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利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法

文檔序號:433390閱讀:2931來源:國知局
專利名稱:利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物能源領(lǐng)域,涉及一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N—乙酰 葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)
21世紀全球最大的挑戰(zhàn)之一就是如何持續(xù)不斷地提供經(jīng)濟發(fā)展和人民生活需要的能源, 能源安全已經(jīng)被各個國家提高到了戰(zhàn)略的高度。由于化石燃料的短缺和污染問題,人們早己 把目光集中在了可再生能源的開發(fā)上,而生物質(zhì)能源的開發(fā)與利用更是受到極大的重視 (Arthur J.Ragauskas et al., 2006)。歐盟委員會計劃在2020年采用可再生燃料代替化石燃料使 用量的20%,他們的中期目標是2010年達到5.75%; 2005年美國能源政策法案要求全美在 2012年之前使用75億加侖的燃料乙醇(約2243萬噸/年)(Gray, K.A. et al.,2006);巴西已 經(jīng)成為世界上第一個在國內(nèi)不供應(yīng)純汽油的國家。2006年,美國總統(tǒng)布什在國情咨文報告中 稱,美國將在2025年之前使用可再生燃料代替75^的進口化石燃料(Herrera, S.,2006)。生物 能源逐漸代替化石燃料已經(jīng)成為未來趨勢,因此開發(fā)更多的可再生生物能源物質(zhì)已成為迫切 需要解決的問題。生物能源物質(zhì)主要有燃料乙醇、生物柴油、生物制氫、沼氣和生物電池,其中燃料乙醇 的研究最為成熟。目前,燃料乙醇巳經(jīng)在巴西、美國以及一些歐洲國家廣泛采用,在未來的 20年,它將成為占統(tǒng)治地位的可再生生物能源。但是,目前用于生產(chǎn)燃料乙醇的原料主要來 自于人和動物賴以生存的糖(巴西)和淀粉(美國)(B. Hahn-Ha gerdal et al.,2006)。這些原 材料還要為動物和人提供食品,我國現(xiàn)已禁止或限制這一產(chǎn)業(yè)的投資。采用纖維素生產(chǎn)燃料 乙醇的方法今年取得很大進展,并逐步走向工業(yè)化。但問題依然存在,據(jù)美國農(nóng)業(yè)部與能源 部估計,每年美國生物量的潛在生產(chǎn)能力是10億噸,如果全部用來生產(chǎn)工業(yè)能源,也只能夠 代替目前使用的30%的化石能源(Kevin A Gray et al., 2006)。而且,釆用纖維素生產(chǎn)乙醇同樣
會占用日益減少的耕地面積。因此, 一方面需要進一步加強纖維乙醇的生產(chǎn)開發(fā),同時還要 尋找更多的可再生能源前體物質(zhì)用于代替化石能源。幾丁質(zhì)是一種天然N—乙酰葡萄糖胺多聚物,是一種潛在的生物能源物質(zhì)。除陸地生物 以外,在海洋生物中有著更為廣泛和大量的分布。通過生物技術(shù)手段,利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)能源 物質(zhì)是完全可能的。首先,自然界中的許多生物體都存在將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖的生 理機制,由6-磷酸果糖可以進一步通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物能源物質(zhì)如乙醇。 一些沙雷菌 (Hildgund Schrempf et al .,2001)和生活在海洋中的弧菌目微生物(Nemat 0. Keyhani et al.,1999)可以直接利用幾丁質(zhì)作為碳源生長,它們體內(nèi)存在一系列代謝幾丁質(zhì)的酶系,能夠?qū)?幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖。大腸桿菌中也存在能夠代謝GluNAc的酶系(Laura I. A lvarez-Anorve, et al.,2005)。生物體中的這一轉(zhuǎn)化過程己經(jīng)清楚,首先幾丁質(zhì)在解聚蛋白CBP 的幫助下解聚(Gustav Vaaje-Kolstad et al., 2005),之后通過四歩酶促反應(yīng)將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷 酸果糖(Meibom,K丄et al., 2004 )。1、 幾丁質(zhì)水解酶(Chitinase, p-N-acetylglucosaminidase)催化chitin—n N-acetyl-D-glucosamine 幾丁質(zhì)水解酶是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷水解酶,包括可以分為幾丁質(zhì)內(nèi)切酶 (endochitinase, EC 3.2.1.14)和幾丁質(zhì)外切酶(p-N-acetylglucosaminidase, EC 3.2.1.52),它們 的主要作用是將幾丁質(zhì)降解為單糖和幾丁二糖(chitobiose) (Parketa1.,1997)。2、 N-乙酰葡萄糖氨激酶(N-acetylglucosamine kinase, EC 2.7.1.59)催化 ATP + N-acetyl-D-glucosamine = ADP+N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate N-乙酰葡萄糖氨激酶(GlcNAc kinase, EC 2.7丄59)屬于N—乙酰己糖激酶家族,能夠?qū)luNAc磷酸化,生成GluNAc-6-P。酶活性中心含有兩個保守的半胱氨酸,還有一個ATP結(jié) 合位點(MarkusBergereta1.,2002)。小鼠N-乙酰葡萄糖氨激酶分子量約為39kD,以二聚體的
