若轉(zhuǎn)染DNA造成表型 改變則該細(xì)胞被異源或外源DNA “轉(zhuǎn)化”了。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化DNA整合(共價連接)進(jìn)構(gòu)成細(xì) 胞基因組的染色體DNA中。“克隆”是通過減數(shù)分裂來自單個細(xì)胞或共同祖先的一群細(xì)胞。“核酸分子”指核糖核酸(腺苷，鳥苷，尿苷或胞苷，“RNA分子”)或脫氧核糖核酸 (脫氧腺苷，脫氧鳥苷，脫氧胸腺苷或脫氧胞苷；“DNA分子”的磷酸酯聚合物形式，或是單鏈 或是雙鏈螺旋。也可能是雙鏈DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語核酸分子特別是DNA或RNA分子，僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，而不限制于任何特定的三級或四級形式。因 此，該術(shù)語特別包括線狀或環(huán)狀DNA分子(例如限制片段)質(zhì)粒和染色體中的雙鏈DNA。討 論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，可根據(jù)常規(guī)在指述序列時僅給出沿RNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5'到 3'方向序列(即該鏈的序列與mRNA同源)。“重組DNA分子”是經(jīng)過分子生物操作的DNA 分子。如果一個核酸分子單鏈形式在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件(見Sambrook等 人，1989，引文見上)下與另一核酸分子退火，則該核酸分子與另一核酸分子，如cDNA，基因 組DNA或RNA，“可雜交”。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”。對于初步篩選同源 核酸，可用對應(yīng)于55°C Tm的低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件，例如，5 X SSC，0. 1% SDS0. 25%牛奶，無甲 酰胺；或30%甲酰胺，5X SSC，0. 5% SDS0中等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)高些的Tm，例如，40%甲 酰胺，與5X或6 X SCC。高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)最高的Tm，例如50%甲酰胺，5X或6XSCC。 雜交要求兩個核酸含有互補(bǔ)序列，盡管依賴雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性可能有殘基之間的錯配。核酸雜 交的合適嚴(yán)謹(jǐn)性依賴核酸長度和互補(bǔ)程度，這些變量在本領(lǐng)域廣為人知。兩段核苷酸序列 相似或同源程度越大，具有該序列的核酸雜交體的Tm值越高，核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對 應(yīng)于較高Tm)按下列順序遞降RNA:RNA，DNA:RNA, DNA:DNA。長度超過100個核苷酸的雜 交體已得到計(jì)算Tm的方式(見Sambrook等人，1989，引文見上9. 50-9.51)。對于較短核酸 即寡聚核苷酸的雜交，錯配的位置就比較重要，并且寡聚核苷酸的長度決定其特異性(見 Sambrook等人，1989，引文見上11. 7-11. 8)。優(yōu)選地，雜交核酸的最小長度是至少約10個 核苷酸；更優(yōu)選地至少約15個核苷酸；最優(yōu)選地至少約20個核苷酸?！巴粗亟M”指載體上外來DNA序列插入染色體中。優(yōu)選地，同源重組對載體定向到 特定染色體位點(diǎn)。對專一性同源重組，載體有足夠長的區(qū)段與染色體序列同源，才能夠互補(bǔ) 結(jié)合并加入染色體中。同源區(qū)段越長，序列相似程度越大，越有可能提高同源重組的效率。DNA “編碼序列”是在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下體外或體內(nèi)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯的 雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5'端(氨基端)的起始密碼子和3'(羧基)端的轉(zhuǎn) 錄終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于原核生物序列，真核mRNA得到的cDNA，真核 (例如哺乳動物的)DNA的基因組DNA序列，甚至是合成DNA序列。若編碼序列要在真核細(xì) 胞中表達(dá)，多聚腺苷化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3'。OB編碼和包圍序列的分離本發(fā)明涉及的核酸也包括編碼諸如圖IA至D (SEQ ID NO 2)，圖3 (SEQ ID NO 4) 圖5(SEQ ID NO 5)和圖6(SEQ ID NO 6)給出的肽類的表達(dá)的核酸。相應(yīng)地，一旦特異性 DNA被分離出來并相對ob基因測序，任何動物細(xì)胞均可以作為核酸來源，用于編碼本發(fā)明 肽類的基因的分子克隆。可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從克隆的DNA(例如DNA “文庫”)中， 用化學(xué)合成，用cDNA克隆，或用基因組DNA克隆或用從所需細(xì)胞中純化的片段克隆，得到 DNA (見Sambrook等人，1989，引文見上；Glover, 1985，引文見上)?；蚪MDNA得到的克隆 可以除編碼區(qū)之外還有調(diào)節(jié)DNA區(qū)和內(nèi)含子DNA區(qū)；由cDNA得到的克隆不含內(nèi)含子序列。 無論來源如何，基因應(yīng)當(dāng)分子克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中使基因增殖。從基因組DNA分子克隆基因時，基因組DNA可用選自cDNA序列的引物來擴(kuò)增。備 選地，產(chǎn)生DNA片段，其中有些編碼所需基因?？捎枚喾N限制性酶在特定位點(diǎn)切割DNA。也 可用DNase連同鎂將DNA切成片段，或例如用超聲處理將DNA物理剪切。線型DNA片段然
29后可根據(jù)大小用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分開，這些技術(shù)包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱 層析。一旦生成了 DNA片段，可用許多方法鑒定含有所需ob或類ob基因的特異性DNA片 段。例如，若擁有一定量的ob或類ob基因或其特異性RNA的一部分或其片段，并能純化， 標(biāo)記，即可用核酸與標(biāo)記的探針雜交對生成的DNA片段進(jìn)行篩選[Benton等人，科學(xué)，196 180(1977)，Grunstein等人，美國國家科學(xué)院院刊，72 :3961 (1975)]。本發(fā)明提供了核酸 探針，可以從此處公開的特異性序列方便地制取，例如雜交探針，其核苷酸序列對應(yīng)于圖IA 至E (SEQ ID NO 1)或圖2A和B (SEQ IDNO 3)描繪的序列的至少10個，優(yōu)選地15個核苷 酸的片段。優(yōu)選地，選擇對本發(fā)明的調(diào)控物肽高度專一的片段。與探針有相當(dāng)多同源性的 DNA片段將雜交。如上述，同源程度越大，就可用越嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。在一個實(shí)施方案中，用 低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件來鑒定同源的調(diào)控物肽。然而，從優(yōu)選地方面看，如此處實(shí)驗(yàn)顯示，編碼 本發(fā)明的調(diào)控物肽的核酸會在與具有圖IA至E (SEQ ID NO 1)或圖2A*B(SEQ ID NO 3) 描繪的核苷酸序列的核酸，或其可雜交片段在中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交；更優(yōu)選地，將在高度 嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交。此外，可用基于基因表達(dá)產(chǎn)物的物理，化學(xué)或免疫的特性的檢驗(yàn)方法來檢測基因 的存在。例如，可選擇cDNA克隆或雜交選擇正確mRNA的DNA克隆，它們產(chǎn)生的蛋白，例如 具有與已知本調(diào)控物肽相似或相同的電泳遷移，等電聚焦行為，蛋白水解消化圖譜，酪氨酸 磷酸酶活性或抗原性質(zhì)。例如，本發(fā)明的抗體可方便地用來從其它來源中篩選調(diào)控物肽的 同源物。編碼本發(fā)明的調(diào)控物肽的基因亦可用mRNA選擇來鑒定，即用核酸雜交然后體外 翻譯。該方法中，通過雜交用片段來分離互補(bǔ)mRNA。這樣的DNA片段可能代表可獲得的純 化調(diào)控物DNA。對分離到的mRNA產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物作免疫沉淀分析或功能檢驗(yàn)(例如 酪氨酸磷酸酶活性)。鑒定具有所需序列的mRNA，因而也鑒定具有所需序列的互補(bǔ)DNA片 段。另外，可通過將細(xì)胞中分離得的多核糖體吸附到專一性抗調(diào)控物肽的固定抗體上，選擇 特異性mRNA。以所選擇的mRNA (來自吸附的多核糖體)為模板可合成放射性標(biāo)記的調(diào)控物肽 cDNA。放射性標(biāo)記的mRNA或cDNA，然后可用做探針，從基因組DNA片段中鑒定出同源的調(diào) 控物肽DNA片段。如上述，此處公開的編碼體重調(diào)控物肽的DNA序列可以不由克隆而是合成地制 備。該DNA序列可設(shè)計(jì)得帶有對體重調(diào)控物肽氨基酸序列適當(dāng)?shù)拿艽a子。一般地，若該序 列用于表達(dá)則選擇對預(yù)定宿主優(yōu)選的密碼子。從用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的相互交疊的寡聚核苷酸 組裝完整序列進(jìn)而組裝完整的編碼序列。見例如Edge，自然，292 :756(1981) ；Nambair等 人，科學(xué)，223 1299 (1984) ；Jay 等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chen.) 259 =6311(1984) 合成DNA序列可方便地構(gòu)建能表達(dá)上述體重調(diào)控物類似物的基因。此外，編碼類 似物的DNA可將天然OB基因或cDNA定點(diǎn)突變制得，該類似物可直接用常規(guī)多肽合成法制 得。有關(guān)將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地加入蛋白質(zhì)一般方法的描述見Noren等人，科 學(xué)，244 182-188(1989)。該方法可用來制備帶有非天然氨基酸的ob多肽類似物。非編碼的核酸
本發(fā)明涉及對可用于在翻譯水平干擾體重調(diào)控物蛋白表達(dá)的反義核苷酸或核酸 酶的制備。該方法用反義核酸和核酸酶阻遏特異mRNA的翻譯，或是用反義核酸屏蔽掉mRNA 或?qū)RNA用核酸酶切割。反義核酸是與特定mRNA分子的至少一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子[見Weintraub， 科學(xué)美國人，(Sci.Am. )262 40-46 (1990) ；Marcus-Sekura,分析生物化學(xué)(Anal. Biochem) 172 :289-295 (1988)]。它們在細(xì)胞中與該mRNA雜交形成雙鏈分子。細(xì)胞不翻 譯形成雙鏈形式復(fù)合物的mRNA。因此，反義核酸干擾mRNA表達(dá)成蛋白質(zhì)。與AUG起始密 碼子雜交的分子和約15個核苷酸的寡聚物會特別有效，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀缀铣?，并且引入?產(chǎn)體重調(diào)控物肽的細(xì)胞中對與大分子相比問題較少。反義法可以用來體外抑制許多基因 的表達(dá)[Marcus-Sekura, 1988，引文見上；Hambor等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.)，168 1237-1245(1988)]。核酸酶是具有特異性切割其它單鏈RNA分子能力的RNA分子，切割方式與DNA限 制性內(nèi)核酸酶有些相似。觀察到某些mRNA能切除其自身的內(nèi)含子，才發(fā)現(xiàn)了核酸酶。通過 修飾這些RNA的核苷酸序列，研究人員已能夠設(shè)計(jì)制造識別RNA分子中特異性核苷酸序列 并切割它的分子[Cech，美國醫(yī)學(xué)會雜志(J. Am. Med. Assoc.) ], 260 =3030-3034 (1988) 由 于其序列特異性，僅僅是具有特殊序列的mRNA被失活。研究者已鑒定兩種核酸酶，四膜片型與“錘頭”型。四膜片型核酸酶識別四堿基序 列。而“錘頭”型識別11到18堿基序列。識別的序列越長，越有可能排它性地在靶mRNA種 類發(fā)生識別，因而，錘頭型核酸酶比四膜蟲型核酸酶優(yōu)選用來使特異性mRNA種類失活，18 堿基識別序列優(yōu)于較短的識別序列。這里描述的DNA序列于是可用于制備針對體重調(diào)控物蛋白及其配體的反義分子 或切割體重調(diào)控物蛋白及其配體的mRNA的核酸酶，從而抑制ob基因的表達(dá)，導(dǎo)致體重增加 與肥胖。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與OB核酸編碼鏈或互補(bǔ)鏈，或OB基因編碼區(qū)5'， 3'或內(nèi)部(內(nèi)含子的)非編碼區(qū)互補(bǔ)的短寡聚核苷酸。這樣的核酸可用做探針-直接標(biāo) 記的寡聚核苷酸探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物-來評價ob基因中突變是否存在或OB mRNA 的表達(dá)水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的非編碼核酸來自人類OB基因。在特定的實(shí)施方案中，非編碼核酸能進(jìn)行使OB基因附近的可擴(kuò)增基因和/或其 它調(diào)節(jié)基因整合的同源重組，例如，使OB多肽高水平表達(dá)，或克服ob基因調(diào)節(jié)序列上阻止 OB多肽正常水平表達(dá)的突變。(見國際專利出版物，WO 91/0666，1991年5月16日出版， Skoultchi ；國際專利出版物WO 91/09955號，1991年7月11日出版，Chappel ；以及國際專 利出版物 WO 90/14092 號，1990 年 11 月 29 日出版，Kucherlapati 和 Campell)。牛產(chǎn)多肽表汰與合成轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是使編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動 子，增強(qiáng)子，終止子等。真核細(xì)胞中多聚腺苷化信號是控制序列。若RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后反式RNA被拼接和翻譯成由編碼序列 編碼的蛋白質(zhì)，則該編碼序列“受控于”細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列?！靶盘栃蛄小卑谟诩?xì)胞表面表達(dá)的蛋白的編碼序列前端。該序列編碼位于成熟 多肽N末端的信號肽，指導(dǎo)宿主細(xì)胞將多肽轉(zhuǎn)移。術(shù)語“轉(zhuǎn)移信號序列”在這里也用來指這類信號序列。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移信號序列與直核生物和原核生物內(nèi)天然存在的許多蛋白質(zhì)相聯(lián)系， 并且常在兩類生物體中行使功能。若一段表達(dá)控制序列控制并調(diào)節(jié)一段DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，則該DNA序列，“經(jīng) 操作連接”該表達(dá)控制序列。術(shù)語“經(jīng)操作連接”包括在待表達(dá)DNA序列前頭有合適的起始 信號(例如ATG)并保持正確的閱讀框架，使DNA序列在表達(dá)控制序列的控制下表達(dá)，并生 產(chǎn)該DNA序列編碼的所需產(chǎn)物。若需要插入重組DNA分子的基因不含有適當(dāng)?shù)钠鹗夹盘枺?則可將起始信號插入基因上游(5')并與基因同閱讀框。“啟動子序列”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)編碼序列的轉(zhuǎn) 錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了明確含義本發(fā)明，啟動子序列3'端是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并向上游(5' 方向)延伸，包括在本底以上可檢測到的水平起始轉(zhuǎn)錄所必要的最小數(shù)目的堿基或成分。 啟動子序列中有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可方便地用例如核酸酶SI定位來定義)，以及結(jié)合RNA聚 合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(一致序列)。本發(fā)明的另一特征是這里公開的DNA序列的表達(dá)。正如本領(lǐng)域所熟知的，將DNA 序列經(jīng)操作連接到適當(dāng)表達(dá)載體上的表達(dá)控制序列上，再用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)膯渭?xì)胞 宿主即可表達(dá)該DNA序列。將本發(fā)明的DNA序列這樣經(jīng)操作表達(dá)控制序列，若起始密碼子ATG不是該DNA序 列之一部分，當(dāng)然也包括將該密碼子加到該DNA序列的正確閱讀框架上。很多宿主/表達(dá)載體組合可用來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)載體，例如， 可包括染色體，非染色體或合成DNA序列的片段。適當(dāng)?shù)妮d體包括SV40的衍生物和已知細(xì) 菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌質(zhì)粒col El, pCRl，pBR322, pMB9, pUC或PUC質(zhì)粒衍生物，例如pGEX 載體，PET載體，pmal-C，pFLAG等及其衍生物，質(zhì)粒如RP4 ；噬菌體DNA，例如大量的λ噬菌 體的衍生物，例如ΝΜ989，和其它噬菌體DNA，例如MB和纖維狀單鏈?zhǔn)删wDNA ；酵母質(zhì)粒如 2μ質(zhì)?；蚱溲苌?；用于真核細(xì)胞的載體，如用于昆蟲或哺乳動物細(xì)胞的載體；得自質(zhì)粒 與噬菌體DNA組合的載體，如經(jīng)修飾采納了噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；以及其 它。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在產(chǎn)甲基酵母，例如巴斯德畢赤氏酵母中實(shí)現(xiàn)ob表達(dá)(見例如，國 際專利出版物WO 90/03431號1990年4月5日出版，Brierley等人；國際專利出版物WO 90/10697號，1990年9月20日出版，Siegel等人)。在特定的實(shí)施方案中，見下，構(gòu)造了使 ob在α-交配因子信號序列控制下表達(dá)的表達(dá)載體。許多表達(dá)控制序列的任一種-控制經(jīng)操作連接于其它的DNA序列表達(dá)的序列_可 用于這些載體來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這樣的有用表達(dá)控制序列包括，例如，SV40的早 期或晚期啟動子，CMV,牛痘，多瘤或腺病毒，Iac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC系統(tǒng)，TRC系統(tǒng)，LTR系 統(tǒng)，λ噬菌體的主要操縱基因和啟動子區(qū)，fd外殼蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶或其 它蛋白水解酶的啟動子，酸性磷酸酶的啟動子(例如Pho5)，產(chǎn)甲基酵母的AOXl啟動子，酵 母α -交配因子的啟動子，以及其它已知能控制原核或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的序 列，及其多種組合。許許多多單細(xì)胞宿主細(xì)胞也可用來表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這些宿主包括熟知 的真核和原核宿主，例如大腸桿菌，假單胞菌，芽孢桿菌，鏈霉菌的菌株；真菌如酵母(釀酒 酵母，以及產(chǎn)甲基酵母如畢赤氏酵母、假絲酵母、漢遜氏酵母和球擬酵母)還有動物細(xì)胞如 CHO, Rl. 1，B-W和LM細(xì)胞，非洲青猴腎細(xì)胞(例如C0S1，C0S7，BSC1，BSC40和BMT10)，昆蟲
