專利名稱：一種快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)與物理科學(xué)，具體涉及芯片電泳技術(shù)；特別提供了一 種使用專用的陣列微流控芯片對藥物核酸相互作用進(jìn)行定量評價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
核酸分子是多態(tài)的(包括序列、結(jié)構(gòu)等)，在它們的結(jié)構(gòu)中往往含有特 定的位點(diǎn)作為一些藥物的作用靶點(diǎn)， 一些藥物與核酸作用會導(dǎo)致核酸的裂 解或者空間螺旋結(jié)構(gòu)的畸變，而許多這些核酸-藥物的相互作用能顯示出生 物學(xué)和臨床藥學(xué)方面的效能，如抑制腫瘤細(xì)胞增長、病毒、細(xì)菌、真菌 和寄生蟲感染等，因此，研究核酸-藥物的相互作用對藥物設(shè)計(jì)、開發(fā)性研 究和臨床用藥有極其重要的指導(dǎo)意義。盡管目前已有很多基于核酸靶點(diǎn)的 藥物應(yīng)用于臨床治療，但是這些藥物往往具有很大的毒性；另一方面，這 些藥物的作用機(jī)理大都不十分明確。現(xiàn)有報(bào)道的藥物與核酸作用的方式有 三種共價(jià)結(jié)合、非共價(jià)結(jié)合和斷裂作用。共價(jià)結(jié)合主要表現(xiàn)為核酸的烷 基化、鏈間交聯(lián)和鏈內(nèi)交聯(lián)等，其中以順鉑和卡鉑為典型代表藥物。非共 價(jià)結(jié)合則以嵌插結(jié)合和溝區(qū)結(jié)合二種方式進(jìn)行，其中溝區(qū)結(jié)合包括大溝區(qū) 結(jié)合和小溝區(qū)結(jié)合，以紡錘菌素為代表藥物。而博來霉素類抗腫瘤藥物是 一類天然存在的糖肽類抗生素，這類藥物直接作用于腫瘤細(xì)胞的核酸，使 核酸鏈斷裂和裂解，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。闡明藥物和核酸之間相互 作用的本質(zhì)，包括作用位點(diǎn)、作用模式、序列長短的影響、誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化
等等，是生物學(xué)家、化學(xué)家以及藥學(xué)家研究的熱點(diǎn)。
定量評價(jià)核酸-藥物的相互作用是藥物研發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)。對于開 發(fā)新型核酸結(jié)合藥物的需求促進(jìn)了多種定量方法的發(fā)展，例如核磁共振、
拉曼光譜、電噴霧質(zhì)譜、圓二色譜、紫外光譜、x-射線單晶衍射、足跡法
和毛細(xì)管電泳分離等方法已經(jīng)被應(yīng)用于定量評價(jià)核酸-藥物的相互作用。一 般來說，簡單快速的方法不能得到更高的信息量，而相對信息量大的方法 卻有耗時(shí)和高儀器要求的。因此，引入一種高信息量、低樣品消耗和快速 簡單的分析方法能夠極大地促進(jìn)核酸-藥物相互作用的研究。更進(jìn)一步地， 為了滿足不斷增長的分析同量的要求，發(fā)展一種具有平行分析多個(gè)樣品能 力的技術(shù)更為重要。
微流控芯片以其高效、快速、微量及便于自動化等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用 于生物分子的分析測定。而陣列微流控芯片以其高通量平行分析的能力在 基因測序和分析領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。將陣列微流控芯片應(yīng)用到定量評 價(jià)藥物核酸相互作用領(lǐng)域?qū)ρ兄坪烷_發(fā)作用于核酸靶藥物具有重要的意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，即 使用專用的陣列微流控芯片對藥物核酸相互作用進(jìn)行定量評價(jià)。
本發(fā)明提供了一種快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在 于使用專用的陣列微流控芯片對藥物核酸相互作用進(jìn)行定量評價(jià)；
所述的陣列微流控芯片由四組平行的電泳單元(電泳單元是指可提供 分析物在高壓直流電場下定向運(yùn)動，并根據(jù)分析物在該電場中的遷移速度 的不同進(jìn)行分離和分析的微通道系統(tǒng)。)組成，每個(gè)電泳單元(1)由樣品
池(2)、進(jìn)樣通道(3)、緩沖液儲液池(4)、分離通道(5)、緩沖液廢液 池(6)組成。 方法過程為
將芯片電泳緩沖液放入陣列微流控芯片緩沖液儲液池(4)中，并充滿 分離通道(5)和進(jìn)樣通道(3);
將不同藥物-核酸濃度配比的混合樣品分別放入的樣品池(2);
然后對樣品池(2)和緩沖液廢液池(6)之間施加電壓進(jìn)行進(jìn)樣；