形式存在并發(fā)揮作用(Hinderlich, S., et al.,1998)。3、 N-乙酰葡萄'塘氨陽6-磷酸去乙?;?N陽acetylglucosamine-6隱phosphatedeacetylase, EC 3.5丄25)催化N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate+H20=D-glucosamine 6- phosphate十a(chǎn)cetate細菌中的N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙?;?GlcNAc-6Pdeacetylase, EC3.5丄25)分子 量約41kD,以四聚體的形式存在。它的作用是將GluNAc-6P脫乙?;蒅luN-6P Gos6 M. Souzaetal"1997)。4、 6-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase, EC 3.5.99.6)催化 D-glucosamine 6-phosphate + H2O = D-fructose 6-phosphate + NH36-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶(GlcN-6P deaminase, EC 3.5.99.6)屬于谷氨酰氨依賴的氨基轉(zhuǎn) 移酶家族,分子量約31kD,以同聚體的形式存在。催化GluN-6P脫氨基生成6-磷酸果糖(Takeshi Tanaka,etal"2005)。雖然幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的生物代謝途徑普遍存在,但是直接利用現(xiàn)有生物體生產(chǎn) 6-磷酸果糖還不能達到產(chǎn)業(yè)化的要求,因為幾丁質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)繁復(fù),以幾丁 質(zhì)為起始物,可以生成除6-磷酸果糖外至少10余種中間或最終產(chǎn)物 (http:〃www.genome,jp/kegg/pathwav.html),例如chitosan、N-acetyl-D -glucosamine、D-Glucosamine、 N-acetyl-D-Mannosamine、 chitobiose、 D-glucos-amine國6-phosphate等。N-acetyl-D-glucosamine 可以脫乙酰基形成D-Glucosamine,然后被磷酸化為D-glucosamine-6-phosphate; N-acetyl-D陽 glucosamine可以通過變位酶的作用生成N-acetyl-D-Mannosamine,進入甘露糖的代謝網(wǎng)絡(luò)等。隨著生物技術(shù)的進步,通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段,實現(xiàn)幾丁質(zhì)生成6-磷酸果糖的高效率轉(zhuǎn) 化是完全可能的。利用基因工程手段將這些酶進行體外表達具有活性的生物酶,已經(jīng)能夠在 體外條件下將GluNAc幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖(Chen Yang et al.,2006)。表i部分物種的兒r質(zhì)含量
生物種類幾丁質(zhì)含量(%)生物種類幾丁質(zhì)含量(%)甲殼類昆蟲類鰲蟹72.1 (器官外殼重)蟑螂10 (千體重)金蟹35 (干體重)雙翅蟲54.8 (器官外殼重)沙蟲下28 (外殼總千重)蝴蝶64 (器官外殼重)龍蝦69.8 (器官外殼重)蠟蟲33.7 (器官外殼重)軟體動物類真菌類蛤殼6.1 (外殼總干重)黑麥霉42 (細胞壁干重)烏賊41(軟骨總干重)點青素8.5 (細胞壁干重)南極蟲下40 52 (外殼總干重)奇異青霉20.1(細胞壁干重)另夕卜,幾丁質(zhì)(chitin)在地球上的含量豐富,年產(chǎn)超過100億噸(Lepri L et a1.,1977),總量僅次于纖維素;同時它來源豐富(表l),容易獲得,不需要占用耕地,僅全球貝類廢物中 幾丁質(zhì)總含量就有1.2xl()S噸。大量的幾丁質(zhì)由于得不到合理得利用,被作為廢物處理,造成 近海污染。綜上所述,采用幾丁質(zhì)作為可再生能源在能源開發(fā)和生物代謝角度都是可行的,隨著生 物工程領(lǐng)域的飛速發(fā)展,幾丁質(zhì)作為自然界存在的含量僅次于纖維素的可再生多聚物,將其 轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)是具有很大的現(xiàn)實意義的,而更多前體能源物質(zhì)的開發(fā)還需要引起更多 的重視。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N—乙酰葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的思路,首次提出幾丁質(zhì)作為能源物質(zhì)的概念,并提供了利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法。本發(fā)明是利用天然可再生多聚物幾丁質(zhì)為原料生產(chǎn)生物能源物質(zhì)(如燃料乙醇),為人類提供更多的可再生資源用于能量的產(chǎn)生,解決人類面臨的日益嚴重