32細(xì)胞(例如Sf9)和組織培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞和植物細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解并不是所有載體，表達(dá)控制序列和宿主在表達(dá)本發(fā)明的DNA序列時都同 樣好地行使功能。也不是所有宿主對同一表達(dá)系統(tǒng)均能很好地行使功能。然而，本領(lǐng)域?qū)?業(yè)人員不用超出本發(fā)明的范圍也不必做過多的實(shí)驗(yàn)即可選擇合適的載體，表達(dá)控制序列和 宿主獲得所需的表達(dá)。例如選擇載體時必須試圖到宿主。因?yàn)檩d體必須在宿主中起作用。 還需試圖載體的拷貝數(shù)，控制拷貝數(shù)的能力，任何其它該載體編碼的蛋白如抗生素標(biāo)記的 表達(dá)。選擇表達(dá)調(diào)節(jié)序列時通常要試圖許多因素。這包括，例如，系統(tǒng)的相對強(qiáng)度，其可 控性，它與待表達(dá)的特定DNA序列或基因的相容性，特別是潛在的二級結(jié)構(gòu)。選擇適當(dāng)?shù)膯?細(xì)胞宿主時需注意，例如，它們與所選載體的相容性，它們的分泌特征，它們正確折疊成蛋 白質(zhì)的能力，它們的發(fā)酵要求，以及待表達(dá)的DNA序列編碼的產(chǎn)物對宿主的毒性，表達(dá)產(chǎn)物 是否容易純化。注意到這些及其它因素，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將會構(gòu)建許多載體/表達(dá)控制序列/宿 主組合來用發(fā)酵方法或在大規(guī)模動物培養(yǎng)物中表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。在特定的實(shí)施方案中可表達(dá)OB融合蛋白。OB融合蛋白含有至少一個功能活性部 分的非OB蛋白以肽鍵連到至少一個功能活性部分的OB多肽上。非ob序列可以在OB的氨 基或羧基端。更優(yōu)選地，為使蛋白水解活性弱的OB融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)，非OB融合蛋白部分 以肽鍵連接到OB蛋白的氨基端。編碼這種融合蛋白的重組DNA分子含有編碼至少一個功 能活性部分的非OB的的序列在框地連到OB編碼序列上，并優(yōu)選地編碼特異性蛋白酶。例 如凝血酶或Xa因子的切割位點(diǎn)，優(yōu)選地位于OB-非OB結(jié)合處。在特定的實(shí)施方案中，融合 蛋白在大腸桿菌或巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，見下，制備含有或不含有g(shù)ln-49的密碼子的載體，它能細(xì) 菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母(畢赤氏)表達(dá)系統(tǒng)中以融合蛋白形式表達(dá)鼠類和人類ob基因。用PCR 和新的引物制備ob基因，使其帶有內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。最好能驗(yàn)證PCR產(chǎn)生的序列，因?yàn)橛?該技術(shù)引入點(diǎn)突變的可能性大。用帶有組氨酸標(biāo)志和蛋白水解切割位點(diǎn)的質(zhì)粒。組氨酸存 在便能在Ni螯合柱上或用親和性純化選擇性分離出重組蛋白。下面的特定實(shí)施方案中的 蛋白水解切割位點(diǎn)，凝血酶切割位點(diǎn)，設(shè)計(jì)成用蛋白酶如凝血酶處理后釋放出全長的成熟 (即沒有信號序列)OB多肽。另一方面可用pGEX載體(Smith等人，基因，67 :31_40 (1988))。該載體將日本裂 體吸蟲(Schistosoma japonicun)轉(zhuǎn)移酶cDNA融合到感興趣序列上。收獲細(xì)菌蛋白質(zhì)，然 后在還原型谷胱甘肽親和柱上很快地純化重組蛋白質(zhì)。接著用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化可以 從融合蛋白上切除GST載體。切除后，可通過谷胱甘肽瓊脂糖吸附去掉載體和未切割的融 合蛋白。有時編碼的蛋白不溶于水而使本系統(tǒng)使用有困難。重組蛋白在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)可能導(dǎo)致表達(dá)蛋白的折疊錯誤而需重新折疊。重組蛋 白可在切割前或切割后再折疊，形成有功能活性的OB多肽。OB再折疊步驟可以是(i)蛋 白質(zhì)在含有還原劑的變性緩沖液中溫育，然后(ii)蛋白質(zhì)在含有氧化劑以及優(yōu)選的蛋白 質(zhì)穩(wěn)定劑或無序劑或兩者兼有的緩沖液中溫育。合適的氧還(還原/氧化)劑對包括但不 限于還原型谷胱甘肽/ 二硫化谷胱甘肽，胱氨酸/半胱氨酸，胱胺/半胱胺和2-巰基乙醇 /2-羥基乙基二硫化物，特別地，融合蛋白可以在移入還原性緩沖液之前在變性劑如脲中增溶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在移入還原性緩沖液之前例如離子交換層析或M螯合層 析純化。變性劑包括但不限于脲和鹽酸胍。重組蛋白然后稀釋約至少10倍，優(yōu)選地約100 倍，移入含有氧化劑的氧化緩沖液，例如，但不限于0. IM Tris-HCl，pH8. 0，lmM EDTA，0. 15M NaCl,0. 3M氧化型谷胱甘肽。融合蛋白然后在室溫下氧化緩沖液中溫育約1至約24小時， 優(yōu)選地約2至約16小時。氧化緩沖液可含有蛋白穩(wěn)定劑，例如糖，醇類，或硫酸銨。氧化緩 沖液可進(jìn)一步含有低濃度的無序劑，使不正確的分子之間相互作用不穩(wěn)定從而促進(jìn)正確的 折疊。合適的無序劑包括但不限于去污劑，多醇，L-精氨酸，鹽酸胍和聚乙二醇(PEG)。用足 夠低濃度的無序劑以避免使蛋白質(zhì)變性，這十分重要。再折疊的蛋白質(zhì)應(yīng)濃縮至少10倍， 優(yōu)選地是濃縮它原來稀釋到氧化緩沖液中的倍數(shù)。細(xì)菌發(fā)酵過程也可能得到含有內(nèi)毒素水平超標(biāo)的重組蛋白質(zhì)制品。因而，本發(fā)明 試圖例如用內(nèi)毒素特異性抗體或其它內(nèi)毒素結(jié)合分子除去這類內(nèi)毒素?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)如使 用E-TOXATE試劑(Sigma，圣路易，密蘇里州)或生物檢驗(yàn)方法確定內(nèi)毒素是否存在。除給定的實(shí)施例外，本發(fā)明人試圖使用桿狀病毒，哺乳動物和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) ob蛋白質(zhì)。例如，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，非融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pVL941 (BamHl 克隆位點(diǎn)；Summers)，pVL1393 (BamHI，XbaI, SamI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII 和 PstI 克 隆位點(diǎn)；Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, SamI, XbaI 和 BamHI 克隆位點(diǎn)，可能進(jìn)行藍(lán)/白重組篩選；Invitrogen)，以及融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pAc 700 (BamHI和KpnI克隆位點(diǎn)，其中BamHI識別位點(diǎn)從起始密碼子開始，Summers)，pAc701和 pAc702 (與pAc700相同，但閱讀框架不同)，pAc360 (BamHI克隆位點(diǎn)在多角蛋白起始密碼子 下游36堿基處；Invitrogen (195))，和pBlueBac HisA，B，C (三個不同閱讀框架，有BamHl，， BglII，PstI，NcoI和HindIII克隆位點(diǎn)，用于ProBond純化的N末端肽，以及藍(lán)/白重組篩 選噬菌斑；Invitrogen (220)) ο本發(fā)明試圖應(yīng)用的哺乳動物表達(dá)載體包括帶有可誘導(dǎo)啟動子例如二氫葉酸還原 酶(DHFR)啟動子的載體，例如，帶有DHFR表達(dá)載體的任何載體，或DHFR/氨甲喋呤共擴(kuò)增 載體，例如pED (Pstl, Sail, SbaI, SmaI和EcoRI克隆位點(diǎn)，該載體既表達(dá)克隆的基因又表達(dá) DHFR ；見 Kaufman，分子生物學(xué)當(dāng)代實(shí)驗(yàn)方法(Current Protocols inMolecular Biology), 16. 12(1991))。此外，谷酰胺合成酶/蛋氨酸硫亞胺共擴(kuò)增載體，例如pEE14(HindII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI和BclI克隆位點(diǎn)，其中載體表達(dá)谷酰胺合成酶和克隆的基因； Celltech) 0另一實(shí)施方案中，可用在Epstein Barv病毒(EBV)控制下指導(dǎo)附加體表達(dá) 的載體，例如 pREP4(BamHl，SfiI，XhoI，NheI，HindIII，NheI，PvuII 和 KpnI 克隆位點(diǎn)， 組成性 RSV-LTR 啟動子，濕霉素選擇標(biāo)記，Invitrogen), pCEP4 (BamHl, Sfil，XhoI, NotI, NheI, HindIII，NheI, PvuII和KpnI克隆位點(diǎn)，組成性hCMV近早期基因，濕霉素選擇標(biāo)記； Invitrogen), pMEP4(Kpnl, PvuI, NheI，HindIII，NotI，XhoI，Sfil, BamHl 克隆位點(diǎn)，可誘 導(dǎo)methallothionein IIa基因啟動子，濕霉素選擇標(biāo)記，Invitrogen)，pREP8 (BamHl，XhoI， NotI, Hindlll，NheI和KpnI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動子，組氨醇選擇標(biāo)記，Invitrogen), pREP9 (Kpnl, NheI, Hindlll, NotI, XhoI, Sfil，和 BamHI 克隆位點(diǎn)，RSV-LTR 啟動子，G418 選擇標(biāo)記，Invitrogen)，和pEBVHis (RSV-LTR啟動子，濕霉素選擇標(biāo)記；N-末端肽可用 ProBond樹脂純化并被腸激酶切割；Invitrogen)。本發(fā)明可選用的哺乳動物表達(dá)載體包 括 pRc/CMV(Hindlll, BstXI, NotI, SbaI 和 ApaI 克隆位點(diǎn)，G418 選擇，Invitrogen), pRc/RSV(HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI 克隆位點(diǎn)，G418 選擇標(biāo)記，Invitrogen)及其它。 本發(fā)明可用的牛痘病毒哺乳動物表達(dá)載體(見Kaufman，1991，引文見上)包括但不限于 pSCl 1 (SamI 克隆位點(diǎn)，TK-與 β -gal 選擇)，pMJ601 (Sal I，SamI，Afl I，NarI，BspMI I，BamHI， ApaI，NheI，SacII，KpnI 和 HindIII 克隆位點(diǎn)，TK-與 β -gal 選擇)，以及 pTkgptFIS (EcoRI， PstI，Sail, AccI，HindII，SbaI，BamHI 和 Hpa 克隆位點(diǎn)，TK 或 XPRT 選擇)。根據(jù)本發(fā)明亦可用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)OB多肽。例如，根據(jù)本發(fā)明，僅舉二例非融 合 pYES2 載體(XbaI，SphI, ShoI, NotI，GstXI，EcoRI，BstXI，BamHI ,SacI, Kpnl 和 HimdI11 克隆位點(diǎn)；Invitrogen)或融合 pYESHisA, B, C (XbaI，SphI ,ShoI, NotI，BstI，EcoRI，BstXI， BamHI，SacI,Kpn I和Hind III克隆位點(diǎn)，N末端肽用ProBond樹脂純化并用腸激酶切割， Invitrogen)。從在本發(fā)明范圍內(nèi)獲得的核苷酸序列可進(jìn)一步制取體重調(diào)控物肽類似物。除了重組表達(dá)OB多肽，本發(fā)明預(yù)計(jì)并完全可能用廣為人知且高度發(fā)展的固相肽 合成技術(shù)制備OB多肽或其片段。本發(fā)明試圖用常用的Boc和Fmoc以及其它保護(hù)基因方案 制備ob多肽或其片段。再折疊和將半胱氨酸側(cè)鏈氧化成二硫鍵的各種技術(shù)在本領(lǐng)域廣為 人知。OB多肽的抗體根據(jù)本發(fā)明，重組或化學(xué)合成的OB多肽，片段或其它衍生物或類似物，包括融合 蛋白，可用作免疫原來產(chǎn)生識別OB多肽的抗體。這種抗體包括但不限于多克隆，單克隆，嵌 合，單鏈，F(xiàn)ab片段及Fab表達(dá)文庫。若分子能特異性與免疫系統(tǒng)的抗原識別分子，如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗 原受體，相互作用，則該分子具有“抗原性”?？乖远嚯陌s至少5個，優(yōu)選地約至少10 個氨基酸。分子的抗原性部分可以是以抗體或T細(xì)胞受體識別有免疫顯性的部分，或是可 通過將抗原性部分與免疫用載體分子偶合產(chǎn)生對分子的抗原的部分，有抗原性的分子不一 定有免疫原性，即不需載體引發(fā)免疫應(yīng)答的能力?！翱贵w”是結(jié)合特異性“表位”的任一免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術(shù)語包含 多克隆，單克隆和嵌合抗體，嵌合抗體的進(jìn)一步詳述見美國專利4，816，397號和4，816，567 號，還包含抗體的抗原結(jié)合部分，包括Fab、F(ab' )2和F(V)(包括單鏈抗體)。相應(yīng)地，此 處用的“抗體分子” 一詞及其眾多語法形式既指未經(jīng)處理的免疫球蛋白分子又指含有抗體 結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的免疫活性部分?！翱贵w結(jié)合位點(diǎn)”指專一性結(jié)合抗體，含有重 鏈和輕鏈可變區(qū)和高度可變區(qū)的抗體分子結(jié)構(gòu)部分?？贵w分子的例子有未處理的免疫球蛋白的分子，基本未經(jīng)處理的免疫球蛋白分 子以及免疫球蛋白分子上含有抗原決定簇的部分，包括那些在本領(lǐng)域稱為Fab，F(xiàn)ab'， F(ab' 的部分，這些部分優(yōu)選地用于這里描述的治療方法?；疚唇?jīng)處理的抗體分子用熟知的方法分別用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解可制 備抗體分子的Fab與F(ab' )2部分。見例如美國專利4，342，566 ^,Theofilopolous等。 Fab'抗體分子部分也為人熟知，制備方法是用巰基乙醇還原F(ab' )2部分上連接兩個重 鏈部分的二硫鍵，然后再將得到的蛋白巰醇用試劑如碘乙胺烷基化。此處優(yōu)選的是含有未 經(jīng)處理的抗體分子的抗體?！皢慰寺】贵w”以其各種語法形式指僅含一種能與特定抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體。因而單克隆抗體對與之發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原僅表現(xiàn)單一結(jié)合親和性。因 此單克隆抗體可能含有一種抗體分子，它具有多個抗體結(jié)合位點(diǎn)，每一個位點(diǎn)都是對一種 不同的抗原有免疫特異性，例如，雙特異性(嵌合)單克隆抗體。術(shù)語“佐劑”指一種能增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑可用做緩慢 釋放抗體的組織貯存體，也可用做非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴系統(tǒng)激活物[Hood等人， 《免疫學(xué)》384頁，第二版，Benjamin/Cummings, Menlo Park,加州(1984)]。通常沒有佐劑， 抗原單獨(dú)第一次進(jìn)攻(challenge)不會引起體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于，完 全福氏佐劑，不完全福氏佐劑，皂苷礦物膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，普盧 蘭尼克聚醇，多聚陽離子(polyanions)，肽，油脂或碳水化合物乳劑，鎖孔他血藍(lán)蛋白，二 硝基酚以及可能有用的人類佐劑如BCG(卡介苗)和parvum棒狀桿菌。優(yōu)選地，佐劑是醫(yī) 藥可接受的。本領(lǐng)域已知的多種方法可用來生產(chǎn)對OB多肽或其片段、衍生物或類似物的多克 隆抗體。生產(chǎn)抗體時，可通過注射OB多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)來免疫多種宿 主動物，這些動物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個實(shí)施方案中，OB多肽 或其片段可連到免疫原性載體上如牛血清清蛋白(BSA)或鎖孔仗血藍(lán)蛋白KLH。根據(jù)宿主 種類，可用多種佐劑增加免疫應(yīng)答，包括但不限于(完全或不完全)福氏佐劑，礦物膠如氫 氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克聚醇、多聚陽離子、肽、油脂、鎖孔他血藍(lán) 蛋白、二硝基酚和可能有用的人類佐劑如卡介苗和parvum棒狀桿菌。若制備對OB多肽或其片段，類似物或衍生物的單克隆抗體，可采用任何在培 養(yǎng)物中用連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)。這包括但不限于Kohler等人，自然，256 495-497 (1975)研制的雜交瘤技術(shù)，Kozbar等人，現(xiàn)代免疫學(xué)(Immunology Today) 4 72 (1983)]，和生產(chǎn)人類單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)[Cole等人，單克隆抗體與癌癥治療， 77-96頁，Alan R. Liss公司(1985)]。除了用融合來產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的不死細(xì)胞系，還可用其 它技術(shù)如用癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染。見例如M. Schreier 等人，“雜交瘤技術(shù)”(1980) ；Hammerling等人，“單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤”(1981)； kennett 等人，“單克隆抗體”(1980)；也見美國專利 4，341，761 號；4, 399，121 號，4，427，783 號，4，444，887 號，4，451，570 號，4，466，917 號，4，472，500 號，4，491，632 和 4，493，890 號。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可用最新技術(shù)(PCT/US90/02545)在無種質(zhì)動物體 內(nèi)生產(chǎn)單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明可用人類抗體，人類抗體可用人類雜交瘤[Cote等人， 美國國家科學(xué)院院刊，80 :2026-2030(1983)]或用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人類B細(xì)胞(Cole 等人，1985，引文見上)得到。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，可采用研制的通過對ob多肽特異 性的小鼠抗體分子基因與具有合適的生物活性的人類抗體分子基因拼接，生產(chǎn)“嵌合抗 體” [Morrison 等人，細(xì)菌學(xué)雜志[J. Bacterol. ] 159-870 (1984) ；Neuberger 等人，自然， 312:604-608(1984) ；Takeda等人，自然，314 :452_454 (1985)]。此類人類或人類化嵌合抗 體優(yōu)選地用于人類疾病或功能失調(diào)(描述見下)的治療中，因?yàn)槿祟惢蛉祟惢贵w與異源 抗體相比更不容易引起免疫應(yīng)答，尤其是過敏反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，所描述的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4，946，778號)。經(jīng)修改可 用來生產(chǎn)OB多肽特異性單鏈抗體。本發(fā)明的另一實(shí)施方案利用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù) [Huse等人，科學(xué)，246 1257-1281 (1989)]來快速而方便地鑒定具有所需要的對ob多肽或
