專利名稱：以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種光子晶體編碼的多元免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組序列得以解碼之后，基因的功能以及基因編碼的蛋白質(zhì)之間 的相互作用成為研究的熱點(diǎn)，人類進(jìn)入了后基因組時(shí)代。后基因組時(shí)代的一個(gè)顯 著特點(diǎn)就是要研究大量的蛋白與核酸之間、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與藥 物之間的相互作用，這些相互作用的研究在采用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法幾乎是不可能 的，因此需要一種高通量的試驗(yàn)平臺(tái)。而高通量的試驗(yàn)平臺(tái)則'要求有高通量的分 子載體，來標(biāo)識(shí)不同的分子發(fā)生的不同相互作用，即所謂的編碼過程。傳統(tǒng)方法 如陣列式生物芯片，是利用分子所固定的不同位置也就是坐標(biāo)作為編碼來區(qū)別不 同的生物分子，這樣的編碼量有限，而且限制其反應(yīng)速度和應(yīng)用。近年來，新型 的編碼載體相繼出現(xiàn)，以光子晶體水凝膠作為載體進(jìn)行編碼成為高通量篩選以及 組合化學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。
相對(duì)于其他形式的載體，水凝膠載體具有顯著的優(yōu)勢(shì)第一，光子晶體水凝 膠具有高度的親水性，可以響應(yīng)外界的刺激，體積發(fā)生顯著的收縮或者膨脹，在
一定的收縮和膨脹范圍內(nèi)不影響已鎖定的膠體晶格結(jié)構(gòu)，只會(huì)改變晶面間距，引 起晶膠陣列衍射峰位置的變化，甚至?xí)鸨∧そY(jié)構(gòu)色的變化，可以逆向判斷環(huán)
境所發(fā)生的變化，進(jìn)而可以檢測(cè)相應(yīng)的外界環(huán)境的變化；第二，可以在水凝膠上 結(jié)合多克隆抗體，進(jìn)行抗原檢測(cè)。當(dāng)抗原結(jié)合到抗體上時(shí)，就會(huì)改變凝膠的體積， 根據(jù)布拉格衍射定理，相應(yīng)的光子晶體薄膜的反射峰發(fā)生了藍(lán)移，甚至能夠引起 光子晶體薄膜結(jié)構(gòu)色薄膜。從而能夠快速準(zhǔn)確的進(jìn)行抗原的檢測(cè)。第三，形狀編 碼又有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以根據(jù)形狀通過肉眼就能簡單的對(duì)檢測(cè)物加以分辨，具 有其他編碼沒有的優(yōu)勢(shì)；第四，以水凝膠為載體可以保持蛋白的活性，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性。
免疫分析主要是利用抗體能夠與相應(yīng)抗原及半抗原發(fā)高特異性結(jié)合這一性 質(zhì)，通過將特定抗體或抗原作為選擇性試劑來對(duì)相應(yīng)待測(cè)抗原或抗體進(jìn)行分析測(cè) 定的方法。它的提出及發(fā)展是20世紀(jì)以來在生物分析化學(xué)領(lǐng)域所取得的最偉大 的成就之一。免疫分析技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和特異性，因而在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中 倍受重視，發(fā)展迅速，成為檢驗(yàn)方法中最為重要的技術(shù)之一。隨著抗體和抗原制 備技術(shù)的成熟及標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和完善，免疫分析技術(shù)作為疾病診斷的主要手段 已被廣泛應(yīng)用于機(jī)體免疫功能、腫瘤標(biāo)志物、內(nèi)分泌功能、傳染性疾病、治療藥 物監(jiān)測(cè)、過敏原檢測(cè)等體外診斷實(shí)驗(yàn)中，其中血凝技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫 分析技術(shù)、熒光免疫分析及免疫膠體金技術(shù)等已被大量地應(yīng)用于日常的檢驗(yàn)工作 中。
最為常見的基于微孔板的酶免疫分析編碼量小，所耗費(fèi)的人力與物力都十分 巨大，且在試驗(yàn)過程中難以充分保證蛋白的活性，難以保持很好的穩(wěn)定性。因此， 增大編碼量，保證蛋白活性，提高檢測(cè)穩(wěn)定性的載體就越來越多的引起人們的興 趣。
多元分析的實(shí)現(xiàn)一般通過兩種方式來實(shí)現(xiàn)。第一種是多探針標(biāo)記法，也就是 利用不同的熒光染料或者同位素等能在相同的分析條件下產(chǎn)生顯著不同檢測(cè)信 號(hào)的標(biāo)記探針來分析。隨著需要測(cè)定的分析物的種類的增加多探針標(biāo)記法對(duì)信號(hào) 檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)雜度的要求增加，而且適合于同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)記物體系也很少，因此其 應(yīng)用受到限制， 一般只用于兩元或者三元的免疫分析。第二種是編碼載體法，即 把抗原或者抗體固定在不同的編碼載體上進(jìn)行免疫分析，常見的有抗體微陣列芯 片和液相芯片。但是這些方法檢測(cè)起來成本很高，不便于臨床推廣。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題針對(duì)現(xiàn)有多元檢測(cè)技術(shù)成本高、編碼量小的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了 一種以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法用于多元免 疫分析具有穩(wěn)定性高，編碼量大，有效保持蛋白活性的優(yōu)點(diǎn)。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的可以通過以下方案實(shí)現(xiàn) 一種以顏色和形狀復(fù)合編 碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括以下步驟第一步，制備不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜將質(zhì)量體積比為 10%的非緊密堆積型二氧化硅膠體晶體用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液稀 釋至質(zhì)量體積在3°/"%范圍內(nèi)的具有不同濃度的一組溶液，分別加入光引發(fā)劑。 排出空氣，灌入模具中，在不同濃度的光子晶體凝膠聚合前體溶液的模具上加蓋 不同形狀的掩模，靜置20 30min，然后經(jīng)紫外光照射聚合40 60min，即得不同 形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜，將所得到的光子晶體水凝膠薄膜從模具上 剝落，洗滌后置于純水中保存；