的能源短缺問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,該方法包括以下歩驟 ①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理;②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法,利用天然或重組的幾丁質(zhì)代謝 酶系,通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法,將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖;③ 以6-磷酸果糖作為碳源,采用生物轉(zhuǎn)化的方法,發(fā)酵生產(chǎn)生物能源物質(zhì)。原料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法、物理方法,或微生物進行預(yù)處理,或利用幾丁質(zhì)結(jié)合 蛋白(CBP)促進幾丁質(zhì)水解酶對幾丁質(zhì)的水解作用,促進其水解增溶。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的過程,可以利用篩選的微生物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化實現(xiàn),或利 用分離純化獲得的幾丁質(zhì)代謝酶系在體外催化實現(xiàn)。微生物包括人工馴化的菌種,或人工改 造的工程菌。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)前體6-磷酸果糖所用的酶系,可以是分離純化提取的天然酶,也可以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達,或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程獨立 或組合進行。利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,還包括幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中副產(chǎn)物蛋白 質(zhì)、碳酸鈣、乙酰基、氨基的生產(chǎn)和利用。本發(fā)明可以將上述步驟的具體過程進行合并或偶聯(lián),最終實現(xiàn)幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物 質(zhì)的目的。下面詳細介紹利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的這一過程。 1、原料的預(yù)處理原料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法進行預(yù)處理,如采用酸或堿除去幾丁質(zhì)中夾雜的蛋白質(zhì) 和碳酸鈣等成分,得到幾丁聚糖;或采用物理方法進行粉碎預(yù)處理,如球研磨或錘研磨、幾 丁質(zhì)固體的蒸汽爆炸或蒸汽膨脹等;還可利用微生物,如乳酸菌和產(chǎn)生檸檬酸的菌株等,對 原料進行預(yù)處理,利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶降解幾丁質(zhì)中含有的蛋白質(zhì),同時產(chǎn)生的酸可以 溶解碳酸鈣。此外,在含有幾丁質(zhì)的溶液中加入一定量的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP)能夠促進
幾丁質(zhì)水解酶對其的水解作用,促使其水解增溶。2、將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖;將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖,這一過程可以通過人工改造的微生物進行體內(nèi)轉(zhuǎn)化或重組 酶的體外催化兩種不同的方法實現(xiàn)。利用人工改造的微生物進行生物轉(zhuǎn)化的方法將幾丁質(zhì)的轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖,其過程包括: 以幾丁質(zhì)作為唯一碳源,加入無機鹽等必要的營養(yǎng)物質(zhì)配制發(fā)酵液,加入合適的微生物進行發(fā)酵,該微生物存在代謝GluNAc的酶系,能夠?qū)luNAc逐步代謝為6-磷酸果糖,使發(fā)酵 液中積累6-磷酸果糖。發(fā)酵產(chǎn)生的6-磷酸果糖可以通過離心出除菌體,收集獲得的上清液即為含有6-磷酸果糖 的溶液,經(jīng)過濃縮處理,可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)化過程。微生物轉(zhuǎn)化所用的菌種可以是經(jīng)過改造的工程菌。改造過程可以是通過誘變篩選或基因 工程手段控制細胞的代謝途徑,阻斷旁路途徑或?qū)氡匾南嚓P(guān)基因,產(chǎn)生專門用于生物轉(zhuǎn) 化的菌種。同樣也可以對細胞體內(nèi)的現(xiàn)有的相關(guān)酶進行改造,從而提高細胞轉(zhuǎn)化底物的能力。 參與轉(zhuǎn)化的微生物可以是大腸菌目的大腸桿菌(&c/2^/c^a co//)或沙雷氏菌(5Wr"Z/a ma/rescms),弧菌目的霍舌L弧菌(附rio c/io/erae)以及鏈霉菌(5^epto呼cey 。/ivaceovi^fo)。