進(jìn)樣完成后，在緩沖液儲液池(4)和緩沖液廢液池(6)之間施加電 壓，進(jìn)行電泳分離和檢測。記錄核酸的峰高峰面積變化，用于計(jì)算藥物核 酸的結(jié)合常數(shù)，定量評價(jià)相互作用。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于 所述的每個(gè)電泳單元的組成部分結(jié)構(gòu)相同或成鏡像對稱，分離通道(5)在 檢測區(qū)域集中排列。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于 所述的進(jìn)樣通道(3)或分離通道(5)的深度或?qū)挾鹊姆秶鸀?0 100微 米。進(jìn)樣通道(3)或分離通道(5)的最適宜深度尺寸是10 20微米。深 度太淺，進(jìn)樣量過小，對檢測器靈敏度要求很高，不宜匹配；深度太深， 芯片制作耗時(shí)長，物料成本增加，并且對分離造成負(fù)面的影響。從理論上 講，進(jìn)樣通道(3)或分離通道(5)的寬度越窄越好，通道越窄越有利于 所針對的可操作物質(zhì)的分離，但窄的通道不宜制作且容易堵塞，因此一般 40 60微米的寬度較好，既可以滿足分離要求，也可以滿足芯片的制作。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于 所述陣列微流控芯片中的不同的電泳單元中所使用的緩沖液是同一種緩沖 液。該緩沖液能溶解進(jìn)行相互作用的所有藥物和核酸。電泳過程常用一些 緩沖液作為運(yùn)行溶液，例如磷酸緩沖液、硼砂緩沖液和醋酸緩沖液等。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于 藥物-核酸的混合樣品中濃度比例范圍為0.5: 1~2: 1。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于 所述各個(gè)電泳單元使用的電泳場強(qiáng)一致，場強(qiáng)范圍為150 1000伏/厘米。 一般從低場強(qiáng)向高場強(qiáng)逐次實(shí)驗(yàn)確定所用的場強(qiáng)，其最佳范圍是300 600
伏/厘米。
本發(fā)明提供的快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于
所述的檢測器同時(shí)檢測多個(gè)通道，在各分離通道的相同位置同時(shí)采集信號，
通常采用電荷藕合器件圖像傳感器(CCD)的采集系統(tǒng)。
多個(gè)平行的電泳單元公用一個(gè)緩沖液池(4)是為了方便操作，在本發(fā) 明所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中均采用此種設(shè)計(jì)。公用的緩沖液廢液池(6)就是用來存 儲廢液的，沒有其他特殊用途。采用獨(dú)立的緩沖液廢液池當(dāng)然也可以實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明的目的。
微流控芯片技術(shù)是當(dāng)前儀器分析的研究熱點(diǎn)，該技術(shù)主要以分析化學(xué) 和生物化學(xué)為基礎(chǔ)，利用微機(jī)電加工技術(shù)，在硅、玻璃、石英、高聚物表 面加工出10-100微米的微通道網(wǎng)絡(luò)，主要以電滲流和電泳流為驅(qū)動力，通 過改變驅(qū)動電壓，控制流體在微通道網(wǎng)絡(luò)中的流動方向和速率，不僅易于 實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的采樣、稀釋、富集、萃取、混合、反應(yīng)、分離、檢測
等操作，而且易于將操作單元陣列化。迄今為止，采用多組平行電泳單元 進(jìn)行快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的報(bào)道還沒有。本發(fā)明創(chuàng)造性地設(shè)計(jì) 了用于定量評價(jià)藥物核酸相互作用的陣列微流控芯片，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同樣
品的同時(shí)分離測定。整個(gè)過程在50秒內(nèi)完成，樣品消耗在微升級。本發(fā)明 與液相色譜，核磁共振，微孔板等傳統(tǒng)相互作用研究方法相比，具有直接、 快速、操作簡單和樣品用量少等優(yōu)勢。
總之，本發(fā)明可在一塊幾平方厘米的塑料、玻璃或石英芯片上，在短 時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)樣品的分離分析，并利用得到的數(shù)據(jù)計(jì)算藥物核酸的結(jié)合 常數(shù)，進(jìn)而定量評價(jià)藥物核酸的相互作用。相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明 具有直接、快速、操作簡單和樣品用量少的特點(diǎn)，具有可預(yù)見的巨大的科 學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1為陣列微流控芯片的結(jié)構(gòu)圖，
圖2為熒光標(biāo)記核酸的電泳譜圖，
圖3為不同濃度的紡錘菌素核酸混合物的電泳譜圖；
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