36其衍生物或類似物特異性的單克隆Fab片段?？捎靡阎夹g(shù)產(chǎn)生含有抗體分子個體基因型的抗體片段。例如，這樣的片段包 括但不限于，F(xiàn)(ab' )2片段，可用胃蛋白酶消化抗體分子來生產(chǎn)；Fab'片段，用通過還原 F(ab' )2片段的二硫橋來生產(chǎn)；Fab片段，可用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子來生產(chǎn)。生產(chǎn)抗體時，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)篩選所需抗體，例如，放射性免疫檢驗(yàn)， ELISA (酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn))，“三明治”免疫檢驗(yàn)，免疫放射性計(jì)量檢驗(yàn)，凝膠擴(kuò)散沉淀檢驗(yàn)， 免疫擴(kuò)散檢驗(yàn)，原位免疫檢驗(yàn)(例如用膠體金，酶或放射性同位素標(biāo)記)，Western印跡，沉 淀反應(yīng)凝集檢驗(yàn)(例如，凝膠凝集檢驗(yàn)，凝血檢驗(yàn))，補(bǔ)體固定檢驗(yàn)，免疫熒光檢驗(yàn)，蛋白A檢 驗(yàn)和免疫電泳檢驗(yàn)等。在一個實(shí)施方案中，通過檢測初級抗體上的標(biāo)記檢測抗體結(jié)合。在另 一實(shí)施方案中，通過檢測二級抗體或試劑對初級抗體的結(jié)合檢測初級抗體，在另外一個實(shí) 施方案中，二級抗體被標(biāo)記。本領(lǐng)域已知多種方法檢測免疫檢驗(yàn)中的結(jié)合，它們均在本發(fā)明 范圍內(nèi)。例如，為了選擇OB多肽上特異性表位的抗體，可以在生成的雜交瘤中檢驗(yàn)與含有 這種表位的OB多肽片段相結(jié)合的產(chǎn)物。為了從某一特定動物物種中選擇出對OB多肽特異 性的抗體，可根據(jù)與該動物物種的細(xì)胞表達(dá)的或從中分離到的OB多肽的陽性結(jié)合來選擇。前述抗體可用于本領(lǐng)域已知的與OB多肽定位及活性相關(guān)的方法中，例如western 印跡，原位OB多肽定位，在合適的生理樣本中測量OB多肽的水平，等等。在特定的實(shí)施方案中，可生成激動或抑制OB多肽活性的抗體。這些抗體可用下文 描述的用來鑒定配體的檢驗(yàn)方法來檢測。在特定的實(shí)施方案中，用從蛋白序列得來的合成肽或用細(xì)菌表達(dá)載體制的重組蛋 白免疫兔子來研制抗體。如上述，經(jīng)仔細(xì)分析所預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)選擇合成肽。特別地，選 擇假定的切割位點(diǎn)之間的肽序列。將合成肽連接到載體例如KLH血藍(lán)蛋白或用羧二亞胺 的BSA上，連同福氏佐劑，免疫兔子。為制備重組蛋白，用pGEX載體表達(dá)多肽(Smith等人， 1988，引文見上)。備選地，可以僅用親水性結(jié)構(gòu)域生成融合蛋白質(zhì)。批量制備表達(dá)的蛋白 并與福氏佐劑免疫兔子。在另一特定實(shí)施方案中用重組OB多肽免疫小雞，用OB柱親和純化從蛋黃中回收 小雞抗OB抗體。優(yōu)選地，免疫用小雞保持處于無專一性致病毒(SPF)環(huán)境中。另一實(shí)施方案中，從缺少循環(huán)OB蛋白的ob/ob小鼠中制備抗瘠素的抗體，由于這 些小鼠不耐受該多肽，因而預(yù)期可能產(chǎn)生抗OB多肽的應(yīng)答，另外也從野生型小鼠中制備抗 瘠素的抗體。兩組小鼠的脾細(xì)胞可與肌肉瘤細(xì)胞融合制備生產(chǎn)單克隆抗體用的雜交瘤。另一實(shí)施方案中，用重組OB多肽免疫兔子，多克隆抗體在進(jìn)一步使用前要免疫純 化，純化的抗體對半定量檢驗(yàn)特別有用，尤其是檢測OB多肽在血清與血漿中是否存在。得到的抗調(diào)控物肽的一組單克隆抗體可對各種性質(zhì)，即同型(isotype)表位、親 和性等進(jìn)行篩選。特別令人感興趣的是能中和調(diào)控物肽活性的單克隆抗體。這樣的單克隆 可用體重調(diào)控物的活性檢驗(yàn)方便地鑒定。若可以免疫親和性純化天然或重組調(diào)控物，高親 和性抗體也很有用。優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷和治療方法中應(yīng)用的抗調(diào)控物抗體是親和性純化的多克隆 抗體。更優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體(mAb)。另外，此處所用的抗調(diào)控物抗體分子是完整抗 體分子的Fab、Fab'、F(ab' )2或F(V)部分。診斷應(yīng)用
本發(fā)明還涉及許多診斷應(yīng)用，包括檢測影響體重異常或肥胖的情況和/或刺激是 否存在的方法，參照的是它們(情況或刺激)引發(fā)本體重調(diào)控物介導(dǎo)的活性的能力。如前 述，可許多已知技術(shù)體重調(diào)控物肽的抗體，然后分離這些抗體并用于檢測懷疑的靶細(xì)胞中 特定轉(zhuǎn)錄活性是否存在的試驗(yàn)中。備選地，本發(fā)明的核酸可用于診斷中?；诳贵w的診斷如前述，用于本發(fā)明的診斷方法包括用含有有效量的調(diào)控物蛋白拮抗物如抗調(diào)控 物抗體(優(yōu)選的是親和性純化的多克隆抗體，更優(yōu)選的是mAb)的檢驗(yàn)方法檢查細(xì)胞樣本 或培養(yǎng)基。另外此處應(yīng)用的抗調(diào)控物抗體是完整的抗體分子或其Fab、Fab'、F(ab' )2或 F(V)部分。如前述，能受惠于該方法的病人包括癌癥、肥胖癥患者或其它以不正常體重為特 征或因素的情況的患者。分離調(diào)控物，誘導(dǎo)抗調(diào)控物抗體以及確定抗調(diào)控物抗體協(xié)助檢查 靶細(xì)胞的能力并將其最優(yōu)化的方法在本領(lǐng)域廣為人知。另外，抗體，包括多克隆和單克隆抗體，調(diào)控體重調(diào)控物的生產(chǎn)或活性的藥物和其 它識別因子和/或其亞基可能會有某些診斷應(yīng)用，可以，例如用于檢測和/或測量可能或必 能發(fā)生體重異常的情況。例如，調(diào)控物肽或其片段可用于用已知技術(shù)在多種細(xì)胞培養(yǎng)基中 生產(chǎn)多克隆抗體或單克隆抗體，諸如利用例如融合的小鼠膽淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜交 瘤技術(shù)。這些技術(shù)詳述見下。同樣，可發(fā)現(xiàn)或合成模仿或拮抗本發(fā)明的受體識別因子活性 的小分子，并可用于診斷和/或治療方法中。用通?？梢詰?yīng)用的免疫方法可證實(shí)細(xì)胞中體重調(diào)控物的存在。已知一些有用的方 法。三種這樣的方法特別有用，它們利用由可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的受體識別因子，由可檢測標(biāo) 記物標(biāo)記的抗體Ab1，或由可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的抗體Ab2。這些方法可用下述方程總結(jié)，其中 星號表示該顆粒被標(biāo)記，“WM”代表體重調(diào)控物。A. WM*+Ab1 = WlfAb1B. WM+Abi* = WMAb1*C. m+Ab.+Ab* = Ab1WMAb2*這些方法及其應(yīng)用對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員都很熟悉因而可在本發(fā)明范圍內(nèi)應(yīng)用?！案?爭性”方法(方法A)的描述見美國專利3，654，090號和3，850，752號。方法B代表熟知 的競爭性檢驗(yàn)技術(shù)。方法C(“三明治”方法)的描述見美國專利RE31，006號和4，016，043 號。已知其它方法，諸如“雙抗體”或“DASP”方法。每種情況下，體重調(diào)控物與一種或多種抗體或結(jié)合物形成復(fù)合物，其中之一用可 檢測標(biāo)記物標(biāo)記。用已知的用于檢測標(biāo)記物的方法可確定復(fù)合物的形成，若需要的話，及其含量。由上可見，Ab2的特征性質(zhì)是它與Ab1反應(yīng)。這是因?yàn)橐粋€哺乳動物物種產(chǎn)生的Ab1 用作抗原可以在另一物種中產(chǎn)生抗體Ab2。例如，可在山羊中用兔抗體作抗原制得Ab2。Ab2 則為山羊的抗兔抗體。在該描述及權(quán)利要求中，Ab1稱為初級或抗體重調(diào)控物抗體，Ab2稱 作二級或抗Ab1抗體。這類研究中最常用的標(biāo)記物是放射性元素、酶、紫外光下的熒光化合物等。已知一些熒光材料，可用作標(biāo)記物。這包括例如熒光素，羅丹明和金胺。一種特別 的檢測材料是在山羊中制備的抗兔抗體并通過異硫氰基與熒光素結(jié)合。體重調(diào)控物或其結(jié)合物可用放射性元素或酶標(biāo)記?？捎萌我环N現(xiàn)在可得到的計(jì)數(shù)方法檢測放射性標(biāo)記物。優(yōu)選的同位素選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、125I、 131I 和 186Re0酶標(biāo)法同樣有用，并可用現(xiàn)有的色度計(jì)量、光度計(jì)量、熒光光度計(jì)量、電流計(jì)量或 氣體計(jì)量技術(shù)中的任一種來檢測。通過與橋聯(lián)分子如碳二亞胺，二異氰，葡糖醛等反應(yīng)將酶 偶聯(lián)到選定的顆粒上。已知許多酶可用于這些方法并加以采用。優(yōu)選的是的過氧化物酶， β-葡糖苷酸酶，β-D-葡糖苷酸酶，β-D-半乳糖苷酶、脲酶，葡糖氧化酶加過氧化物酶和 堿性磷酸酶。美國專禾U 3，654，090號；3, 850，752號和4，016，043引用了作為其它標(biāo)記材 料與方法的例子。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，可制備適于醫(yī)學(xué)專家使用的試劑盒，來確定在可 疑的靶細(xì)胞中預(yù)先確定的轉(zhuǎn)錄活性或轉(zhuǎn)錄活性能力是否存在。與上述檢驗(yàn)技術(shù)相適應(yīng)，一 類這樣的試劑盒含有至少是標(biāo)記的體重調(diào)控物或其結(jié)合物，例如對其特異性的抗體，其用 法當(dāng)然依賴所造的方法，例如“競爭性” “三明治式” “DASP”等。試劑盒也可含有外圍試劑 如緩沖液穩(wěn)定劑等。相應(yīng)地，可制備檢驗(yàn)用試劑盒來顯示細(xì)胞中預(yù)先確定的轉(zhuǎn)錄活性的存在或能力， 它包含(a)預(yù)定量的至少一種標(biāo)記的有免疫化學(xué)反應(yīng)性的成分，通過將本調(diào)控物或特異 性結(jié)合物直接或間接連到可檢測的標(biāo)記物上得到。(b)其它試劑；和(c)試劑盒的用法。更具體地，診斷試劑盒可以包括(a) 一定量的上述體重調(diào)控物(或結(jié)合物)，通常結(jié)合到固相上形成免疫吸附物， 或備選地結(jié)合合適的標(biāo)志，或多種此類終產(chǎn)物等(或其結(jié)合物)每樣一種；(b)如需要，其它試劑；和(c)試劑盒的用法。在進(jìn)一步的變型中，檢驗(yàn)用試劑盒可制備來用于上述目的，根據(jù)預(yù)定的操作(如 “競爭性” “三明治式” “雙抗體”等)起使用并且包括(a)通過將體重調(diào)控物與可檢測標(biāo)記物偶聯(lián)得到的一種標(biāo)記的組分；(b) 一種或多種附加的免疫化學(xué)試劑，其中至少一種試劑是配體或固定化配體，該 配體選自(i)能與標(biāo)記的組分(a)結(jié)合的配體；(ii)能與標(biāo)記組分(a)的結(jié)合物結(jié)合的配體；(iii)能與至少一種待確定的組分結(jié)合的配體；(iv)能至至少一種待確定組分的至少一種結(jié)合物相結(jié)合的配體；和(c)檢測和/或確定體重調(diào)控物與其特異性結(jié)合物之間免疫化學(xué)反應(yīng)的一個或多 個組分的操縱方法的執(zhí)行說明?；诤怂岬脑\斷由實(shí)施例可見，本發(fā)明的核酸可用來檢測與OB多肽缺陷相關(guān)并導(dǎo)致肥胖表型的 缺陷。例如，核酸探針(例如，Northern分析或RT-PCR分析中)可有來確定肥胖表型是否 與OB mRNA表達(dá)不定，或非功能性O(shè)B mRNA表達(dá)，例如在db/db小鼠中(其中缺陷起因于缺乏OB受體)相關(guān)聯(lián)或是何處突變產(chǎn)生不轉(zhuǎn)錄的mRNA。而且，本發(fā)明的基于核酸的診斷技術(shù) 可與基于抗體的技術(shù)聯(lián)合使用。進(jìn)一步在分子水平了解肥胖或厭食表型。最近分離的人類cDNA克隆被測序，已在這里給出。這就幫助我們確列人類基因 的完整序列(見圖20A至C;SEQ ID NO :22)。得到了人類OB基因內(nèi)含子的DNA序列(圖 20)，該序列被用來制備PCR引物，PCR擴(kuò)增人類基因組DNA的OB基因編碼序列，來鑒定OB 基因的突變或等位變異體，所有這些均與上面詳述的操作方法相符。用來擴(kuò)增人類基因組 OB的PCR引物的描述見下文的特定實(shí)施例中。目前的假說是ob基因的雜合突變與輕微/中度肥胖相聯(lián)系而純合突變與幾種基 于DNA序列的肥胖癥診斷檢驗(yàn)相聯(lián)系。如果該假說成立，就可確證某些人有得肥胖癥的危 險，并且能在體重增加到得肥胖癥之前進(jìn)行藥物治療和/或改變?nèi)说纳盍?xí)慣。此外，以人類OB突變形式分離的雜合子的存在可用于診斷。多種PCR引物，包括 基于圖20A至C給出的核苷酸序列的PCR引物可用于此。OB基因也可用于診斷測量營養(yǎng)失調(diào)中其編碼的RNA和蛋白質(zhì)。知道在某種特定的 營養(yǎng)失調(diào)癥中OB RNA和/或其編碼的蛋白是否不受調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)十分重要。因此，若胖 人OB水平增加，問題應(yīng)當(dāng)發(fā)生在OB下游，而若OB減少，應(yīng)當(dāng)是不適當(dāng)?shù)牡退絆B造成肥 胖(不論缺陷是否在OB基因上)。反過來，若是體重減輕的癌癥或愛滋病患者OB水平升 高，則可下結(jié)論說OB的不正常的高度表達(dá)造成體重減輕?？寺〉娜祟恈DNA可用于測量人類OB RNA的水平。另外，可制備重組人類蛋白用 以研制免疫檢驗(yàn)方法來測量脂肪和，如果可能的話，OB蛋白的血漿水平。治療應(yīng)用本發(fā)明的多肽，核酸和抗體有顯著的治療潛力。優(yōu)選地，治療有效量的該試劑與藥 用載體，稀釋劑或賦形劑一起給藥。術(shù)語“藥用，，指分子實(shí)體或組合物，它們在生理上可耐受，對人類給藥時一般不會 產(chǎn)生過敏或其它不適反應(yīng)，如反胃，眩暈等。優(yōu)選地，此處應(yīng)用的“藥用”指受聯(lián)邦或州政府 的管理部門批準(zhǔn)或列在《美國藥典》或其它動物用，更具體地人用的，受到廣泛承認(rèn)的藥典。 術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑、賦形劑或化合物給藥時的載體(vehicle)。這樣的藥用載體可 以是無菌液體如水和油、包括石油、動物、植物或合成來源的如花生油、礦物油、芝麻油等， 水或鹽溶液和水溶右旋糖和甘油溶液優(yōu)選地用做載體，尤其是用于注射用溶液。適宜的藥 用載體的描述見Martin《雷明頓氏醫(yī)藥科學(xué)》18版，Mark出版公司，Easton，賓州(1990)?！爸委熡行Я俊币辉~在這里用來指足夠使宿主的活性、功能和反應(yīng)降低至少 約15 %，優(yōu)選地至少50 %，更優(yōu)選地至少90 %，最優(yōu)選地完全阻止其臨床上重要的虧缺 (deficit)的量。備選地，治療有效量足以引起宿主中臨床上重要的病情的改善。用重組OB多肽給藥導(dǎo)致體重減輕，特別是脂肪組織減少。OB多肽可用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌和 /或哺乳動物表達(dá)載體，或合成法或從血漿或血清中純化方法制備，所有這些均在前面有詳 述。備選地，用上文描述的同源重組技術(shù)可誘導(dǎo)天然OB多肽表達(dá)增加。OB多肽活性降低(通過利用拮抗物，抑制物，使用中和抗體或反義分子)會導(dǎo)致體 重增加，在治療與癌癥、愛滋病或神經(jīng)性厭食癥相關(guān)的體重減輕時需要體重增加。OB活性的 調(diào)控可用于減輕體重(通過增大其活性)或增加體重(通過降低其活性)?；诙嚯牡闹委熖幚?br> 在最簡單的分析中，OB基因決定哺乳動物，特別是小鼠和人的體重。OB基因產(chǎn)物及相應(yīng)的同源分子看似一種信號途徑的一部分，脂肪組織通過該途徑與腦和其它器官進(jìn)行 通訊。相信OB多肽本身即是信號分子，即激素。OB多肽或其功能活性部分或其拮抗物可以口服或腸胃外給藥，優(yōu)選地腸胃外給 藥，由于代謝自穩(wěn)態(tài)是持續(xù)過程，ob多肽優(yōu)選地要可控地釋放給藥。例如，多肽可通過靜 脈注入，內(nèi)植滲透泵，片下膜，脂質(zhì)體及其它給藥方式給藥。在一個實(shí)施方案中，可用泵 [Langer等人編，《可控釋放技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，CRC出版社Boca Raton，弗羅里達(dá)州(1974)； Sefton, CRC生物醫(yī)學(xué)工程評論與參考，14 =201(1987) ；Buchwald等人，外科(Surgery)88 507(1980)]。Saudek等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志321 :574(1989)]。另一實(shí)施方案中，可用 聚合材料[Langer，1974，引文見上；Sefton, 1987,引文見上；SmoIen等人編，可控藥物生 物供應(yīng)，藥產(chǎn)品設(shè)計(jì)與功能，Wiley，紐約(1984) ；Ranger等人，高分子科學(xué)綜述，高分子 化學(xué)雜志(J. Macromol. Sci. Rev. Macromol Chem. 23 16 (1983),也見 Levy 等人，科學(xué)， 228 190 (1985) ；During 等人，神經(jīng)學(xué)年鑒(Ann. Neurol) 25 :351 (1989) ；Howard 等人，神 經(jīng)外科雜志(J. Neurosurg) 71 105 (1989)。另一實(shí)施方案中，可控釋放系統(tǒng)置于治療目 標(biāo)(即腦)附近，因而僅需全身劑量的一部分量[見例如，(Goodson，可控釋放技術(shù)的醫(yī) 學(xué)應(yīng)用，卷2，115-138頁(1984))。其它可控釋放系統(tǒng)的討論見綜述，Langer，科學(xué)，249 : 1527-1533(1990)。另一實(shí)施方案中，治療化合物通過載體(特別是脂質(zhì)體)給藥(見 Lenger, 1990，引文見上)；Treat等人，傳染病和癌癥治療中的脂質(zhì)體，Lopez-Berestein和 Fidler(編)，Liss，紐約，353-365(1989) ； Lopez-Berestein,出處同上，317-327 頁；見上述 引文。)另一方面，用OB基因轉(zhuǎn)化并高水平表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞可移植入需要ob的受 試者中。優(yōu)選地，移植OB轉(zhuǎn)化的自體細(xì)胞以避免排斥；備選地，可用已知技術(shù)將生產(chǎn)可溶性 因子的非自體細(xì)胞屏蔽在聚合物基質(zhì)中避免免疫識別與排斥。OB多肽可通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用途徑給藥。備選地，OB 多肽經(jīng)適當(dāng)配制，可通過鼻腔或口腔給藥。以必要的時間間隔例如每日、每12小時等給治 療有效劑量的藥(即能有效誘導(dǎo)受試者代謝變化的劑量)可保證OB的恒定供給。這些參 數(shù)依賴待治的疾病的嚴(yán)重程度，相伴的其它措施如食譜調(diào)控，受試者的體重，年齡與性別， 以及其它標(biāo)準(zhǔn)，這些均可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員良好的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)治實(shí)踐來確定。藥物組合物本發(fā)明另一方面提供上述藥物組合物。這些藥物組合物可以供注射給藥，口服，或 肺部，鼻腔及其它給藥方式。一般地，本發(fā)明涉及的藥物組合物含有有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì) 或衍生產(chǎn)物，還有藥用稀釋劑、保鮮劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體、這些成分包括各 種緩沖液成分(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)，pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑；添加劑如去污 劑和增溶劑(例如Tween 80，多聚乙氧基醚，抗氧化劑(例如抗壞血酸，偏二亞硫酸鈉)，保 鮮劑(例如Thimersol，苯醇)和填充物質(zhì)(例如乳糖，甘露醇)；將這些材料加入到顆粒狀 聚合物如聚乳酸、聚葡糖酸等的制劑中或加入脂質(zhì)體中。也可用透明質(zhì)酸。這些組合物可 能影響本蛋白及衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。見例如馬丁， 雷明頓氏醫(yī)藥科學(xué)，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，賓州18042) 1435-1712頁，在此 引入作為參考。組合物可以是液體形式或干粉形式，如凍干形式。