利用酶工程方法將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖,是指在體外條件下通過酶催化轉(zhuǎn)化,將幾 丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖。此過程需要四步酶的催化反應(yīng),需要四種酶參與,即幾丁質(zhì)水解 酶、N-乙酰葡萄糖氨激酶、N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙酰化酶、6-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶,可 通過兩種方法實現(xiàn)該過程。 一種方法是將酶的粗提液加入到含有底物的溶液中,在密封的容 器中保溫一段時間進行催化轉(zhuǎn)化。四種酶可以按一定的比例同時加入,也可以每次加一種酶 進行三歩酶催化反應(yīng),因為四種酶的催化反應(yīng)條件不一定完全相同。另一種方法是通過酶的 固定化技術(shù),分別將酶固定在固相載體上,實現(xiàn)底物轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物,并回收和重復(fù)利用催 化所用的酶。 將GluNAc轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖過程所用的酶(幾丁質(zhì)水解酶、氮-乙酰葡萄糖氨激酶、氮 -乙酰葡萄糖氮-6-磷酸去乙酰化酶、6-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶),可以是分離純化提取的天然酶, 也可以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。改造的酶可以 是通過對活性位點或底物結(jié)合位點的相關(guān)氨基酸殘基進行定點突變,篩選得到高活性的酶。 重組酶可以通過蛋白質(zhì)工程手段進行生產(chǎn),將改造好的酶基因轉(zhuǎn)移到表達載體上進行表達, 然后對表達產(chǎn)物進行分離純化,用于生產(chǎn)。表達的載體可以是原核表達載體、桿狀病毒表達 載體、酵母表達載體等所有重組表達載體。采用的方法均是本領(lǐng)域熟悉的基因克隆表達和分 離純化的方法。3、 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)6-磷酸果糖通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的過程可以通過發(fā)酵的方法實現(xiàn),以6-磷 酸果糖作為碳源,按一定比例補充其它營養(yǎng)元素,在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵,生產(chǎn)酒精或其它牛 物能源物質(zhì)。具體過程采用的是本領(lǐng)域熟悉的發(fā)酵方法。此過程采用的菌種可以利用現(xiàn)有的高產(chǎn)酒精的菌種進行發(fā)酵,通過優(yōu)化發(fā)酵條件達到高 的收率。這種菌種包括畢赤酵母(戶/c/7&^p/to)、啤酒酵母CSacx/7araw_y£^ce/"ev&/ae;)。4、 過程偶聯(lián)可以將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程進行偶 聯(lián)。采用合適的細胞在生物體內(nèi)同時進行生物轉(zhuǎn)化,直接將幾丁質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為乙醇或其它生 物能源物質(zhì)。偶聯(lián)過程所采用的菌種可以通過對現(xiàn)有的海洋中存在的能夠代謝幾丁質(zhì)的微生 物進行改造,使之能夠產(chǎn)生乙醇,或在產(chǎn)酒精的微生物中引入代謝幾丁質(zhì)的基因,通過一歩 發(fā)酵就可以實現(xiàn)幾丁質(zhì)的能源化。也可以通過共發(fā)酵的方法,采用一種微生物實現(xiàn)幾丁質(zhì)的 增溶,將幾丁質(zhì)水解為GluNAc,而另一種微生物以GluNAc為唯一碳源生產(chǎn)乙醇或其它生物 能源物質(zhì),兩種微生物同時存在一個發(fā)酵體系中。5、 副產(chǎn)物的應(yīng)用 副產(chǎn)物的應(yīng)用是指在綜合利用幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的許多副產(chǎn)物。幾丁質(zhì)的水解增溶 過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以作為飼料進行加工,碳酸鈣可以用于工業(yè)生產(chǎn);GluNAc轉(zhuǎn)化到6-磷酸果糖的過程中脫去的乙?;梢灾苯舆M入三羧酸循環(huán),為微生物提供能量,或者轉(zhuǎn)化為 乙醇;脫去的氨基可以將其轉(zhuǎn)化為銨鹽,將其變?yōu)橐环N重要的氮源和化工原料。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的作進一步說明。圖h亞洲玉米螟總RNA提取,1: DL 2000 Marker; 2: RNA。圖2:幾丁質(zhì)水解酶基因調(diào)取中5'RACE后PCR鑒定,測序后正確。1: DL2000Marker; 2: PCR產(chǎn)物。圖3:幾丁質(zhì)水解酶基因的PCR擴增。h DL 2000 Marker; 2: PCR產(chǎn)物。圖4:幾丁質(zhì)水解酶連接到pFastBac HT A上之后的酶切鑒定。Ml: DNAMarker DL2000;M2: X-Hind III DNA Marker;1 4:對四個單克隆菌落DNA的酶切鑒定;5:酶切前的質(zhì)粒。圖5:Bacmid質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果。Ml: X國Hind III DNAMarker; M2: DNAMarkerDL2000;1 6:進行鑒定的6個單克隆菌落,發(fā)生轉(zhuǎn)座的bacmid產(chǎn)生約2430的片斷。 圖6:采用SOURCE 30Q對亞洲玉米螟粗酶液進行初步分離。蛋白質(zhì)280nm吸收; -酶活力。圖7:采用羥基磷灰石柱對粗酶液進行再次分離。蛋白質(zhì)280nm吸收;酶活力。 圖8:幾丁質(zhì)水解酶純化后電泳SDS—PAGE圖。1:純化后電泳樣品;M:蛋白質(zhì)Marker。