對熒光標(biāo)記的核酸測定。本實(shí)驗(yàn)所用芯片為圖1所示含四個(gè)電泳單元 的玻璃芯片，通道寬50拜，深15脾。緩沖液放入緩沖液儲液池(4)，并 應(yīng)用負(fù)壓將緩沖液充滿分離通道(5)和廢液池(6),將l(HiM熒光標(biāo)記的 核酸混合10pM內(nèi)標(biāo)物熒光素，將四份樣品加入到樣品池(2)。在樣品池 (2)和廢液池(6)之間加電壓(場強(qiáng)400V)，時(shí)間6秒，然后切換電壓 至緩沖液儲液池(4)和廢液池(6)之間(場強(qiáng)400V)，樣品池(2)施加 抑制電壓以防止樣品泄漏，在距離進(jìn)樣點(diǎn)3 cm處檢測(結(jié)果見圖2)。從 圖中可以看出，各個(gè)分離通道之間熒光標(biāo)記的核酸與內(nèi)標(biāo)物的峰高峰面積 比例基本一致，整個(gè)分析過程在50秒內(nèi)完成。 實(shí)施例2
對紡錘菌素(netropsin)和核酸的結(jié)合常數(shù)測定。本實(shí)驗(yàn)所用芯片為圖 l所示含四個(gè)電泳單元的玻璃芯片，通道寬50pm,深15nm。緩沖液放入 緩沖液儲液池(4)，并應(yīng)用負(fù)壓將緩沖液充滿分離通道(5)和廢液池(6)， 將紡錘菌素和熒光標(biāo)記的核酸按0.5: 1-2: l濃度比例混合(加入10nM內(nèi) 標(biāo)物熒光素)，將四種不同濃度比例的混合溶液加入到樣品池(2)。在樣品 池(2)和廢液池(6)之間加電壓(場強(qiáng)400V)，時(shí)間6秒，然后切換電 壓至緩沖液儲液池(4)和廢液池(6)之間(場強(qiáng)400V)，樣品池(2)施 加抑制電壓以防止樣品泄漏，在距離進(jìn)樣點(diǎn)3 cm處檢測(結(jié)果見圖3)。 從圖中可以看出，隨著紡錘菌素加入濃度的增加，內(nèi)標(biāo)物峰高峰面積不變, 核酸峰高、峰面積下降。整個(gè)分析過程在50秒內(nèi)完成。
權(quán)利要求
1.一種快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于使用專用的陣列微流控芯片對藥物核酸相互作用進(jìn)行定量評價(jià)；所述的陣列微流控芯片由四組平行的電泳單元(1)組成，每個(gè)電泳單元由樣品池(2)、進(jìn)樣通道(3)、緩沖液儲液池(4)、分離通道(5)、緩沖液廢液池(6)組成；方法過程為將芯片電泳緩沖液放入陣列微流控芯片緩沖液儲液池(4)中，并充滿分離通道(5)和進(jìn)樣通道(3)；將不同藥物-核酸濃度配比的混合樣品分別放入的樣品池(2)；然后對樣品池(2)和緩沖液廢液池(6)之間施加電壓進(jìn)行進(jìn)樣；進(jìn)樣完成后，在緩沖液儲液池(4)和緩沖液廢液池(6)之間施加電壓，進(jìn)行電泳分離和檢測，記錄核酸的峰高峰面積變化，用于計(jì)算藥物核酸的結(jié)合常數(shù)，定量評價(jià)相互作用。
2、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述的每個(gè)電泳單元(1)的組成部分結(jié)構(gòu)相同或成鏡像對稱，分 離通道(5)在檢測區(qū)域集中排列。
3、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述的進(jìn)樣通道(3)和分離通道(5)的深度或?qū)挾鹊姆秶鸀?0 100微米。
4、 按照權(quán)利要求3所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述的進(jìn)樣通道(3)和分離通道(5)的深度范圍為10 20微米， 寬度的范圍為40 60微米。
5、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述陣列微流控芯片中的不同的電泳單元中所使用的緩沖液是同 一種緩沖液。
6、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于藥物-核酸的混合樣品中濃度比例范圍為0.5: 1~2: 1。
7、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述各個(gè)電泳單元使用的電泳場強(qiáng)一致，場強(qiáng)范圍為150 1000 伏/厘米。
8、 按照權(quán)利要求7所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特 征在于所述各個(gè)電泳單元使用的電泳場強(qiáng)一致，場強(qiáng)范圍為300 600伏/厘米。
9、 按照權(quán)利要求l所述快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于所述的檢測器同時(shí)檢測多個(gè)通道，在各分離通道的相同位置同時(shí)采集信號。
全文摘要
一種快速定量評價(jià)藥物核酸相互作用的方法，其特征在于使用專用的陣列微流控芯片對藥物核酸相互作用進(jìn)行定量評價(jià)。相對于現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明具有直接、快速、操作簡單和樣品用量少的特點(diǎn)，對作用于核酸靶藥物的高通量篩選有廣泛的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101372709SQ20071001257
公開日2009年2月25日 申請日期2007年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者戴忠鵬, 林炳承, 錚 沈, 秦建華 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所