口服此處涉及口服固體制劑形式，綜述見馬丁，雷明頓氏醫(yī)藥科學(xué)，第18版(1990， Mack出版公司，Eastin，賓州18042)第89章，在此引入作為參考。固體制劑形式包括藥片、 膠囊、藥丸、錠劑或糖錠，扁囊劑或小藥丸。另外脂質(zhì)體或蛋白樣膠囊包衣可用于配制本組 合物(見例如美國專利4，925，673號報(bào)道的蛋白樣微球)。可用脂質(zhì)體膠囊包衣，脂質(zhì)體可 用多種聚合物衍生(例如美國專利5，013，556號)。關(guān)于可能用于治療的固體制劑形式的 討論見Marshall，現(xiàn)代醫(yī)藥，第10章，Banker和Rhodes編(1979)，在此引入作為參考。通 常制劑中包括該蛋白質(zhì)(或化學(xué)修飾的蛋白質(zhì))以及使之免受胃內(nèi)環(huán)境破壞的惰性成分， 并在腸內(nèi)釋放出生物活性物質(zhì)。也特別涉及到上述衍生蛋白的口服制劑形式?？梢曰瘜W(xué)修飾蛋白，使衍生物口服 更有效。通常所涉及的化學(xué)修飾是將至少一個部分(moiety)連到蛋白質(zhì)(或肽)分子上， 該部分能夠(a)抑制蛋白水解；和(b)使蛋白(或肽)分子從胃或腸進(jìn)入血流。最好是蛋白 質(zhì)穩(wěn)定性增加并且在體內(nèi)循環(huán)時間增加。這樣的部分例子包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇 共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski等人， 1981，引文見上；Newmark 等人，應(yīng)用生物化學(xué)雜志(J. Appl. Biochem.) 4 185-189 (1982)。 其它可用的聚合物有聚-1，3- 二茂烷和聚-1，3，6-三茂烷，如上述，優(yōu)選用于醫(yī)藥用途的是 聚乙二醇部分。蛋白質(zhì)(或衍生物)的釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大 腸。對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說存在這樣的制劑，它不溶在胃里，但會在十二指腸或腸的其它部 位釋放物質(zhì)。優(yōu)選地，這種釋放將避免對胃環(huán)境的有害作用，作用方式或是保護(hù)蛋白質(zhì)(或 衍生物)或是在胃環(huán)境以外如腸內(nèi)釋放生物活性物質(zhì)。為了保證完全抵抗胃液，包衣必須對至少pH5. O不可滲透?？梢圆捎米鳛槟c包衣 的常用惰性成分，其例子有乙酸纖維素苯三酸酯(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯 (HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙烯乙酸鄰苯二甲酸酯(PVAP)，Eudragit L30D,Aquateric, 乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯(CAP) ,Eudragit L，EudragitS.和Shellac。包衣可作混合膜用。包衣或包衣的混合物也可用于 藥片，但不是為了保護(hù)藥片不受胃破壞。這可包括 糖衣或是使藥片更易吞咽的包衣。膠囊可會有硬殼(如明膠)以輸送干藥物即粉末；對液 體可用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是厚淀粉或其它可食用紙。對藥丸、錠劑、模壓藥片 或片齊U研磨齊U，可用濕混技術(shù)(moist massing technique)。藥物可以是顆粒大小約為Imm的小球或小片形式的細(xì)多顆粒制劑。膠囊給藥的制 劑材料也可以是粉末，輕壓的填料甚至是藥片?？捎脭D壓法制備藥物。加色劑(colorant)與香味劑可包括在內(nèi)。例如蛋白質(zhì)(或衍生物)可先配制(例 如用脂質(zhì)體或微球膠囊)，再進(jìn)一步加到食用品中去，例如含有加色劑和香味劑的冰鎮(zhèn)飲 料?？梢杂枚栊圆牧舷♂尰蛱罴铀幬锏捏w積。稀釋劑可包括碳水化合物，特別是甘露 醇，α-乳糖、脫水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可用作填充物，包 括磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。可購得的稀釋劑有Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500, Emcompress 禾口 Avicell。崩解劑也可包括在藥物制劑中制成固體制劑形式。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉以及可購得的基于淀粉的崩解劑(淀粉乙醇酸鈉)。還可用葡糖鈉淀粉，離子交換樹 月旨，羧甲基纖維素鈉，ultramylopectin、褐藻酸鈉、明膠、桔皮、羧甲基纖維素酸、天然海綿 和皂土。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉末狀樹膠可用做崩解劑和結(jié)合 齊IJ，這包括諸如瓊脂，Karaya或黃蓍膠等粉末狀樹膠。褐藻酸及其鈉鹽也可用做崩解劑。 結(jié)合劑可用來將藥劑結(jié)合在一起形成硬的藥片，包括天然材料如阿拉伯膠、黃蓍 膠、淀粉、和明膠。其它的結(jié)合劑包括甲基纖維素(MC)，乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素 (CMC)。醇溶液中用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)使藥物成粒?？鼓Σ羷┛捎迷谒幬镏苿┲蟹乐古渲七^程中發(fā)生粘連。在藥物與模壁之間可用一 層潤滑劑，包括但不限于硬脂酸及其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油 和蠟。還可用可溶自潤滑劑如用月桂酸硫酸鈉、月桂酸硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇和 Carbowax 4000 禾口 6000。助流劑(glidant)可用來增加配制時藥品流動性，并在擠壓過程中幫助重整。助 流劑可能包括淀粉、滑石、熱解硅膠和水合硅鋁鹽。為幫助藥物在水性環(huán)境中溶解，可用表面活性劑作潤濕劑。表面活性劑可包括陽 離子去污劑如月桂酸硫酸鈉，十六烷基硫化琥珀酸鈉和十六烷基磺酸鈉。也可用陽離子去 污劑如氯芐烷銨或氯化芐乙氧銨?？梢杂迷谥苿┲凶鞅砻婊钚詣┑姆请x子型去污劑包括 Iauromacrogol 400，硬脂酸-40-聚烴氧基酯，聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60，甘油單硬 脂酸多乙氧基醚40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活 性劑或單獨(dú)或以不同比例混合地用在蛋白質(zhì)或衍生物的制劑中?？梢源龠M(jìn)蛋白質(zhì)(或衍生物)吸收的添加劑有例如脂肪酸、油酸，亞油酸和亞麻酸?？赡苄枰煽蒯尫诺闹苿?。藥物可加入允許以擴(kuò)散或滲漏機(jī)制釋放的惰性基質(zhì)即 樹膠中。緩慢降解的基質(zhì)也可加入制劑中。本藥物的另一種可控釋放方式可以是基于Oros 治療系統(tǒng)(Alza公司)的方法，即該藥物由半透膜包裹，由滲透作用允許水從單個小孔進(jìn) 入，藥物從單個小孔排出。有些腸包衣也有延緩釋放的作用。其它包衣也可用于制劑，這包括許多可用于包衣鍋(pan)的糖類。治療劑也可以 是膜包衣藥片；這種情況下用的材料分為兩組。第一組為非腸道材料，包括甲基纖維素，乙 基纖維素，羥乙基纖維素，甲基羥基-乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基-甲基纖維素，羧 甲基纖維素鈉，providone和聚乙二醇。第二組包括腸道物質(zhì)，即常用的苯二酸酯。可用混合材料得到最佳的膜包衣。膜包衣可用包衣釜(pancoater)或流化床 (fluidized bed)或用擠壓包衣。肺部給藥本發(fā)明也涉及將本蛋白(或其衍生物)肺部給藥。當(dāng)哺乳動物吸氣時，該 蛋白(或衍生物)給藥到肺部，并穿過肺上皮襯進(jìn)入血流。有關(guān)的報(bào)道見Adjei等 人，醫(yī)藥研究，7 (6) =565-569(1990) ；Adjei 等人，國際醫(yī)藥雜志，63 :135_144 (1990) (Ieuprolideacetate) ；Braquet 等人，心血管藥學(xué)雜志 13 (增刊 5) 143-146 (1989) (endothelin-Ι) ；Hubbard 等人，內(nèi)科藥年刊(Annals oflnternal Medicine)3(3) 206-212(1989) (α 1-抗胰蛋白酶)；Smith 等人，臨床調(diào)查雜志(J. Clin. Invest.)84 1145-1146(1989) (α 1-蛋白酶)，Oswein等人，“蛋白質(zhì)的氣溶膠化”，呼吸系統(tǒng)送藥研討會進(jìn)展II，Keystone，科羅拉多(1990年3月)(重組人類生長激素)，Debs等人，免疫學(xué)雜志， 140 =3482-3488 (1988)和Platz等人，美國專利5，284，656號(粒細(xì)胞集落刺激因子)。本 發(fā)明實(shí)際應(yīng)用時也涉及到大量的為治療產(chǎn)品肺部送藥設(shè)計(jì)的機(jī)械裝置，包括但不限于霧化 器，計(jì)量劑量吸入器(metered-dose inhaler)和粉末吸入器，所有這些均為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人 員所熟知。某些適用于本發(fā)明實(shí)踐的可購得儀器例子有Ultravent霧化器，Mallinckrodt 公司制造，圣路易，密蘇里州；AcornII霧化器，Marqust醫(yī)藥產(chǎn)品公司制造，Englewood, 科羅拉多州；Ventolin計(jì)量劑量吸入器，葛蘭素公司制造，研究三角公園，北卡羅來納州； Spinhaler粉末吸入器，F(xiàn)ison公司制造，Bedford，麻省。 所有這些儀器均需用適于蛋白質(zhì)(或衍生物)散發(fā)的制劑。典型地，每種制劑針 對某種儀器，除了治療中常用的稀釋劑，佐劑和/或載體外可能還要用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑材料。 也試圖用脂質(zhì)體，微膠囊或微球，包含復(fù)合物或其它類型的載體。根據(jù)化學(xué)修飾類型或所用 儀器類型在不同的制劑中也可采用化學(xué)修飾的蛋白。適用于噴氣式或超聲式霧化器的制劑一般包括溶于水的蛋白質(zhì)(或衍生物)，其 濃度為每毫升溶液約0. 1至25毫克生物活性蛋白。制劑亦可包括緩沖液和簡單糖(Simple sugar)(例如用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓)。霧化器制劑也可含有表面活性劑，以減小或 避免蛋白質(zhì)形成氣溶膠時溶液原子化導(dǎo)致的表面誘導(dǎo)聚集。用于計(jì)量劑量吸入器的制劑通常包含精細(xì)分離的粉末，它含有經(jīng)表面活性劑協(xié)助 懸浮于推進(jìn)劑的蛋白質(zhì)(或衍生物)。推進(jìn)劑可以是任何常規(guī)使用的材料，如氯氟烴，氫氯 氟烴，氫氟烴，氫烴，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇和1，1，1，2_四氟乙烷 或其組合。合適的表面活性劑包括山梨醇三油酸和大豆卵磷酯。油酸也可用作表面活性劑。用于粉末吸入器散發(fā)的制劑包含含有蛋白質(zhì)(或衍生物)的精細(xì)分離的干粉末， 也可含有填充劑，如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，其含量足以協(xié)助粉末從儀器中散發(fā)出去， 例如占制劑重量的50%至90%。蛋白質(zhì)(或衍生物)最好制成顆粒形式，平均顆粒大小小 于10 μ m最優(yōu)選地0. 5至5 μ m，以最有效地送藥到肺遠(yuǎn)端。鼻腔給藥本發(fā)明也涉及鼻腔給藥本蛋白(或衍生物)。鼻腔給藥使蛋白在給藥后直接進(jìn)入 血流，而不必將藥物沉積于肺部。鼻腔給藥的制劑包括葡聚糖或環(huán)葡聚糖。治療方法，制備藥品的方法本發(fā)明另一方面提供治療處理(treatment)與制備藥物的方法。能通過施用本衍 生物而緩解或調(diào)控的病癥描述如上。劑量對所有上述分子，進(jìn)行進(jìn)一步研究后會得到治療不同病人的不同情況所需合適劑 量水平的資料，普通的技術(shù)人員應(yīng)注意治療前后情況，受藥人的年齡和一般健康狀況，即能 確定正確的劑量。通常對注射或輸液，劑量在0. 01 μ g生物活性蛋白質(zhì)/kg體重(只計(jì)算 無化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)量)與10mg/kg(同上說明)之間。劑量表可根據(jù)所有蛋白或衍生物 循環(huán)半衰期，多肽是丸劑給藥還是連續(xù)輸液及所用制劑而變化。與其它化合物一起給藥對于與肥胖癥相聯(lián)系的療法，本蛋白(或衍生物)可與治療其它肥胖癥的臨床并發(fā)癥的一種或多種藥物組合物共用，例如那些用來治療糖尿病(例如用胰島素)、高血壓、 高膽固醇及其它與肥胖癥伴生的病癥的藥物組合物，另外其它抑制食欲的藥也可一起給 藥，例如苯異丙胺可同時給藥(例如將本蛋白與胰島素混合物給藥)或依次給藥?；诤怂岬闹委熖幚鞳B基因可引入人體脂肪細(xì)胞用于肥胖癥基因療法。這種療法預(yù)計(jì)會降低體重。反 過來，將反義構(gòu)建體引入人體脂肪細(xì)胞會降低活性O(shè)B多肽的水平，預(yù)計(jì)會使身體更肥胖。在一個實(shí)施方案中，將編碼OB多肽的基因通過病毒載體引入體內(nèi)。這樣的載體 包括毒性減弱的或缺陷型DNA病毒，例如但不限于單純皰疹病毒(HSV)，乳頭狀瘤病毒， Epstein-Barr病毒(EBV)，腺病毒，腺相關(guān)病毒(AAV)等。優(yōu)選的是缺陷型病毒，其病毒 基因全部或幾乎全部缺失。缺陷型病毒引入細(xì)胞后不會感染。用缺陷型病毒可給藥到 專一性定位區(qū)域的細(xì)胞中，而不必考慮載體可能感染其它細(xì)胞。因此，脂肪組織可特異 性定向。某些載體和例子包括但不限于缺陷型皰疹病毒I(HSVl)載體[Kaplitt等人，分 子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Molec. Cell. Neurosci.)，2 320~330 (1990)]，毒性減弱的腺病毒載體， 如 Stratfbrd-Perricaudet 等人，臨床調(diào)查雜志(J.Clin. Invest. )，90 626-630 (1992) 描述的載體，以及缺陷型腺相關(guān)病毒載體[Samulski等人，病毒學(xué)雜志，(J. Virol. )61 3096-3101(1987) ；Samulski 等人，病毒學(xué)雜志，63 :3822_3828 (1989)]。另一實(shí)施方案中，可通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入基因。例如Anderson等人，美國專 利 5，399，346 號；Mann 等人，細(xì)胞，33 153-(1983) ；Temin 等人，美國專利 4，650，764 號， Temin等人，美國專利5，124，263號；國際專利出版物W095/07358號，1995年3月16日出 版，Dougherty 等，以及 Kuo 等人，血液(Blood) 82 845 (1993)。備選地，載體可通過脂感染(lipofection)引入體內(nèi)。過去十年里，越來越多地 應(yīng)用脂質(zhì)體制膠囊及體外核酸轉(zhuǎn)染。設(shè)計(jì)來限制脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染遇到的困難與危險的合 成性陽離子類脂可用來制備用于編碼標(biāo)記物的基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體[Feigner等人， 美國國家科學(xué)院院刊，84 7413-7417(1987)；見Mackey等人，美國國家科學(xué)院院刊，85 8027-8031(1988)]。用陽離子類脂可能促進(jìn)帶負(fù)電荷的核酸的成膠囊作用，也可能促進(jìn)帶 負(fù)電荷的細(xì)胞膜的融合(Feigner等人，科學(xué)，337:387-388 (1989))。用脂感染將外源基因 引用特定體內(nèi)器官在實(shí)踐上有某些優(yōu)點(diǎn)。將脂質(zhì)體分子定向到特定細(xì)胞代表了一方面優(yōu) 點(diǎn)。很明顯，在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織，如胰，肝，腎和腦中定向轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞類型會特別有 用。脂肪可與其它分子化學(xué)偶聯(lián)，用于定向用途(見Mackey等人，1988，引文見上)。定向 的肽類，例如激素或神經(jīng)遞質(zhì)，和蛋白質(zhì)如抗體，或非肽分子可與類脂化學(xué)偶聯(lián)。也可以以裸露的DNA質(zhì)粒形式將載體引入體內(nèi)。用于基因療法的裸露DNA載體 引入所需的宿主細(xì)胞中可采用本領(lǐng)域已知的方法，例如轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞融 合，DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀，應(yīng)用基因槍或利用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)物(見例如Wu等人，生物 化學(xué)雜志，267 963-967(1992) ；Wu 等人，生物化學(xué)雜志，263 14621-14624 (1988) ；Hartmut 等人，加拿大專利申請，2，102，311號1990年3月15日提交。農(nóng)業(yè)應(yīng)用OB基因也可從家養(yǎng)動物中分離 得到，并由此獲得相應(yīng)的OB多肽，在特定實(shí)施方案 中，見下，從小鼠OB基因得到的探針與得自大量動物物種的相應(yīng)同源編碼序列雜交。如對 人類療法討論的那樣，也可制備重組蛋白質(zhì)，對家養(yǎng)動物給藥。用多肽給藥可生產(chǎn)瘦肉型食用動物，如肉用牛、豬、家禽、綿羊等。優(yōu)選地施用自體OB多肽，盡管本發(fā)明也試圖用抗自體 多肽給藥。由于OB多肽包含約160個氨基酸殘基，它不是高度免疫原性的。因此，用非自 體多肽給藥可能不引起免疫應(yīng)答。 備選地，將克隆的基因引入轉(zhuǎn)基因家養(yǎng)動物可能會通過OB轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)而降 低體重改善肥胖。實(shí)現(xiàn)這個設(shè)想的最簡單方法是用自身的或其它脂肪特異性啟動子將OB 轉(zhuǎn)基因定位到脂肪中。反過來，在其它情況下如培育Kobe (神戶)牛肉或肥胖的肝臟做肥肝(foie gras) 時需要增加體內(nèi)脂肪含量。將反義OB轉(zhuǎn)基因定位到脂肪中或用基因剔除(knockout)技術(shù) 可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。此外，若需要體重中脂肪百分比增大，可用OB多肽的抑制物或拮抗物給藥。 這樣的抑制物或拮抗物包括但不限于與多肽反應(yīng)的抗體和與OB受體結(jié)合但不激活它的多 肽片段，即OB多肽的拮抗物。美容應(yīng)用OB多肽除有利健康外，在美容上也有重要價值。特別地，因?yàn)楸景l(fā)明的OB多肽，包 括其衍生物和激動劑類似物，可用于調(diào)控動物脂肪細(xì)胞貯存的速率與數(shù)量，故可用來減少 不美觀的脂肪組織，例如腹部，臀部，大腿，頸部或頦部的脂肪貯存，它們雖不會導(dǎo)致肥胖， 但有損個人形象。據(jù)認(rèn)為部分地可通過降低食欲，即降低食物攝入量，增加基礎(chǔ)代謝率，或 二者兼用來達(dá)到減少脂肪的效果。因此，本OB多肽或其衍生物或激動物類似物，可給藥至 受試者中，通過調(diào)控脂肪貯存，降低食欲或二者兼用，在脂肪組織貯存處產(chǎn)生美容的變化。另外，本組合物與方法可與許多方法合用，例如改變身體整體形象的美容手術(shù) (例如吸脂術(shù)到激光手術(shù)，通過吸除或切割脂肪組織來降低身體質(zhì)量)，鍛煉(尤其是跑步 和體重訓(xùn)練)，低脂肪食譜，催眠，生物反饋，這些都是嘗試降低脂肪組織百分比，改善體形 的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及一種調(diào)控個體脂肪組織的美容方法，包括用可調(diào)控脂肪的量 的OB多肽或其衍生物或激動物類似物，給藥至需要調(diào)控脂肪組織美容及改善體形的個體 中。優(yōu)選地，調(diào)控脂肪組織即減少脂肪組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減少脂肪組織的美容方法，該方法包括 用可調(diào)控脂肪的量的OB多肽或其衍生物或激動物類似物，給藥至需要調(diào)控脂肪組織美容 或改善體形的個人中。OB 受體分離出OB因子的受體會大大有助于研制其小分子激動劑或拮抗物。制備活性O(shè)B 多肽并用它來用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選表達(dá)文庫可實(shí)現(xiàn)該目的。用細(xì)菌或哺乳動物表達(dá)載體制備的 重組多肽給藥并觀察其短期效果以及用重組多肽持續(xù)給藥至表達(dá)文庫的細(xì)胞中，或直接檢 測OB多肽對細(xì)胞的結(jié)合，用這些方法可檢測受體與表達(dá)文庫的結(jié)合。目前認(rèn)為OB受體可能位于下丘腦或肝中，優(yōu)選地用標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)克隆載體構(gòu)建這些 組織的cDNA文庫。然后將這些cDNA克隆引入COS細(xì)胞庫中，用活性配體篩選得到的轉(zhuǎn)化體 來鑒定表達(dá)OB受體的COS細(xì)胞。分離陽性克隆，回收克隆受體。克隆受體與OB配體(假 設(shè)它是激素)共用研制出篩選小分子OB調(diào)控物的必要組分。本發(fā)明應(yīng)用的特定檢驗(yàn)系統(tǒng)稱為受體檢驗(yàn)。受體檢驗(yàn)(rec印torassay)中，待檢 驗(yàn)材料適當(dāng)?shù)貥?biāo)記，然后用一定量的標(biāo)記與未標(biāo)記的材料接種到某種細(xì)胞檢查克隆中，再進(jìn)行結(jié)合研究，確定標(biāo)記的材料結(jié)合細(xì)胞受體的程度。這樣即可確定材料間親和性的差別。相應(yīng)地，一定量的純化體重調(diào)控物放射性標(biāo)記再，例如，與抗體或其其它抑制物結(jié) 合，然后進(jìn)行結(jié)合研究。制備含有不同量的標(biāo)記的與未標(biāo)記的未結(jié)合的體重調(diào)控物的溶液， 然后接種細(xì)胞樣本再溫育。得到的細(xì)胞單層經(jīng)沖洗溶解然后用伽馬計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)足夠長時 間，使標(biāo)準(zhǔn)差小于5%。對這些數(shù)據(jù)作Scatchard分析，然后做出有關(guān)材料活性的觀察與結(jié) 論。雖然上述僅為一例，但其說明的一種方法，即當(dāng)檢驗(yàn)材料的細(xì)胞結(jié)合能力可能是供區(qū)別 用的特征時，可采用受體檢驗(yàn)。因而，受體檢驗(yàn)對于鑒定本調(diào)控物的特異性受體如db受體 特別有用。