具體實施方式
實施例1、采用化學(xué)方法對幾丁質(zhì)進行預(yù)處理將原料浸泡到含有0.8 1.2M鹽酸的溶液中1~3小時,處理兩到三次以去除原料中含有 的碳酸鈣及無機鹽。再用40 70g/L的NaOH溶液處理2小時作用,處理三次以出去原料中 含有的蛋白質(zhì)。清洗后即完成了原料的預(yù)處理過程。2、以幾丁質(zhì)水解酶為例說明幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵酶的獲得、生產(chǎn)以及催化轉(zhuǎn)化方法。 2.1亞洲玉米螟幾丁質(zhì)水解酶基因的獲得 根據(jù)同源序列設(shè)計引物 C Fl: 5,-GACATRTTCCAYATGGGMGG-3, C Rl 5,-TCCGMCTGCTCBGACCACAG-3'使用TaKaRaRNAiso Reagent試劑盒從玉米螟中提取總RNA (附圖1),變性后采用 Reverse Transcriptase M-MLV進行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。采用上述引物,使用TakaraLATaq 進行PCR反應(yīng),對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增,對目的條帶進行回收測序。根據(jù)測序正確的序列和保守序列再進一步設(shè)計引物,通過類似的方法以cDNA為模 板進行PCR,進行獲得更多的序列。最后通過5'RACE和3'RACE獲得基因的5'端3'端, 完成基因的獲得(附圖2)。目的基因克隆到pMT18-T載體上。 2.2幾丁質(zhì)水解酶表達載體的構(gòu)建和體外重組表達1) 將水解酶基因克隆到桿狀病毒表達載體PFastBacTMHTA上 根據(jù)獲得的幾丁質(zhì)水解酶基因序列設(shè)計引物pET F1: 5 , -TATTCCGGATTATTCATACC-3' pET Rl: 5 ,-TTCAGGTTCAGGGGGAGGTG-3'以含有目的基因的pMT-18T載體為模板,以上述引物進行PCR擴增(附圖3),對擴 增產(chǎn)物和表達載體pFastBacTMHTA和進行酶切,回收后對相應(yīng)片斷進行連接,轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5ot細胞。過夜培養(yǎng),挑取但菌落進行PCR鑒定。提取陽性菌落,提取質(zhì)粒,進 一步進行酶切鑒定(附圖4),最后進行測序。2) 生產(chǎn)重組Bacmid
將測序正確的含有目的基因的pFastBacTMHT A轉(zhuǎn)化Invitrogen MAX E伍ciency DH10Bac Competent Cells,培養(yǎng)48小時,挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,進行PCR鑒定(附圖5)。鑒定正確的bacmid質(zhì)??捎糜诟腥炯毎M行重組酶的生產(chǎn)。 2.3'天然幾丁質(zhì)水解酶(Chitinase)的分離純化得到的初始材料經(jīng)高速離心以及脫鹽柱凈化后,經(jīng)SOURCE 30Q分離(附圖6)。經(jīng) 分管收集洗脫峰并以對硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺pNP-GlcNAc為生色底物檢測,獲得了一 個活力組分。濃縮并脫鹽后,用羥基磷灰石柱(附圖7), MonoQ進行分離,最后得到了 純酶(附圖8)。2.4采用幾丁質(zhì)酶在體外將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為幾丁單糖以幾丁質(zhì)顆粒為載體,采用戊二醛進行交聯(lián),將幾丁質(zhì)酶固定在幾丁質(zhì)顆粒上,實現(xiàn) 幾丁質(zhì)酶的固定化。每0.1g幾丁質(zhì)與2mL5X的戊二醒交聯(lián),酶與載體的比例為20mg/g。 取0.5g固定化酶與10mLl^的幾丁質(zhì)溶液在6(TC保溫,進行酶催化反應(yīng),將可溶幾丁質(zhì) 轉(zhuǎn)化為幾丁單糖。 2.5幾丁質(zhì)水解酶活力測定方法取5pl酶,加入底物6pl 10mMpNP-P-GlcNAc和49nl5mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8), 30。C反應(yīng)5min,加入60[U 0.5 MNa2C03中止反應(yīng)。405nm下檢測酶活力。底物對硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺《A《p-nitrophenyl 2隱acGtamido-2-deoxy-卩-D隱glucopyranoside (pNP-卩-GldSTAc)3、以畢氏酵母通過連續(xù)發(fā)酵將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)乙醇為例介紹微生物生 物轉(zhuǎn)化方法畢氏酵母菌的預(yù)培養(yǎng)從平板上挑取酵母菌落接種于100mL培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24小時, 對酵母進行活化。采用活化的酵母菌,以6-磷酸果糖為原料進行生物轉(zhuǎn)化獲得乙醇。每1L發(fā)酵培養(yǎng)基加
入lOOmL活化的酵母菌預(yù)培養(yǎng)液,流加糖濃度為200g/L,流速為20mL/h.控制溫度為30°C,pH7.0,連續(xù)發(fā)酵60小時。酵母預(yù)培養(yǎng)基成分酵母膏3.85g/L;蛋白棟3.0g/L; 6-磷酸果糖20g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基成分酵母膏3.85g/L;蛋白棟3.0g/L;流加糖為6-磷酸果糖。
權(quán)利要求
1、利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理;②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法,利用天然或重組的幾丁質(zhì)代謝酶系,通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法,將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖;③以6-磷酸果糖作為碳源,采用生物轉(zhuǎn)化的方法,發(fā)酵生產(chǎn)生物能源物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,所述的原 料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法、物理方法,或微生物進行預(yù)處理,或利用幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP) 促進幾丁質(zhì)水解酶對幾丁質(zhì)的水解作用,促進其水解增溶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的過程,可以利用篩選的微生物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化實現(xiàn),或利用分離純化獲得的幾丁質(zhì)代謝酶系在體外催化實現(xiàn)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,所述的 微生物包括人工馴化的菌種,或人工改造的工程菌,可以是大腸菌目的大腸桿菌(Ewte^^" co/z')或沙雷氏菌(&rraria warcescera),弧菌目的霍亂弧菌(W6n'o c/w/erae)以及鏈霉菌
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,所述的幾 丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)前體6-磷酸果糖所用的酶系,可以是分離純化提取的天然酶,也可 以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達,或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征還在于所述的 幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程獨立或組合進行。
7、 根據(jù)權(quán)利要求要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征在于,還包 括幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中副產(chǎn)物蛋白質(zhì)、碳酸鈣、乙?;?、氨基的生產(chǎn)和利用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N-乙酰葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法,其特征包括以下步驟①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理;②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法,利用天然或重組或人工改造的幾丁質(zhì)代謝酶系,通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法,將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖;③以6-磷酸果糖作為碳源,采用生物轉(zhuǎn)化的方法,發(fā)酵生產(chǎn)酒精等生物能源物質(zhì);轉(zhuǎn)化過程還涉及幾丁質(zhì)代謝過程中的其它副產(chǎn)物,如蛋白質(zhì)、碳酸鈣、乙?;被鹊纳a(chǎn)和利用。利用本發(fā)明提供的方法可為人類提供更多的可再生資源用于能量的生產(chǎn),解決人類面臨的日益嚴重的能源短缺問題。
文檔編號C12R1/425GK101130799SQ20071001241
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者田 劉, 屈明博, 君 楊, 青 楊 申請人:大連理工大學(xué)
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