本發(fā)明涉及的進(jìn)一步的有用檢驗(yàn)方法是“順反(cis/trans)”檢驗(yàn)。簡言之，本檢 驗(yàn)用到兩種遺傳結(jié)構(gòu)，其一通常是一種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染量合適的細(xì)胞系中會持續(xù)表達(dá)特定的感 興趣受體，另一是一種質(zhì)粒，在受體/配體復(fù)合物控制下表達(dá)標(biāo)志物如熒光素酶。因而，例 如若需要評價一化合物是否特定受體的配體，其中一種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)在選定的細(xì)胞系中表達(dá)受 體，另一質(zhì)粒含有一啟動子，與熒光素酶基因相連，特定受體的反應(yīng)元件插入熒光素酶基因 中。如果受檢驗(yàn)的化合物是受體的激動劑，配體會與受體形成復(fù)合物，該復(fù)合物就結(jié)合反應(yīng) 元件，并起始熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。用光計(jì)量方法測量所得的化學(xué)發(fā)光得到劑量反應(yīng)曲線， 將其與已知的配體的劑量反應(yīng)曲線相比。前述方法的詳述見美國專利4，981，784號和PCT 國際出版物WO 88/03168號；用于技術(shù)人員參考。一旦鑒定出表達(dá)OB受體基因序列的重組體即可分析重組OB受體。用基于OB受體 的物理與功能特性的檢驗(yàn)方法可實(shí)現(xiàn)這一目的，包括將受體放射性標(biāo)記，然后用凝膠電泳， 免疫檢驗(yàn)，配體結(jié)合等分析。而且，可如上述產(chǎn)生ob受體的抗體。OB受體的結(jié)構(gòu)可用本領(lǐng)域已知的許多方法來分析。優(yōu)選地，分析不同結(jié)構(gòu)域的結(jié) 構(gòu)，特別是OB結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。可通過鑒定與其它已知蛋白質(zhì)，尤其是激素和蛋白質(zhì)受體 的序列相似性來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。相似性(或同源性)程度可提供預(yù)測OB受體或其一個結(jié)構(gòu) 域的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)。在特定的實(shí)施方案中，可利用例如FASTA和FASTP程序[Pearson 等人，美國國家科學(xué)院院刊，85 =2444-48(1988)]與GenBank中的序列進(jìn)行序列比較?？捎糜H水性分析(例如Hopp等人，1981，引文見上)進(jìn)一步分析蛋白序列的特征。 可用親水性圖譜鑒定OB受體蛋白的疏水性與親水性區(qū)域，進(jìn)而可預(yù)測細(xì)胞外區(qū)，膜結(jié)合區(qū) 和細(xì)胞內(nèi)區(qū)。也可進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析(例如Chou等人，1974，引文見上)來鑒定OB受體采取特 定二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。用本領(lǐng)域提供的計(jì)算機(jī)軟件程序還可進(jìn)行操縱，翻譯和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，以及開放 閱讀框架預(yù)測與繪制。本發(fā)明提供充足來源的重組OB多肽，并能分離OB受體(即db基因產(chǎn)物)，故能定 量確定OB多肽和OB受體或其結(jié)構(gòu)域的活性構(gòu)象結(jié)構(gòu)。特別地，有足夠的材料用于核磁共振 (NMR)，紅外(IR)，拉曼和紫外(UV)，尤其是圓二色(CO)，光譜分析。特別是NMR是溶液中分 子結(jié)構(gòu)分析的有力工具，溶液中更接近分子的天然環(huán)境(Marion等人，1983，引文見上Bar 等人，1985，引文見上；Kimura等人，1980，引文見上)。也可運(yùn)用其它結(jié)構(gòu)分析方法。這包 括但不限于X射線晶體學(xué)分析(Engstom，1974，引文見上)。更優(yōu)選地，可研究OB多肽和OB受體的共結(jié)晶。分析共結(jié)晶可提供有關(guān)結(jié)合的詳細(xì)資料，進(jìn)而可能合理地設(shè)計(jì)配體激動劑和拮抗物。也可用計(jì)算機(jī)模型，特別是與NMR或X 射線方法共用(Fletterick等人編，當(dāng)代分子生物學(xué)通訊中的計(jì)算機(jī)繪圖與分子模型，冷 泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1986)]。鑒定并分離本發(fā)明的編碼OB受體的基因，能提供比從天然來源分離所得量多得 多的受體表達(dá)，或是使受體在專門設(shè)計(jì)或細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后指示表達(dá)的受體的活性的指示 細(xì)胞中表達(dá)。相應(yīng)地，除了基于OB多肽結(jié)構(gòu)合理地設(shè)計(jì)激動劑和拮抗物，本發(fā)明還涉及其 它用本領(lǐng)域已知的不同篩選檢驗(yàn)方法鑒定OB受體的特異性配體。本發(fā)明參考下述實(shí)施例可能更易理解，這些實(shí)施例僅是本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)例而不具 有限制性。實(shí)施例部分下述文字概述了鑒定基因材料的方法，以舉例說明本發(fā)明。該方案包括四個連續(xù) 步驟A)遺傳定位(Genetic Mapping), B)物理定位，C)分離候選基因，和D)檢測突變，在 此之前先確證從受試者中分離到小鼠基因(D步)，找到同源人類基因，并測定了小鼠和人 類基因以及假設(shè)(putative)的蛋白質(zhì)的性質(zhì)。這些步驟詳述如下。A.遺傳定位從遺傳交叉實(shí)驗(yàn)中分離出Ob突變，用標(biāo)準(zhǔn)連鎖分析將突變相對RFLP (限制片段長 度多態(tài)性)定位。從這些數(shù)據(jù)知，OB基因在近端小鼠6號染色體的 5cM間隔上。(5cM是 相當(dāng)于每100個動物發(fā)生5個遺傳交叉的遺傳距離測量單位。)共得到771個能提供資料 的減數(shù)分裂后代，并用于后來的遺傳定位(Friedman等人，1991，引文見上)。相對于OB定 位的遺傳座位均先前見于報(bào)道。所述的最近的兩個RFLP由得自羧肽酶基因和met癌基因 的探針確定。上述實(shí)驗(yàn)的遺傳分辨能力不足以克隆ob，主要是因?yàn)闆]有一個遺傳標(biāo)記是緊密連 鎖的。為了鑒定必需的緊密連鎖RFLP，分離到另外的探針并擴(kuò)展了遺傳雜交。一種稱為染 色組微切(microdissection)的方法用來從近端小鼠6號染色體分離到DNA的隨機(jī)片段 (Bahary等人，哺乳動物基因組，4:511-515 (1993))。對每個克隆的探針檢驗(yàn)其與ob的緊 密連鎖。甚于這些研究，選出一種探針，D6RcK13，又稱psd3，由于其遺傳上接近0B，可用于 進(jìn)一步分析。該探針用于確定來自種間雜交與亞種間雜交的835個ob后代的基因型，這表 明D6RcK13在所有853個動物中并非都重組，這同Bahary等人報(bào)道的相同。在物理定位 過程中，從來自YAC 53A6的粘粒亞克隆中鑒定到一種新的多形性標(biāo)記。這種新標(biāo)記位于 D6RcK13和OB基因之間，用來確定來自種內(nèi)雜交和回交的另外771個能提供資料的減數(shù)分 裂后代的基因型。鑒定出 一個動物#167，其在ob與D6RcK39中有重組交換。這些研究顯 示 D6RcK39/D6RcK13 距 ob 約 0. 06cM。另一個探針，Pax4 經(jīng)鑒定距 ob 0. 12cM。Pax4 在兩 個動物#111和#420中重組。Pax4是早先被Gruss及合作者定位到小鼠6號染色體近端上 的假基因[Gruss等人，基因組學(xué)11 :424-434(1991)]。在此基礎(chǔ)上確定OB基因位于Pax4 和D6RcK13之間 0. 2cM的間隔上。下一步是將中間這段DNA克隆來分離0B。B.物理定位這一段克隆DNA用于酵母人工染色體(YAC)，一種相對來說新的克隆載體，可以克 隆通常是長度超過一百萬堿基對的連續(xù)DNA長段。
用D6RcK13和Pax4分離酵母人工染色體。為實(shí)現(xiàn)這一目的，制備純化的DNA探針用來分離相應(yīng)的YAC。這些YAC(#8，#16，#107和#24)先分離并測定特性，基于檢驗(yàn)結(jié)果， 結(jié)論是YAC16是延伸最遠(yuǎn)，即距ob最近的YAC?；厥誝AC#16的關(guān)鍵末端(key end)，確定 該末端距ob比距Pax4近。該末端被稱為16M(+)。因?yàn)樵撎结樑c動物#420中不重組(如 Pax4)故得此結(jié)論。該末端經(jīng)測序用來做PCR檢驗(yàn)。用PCR檢驗(yàn)來篩選YAC文庫。分離到4 個陽性克隆。接下來的用末端補(bǔ)救(end-rescimg)，限制定位，脈沖電場凝膠和用遺傳交叉 做的Southern印跡，檢測這些YAC的性質(zhì)，確定這些YAC中的兩個adu和aad，對進(jìn)一步的 研究十分重要。YAC aad是550KB非嵌合YAC，延伸最遠(yuǎn)。因而該YAC的遠(yuǎn)端，aad (pICL)， 被用來完成物理圖譜。YAC adu是370kb的非嵌合YAC，其遠(yuǎn)端adu(+)經(jīng)確定，與所有遺傳 交叉的ob后代包括#111和#167均不重組，顯示OB基因可能在該YAC上。設(shè)計(jì)了對這兩個末端add(pICL)和adu (+)的PCR檢驗(yàn)并用來分離更多的YAC和 Pl克隆繼續(xù)物理定位。這樣分離的重要Pl克隆包括498，499，500 (用于自aad (PlCL)探針 分離到)和322，323和324 (用來自adu (+)的探針)。同時，檢測有D6RcK13分離到的YAC (53A6, 25A8, 25A9, 25A10)。這些研究確定53A6 近端向aad YAC延伸得最遠(yuǎn)。53A6與aad之間的空檔的大小確定為 70KB。53A6，53 (pICL) 關(guān)鍵末端然后被用來篩選現(xiàn)有的3個YAC文庫和一個Pl文庫。分離到一個關(guān)鍵的Pl克隆， 325。該P(yáng)l克隆與上述aad (pICL)分離到的那些Pl有重疊，因而可用來填上53 (pICL)和 aad(pICL)之間的空檔。結(jié)果是克隆到含有YAC和Pl克隆的整個結(jié)構(gòu)區(qū)(contig)，它長約 2. 5 百萬堿基對，并跨越 Pax4，16M(+)，adu (+)，aad (pICL)，53 (pICL)，D6RcK13 和 D6RcK39。 仔細(xì)將動物#111和#167的重組位點(diǎn)定位，即可做出結(jié)論，OB位于400KB間隔上。為了提供 用于分離OB基因的可用的DNA來源，在其24個Pl克隆中分離了涵蓋該非重組區(qū)的500KB。 這些克隆包括后來證明有用的322和323，它們被用于外顯子捕捉(exon trapping) 0攜帶OB的染色體部分物理圖譜由圖7A給出。圖7A顯示YAC結(jié)構(gòu)，和7顯示Pl 結(jié)構(gòu)區(qū)。C.分離候選基因這一段用來分離基因的方法是外顯子捕捉。該方法利用購得的載體通過選擇引入 試驗(yàn)結(jié)構(gòu)的基因組DNA中功能性切割受體與功體序列來鑒定外顯子DNA (即編碼序列)。來 自Pl克隆的DNA生長后亞克隆到外顯子捕捉載體中。這些克隆是克隆到Bluescopt載體 中的短插入序列。每個克隆用對應(yīng)于包圍插入序列的質(zhì)粒序列的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增直接在攜帶質(zhì)粒的載體上進(jìn)行。反應(yīng)由Biomek機(jī)器手布置(set up)。PCR產(chǎn)物于 含有溴乙錠的瓊脂糖凝膠、TBE緩沖液中電泳。外顯子捕捉技術(shù)經(jīng)修飾除去Pl克隆中 的污染大腸桿菌DNA，并篩選掉豐富的偽跡外顯子，這些外顯子占設(shè)想捕捉到的外顯子的超 過80-90%。外顯子捕捉載體包括HIV序列；這些載體序列的短片段對應(yīng)該偽跡。用多種Pl克隆進(jìn)行外顯子捕捉實(shí)驗(yàn)。外顯子捕捉產(chǎn)物用PCR擴(kuò)增，選擇并測序。 假設(shè)的“外顯子”序列用Blast計(jì)算機(jī)程序跟GenBank中的序列比較。選出約15個外顯子 進(jìn)一步用RT-PCR，Northern分析和動物印跡(200blit)檢查對應(yīng)的RNA或保守序列是否存 在。發(fā)現(xiàn)15個假設(shè)的外顯子中的7個325-2，323-9，322-5，D1-F7，1H3和267編碼RNA轉(zhuǎn) 錄物。325-2是睪丸特異性基因；323-8和323-9象是主要在腦和腎表達(dá)的同一基因的兩個 外顯子。1H3和322-5代表兩種低水平腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄物。D1-F7是來自前面克隆的基因，肌醇單磷酸脫氫酶(IMPDH)，的外顯子，該基因具有普適的表達(dá)形式。所有這些基因都不象是編碼 OB。2G7是OB外顯子，進(jìn)一步討論見下面。三次嘗試外顯子捕捉OB基因失敗后，將所有來自關(guān)鍵OB區(qū)的Pl的DNA匯集起來 做另一次嘗試。這包括 Pl, 258, 259，322，323，324，325，498，499，500，653，654 及其它。此 后Pl 258，260，322，498和499亞克隆到外顯子捕捉載體中，然后用細(xì)菌克隆制備幾個平板 (plate)，每一個帶有一種假設(shè)的外顯子。得到了約192個代表假設(shè)的OB候選物的克隆。如 上述，觀察到總有一偽跡存在，使得許多分離物含有兩個來自該載體的捕捉到的外顯子。因 此通過克隆的大小以及通過對應(yīng)該偽跡的DNA探針雜交物與凝膠上Southern印跡對應(yīng)帶 相雜交這一事實(shí)來鑒定克隆。這樣，192個克隆中的185個排除掉，不再做進(jìn)一步評價。僅 靠大小就排除偽跡是不可能的，因?yàn)檫@樣最后可能排除了對應(yīng)于OB的外顯子。因此，192個外顯子中共有7個外顯子選來做進(jìn)一步研究。先制備將這7個外顯 子測序的模板，然后測序。分析7個內(nèi)顯子的序列發(fā)現(xiàn)這7個完全相同并且有一個明顯是 偽跡。更具體地，克隆1D12含有“HIV序列”即偽跡帶。這樣就剩下3個外顯子作進(jìn)一步分 析(F1,2G7和1H3。IFl被排除是因?yàn)樗ㄎ辉陉P(guān)鍵區(qū)之外。1H3和267的PLR引物都選 來合成。確定了 2G7上外顯子的序列，由圖10給出(SEQ ID NO 7)。2G7的PLR引物選來 合成。序列上對應(yīng)于PLR引物的部分7劃線。所用引物為5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG(Tm = 60. 0°C )(SEQ ID NO 8)3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60. 0°C )(SEQ ID NO 9)這些引物擴(kuò)增基因組DNA，PCR條件為25-30輪，55°C退火2'，72°C延伸2'， 94°C變性1 ‘，標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液。PCR反應(yīng)中加上32P_dCTP相應(yīng)地減少冷的(cold) dCTP的 量，即可用這些引物產(chǎn)生標(biāo)記的探針。對許多組織RNA作RT-PCR、結(jié)論是，在所有檢查過的組織中2G7僅在白脂肪中表達(dá) (圖11A)。此后，32P標(biāo)記的2G7與組織RNA的Northern印跡雜交(圖11B)顯示該RNA在脂肪組織中高水平表達(dá)，在所有其它組織中不表達(dá)或以很低水平表 達(dá)(這里的信號是可能是污染組織制備物的脂肪造成的)。每種上述組織的10 μ g總RNA 甲醛的瓊脂糖凝膠上電泳。該探針與印跡65°C在標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液，Rapid Hybe (Amersham) 中雜交。RNA大小約4. 9KB。此時2G7已試圖為OB基因的可能候選物并進(jìn)一步分析。D.檢測突變 為了證實(shí)2G7編碼OB基因，有必要擺出該基因DNA序列的RNA表達(dá)水平在突變型 與野生型動物之間的差別?，F(xiàn)有ob基因的兩種不同突變可供研究，C57BL/GJ ob/ob (IJ)和 CKc/Smj ob/ob (2J) 0此后分別稱之為IJ和2J。(非正式的術(shù)語用來指所研究的小鼠株。 該實(shí)施例與附圖中均應(yīng)理解為C57BL/6J指C57BL/6J +/+ ；CKC/Smj指SM/CKc-+Pae-+/+ ； CKC/smj ob/ob指SM/CKc-+Dea-ob2Vob，。從分離自1J，2J和對照動物的脂肪組織制取RNA。 每個樣品的總RNA用DNase處理，然后用寡聚dT作引物以及逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。得到的 單鏈cDNA然后用2G7引物(條件由面給出)對下面的帶或用購置的肌動蛋白引物對上面 的帶做PCR擴(kuò)增。RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖TBE凝膠上走過用溴乙錠染色(圖12A)。用RT-PCR發(fā)現(xiàn)2G7mRNA在IJ和所有其它對照小鼠中表達(dá)。但完全不見于2J小鼠。30輪擴(kuò) 增后未見任何信號。該實(shí)驗(yàn)直接證明2G7對應(yīng)OB基因的一個外顯子。由于2J突變相對來說發(fā)現(xiàn)較晚并被認(rèn)為是同類系株，該結(jié)果第一次提供證據(jù)說 2G7是OB基因的一個外顯子。該突變可能位于啟動子區(qū)故導(dǎo)致mRNA全部不合成。該RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中 IJ小鼠的信號存在預(yù)示IJ可能攜帶點(diǎn)突變，但并不造成RNA樣品大小的大變化。另 夕卜，用RT-PCR檢測另外4個2J動物也沒有2G7mRNA.該結(jié)果由Northern 印跡證實(shí)(圖 12B)。從每一株(C57B1/6J lJ，CKC/smj 和 2J) 制備脂肪細(xì)胞RNA。各IOyg RNA專膠單做印跡。印跡用2G7探針做探針雜交，該探針是用 32P-dCTP對圖11中的材料即帶做PCR擴(kuò)增而PCR標(biāo)記的。肌蛋白作所載的RNA量的對照。 在所有樣品中肌動蛋白信號相當(dāng)相似。OB信號在腦中不存在因?yàn)閙RNA對脂肪細(xì)胞有特異 性。Northern分析的結(jié)果證實(shí)2G7特異性RNA在2J小鼠中不存在。obRNA在CKC/smj ob/ob小鼠中不存在是因?yàn)樵摲逝滞蛔冃椭曛性摶虮黄茐?disrupt)不產(chǎn)生RNA。另外， 在IJ和db/db脂肪中2G7RNA的水平增加約10-20倍。這些結(jié)果與下面的假說不矛盾，即 OB或是編碼循環(huán)激素或是與脂肪細(xì)胞產(chǎn)生一種調(diào)控體重的信號有關(guān)。這些結(jié)果支持2G7即 OB基因這一結(jié)論并預(yù)示IJ小鼠有一個點(diǎn)突變，可能是無義突變，導(dǎo)致翻譯過早終止。用來自4個不同2J動物的脂肪細(xì)胞RNA制備物重復(fù)了這些Northern結(jié)果(圖 13)。該檢驗(yàn)中，ap2是脂肪特異性轉(zhuǎn)錄物，用做對照，幾乎與圖12B的肌肉蛋白作用相同。 ap2帶密度變化并無任何深義。利用報(bào)道的ap2序列設(shè)計(jì)PCR引物來標(biāo)記ap2。用PCR標(biāo) 記的同樣方法對脂肪細(xì)胞RNA的RT-PCR產(chǎn)物再標(biāo)記。這種分析表明正常純合或雜合動物 中存在OBmRNA，2J突變體動物中不存在OB mRNA.在IJ小鼠中鑒定了突變。該突變是C變成T的氨基酸IOs的精氨酸變成早熟終止 密碼子，這很可能解釋了為什么IJ突變中ob mRNA表達(dá)水平很高(圖14)(見圖12和13， C57BL/6J ob/ob 道)。最近用Southern印跡得出結(jié)論2J突變是由于OB 5'端的可檢測的DNA變化向使 RNA完全不表達(dá)。這種可能重排的真正性質(zhì)尚待確定。用四種不同的限制性內(nèi)核酸酶對來自CKC/smj (SM/CKc-+Dac)和C57BL/6J小鼠的 DNA作基因組Southern印跡。以確定突變型ob是否產(chǎn)生專一的片段模式(pattern)(圖 15A)。約IOyg DNA(來自從肝、胃或脾制備的基因組DNA)用所述限制性酶消化。DNA然 后在1 %瓊脂糖TBE凝膠上電泳。DNA轉(zhuǎn)移到Imobilion膜上與PCR標(biāo)記的2G7探針雜交。 關(guān)鍵帶是最上面的CKC/Smj ob/ob/SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J)DNABj 111消化物的帶。該帶比其 它株的分子量要高，預(yù)示該株有突變。圖15B是Ob2V+雜交后代基因組DNA的BglII消化物的Southern印跡。有些DNA 僅有上帶，有些僅有下帶，有些兩帶均有。僅有上帶的動物異常肥胖(allo-obese)即ob2V Qb2j0這些數(shù)據(jù)顯示圖15A給出的多形性(即突變)按遺傳意義分離。實(shí)施例1 cDNA克隆與OB序列確定用標(biāo)記的2G7PCR探針，從小鼠脂肪細(xì)胞λ gt IlcDNA文庫(Cbnetech 5' -STRETCH cDNA來自瑞士小鼠的睪丸脂肪墊，#WL 30056)分離到共50個小鼠cDNA克 隆。從人類脂肪細(xì)胞 λ gt ID cDNA 文庫(Clonetech 5' -STRETCH cDNA 腹部，#HL1108a)分離到30個雜交人類cDNA克隆。用噬菌斑lift方法進(jìn)行文庫篩選。噬菌斑lift的濾膜 用高溫滅菌鍋法變性。濾膜副本與PCR標(biāo)記的2G7探針(Rapid Hybe緩沖液，65°C過夜)雜 交。預(yù)雜交2-4小時后，濾膜65°C用2 X SSC，2% SDS沖洗2次，30分鐘，然后在X射線膠片 下曝光。副本陽性的用噬菌斑純化。噬菌斑純化的噬菌體用購置的載體引物，例如XgtlO 和λ gtllPCR擴(kuò)增。得到的PCR產(chǎn)物對應(yīng)于每種噬菌體的cDNA插入序列，兩端各有少量載 體序列。帶用凝膠純化，用ABl自動測序儀和載體引物測序后探測DNA聚合酶。粗的測序數(shù)據(jù)用手工逐個堿基地檢查，校正計(jì)算機(jī)程序的的小錯誤。一得到正確 的序列，就合成下游引物用來繼續(xù)測序。重復(fù)這種實(shí)驗(yàn)直到每個現(xiàn)有的cDNA克隆均已測序 并合成到一個結(jié)構(gòu)區(qū)(contig)中。到現(xiàn)在已整理出mRNA 5'端的 300個殘基對。一個 cDNA克隆延伸到mRNA的5'端，因?yàn)樵撔蛄信c脂肪組織RNA的5‘ RACE產(chǎn)物完全相同(數(shù) 據(jù)未給出)。序列數(shù)據(jù)顯出有一個167個氨基酸的開放閱讀框架(圖1)。存在一個Ko2aK翻譯 起始一致序列且ATG上游三個殘基處有腺苷殘基。按含有還是不含單個谷酰胺密碼子分出 兩類cDNA。該殘基位置緊靠2G7外顯子拼接受體的3'端。由于谷酰胺的CAG密碼子含有 一個可能的AG拼接受體序列，看起來在一亞類cDNA中拼接受體位點(diǎn)滑動造成三個堿基對 的缺失，如下所示。gin ser val ag CAG TCG GAT (帶谷酰胺)(SEQ ID NO 17)個(拼接受體位點(diǎn))gin ser valag CAG TCG GTA (不帶谷酰胺)個(拼接受體位點(diǎn))上面序列的ag對應(yīng)于谷酰胺密碼子上游假定的內(nèi)含子序列，而AG是假定的備選 拼接位點(diǎn)。該谷酰胺殘基位于分子的高度保守區(qū)，它對生物活性有何重要性尚不清楚。檢測了假定的N末端信號序列，其信號切割序列預(yù)計(jì)在氨基酸21位丙氨酸殘基的 羧基端。該假定的信號序列應(yīng)用根據(jù)von Heijne方的計(jì)算機(jī)算法證實(shí)了。用該技術(shù)、最可 能的信號序列經(jīng)鑒定在對應(yīng)于氨基酸1-23的多肽編碼區(qū)，其序列為MCffRPLCRFLffLffSYLSYVQA 丨 VP (SEQ ID NO 10)其中箭頭指出假定的信號序列切割位點(diǎn)。氨基酸序列的其余部分主要親水， 除N末端信號序列外沒有什么值得注意的超二級基元(motif)或膜跨越結(jié)構(gòu)域。特別 的。我們沒有找到N聯(lián)糖基化作用的一致序列或在預(yù)計(jì)含有的蛋白質(zhì)中預(yù)示蛋白切割的 雙堿性氨基酸序列Sabatini等人，遺傳病的代謝基礎(chǔ)，177-223頁，C. V. Scriver等人編。 McGeaw-Hill紐約)。用Blast和Block程序搜索數(shù)據(jù)庫并未鑒定出任何同源序列。用Northern印跡分析人類脂肪組織RNA，檢測到與小鼠ob基因大小相似的RNA 種。對cDNA克隆測序并分析發(fā)現(xiàn)人類OB還編碼167氨基酸的多肽(圖2A和B和圖3)。 帶有或不帶有3個堿基對缺失的兩類cDNA在人類中也找到了(圖6)。小鼠和人類OB基因 在預(yù)計(jì)的編碼區(qū)中高度同源，但在現(xiàn)有的3'和5'非翻譯區(qū)僅有30%同源性。人類OB多肽中也有N末端信號序列。比較人類和小鼠OB多肽序列可以看出兩個分子在氨基酸水平 共有83%相同(圖4)。兩個物種的成熟蛋白N末端同源性更高，在N末端100個氨基酸殘 基中僅有6個保守的和3個非保守的氨基酸替換。從小鼠，大鼠，兔，田鼠，貓，牛，綿羊，豬，人，雞，鰻魚和果蠅中分離基因組DNA，用 EcoRl限制性消化。消化物在瓊脂糖TBE凝膠上電泳，DNA然后轉(zhuǎn)移到immobilon膜上 用PCR標(biāo)記的2G7探針探測。濾膜在65°C雜交。用2XSSC 0. 2% SDS 65°C沖洗再次，每 次20分鐘。即換兩次緩沖液。這些數(shù)據(jù)顯示OB在脊椎動物中是保守的(圖16)。注意鰻 魚DNA有2+信號；鰻魚是一種魚?？傊?，現(xiàn)有證據(jù)顯示體重與肥胖是受生理控制的。7年前開始嘗試鑒定該系統(tǒng)的兩 個主要成分，OB與OB基因。本實(shí)施例表明，OB基因現(xiàn)在鑒定為脂肪特異性基因。在調(diào)節(jié)體 重中起重要作用。該基因的產(chǎn)物，很可能是分泌的激素在診斷與治療人和非人類動物的營 養(yǎng)失調(diào)時有重要應(yīng)用。實(shí)施例2 :0B在細(xì)菌中表汰 鼠類和人類編碼ob的cDNA被克隆到pET-156表達(dá)載體(Novagen)中。該載體含 有T7啟動子和Ia操縱基因，表達(dá)的融合蛋白含有組氨酸尾標(biāo)(His標(biāo)志)，并在編碼序列插 入位點(diǎn)緊接的上游有凝血酶切割位點(diǎn)(圖17) (SEQ ID NO 11和12)。小鼠和人類cDNA經(jīng)修飾，信號序列末端的丙氨酸變成NdeI位點(diǎn)，與3'區(qū)-獨(dú)立 的序列相同。用新的引物作PCR可插入NdeT位點(diǎn)Mnde-5'(鼠類 5'引物)CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO 13)Mnde-3'(鼠類 3'引物)TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO 14)Mnde-5'(鼠類 5'引物)TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO 15)Mnde-3'(鼠類 3'弓丨物)TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO 16)引物在中間含有6個堿基對的錯配，在PCR片段的兩端NdeI 了限制位點(diǎn)。攜帶小 鼠或人類cDNA的噬菌體用這些引物PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用NdeI消化在低熔點(diǎn)瓊脂糖 凝膠上純化。凝膠純化帶亞克隆到PET載體中。得到的載體要測序保證在克隆的PCR擴(kuò)增 一步?jīng)]有引入突變。制備了編碼和缺失谷酰胺49的人類和鼠類cDNA結(jié)構(gòu)。特別地，用PCR 克隆方法后，pET15b結(jié)構(gòu)含有人類或小鼠OB編碼序列，除去信號序列并與His-標(biāo)志融合。 該結(jié)構(gòu)經(jīng)測序以保證在PCR擴(kuò)增一步OB基因編碼區(qū)未引入序列錯誤。得到的兩個質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，pETM9和pETH14，選來轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)宿主。在最佳狀態(tài)下用 ImM IPTG誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化細(xì)菌能生產(chǎn)100-300 μ g/ml的OB融合物。OB融合蛋白的主體在包涵 體中。用8M鹽酸胍或脲溶解后，融合蛋白通過His-結(jié)合(Ni-螯合)樹脂柱純化。OB融合 蛋白的柱純化條件(包括結(jié)合，沖洗和洗脫)由實(shí)驗(yàn)確定。OB民蛋白在5mM咪唑/6M鹽酸 胍時結(jié)合樹脂，高達(dá)20mM咪唑/6M鹽酸胍時仍結(jié)合。蛋白可用60mM咪唑/6M鹽酸胍從樹 脂上洗脫(圖18A，B)。純化的人類和小鼠OB融合蛋白進(jìn)一步在PBS中透析從制備物中除 去鹽酸胍，然后用來制造多克隆抗體。
為了檢查融合蛋白產(chǎn)物的生物活性，試驗(yàn)研究純化蛋白的再折疊條件。這包括首 先融合蛋白在IM胍溶液中透析，再用0. 4M精氨酸溶液稀釋。檢驗(yàn)生物功能之前將His標(biāo) 志從融合蛋白上除去。用來自人胎盤的凝血酶處理融合蛋白可辦到這一點(diǎn)。另外，用PCR克隆方法將沒有信號序列的人類和小鼠OB基因編碼序列個個插入 PET 12c載體中。這些結(jié)構(gòu)可指導(dǎo)合成的OB融合蛋白進(jìn)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的胞外質(zhì)空間。從 胞外質(zhì)空間回收的OB融合蛋白僅需簡單的凝膠過濾即可從其它宿主細(xì)胞中純化出來，并 且在此過程中不會變性。實(shí)施例3制備OB多肽的抗體除了用重組蛋白產(chǎn)生多克隆抗體，用免疫原性作圖(plo+)軟件(GCG軟件包)也 鑒定了來自推導(dǎo)出的鼠類OB序列的一組4段肽序列。這4個羧基端肽片段是(SEQ ID NO: 18)Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQ ID NO: 19)Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gin-Thr-Leu-Ala(SEQ ID NO 20)Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-L eu-Asp(SEQ ID NO 21)Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-P ro-Glu-Cys這些肽與KLH偶合，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以lis肽-KLH偶合物免疫兔子。從兔子中回收對 每種多肽特異性的多克隆抗血清。實(shí)施例4 OB多肽的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)為了證實(shí)功能性信號序列的存在，包含整個開放閱讀框架的人類cDNA亞克隆到 pGEM載體中。該實(shí)驗(yàn)僅用人類cDNA是因?yàn)闆]有回收到合適的小鼠亞克隆。正鏈人類ob mDNA用Sp6聚合酶轉(zhuǎn)錄，與或還與貓胰微球體膜用于體外翻譯反應(yīng)。初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以 18KD的分子量遷移，這與從cDNA序列推斷的一致。反應(yīng)中加微球體膜使翻譯總效率抑制約 5倍。但是，有膜的制備物中約50-70%的OB初級翻譯產(chǎn)物截短了約2KD，顯示信號序列有 功能(圖19A)。白介素-IaRNA，不編碼信號序列，當(dāng)反應(yīng)中含有微球體膜時，其初級翻譯 產(chǎn)物的大小不變。為了證實(shí)OB蛋白發(fā)生了轉(zhuǎn)運(yùn)，用蛋白酶-K處理體外翻譯產(chǎn)物。蛋白酶 處理使18KD初級翻譯產(chǎn)物完全水解而16KD處理過的形式不受影響，顯示后者轉(zhuǎn)運(yùn)到了微 球體的囊腔內(nèi)(圖19B)。這些數(shù)據(jù)與OB是分泌分子的假說相符。信號序列切割后，兩個半胱氨酸殘基留在推斷的蛋白中，有可能該分子與其它分 泌多肽一樣特征地具有二硫鍵[Shen等人，科學(xué).224 168-171 (1984)]。實(shí)施例5 確定OB基因的性質(zhì)為了確定肥胖病與人類OB基因的遺傳變化之間的關(guān)系，確定人類OB基因的序列 (圖20A至C)(SEQ ID NO :22至24)。用人類編碼序列的特異性引物來篩選人類Pl文庫。 得到3個不同的Pl克隆。待其長大，用包圍第一個和第二個編碼外顯子之間的切割位點(diǎn)的 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。整個內(nèi)含子區(qū)，約2Kb，擴(kuò)增后部分測序(見圖20A;如SEQ ID NO 22和24所示)。用PCR檢驗(yàn)和其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了鼠類和人類基因的基因結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)小鼠OB基 因含有3個外顯子，其中第二個和第三個是編碼序列。(圖20D)。人類OB基因的編碼區(qū)有 相同結(jié)構(gòu)。但人類基因缺少一個5'外顯子和內(nèi)含子(圖20E)。制備了兩組來自人類基因的內(nèi)含子序列的引物(圖20A至C)。引物序列如下(F 和R分別指向前和反向)。HOBlgF 5' -CCCAAGAAGCCCATCCTG-3‘ (SEQ ID NO 29)HOBlgR 5' -GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3‘ (SEQ ID NO 30)HOB 2gF 5' -CCACATGCTGAGCACTTGTT-3‘ (SEQ ID NO 31)HOB 2gR 5' -CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3‘ (SEQ ID NO 32)從多種來源得到DNA樣本，然后用這些組引物擴(kuò)增嚴(yán)重肥胖病人的人類基因組 DNA。PCR產(chǎn)物在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上走膠。將帶切下并用瓊脂酶消化。用ABl S73A DNA 側(cè)序列儀和Tag雙脫氧終止子試劑盒(ABl，珀金-埃爾默)得到序列。到現(xiàn)在檢測到一個 病人樣本的ob基因有一個點(diǎn)突變。該突變在第一個外顯子上，不改變氨基酸序列。初步的 數(shù)據(jù)顯示另一個患者的第一個外顯子中可能有插入序列?？梢杂脺y序酶代替Tag DNA聚合 酶的另一種自動測序方法得到對檢測突變可讀性更強(qiáng)的序列。實(shí)施例6 :0B在酵母中表汰OB克隆定位后，重要的是發(fā)現(xiàn)OB蛋白減少食物攝入量和體重的生理機(jī)制。朝這個 方向邁出的第一步是用表達(dá)系統(tǒng)重組生產(chǎn)出有功能的蛋白。除了成功的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，也 可選用酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)OB有幾個吸引人的特點(diǎn)。最重要的是更可能生產(chǎn)有生物 活性的真核蛋白。哺乳動物細(xì)胞分泌OB多肽。所有真核生物分泌蛋白都很相似，就是說酵 母分泌器與哺乳動物分泌途徑比與細(xì)菌分泌途徑更相似。特別地，哺乳動物對OB的蛋白修 飾可能也見于酵母分泌系統(tǒng)的表達(dá)。另外，蛋白折疊在通過分泌器時進(jìn)行因而ob通過酵母 分泌器運(yùn)送更可能產(chǎn)生具有天然生物活性的正確折疊的蛋白。這對OB很重要，因?yàn)閮蓚€半 胱氨酸殘基可能形成二硫橋。與分泌途徑不同，細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境阻止二硫橋的形成，因此 為了體內(nèi)形成二硫鍵OB通過分泌途徑至關(guān)重要。其它的優(yōu)點(diǎn)有操縱酵母時方便快捷，載體 和菌株易得，酵母重組技術(shù)有豐富的經(jīng)驗(yàn)。選巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)系統(tǒng)有四個原因，(1)它與其它酵母系統(tǒng)如釀酒酵母相 比異源蛋白表達(dá)水平要高；(2)巴斯德畢赤氏酵母比釀酒酵母其蛋白糖基化與哺乳動物系 統(tǒng)中更相似(盡管用計(jì)算機(jī)搜索并未檢測到ob中有糖基化位點(diǎn)，但仍可能在未辨認(rèn)出的位 點(diǎn)有糖基化)。(3)巴斯德畢赤氏酵母天然情況下分泌很少的蛋白，因而純化表達(dá)的外源蛋 白時通常直接了當(dāng)；和(4)載體和酵母菌株可購得(購自Invitrogen)。生成酵母表達(dá)載 體的兩種策略見圖21和22。選用的載體是pPIC9。該載體含有一個克隆位點(diǎn)，就在α -交配因子早前編碼序列 的下游，該序列指導(dǎo)被克隆進(jìn)克隆位點(diǎn)的基因編碼的蛋白通過分泌途徑分泌出去。該載體 的另一重要性質(zhì)是有HIS4基因，當(dāng)酵母被載體轉(zhuǎn)化后用酵母營養(yǎng)缺陷株在缺組氨酸的培 養(yǎng)基上生長可選擇出載體是否被攝入?？寺〔呗匀缦翽CR擴(kuò)增OB cDNA，所用的5'弓丨物在 其3'端所含序列與緊跟在推斷的導(dǎo)肽切割位點(diǎn)后面的OB序列互補(bǔ)，其5'端所含序列與 載體的α-交配因子序列的3'端互補(bǔ)。5'引物還含有Xho I位 點(diǎn)，3'引物設(shè)計(jì)成其3'端序列與OB的最后幾個氨基酸互補(bǔ)，其5'端含有EcoRI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增之后，PCR產(chǎn)物用 XhoI和EcoRI消化并克隆到同樣消化的pPIC9中。將含有和不含49位密碼子的谷酰胺的 小鼠和人類OB cDNA克隆后，對所有4個結(jié)構(gòu)分離出單個的克隆，測序來確證該結(jié)構(gòu)以正確 的方向和閱讀框克隆，并且PCR擴(kuò)增一步?jīng)]有引入突變。鑒定這些克隆有正確的序列后，將 其轉(zhuǎn)化入P. pastons菌株GSl 1S，一種組氨酸營養(yǎng)缺陷型。對兩個小鼠OB結(jié)構(gòu)，對轉(zhuǎn)化的酵母克隆篩選蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)化酵母含有OB的證據(jù) 是，做了 DNA點(diǎn)印跡(dot-blot)檢驗(yàn)和菌落雜交檢驗(yàn)，均顯示轉(zhuǎn)化酵母中有OB序列，未轉(zhuǎn) 化酵母中沒有。并且，轉(zhuǎn)化酵母往培養(yǎng)基中分泌16KDa的蛋白，而未轉(zhuǎn)化酵母不分泌這樣大 小的蛋白(圖23A)。推斷的OB大小即16KDa。對兩種小鼠構(gòu)建體均已鑒定出單個克隆為 OB的向效表達(dá)物。目的正在研制一種策略將ob純化至同質(zhì)。一種策略是在陽離子交換柱 上純化OB (圖23B)，初步數(shù)據(jù)顯示強(qiáng)陽離子交換劑可能有用。然而，陽離子交換層析后，假 定的OB產(chǎn)物丟失了。這顯示樣品中有蛋白酶。一種解決這個問題的策略是制備ob-His標(biāo)志融合物用于酵母中表達(dá)(圖22)。進(jìn) 一步的評價顯示沒有His標(biāo)志的OB與Ni-螯合柱緊密聯(lián)結(jié)。用Ni-螯合純化OB多肽，再 凝膠過濾，得到產(chǎn)物純度足夠做質(zhì)譜分析。質(zhì)譜證實(shí)了表達(dá)的蛋白的分子量與預(yù)計(jì)的分子 量相同，強(qiáng)有力地證實(shí)了 ob在畢赤氏酵母中成功表達(dá)。然而，Ni-螯合/凝膠過濾純化方法得到的OB純度不夠。還存在其它小分子?？?起來Ni螯合柱空體積(void volume)中洗脫下了蛋白水解活性。相應(yīng)地，計(jì)劃用三步純化 過程N(yùn)i-螯合。隨后是陽離子交換(除去小分子污染物)再凝膠過濾。用考馬斯藍(lán)給SDS-PAGE凝膠染色，估計(jì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示出當(dāng)酵母在搖瓶中生 長時約為10mg/l。在發(fā)酵罐中預(yù)計(jì)水平會上升，我們已準(zhǔn)備進(jìn)行發(fā)酵，希望得到更大量的蛋 白質(zhì)。對于人類OB結(jié)構(gòu)，鑒定到含有高拷貝數(shù)OB基因的轉(zhuǎn)化酵母克隆。它們預(yù)計(jì)會表達(dá) OB蛋白。研制出抗體后，將用抗體來證實(shí)確實(shí)鑒定到分泌的16KDa蛋白。7 =ob融合g白在細(xì)菌Φ的高7k平表達(dá).制備冷凍貯備物(freezer stock)在滅菌過的無碳源M9ZB培養(yǎng)基的2個4ml等分中，各加入40 μ 1貯備的右旋 糖(0.48/!111，濾器滅菌過)，1(^1氨芐青霉素貯備物(200mg/ml)，和5μ1氯霉素貯備物 (34mg/ml，在乙醇中)。每個單個大腸桿菌菌落均含有克隆的Novagen pET_146載體中的小 鼠和人類0B/DNA，用來接種。試管37°C溫育過夜。0. 5ml過夜培養(yǎng)物用來接種于50ml含有右 旋糖，氨芐青霉素和氯霉素的M9ZB培養(yǎng) 基。這些在30°C溫育并定期監(jiān)測600nm處吸收(A600)。A600約1_12時，將175 μ 1等分小 份的培養(yǎng)基與25μ 1 60%甘油混合于2ml Eppendorf管中，用液氮快速冷凍，貯于_80°C。 培養(yǎng)物生長含有0. 5ml 40%右旋糖，125 μ 1氨芐青霉素貯備物和50 μ 1氯霉素貯備物的50ml M9ZB培養(yǎng)基用Iml冷凍貯備物接種，30°C溫育。A600為1-1. 2時，4個2L燒瓶每個用IOml 該培養(yǎng)物接種，每個燒瓶中有含有右旋糖，氨芐青霉素和氯霉素的500ml M9ZB培養(yǎng)基。30°C 溫育直到A600為約1-1. 2時加入終濃度為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)。培養(yǎng)物溫育過夜。離心 4000rpm 20分鐘收獲細(xì)胞。該表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)出的重組OB多肽占總蛋白的百分比相當(dāng)高，數(shù)量 級為克/每升大腸桿菌。
細(xì)胞裂解與內(nèi)含體的重懸浮 細(xì)胞漿重懸浮于最小體積的2mM HEPES, pH7. 210%甘油，0. lMKCl,5mM MgCl2,1% aprotinin, ImM pMSF 5mg/ml leupentin，禾口 50 μ g/ml DNase I 中。懸浮液用液氣禾口溫水冷 凍解凍三次。裂解的細(xì)胞離心18000rpm 30分鐘，重懸浮于20mM HEPES，pH7. 5,0. IM NaCl 中。懸浮物經(jīng)超聲處理，加TritonX 100至終濃度2%。再離心18000rpm 15分鐘。兩輪這 樣的操作之后，再進(jìn)行三輪Triton自由沖洗(free wash)。最后片狀沉淀物溶于6M鹽酸 胍，20mM HEPES，pH7. 5，超聲處理然后離心。上清用于進(jìn)一步純化。OB蛋白在未折疊狀態(tài)下用固定化金屬離子親和層析(IMAC)純化。40ml Pharmcia 螯合快速流動瓊脂糖柱用5倍柱體積的50mM ■504裝料再用611鹽酸胍，201111 HEPES，pH7. 5 平衡。溶液上柱。用6M鹽酸胍，30mM咪唑，20mM HEPES，pH7. 5洗柱。最后蛋白用含有0. 2M 咪唑的同一緩沖液洗脫。6M鹽酸胍中的未折疊蛋白加乙酸鈉(NaAc)至IOmM后貯于4°C， 用乙酸調(diào)pH至約4. 5.再折疊及蛋白質(zhì)的純化；含有IOOmg蛋白的6M鹽酸胍用67 μ 1 IM 二硫蘇糖醇(DTT)處設(shè)，然后用6Μ鹽酸 胍，IOmM NaAc,ρΗ4. 5稀釋至約67ml。室溫?cái)嚢杓s一小時。然后邊攪拌邊稀釋入4L的20% 甘油，2. 5mM CaCl2，20mMTriS，pH8.4中。適當(dāng)混合后。溶液室溫下放置約8小時，無需進(jìn)一 步攪拌。然后加入2000單位的純化牛凝血酶(來自thrombostat，Parke-Davis產(chǎn)品)，輕 輕攪拌溶液。約2. 5小時后再加2000單位的凝血酶再切割組氨酸-標(biāo)志3小時。加PMSF 至終濃度0. ImM中止凝血酶切割。溶液過濾后置于4°C。切割后的蛋白進(jìn)一步如上用同一根IMAC柱純化，柱子用IM KC1，20%甘油，20mM HEPES，pH8. 4緩沖液平衡。蛋白質(zhì)溶液加樣后，用相同緩沖液洗再用IM KC1，20%甘油，40mM 咪唑，20mM HEPESpH8.4將切割后的蛋白洗脫。未切割的蛋白被0. 2M咪唑洗脫。純化的切割后蛋白濃縮后，用50-100mM EDTA，IOmM鐵氰化鉀處理(將未完全的氧 化進(jìn)行到底)再用superdex 75 16/60柱凝膠過濾。該方法的產(chǎn)量接近起始蛋白的50%。一旦純化，表達(dá)的蛋白即可用幾種方法測定性質(zhì)。物理定性包括用動態(tài)光散射確 定結(jié)構(gòu)同質(zhì)性并作為正確折疊的量度，光散射數(shù)據(jù)顯示人類OB多肽主要或完全表達(dá)成單 體，而小鼠OB多肽可是單體亦可是二聚體。用Ellman氏試劑檢驗(yàn)及質(zhì)譜分析證實(shí)半胱氨酸殘基在蛋白中形成二硫鍵。將這 種氧化形式的多肽給藥至小鼠，描述如下，該多肽顯示有生物活性。用圓二色粗略確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)幾何。生理緩沖液(pH約8，約生理離子強(qiáng)度)中 的⑶譜顯示人類OB多肽含約60% α-螺旋結(jié)構(gòu)和約40%無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。鼠類OB多肽用 ⑶譜發(fā)現(xiàn)有約50% α-螺旋和50%無規(guī)卷曲。用有限水解，隨后做質(zhì)譜(Cohen等人，1995，引文見上)來鑒定OB多肽上能被水 解的部分。該分析顯示氨基酸殘基54至60有一柔性環(huán)結(jié)構(gòu)(描繪見圖4)。很可能該柔性 環(huán)連接兩個已確定的2°結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，例如α-螺旋。重要的是，如下面的實(shí)施例顯示，可用下述方法檢驗(yàn)純化蛋白的生物活性用滲透 泵(例如AZLET滲透泵，Alza公司，PaloAlto，加洲)或每日腹膜內(nèi)單次注射將蛋白給藥至 瘦的與肥胖的嚙齒動物體內(nèi)，至少兩個星期，觀察對進(jìn)食行為和體重的影響。^MM 8 :0B ^flt (瘠素)
小鼠OB座位的基因產(chǎn)物在調(diào)節(jié)體重時起重要作用。本實(shí)施例證實(shí)OB蛋白在小鼠、大鼠和人類血漿中循環(huán)。所有三個物種中循環(huán)形式對沒有信號序列的推導(dǎo)出的多肽序列做 SDS-PAGE得到分子量相同，顯示在體內(nèi)該蛋白切除信號序列后沒有再被處理。OB蛋白不存 在于C57/B16J ob/ob小鼠的血漿中，以相對于對照10倍高的濃度存在于db/db小鼠的血 漿中，以相對于對照20倍高的濃度存在于fa/fa小鼠的血漿中。這顯示這些肥胖動物突變 體對OB的作用有抵抗力。在一組6個瘦人受試者中OB蛋白的血漿水平有7倍的差別。每 日注射重組小鼠OB蛋白顯著減輕ob/ob小鼠的身體質(zhì)量，對野生型小鼠體重的影響明顯， 對db/db的小鼠無影響。這些數(shù)據(jù)顯示OB座位的基因產(chǎn)物有內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)體重。材料和方法用重組蛋白同福氏試劑(HRP公司)免疫兔子。將抗血清通過偶聯(lián)上重組蛋白的瓊 脂糖4B柱制備得免疫純化的抗小鼠OB抗體，描述見[Harlow等人，抗體，實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港 實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1988)]。小鼠血漿免疫沉淀如下用未偶聯(lián)的瓊脂糖4B室溫 下振蕩2小時將含有約25mM EDTA的各0. 5ml的小鼠，大鼠和人血漿預(yù)澄清。離子(Spin)除 去瓊脂糖，加入50ml含有親和純化抗體的50 %抗體偶聯(lián)瓊脂糖懸浮液，濃度為lmg/ml壓縮 瓊脂糖。加入半ml 2 X RIPA緩沖液，得到最終結(jié)合條件如下50mM Tris-HCl，pH7. 5, IOOmM NaCl，l%NP-40，0. SDS，0.5%脫氧膽酸鈉和0.025%疊氮化鈉。4°C振蕩反應(yīng)過夜。用 RIPA緩沖液將抗體偶聯(lián)的瓊脂糖洗8遍，然后用PBS漂洗3遍，在15% SDS-PAGE上走膠， 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與抗重組蛋白的生物素偶聯(lián)免疫純化的抗體作Western印 跡。所用的二抗是HRP-鏈親和素，用ECL作檢測。為了將小鼠血清中的OB定量，將遞增量的再折疊重組小鼠OB蛋白(0.01，0.1， 0.5，2.0，15. Ong)加入100 λ的C57BL/GJ ob/ob血清中，4°C與蛋白A'瓊脂糖偶聯(lián)抗體 溫育3小時，用緩沖液A(10mM磷酸鈉緩沖液，pH7. 4, IOOmM NaCl, 1% Triton X-100 ；5mM EDTA，(mM PMSF)充分洗滌后，樣品重懸浮于樣品緩沖液中，裝到15% SDS-PAGE上轉(zhuǎn)移至硝 酸纖維素膜上。用免疫純化的生物素偶聯(lián)抗氨基末端抗體作一抗，HRP-鏈親和素作二抗進(jìn) 行Western印跡，然后是ECL檢測。用polytron 和 dounce 勻漿在 NPS 緩沖液(IOmM Tris, ρΗ7· 5，IOmMNaCl, IOmM ICCI，0. 15mM 精胺，0. 5mM 亞精胺，14mM β-巰基乙醇，0.5mM EGTA, 2mM EDTA,0. 5% NP-40) 將脂肪組織勻漿制備細(xì)胞質(zhì)提取物700g離心去除細(xì)胞核。如上述作免疫沉淀只不過用的是免疫純化的抗人類OB抗體。對于ELISAJf IOOrnl的lmg/ml免疫純化抗人類OB抗體溶液溶解到硼酸鹽緩沖的PBS溶液中，加到微滴板 (Carning貨號#2595) 4°C過夜。用含有0. 05% Tween20的硼酸鹽溶液洗板4次去除多余的 液體。已知量的再折疊人類OB蛋白或血漿樣品100ml加入每個小孔，4°C溫育過夜。清洗 后，滴板加100ml生物素偶聯(lián)的免疫純化抗人類抗體(0. lmg/ml于明膠-硼酸鹽緩沖溶液 中)室溫溫育4小時。清洗后加辣根過氧化物酶(HRP)-鏈親和素到滴定板上(0. lmg/ml 于硼酸鹽緩沖液，0. 3%明膠)。用HRP底物溶液(ABTS. 0. 3mg/nl和H2O2，0. 01 %于檸檬酸 中)來檢測，414nm處測0. D將抗體結(jié)合定量化。將小鼠和人類OB基因編碼序列從含有OB cDNA序列的質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增出來，亞克 隆到pPIC. 9質(zhì)粒(Invitrogen)中。所用的人類5'引物是5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3‘ (SEQ ID NO 34)
3'引物是5' GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3‘ (SEQ IDNO 35)對于小鼠，5'引物是5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG3' (SEQ ID NO 36)3'引物是5' GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3‘ (SEQ ID NO :37)。小鼠和人類的5'引物在5'端含有XhoI位點(diǎn)并且含有載體pPIC9中α-交配因 子信號序列最末四個氨基酸的編碼序列。該載體指導(dǎo)異源表達(dá)的基因從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基 中。5' RCR引物還包括OB基因開放閱讀框架中信號序列切割位點(diǎn)之后氨基酸位置21的 丙氨酸之前的前面19個核苷酸。3'引物在其5'端含有EcoRI位點(diǎn)，其后緊跟著與假設(shè)的 OB終止密碼子互補(bǔ)的序列。PCR條件如下變性94°C 1分鐘，退火55°C 1分鐘，延伸72°C 2. 5分鐘。用紙循環(huán)次數(shù)PCR(15輪)和校正閱讀聚合酶PFU(Stratagene)來限制PCR產(chǎn)生 的突變的個數(shù)。PCR產(chǎn)物用XhoI和EcoRI消化并克隆到同樣消化的載體pFPIC. 9里。所有 的結(jié)構(gòu)均對兩條鏈測序保證沒有任何PCR產(chǎn)生的突變。 克隆用原生質(zhì)球洗轉(zhuǎn)化到巴斯德畢 赤氏酵母(His—)中在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上選擇。對約200個小鼠和人類克隆用菌落雜交 篩選高拷貝數(shù)的整合。對高拷貝數(shù)克隆然后檢測OB表達(dá)，先用考馬斯染色顯示轉(zhuǎn)化酵母的 培養(yǎng)基中存在新的16KD蛋白質(zhì)。用抗細(xì)菌表達(dá)的OB蛋白的抗體證實(shí)16KD帶是0B。重組 蛋白用下述兩步純化法純化。進(jìn)行質(zhì)譜和溴化氰處理，描述見Beavis等人，美國國家科學(xué) 院院刊，87 6873-6877(1990)。小鼠和人類OB基因信號序列C末端的全部OB編碼序列亞克隆到pET156表達(dá)載 體(Novagen)中，在大腸桿菌[BL21 (DE3) plYsS]中用T7RNA聚合酶系統(tǒng)[Studier等人，酶 學(xué)方法(Meth. Enzymology)，185 :80_89 (1990)]。過度表達(dá)。30°C細(xì)胞生長到 595nM 吸收 為0. 7，用0. 5mM異丙基-β -D-硫化半乳糖-吡喃誘導(dǎo)過夜，用低速離心收集。用三輪冷 凍解凍實(shí)現(xiàn)裂解，用Dnase I進(jìn)行DNA消化。用超聲處理和去污溶解進(jìn)行膜提取、最終的包 涵體片狀沉淀溶于6Μ鹽酸胍，20mMHEPES, pH8. 4。在變性條件下用Ni-離子親和柱和遞增 量的咪唑沖洗以IMAC純化重組OB蛋白。純化的變性O(shè)B蛋白然后貯存于6M鹽酸胍，IOmM 乙酸鈉(NaAc)pH5中用ImM DTT室溫下還原1小時。將還原的蛋白稀釋入20%甘油，5mM CaCl2, 5mM NaAc. pH5中，攪拌并于室溫溫育8_12小時完成變性。變性后添加Tris至IOmM 將pH調(diào)至84，用凝血酶切割去除六組氨酸-尾標(biāo)。切割過并變性的蛋白質(zhì)用IMAC再純化 并將產(chǎn)物從凝血酶和末切割的融合蛋白中分離出來。切割過并復(fù)性的蛋白質(zhì)用40mM咪唑 從Ni-離子親和柱洗脫，而凝血酶留不住，未切割的融合蛋白用0. 2mM咪唑洗脫。然后濃縮 樣品，用IOOmMEDTA和IOmM鐵氰化鉀處理，用Pharmacia Superdex 75 16/60柱凝膠過濾 進(jìn)一步純化。進(jìn)行Ellman氏檢驗(yàn)，描述見Ellman，生物化學(xué)與生物物理檔案(Arch. Biochem. Bivphys)82 :70-77(1959)。將 39. 6mg 5,5' _ 二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶于 IOml 0. 05M磷酸，pH8. 0，制得Ellman氏試劑。412nm下游離巰基(用ImM還原DTT貯液)濃度 范圍10-120mM作標(biāo)定曲線，每次檢驗(yàn)用0. 02ml Ellman氏試劑，共0. 5ml反應(yīng)混合物。對 游離巰基測得消光系數(shù)是UgTAM-1CnT1 (相關(guān)系數(shù)0. 99987)，與以前的報(bào)道值ΠΘΟΟΜ-^πΓ1 相差小于5%。
對50ml的2mg/ml純凝膠過濾的蛋白質(zhì)進(jìn)行Ellman氏檢驗(yàn)，它對應(yīng)于終反應(yīng)混合 物中可能的游離巰基濃度約為24mM。得到的溶液A412約0. 02，顯示蛋白中的兩個半胱氨 酸殘基為氧化態(tài)形成胱氨酸或其游離巰基完全包埋在折疊蛋白的外面接觸不到的核心中。 對6M鹽酸胍中的未折疊蛋白作相同的檢驗(yàn)得到的結(jié)果。小鼠單獨(dú)關(guān)在無致病源的環(huán)境中逐步適應(yīng)下列食譜。35% (W/W)實(shí)驗(yàn)嚙齒類食譜 5001 (PMP飼料公司)5. 9% (W/W)，木薯淀粉布丁混合物(通用食品)和59. 1 %水，在能量 含量(Energe content)為130Kcal/gm。食物用高壓蒸鍋消毒，包裝到60mm塑料小碟中， 小蝶固定于IOOml培養(yǎng)皿上部。木薯淀粉使食物呈漿糊狀，動物很難弄得籠子中到處都是 食物。IOOmm塞能回收動物濺出的食物。每天早晨往籠中放一碟新鮮食物，將前一天的小 碟取走，稱重。測重量差即可測量每日食物消耗。重組蛋白對食物攝入量的影響和體重測 量工作是在從Jackson實(shí)驗(yàn)室購得的三株小鼠C57B1/6J ob/ob，C57B1/Ks db/db和CBA/ J +/+上進(jìn)行的。每株30個小鼠分成10個一組。每株的一組每日接受再折疊細(xì)菌ob蛋白 的腹腔內(nèi)(i.P.)注射，劑量是5mg/g/天300μ1 PBS。第二組接受同等體積PBS的腹腔內(nèi) 注射。這些對照小鼠接受的是重組蛋白PBS要透析物的注射。PBS用Acticlean ETOX柱消 除了內(nèi)毒素。第三組動物不接受注射。每日記錄食物攝入量規(guī)律性以3. 5周為間隔測量體 重。在配對喂食實(shí)驗(yàn)中另外一組ob小鼠的食物攝入量在每日基礎(chǔ)上與接受蛋白的ob小鼠 消耗量相同。MMOB蛋白在小鼠，大鼠和人類血漿中循環(huán) 利用pET156細(xì)菌表達(dá)載體(Novagen)并克隆至巴斯德畢赤氏酵母一種將重組蛋 白直接分泌到培養(yǎng)基中的酵母表達(dá)系統(tǒng)中，制備重組小鼠和人類OB蛋白。在酵母中表達(dá)的 ob蛋白含有信號序列羧基端146個氨基酸。用細(xì)菌蛋白(IPR公司)免疫兔子。抗體經(jīng)免 疫純化(研究遺傳學(xué)并用同血漿和脂肪組織的蛋白做免疫沉淀和Western印跡。小鼠血漿的OB蛋白SDS-PAGE以16KD表現(xiàn)分子量遷移。電泳遷移率與酵母分泌 的除去信號序列的重組OB蛋白相同(圖24A)。在105密碼了有無義突變的C57BL/6J ob/ ob小鼠的血漿中未檢測到該蛋白。用幾種不同的抗血清也未能鑒定到cDNA序列推斷的截 短105殘基多肽鏈。db/db小鼠與對照小鼠相比，觀察到循環(huán)蛋白水平升高10倍(圖24A)。野生型和 fa/fa大鼠的血漿做免疫沉淀，顯示突變型大鼠與野生型相比OB蛋白水平增加20倍(圖 20B)。db突變造成與ob小鼠中見到的相同的肥胖表型(Bahary等人，1990，引文見上)。 肥胖(fatty)小鼠肥胖是因?yàn)榕cdb同源的基因上有隱性突變(Truett等人，1991，引文見 上)。為了將小鼠血漿中OB水平定量，在血清中加入遞增量的重組蛋白作免疫沉淀(圖 24C)。Western印跡上見到隨著重組蛋白量增加信號強(qiáng)度線性增加。將小鼠血漿中天然蛋 白的信號強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)比較，顯示野生型小鼠中OB蛋白循環(huán)水平約20ng/ml。這些數(shù)據(jù)表明 免疫沉淀和Western印跡在抗體過多條件下進(jìn)行。db/db小鼠脂肪組織的蛋白提取物與對 照相比也可看出OB蛋白水平增加(圖24D)。如對分泌蛋白材料，脂肪組織的蛋白為粗膜 (crude menobrane)部分分級分離(數(shù)據(jù)未給出)。取自6個身體質(zhì)量系數(shù)(BMI)小于25 (BMI =體重/身高2)的瘦人受試者的血漿 樣本用抗人類蛋白的抗體自免疫沉淀。免疫沉淀的材料以與酵母中表達(dá)的146氨基酸人類蛋白相同的電泳遷移率遷移。6個樣本中信號強(qiáng)度相差很大。(圖25A)自顯影密度測量顯 示個體HPl和HP6水平相差約5倍，其它受試者水平居中。用免疫純化抗體和再折疊的細(xì) 菌蛋白作標(biāo)準(zhǔn)(見下)研制出一種酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)(ELISA)。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖25B給出。 利用該檢驗(yàn)得知，6個人類血漿樣本中CB蛋白的血漿水平在2-15ng/ml之間變化(圖25C)。 HP血漿中OB蛋白水平在免疫檢驗(yàn)的線性范圍外，彡15ng/ml。這些定量差別與Western印 跡中所見相同。初步數(shù)據(jù)顯示瘠素可能至少部分與另一蛋白質(zhì)或多個蛋白質(zhì)形成復(fù)合物循環(huán)。該 結(jié)論基于血清滴定曲線相對于重組標(biāo)準(zhǔn)的異質(zhì)性(heterogeneity)。在兔抗OB柱上變性與 非變性條件下凝膠過濾HPLC免疫純化大量瘠素，用ELISA和SDS-PAGE監(jiān)測進(jìn)行分析，顯示 OB多肽行為類似高分子量復(fù)合物。然而，這些僅為初步數(shù)據(jù)，OB結(jié)合蛋白，如果有的話，性 質(zhì)尚待進(jìn)一步研究。OB蛋白的結(jié)構(gòu)特征 由于OB蛋白有兩個半胱氨酸殘基，在體內(nèi)氧化環(huán)境下可形成分子間或分子內(nèi)二 硫鏈。在樣本緩沖液中添加或不添加還原試劑重復(fù)Western印跡。兩種條件下，人類血清 中的OB蛋白以單體形式遷移(數(shù)據(jù)未給出)。非還原條件下，在與16KD單體和約32KD 二 聚體相應(yīng)的位置檢測到db小鼠血清的免疫沉淀到的蛋白(圖20A)。還原條件下分子量較 高的部分消失，提示小鼠db的一部分通過形成分子間二硫鍵以高分子量形式循環(huán)。小鼠OB 的約80%以約16KD蛋白形式循環(huán)，20%以約32KD形式循環(huán)。當(dāng)小鼠和人類蛋白在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)時也見到同樣的分子形式[Alrams 等人，免疫學(xué)綜述(Immunol Rev.), 5-24 (1992) ] 0這些研究中，對應(yīng)于146氨基酸的成熟 OB蛋白的DNA序列克隆到pPIC. 9載體(Invitrogen)中酵母α -交配因子信號序列下游。 從表達(dá)小鼠和人類蛋白的株的酵母培養(yǎng)基中純化OB蛋白，在還原和非還原條件下電泳(圖 26Α)。非還原條件下，小鼠蛋白主要以二聚體形式在酵母中表達(dá)，當(dāng)還原劑存在時，僅以單 體形式表達(dá)。兩種情況下，重組人類蛋白質(zhì)均遷移到單體的位置(數(shù)據(jù)未給出)。在畢赤氏酵母中表達(dá)的純化人類蛋白用質(zhì)譜1990確定其分子量為 16，024士3Da(Beavis，1990，引文見上)。該值與含有單個分子間二硫橋的蛋白的氨基酸序 列的計(jì)算值(16. 024Da)相符。用基質(zhì)輔助激光去吸收質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的溴化氰切割產(chǎn)物， 顯示半胱氨酸117和167通過一個分子內(nèi)二硫鏈相連(圖26B)。溴化氰在蛋氨酸殘基羧基 端切割。生物活性蛋白的制備與定性小鼠OB蛋白從pET156質(zhì)粒在大腸桿菌中以不溶性融合蛋白形式表達(dá)，其20個殘 基的N末端六組氨酸尾標(biāo)含有一個凝血酶切割位點(diǎn)。細(xì)菌包涵體用鹽酸胍溶解，在變性環(huán) 境下用固定化金屬離子親和層析(IMAC)純化(圖27)。純化的變性融合蛋白經(jīng)還原、稀釋， 在室溫下水溶液中再折裂。凝血酶切割后，含有4個附加的N末端殘基(Gly-Ser-His-Net ； (SEQ ID NO 38)的復(fù)性小鼠OB蛋白用IMAC再純化，直到用SDS-PAGE和質(zhì)譜制定已> 98% 同質(zhì)?；|(zhì)輔助激光去吸收質(zhì)譜給出分量測量值16，414士3Da(推測值=16，415Da)。還原 性和非還原性SDS-PAGE凝膠顯示出表觀分子量16KD的單一分子。(數(shù)據(jù)未給出)。用DpSOl分子大小檢測儀(蛋白質(zhì)解決方案公司)做動態(tài)光散射，顯示復(fù)性的小 鼠OB蛋白大多是單體。有些高階聚集物。蛋白用EDTA處理并化學(xué)氧化。然后用凝膠過濾去除高分子量物質(zhì)。進(jìn)一步用動態(tài)光散射證實(shí)純化的復(fù)性重組小鼠OB蛋白是單一分散相。 用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)透析后，用Acticlean ETOX柱(Sterogene生物分離公司)去 除細(xì)菌內(nèi)毒素。蛋白質(zhì)終產(chǎn)量是45mg/l。
對純化的復(fù)性重組小鼠OB蛋白作Ellman氏檢驗(yàn)來確定其氧化態(tài)(Ellman，1959， 引文見上)。復(fù)性蛋白和6M鹽酸胍去折疊的蛋白均顯示游離巰基含量小于0. 5%，這表明 單體產(chǎn)物含有一個分子內(nèi)二硫鍵。對再折疊細(xì)菌蛋白的溴化氰切割產(chǎn)物作質(zhì)譜證實(shí)了這一 點(diǎn)(數(shù)據(jù)未給出)。OB蛋白的生物活性純化的復(fù)性重組小鼠OB蛋白每日腹膜內(nèi)單次注射5mg/kg日給藥至10個 C57B1/6J ob (年齡 16 周)，C57B1/Ks db/db (年齡 12 周)和 CBA/J+/+(年齡 8 周)小鼠的 各組中。同樣數(shù)量的動物每日接受PBS注射。用于對照注射的PBS來自蛋白平衡后的透析 物。三個小鼠株的另外10個動物不接受注射。每日監(jiān)測每個動物的食物攝入量，以3或4 日間隔記錄動物體重。9組小鼠每一組食物攝入量和體重的累積結(jié)果由圖28A至F給出，數(shù) 據(jù)的統(tǒng)計(jì)意義由表1給出。接受蛋白注射的C57B1/6J ob/ob小鼠的食物攝入量在第一次注 射后顯著降低，并持續(xù)降低至第五天，穩(wěn)定到與接受PBS注射的動物攝入量的約40%相等 的水平上(P <0.001)。假注射OB小鼠在三周研究期間體重不減。接受蛋白的C57B1/6J db/db小鼠5天后失去約10%體重(ρ < 0. 001)。這些小鼠在三周處理中體重繼續(xù)減輕，直 到其體重減至初始體重的平均60% (p<0.001)。另一組ob小鼠與接受蛋白的ob小鼠成 對飼養(yǎng)。圖29B的數(shù)據(jù)顯示成對飼養(yǎng)的小鼠比接受重組蛋白的動物體重減輕要少得多(ρ <0.02)。接受蛋白或媒介物(vehicle)的兩只小鼠的照片顯示了蛋白質(zhì)處理造成的外觀 巨大差別(圖29B)。為了進(jìn)一步確證蛋白質(zhì)的效果，對每組的兩個小鼠做尸體解剖。粗檢 接受蛋白的ob小鼠即看出體內(nèi)脂肪和肝大小減少很多。db和野生型小鼠肝重在處理過程 中不變。接受PBS注射的ob小鼠肝重5. 04和5. 02克，而接受重組蛋白的動物肝重2. 23和 2. 03克。與ob小鼠特征的淺色肥肝相對照，接受蛋白的ob小鼠肝具正常有肝特有的顏色 (圖29C)。肝組織切片顯示未處理的動物有肥肝，而蛋白處理的動物中情況大為改善(數(shù) 據(jù)未給出)。與ob小鼠不同，接受蛋白的C57BL/KS db/db小鼠相對接受媒介物的對照組體重 與食物攝入量并無顯著差別(圖28A至F，表1)。所有3組db/db小鼠在處理過程中減重 2-5克。用血糖計(jì)測量db小鼠平均血糖。在所有小鼠均> 500mg/dl顯示這些小鼠得了肥 胖癥后帶來的糖尿病，對db小鼠的注射兩周后結(jié)束。野生型小鼠中，用重組蛋白給藥后體重減輕小組明顯(圖28A至F，表1)。蛋白注 射5周后，受處理的小鼠平均減重0.5克而對照小鼠增重0.4克(P>0.02)。在隨后的兩 個時間點(diǎn)接受蛋白的動物體重比每日接受PBS注射的小鼠明顯要輕。體重變化在后來的時 間點(diǎn)變得不明顯。在體重減輕的動物中，食物攝入量與對照動物并無顯著不同。注射PBS 對ob，ab和野生型小鼠的食物攝入量和體重與未接受注射的小鼠相比有小而明顯的影響 (P < 0. 05)。表 權(quán)利要求
1.一種具有大約145到167個氨基酸，能夠調(diào)控動物體重的肥胖癥(OB)多肽，或其具 有相同生物活性的等位變異體或類似物，包括片段。
2.權(quán)利要求1的OB多肽或其等位變異體或類似物，包括片段，該多肽包含SEQID NO 2、4、5或6的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的OB多肽的免疫原性片段。
4.OB多肽的免疫原性片段，其選自Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr(SEQID NO 18)；Leu-His-Pro-IIe-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala(SEQ IDNO 19)；Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu -Asp(SEQ ID NO 20)；禾口Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-G Iu-Cys(SEQ ID NO 21)。
5.權(quán)利要求2的人類OB多肽類似物，其中選自氨基酸53、56、71、85、89、92、95、98、 110、118、121、122、126、127、128、129、132、139、157、159、163 和 166(根據(jù) SEQ ID NO 4 的 編號)的一個或多個氨基酸被他氨基酸替換。
6.權(quán)利要求5的人類OB多肽類似物，其中替換中用SEQID NO :2給出的小鼠OB多肽 的趨異氨基酸進(jìn)行的。
7.權(quán)利要求5的人類OB多肽類似物，其中替換是用丙氨酸進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求5的人類OB多肽類似物，其選自下列多肽，其中(a)第53位的絲氨酸殘基被甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或蘇氨酸替換；(b)第98位的絲氨酸殘基被甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸或蘇氨酸替換；和(c)第92位的精氨酸殘基被天冬酰胺、賴氨酸、組氨酸、谷酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸替換。
9.權(quán)利要求2的OB多肽類似物，其與SEQID NO :2、4、5或6給出的人類OB多肽氨基 酸序列有83%或更高的的氨基酸序列同源性。
10.權(quán)利要求2的人類OB多肽類似物，其選自下列多肽，其中(a)一個或多個天冬氨酸殘基被谷氨酸替換；(b)一個或多個異亮氨酸殘基被亮氨酸替換；(c)一個或多個甘氨酸或纈氨酸殘基被丙氨酸替換；(d)一個或多個精氨酸殘基被組氨酸替換；(e)一個或多個酪氨酸或苯丙氨酸殘基被色氨酸替換；(f)第121至128位的一個或多個殘基(根據(jù)SEQID NO 4的編號)被甘氨酸或丙氨 酸替換，和(g)第54至60位或118至166位的一個或多個殘基(根據(jù)SEQIDNO 4的編號)被 賴氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或脯氨酸替換。
11.權(quán)利要求1、2、3、5、6或9中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽，其選自下列多肽(a)第1到21位殘基缺失的多肽；(b)(a)的部分多肽，其第21位是蛋氨酸，或其第18位至21位是(SEQ ID NO 38)甘氨 酸_絲氨酸_組氨酸_蛋氨酸序列，或其第1位至21位是蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨 酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮 氨酸-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-組氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID N0:98)。
12.權(quán)利要求1、2、3、5、6或9中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽，其選自下列多肽(a)第1到21位殘基缺失的多肽；(b)(a)的部分多肽，其第14位至21位是亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸-谷氨 酸_丙氨酸_谷氨酸_丙氨酸序列(SEQ IDNO 26)，或第18至21位是谷氨酸-丙氨酸-谷 氨酸_丙氨酸序列(SEQ ID NO :27)，或第18至21位是亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸 序列(SEQ ID NO 28)，或第2至21位是蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯 氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲氨酸_脯氨酸序列(SEQ ID NO 99)，或第18至21位是甘氨 酸-絲氨酸-脯氨酸序列。
13.權(quán)利要求7、8、9或10中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽，其選自下列多肽(a)第1到21位殘基缺失的多肽；和(b)(a)的部分多肽，其第21位是蛋氨酸，或第18位至21位是甘氨酸-絲氨酸-組 氨酸_蛋氨酸序列(SEQ ID NO 38)，或第1位至21位是蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨 酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮 氨酸-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-組氨酸-蛋氨酸序列(SEQ ID NO 98), 或第14位至21位是亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨 酸序列(SEQ IDN0:26)，或第18至21位是谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID N0:27)，或第18至21位是亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸序列(SEQ ID N0:28)，或第2 至21位是蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲 氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID N0:99)，或第18至21位是甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸序列。
14.權(quán)利要求2的人類OB多肽的截短的類似物，它選自下列多肽(根據(jù)SEQID NO 4 的編號)，其中(a)第121位到128位的一個或多個殘基缺失；(b)第1-116位殘基缺失；(c)第1-21位和54到167位殘基缺失；(d)第1-60位和117到167位殘基缺失；(e)第1-60位殘基缺失；(f)第1-53位殘基缺失；(g)(a)的部分的類擬物，其中第1-21第殘基缺失；和(h)(a)至(g)的部分的類擬物，其N末端氨基酸或氨基酸序列選自(1)蛋氨酸；(2)甘氨酸_絲氨酸_組氨酸-蛋氨酸序列(SEQIDNO 38)；(3)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲 氨酸_組氨酸_蛋氨酸序列(SEQ ID NO 98)；(4)亮氨酸-谷氨酸-賴氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸序列(SEQ ID NO 26)；(5)谷氨酸_丙氨酸_谷氨酸-丙氨酸序列(SEQIDNO ,21)；(6)亮氨酸_谷氨酸_賴氨酸-精氨酸序列(SEQIDNO 28)；(7)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲 氨酸-脯氨酸序列(SEQ ID N0:99)，和(8)甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸序列。
15.權(quán)利要求1至14中任一權(quán)項(xiàng)的重組OB多肽。
16.權(quán)利要求1至14中任一權(quán)項(xiàng)的化學(xué)合成的OB多肽。
17.權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽衍生物，它還具有一個或多個與之相連的化學(xué)基元。
18.權(quán)利要求17的衍生物，其中化學(xué)基元為水溶性聚合物。
19.權(quán)利要求18的衍生物，其中水溶性聚合物是聚乙二醇。
20.權(quán)利要求19的衍生物，該衍生物被單、雙、三或四聚乙二醇化。
21.權(quán)利要求20的衍生物，該衍生物N被末端單聚乙二醇化。
22.權(quán)利要求21的衍生物，它是一種OB多肽，該多肽包含SEQIDNO 4的氨基酸殘基 22 至 167 或 SEQ ID NO 6 的殘基 22 至 166。
23.權(quán)利要求21的衍生物，它是一種OB多肽，該多肽包含SEQIDNO 4的殘基22至167 或SEQ ID NO 6的殘基22至166的氨基酸序列，且第21位為蛋氨酸。
24.編碼權(quán)利要求1至6、9或11中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽的分離的核酸分子。
25.編碼權(quán)利要求7、8、10、12、13或14中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽的分離的核酸分子。
26.一種用于保證具有調(diào)控哺乳動物體重的生物活性的OB多肽表達(dá)的DNA分子，該 DNA選自(a)SEQ ID NO 1和3給出的DNA分子或其片段；(b)與(a)中定義的DNA分子雜交的DNA分子或其可雜交片段；和(c)編碼被前述任意DNA分子編碼的氨基酸序列的表達(dá)的DNA分子。
27.權(quán)利要求26的DNA分子，它是SEQ ID NO 22和24的人類基因組DNA分子。
28.權(quán)利要求24的DNA分子，其編碼一種多肽，該多肽所具有的氨基酸序列選自(a)SEQ IDNO2 ；(b)SEQ IDNO2的氨基畫I 22 至 167 ；(c)SEQ IDNO4；(d)SEQ IDNO4的氨基畫I 22 至 167 ；(e)SEQ IDNO5 ；(f)SEQ IDNO5的氨基畫I 22 至 166 ；(g)SEQ IDNO6 ；(h)SEQ IDNO6的氨基畫I 22 至 166 ；和(i) (b) (d) (f)或(h)的部分氨基酸序列，其N末端氨基酸或氨基酸序列選自(1)蛋氨酸；(2)甘氨酸-絲氨酸-組氨酸-蛋氨酸序列(SEQIDNO 38)，和(3)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲 氨酸_組氨酸_蛋氨酸序列(SEQ ID NO 98)。
29.權(quán)利要求28的DNA分子，它編碼(b)(d) (f)或(h)的部分氨基酸，其N末端氨基酸 序列選自(1)亮氨酸_谷氨酸_賴氨酸_精氨酸_谷氨酸_丙氨酸_谷氨酸_丙氨酸序列(SEQ ID NO 26)；(2)谷氨酸_丙氨酸_谷氨酸-丙氨酸序列(SEQID NO ,21)；(3)亮氨酸_谷氨酸_賴氨酸-精氨酸序列(SEQID NO 28)；(4)蛋氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨 酸_組氨酸_絲氨酸_絲氨酸_甘氨酸_亮氨酸_纈氨酸_脯氨酸_精氨酸_甘氨酸_絲 氨酸“脯氨酸序列(SEQ IDNO 99)，和(5)甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸序列。
30.權(quán)利要求24的DNA分子，它含有編碼SEQID NO :3給出的蛋白質(zhì)的編碼序列。
31.權(quán)利要求24的DNA分子，它含有編碼SEQID NO 3的氨基酸22至167的序列。
32.一種被可檢測標(biāo)記的核酸分子，它可以與權(quán)利要求24至31中任一權(quán)項(xiàng)的DNA分子 雜交。
33.一種可以與OB核酸非編碼區(qū)雜交的核酸，該非編碼區(qū)選自內(nèi)含子、5'非編碼區(qū)和 3'非編碼區(qū)。
34.一種用于擴(kuò)增編碼OB多肽的人類基因組DNA的寡核苷酸引物。
35.權(quán)利要求32的寡核苷酸，它選自HOB IgF 5' -CCCAAGAAGCCCATCCTG-3‘ (SEQ ID NO 29)；HOB IgR 5' -GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3‘ (SEQ ID NO 30)；HOB 2gF 5' -CCACATGCTGAGCACTTGTT-3‘ (SEQ ID NO :31)；和HOB 2gR 5' -CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3‘ (SEQ ID NO :32)。
36.一種含有權(quán)利要求24至31中任一權(quán)項(xiàng)的DNA分子的載體。
37.一種表達(dá)載體，它含有經(jīng)操作與一段表達(dá)控制序列相連的權(quán)利要求24、26、30或31 中任一權(quán)項(xiàng)的DNA分子。
38.一種表達(dá)載體，它含有經(jīng)操作與一段表達(dá)控制序列相連的權(quán)利要求27或29的DNA 分子。
39.一種表達(dá)載體，它含有經(jīng)操作與一段表達(dá)控制序列相連的權(quán)利要求25的DNA分子。
40.一種用權(quán)利要求24或25的DNA分子或權(quán)利要求36至39中任一權(quán)項(xiàng)的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞宿主。
41.權(quán)利要求40的單細(xì)胞宿主，它選自細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞 和組織培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞。
42.權(quán)利要求40的單細(xì)胞宿主，它選自大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、酵母、CH0, Rl. 1、B-W、L-M、C0S1、D0S7，BSCl、BSC40、BMTlO 和 Sf9 細(xì)胞。
43.權(quán)利要求40的單細(xì)胞宿主，其中細(xì)胞宿主是酵母宿主，選自啤酒酵母、畢赤氏酵 母、假絲酵母、漢遜氏酵母、球擬酵母。
44.含有編碼OB多肽的DNA序列的哺乳動物細(xì)胞，所述DNA序列經(jīng)同源重組過程而被 體外修飾，使OB多肽更高效地表達(dá)，同源重組過程包括將表達(dá)調(diào)節(jié)序列插入到OB多肽編碼 序列的功能性相近處。
45.權(quán)利要求44的細(xì)胞，其中表達(dá)調(diào)節(jié)序列是OB多肽表達(dá)調(diào)節(jié)序列，并且同源重組過 程替換掉了突變型OB多肽表達(dá)調(diào)節(jié)序列。
46.權(quán)利要求45的細(xì)胞，其中表達(dá)調(diào)節(jié)序列插入序列不是OB多肽調(diào)節(jié)序列。
47.一種制備OB多肽的方法，它包括(a)在適于表達(dá)OB多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求40至46中任一權(quán)項(xiàng)的細(xì)胞；和(b)回收表達(dá)的OB多肽。
48.權(quán)利要求47的方法，其中的細(xì)胞是細(xì)菌或酵母。
49.權(quán)利要求47或48的方法，其進(jìn)一步包括(c)在Ni螯合柱上層析OB多肽；和(b)用凝膠過濾法純化OB多肽。
50.權(quán)利要求49的方法，其進(jìn)一步包括步驟(c)之后及步驟(d)之前在強(qiáng)陽離子交換 柱上層析OB多肽。
51.對權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法產(chǎn)生的OB多肽有 特異性的抗體。
52.權(quán)利要求51的抗體，它是單克隆或多克隆抗體。
53.權(quán)利要求52的抗體，它被可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。
54.生產(chǎn)權(quán)利要求52的單克隆抗體的不死細(xì)胞系。
55.一種制備OB多肽特異性抗體的方法，它包括(a)將權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法產(chǎn)生的OB多肽偶 聯(lián)到載體蛋白上；(b)用與佐劑混合的步驟(a)的OB多肽片段-載體蛋白偶聯(lián)物免疫宿主動物；和(c)從免疫的宿主動物獲得抗體。
56.一種測量OB多肽在樣本中是否存在的方法，該方法包括(a)在適于形成包含抗體和OB多肽的反應(yīng)復(fù)合物的條件下將懷疑含有OB多肽的樣本 接觸特異性結(jié)合OB多肽的抗體；和(b)檢測樣本中含有抗體和OB多肽的反應(yīng)復(fù)合物是否形成，若檢測到反應(yīng)復(fù)合物的形成則說明樣本中有OB多肽。
57.權(quán)利要求56的方法，其中抗體結(jié)合在固相支持物上。
58.一種體外測定生物樣本中OB多肽水平的方法，該方法包括(a)用權(quán)利要求56或57的方法檢測生物樣本中反應(yīng)復(fù)合物的形成；和(b)測定形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，反應(yīng)復(fù)合物的量對應(yīng)生物樣本中OB多肽的水平。
59.一種體外檢測或診斷哺乳動物受試者中與OB多肽水平升高或降低相關(guān)的病癥是 否存在的方法，該方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求58測定來自哺乳動物受試者的生物樣本中OB多肽的水平，和(b)將步驟(a)中檢測到的水平與正常受試者中或受試者早些時候的OB多肽水平相比較與正常水平相比OB多肽水平升高說明有與OB多肽水平上升相聯(lián)系的疾病，與正常水 平相比OB多肽水平下降說明有與OB多肽水平下降相聯(lián)系的疾病。
60.一種對哺乳動物受試者中與OB多肽水平上升或下降有聯(lián)系的疾病的治療處理的 體外監(jiān)測方法，該方法包括在不同時間點(diǎn)，對患有與OB多肽水平上升或下降相聯(lián)系的疾病 并接受相關(guān)治療處理的哺乳動物受試者取一系列生物樣本，用權(quán)利要求58的方法，測定其 中OB多肽的水平。
61.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的 方法制備的OB多肽和藥用載體。
62.權(quán)利要求61的藥物組合物，它被用于降低動物體重。
63.一種用于增加動物體重的藥物組合物，它包括權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用 權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽的拮抗物和藥用載體。
64.權(quán)利要求63的藥物組合物，其中拮抗物選自結(jié)合OB多肽并中和其活性的抗體， 結(jié)合但不活化OB多肽受體的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
65.一種用于減輕個體體重的改善體形的美容組合物，它包含權(quán)利要求1至16中任一 權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽和可接受的載體。
66.一種用于增加個體體重的改善體形的美容組合物，它包括權(quán)利要求1至16的或用 權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽的拮抗物和可接受的載體。
67.權(quán)利要求66的美容組合物，其中拮抗物選自結(jié)合OB多肽并中和其活性的抗體，結(jié) 合但不活化OB多肽受體的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
68.一種改善個體體形的美容方法，其中權(quán)利要求64至67中任一權(quán)項(xiàng)的美容組合物被 施用給個體，其劑量足以將個體體重調(diào)節(jié)到需要的水平。
69.與編碼權(quán)利要求1至4或9中任一權(quán)項(xiàng)的OB多肽的核酸雜交的反義核酸分子在制 造用于調(diào)節(jié)哺乳動物體重的藥物方面的應(yīng)用。
70.編碼權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽 的核酸分子在制造用于調(diào)節(jié)動物體重的基因治療藥物方面的應(yīng)用。
71.用權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽在 制造用于調(diào)節(jié)動物體重的藥物方面的應(yīng)用。
72.用權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽在 制造用于調(diào)節(jié)哺乳動物體重的藥物方面的應(yīng)用，該藥物被用來治療糖尿病，高血壓或高膽 固醇。
73.用權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽在 制造用于調(diào)節(jié)哺乳動物體重的藥物方面的應(yīng)用，該藥物與治療糖尿病，高血壓或高膽固醇 的藥物結(jié)合使用。
74.用權(quán)利要求1至16中任一權(quán)項(xiàng)的或用權(quán)利要求47至50的方法制備的OB多肽的 拮抗物在在制造用于增加動物體重的藥物方面的應(yīng)用。
75.權(quán)利要求74的應(yīng)用，其中拮抗物選自結(jié)合OB多肽并中和其活性的抗體，結(jié)合但不活化多肽受體的OB多肽片段，以及OB多肽的小分子拮抗物。
76.權(quán)利要求71至75中任一權(quán)項(xiàng)的應(yīng)用，它被用適于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、鼻腔、口腔或肺部施用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供肥胖癥(OB)多肽和編碼這些多肽的核酸分子，解決動物，特別是哺乳動物的肥胖癥和脂肪含量的控制問題。本發(fā)明的核酸序列不僅能重組產(chǎn)生OB多肽，其本身也可用于體重調(diào)控。
文檔編號A61K8/64GK102002102SQ20101017026
公開日2011年4月6日 申請日期1995年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月17日
發(fā)明者J·L·哈拉斯, J·M·弗雷德曼, K·加吉瓦拉, M·馬非爾, R·普勒安卡, S·K·伯雷, 張一影 申請人:洛克菲勒大學(xué)