第二步，制備多元免疫檢測(cè)用復(fù)合編碼光子晶體水凝膠薄膜將一種顏色或 一種形狀作為一種編碼，選取由第一步制得的具有不同顏色或者不同形狀的光子 晶體水凝膠薄膜，在具有同種編碼的水凝膠薄膜表面包被同種特異性抗原或者抗 體制成一種免疫水凝膠薄膜，將分別制備好的免疫水凝膠薄膜用磷酸鹽緩沖液洗 滌，封閉緩沖液之后，將制備的各種形狀的水凝膠薄膜進(jìn)行混合，即得到多元免 疫檢測(cè)用復(fù)合編碼光子晶體水凝膠薄膜；
第三步，檢測(cè)將第二步制備的多元免疫檢測(cè)用復(fù)合編碼光子晶體水凝膠薄 膜與待測(cè)樣品混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后用磷酸鹽緩沖
液洗滌，再加入標(biāo)記二^進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束磷酸鹽緩沖液洗滌，檢測(cè)復(fù)合 編碼光子晶體水凝膠薄膜的標(biāo)記二抗的信號(hào)，即可得出待測(cè)樣品中待測(cè)分子的有 無及多少。所述的待測(cè)樣品為病原微生物抗原或其抗體、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、 自身抗體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、毒品、興奮劑、各種細(xì)胞表面的可溶性標(biāo)記或者各 種可溶性受體分子中的任意一種或幾種。
所述光子晶體水凝膠薄膜的結(jié)構(gòu)是在水凝膠單體溶液中二氧化硅膠體粒子 有序自組裝的蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，或是反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體；蛋白石或者 反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體能反射特定波長的光，其反射光譜具有特征反射峰，波 長范圍涵蓋可見區(qū)，根據(jù)波長的不同可以顯示出不同顏色。將一種顏色或一種形 狀作為一個(gè)編碼，所述的光子晶體水凝膠薄膜的復(fù)合編碼為光子晶體反射光譜中 特征反射峰波長的數(shù)值與其不同形狀復(fù)合而成，所述的光子晶體水凝膠薄膜的形 狀為星形、三角形、圓形任意一種或幾種。這樣可以大大擴(kuò)大編碼量。
光子晶體水凝膠薄膜表面抗原或者抗體利用其表面的功能基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)連 接?？贵w或者抗原的種類用光子晶體水凝膠薄膜的編碼來標(biāo)識(shí)，在同種編碼的水凝膠薄膜上固定同種抗體或者抗原，使抗體或者抗原的種類與編碼形成一一對(duì)應(yīng) 的關(guān)系。標(biāo)記二抗的標(biāo)記物是酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光標(biāo)記、或者量子點(diǎn)標(biāo) 記。將多個(gè)不同編碼的水凝膠薄膜與同一個(gè)待測(cè)樣品混合，可以同時(shí)檢測(cè)樣品中 多個(gè)待分析物。
有益效果本發(fā)明以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法與現(xiàn)有
多元免疫分析方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1) 本發(fā)明就是將光子晶體編碼和水凝膠形狀相結(jié)合，大大增加了編碼量，
如果m種特征反射峰的光子晶體有n種特征反射峰強(qiáng)度，那么就可以得到 n"M種編碼，同時(shí)可以有k種不同形狀的光子晶體水凝膠薄膜，那么編碼量 就可以達(dá)到k(nm，l)種。
(2) 采用不同濃度的光子晶體可以得到不同的反射峰位置編碼，反射峰位置 可以涵蓋可見區(qū)域，而且半峰寬窄，本身編碼量大。加之水凝膠薄膜可以制 成不同的形狀，可以與反射峰進(jìn)行復(fù)合編碼。從而，光子晶體水凝膠薄膜的 編碼量大大提高，可以滿足同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的需要，也可以滿足高通量檢 測(cè)的需要。
(3) 光子晶體水凝膠薄膜具有高度親水性，可以響應(yīng)外界的刺激。
(4) 光子晶體水凝膠薄膜熒光本底低，利于提高熒光的強(qiáng)度和檢測(cè)反應(yīng)的靈 敏度。


圖1不同形狀光子晶體水凝膠薄膜生成方式示意圖。 圖2以雙抗夾心法為例的混合多元免疫測(cè)定水凝膠薄膜進(jìn)行反應(yīng)示意圖。 圖3以雙抗夾心法為例的反應(yīng)結(jié)束后分開多元免疫檢測(cè)水凝膠薄膜檢測(cè)信 號(hào)示意圖。
以上的圖中有光子晶體編碼水凝膠薄膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)1、 二氧化硅粒子2、抗
原3、標(biāo)記二抗4。
具體實(shí)施例方式
一種以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括以下
7步驟
第一步，如圖1所示，制備不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜將質(zhì) 量體積比為10%的非緊密堆積型二氧化硅膠體晶體用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰 胺混合液稀釋至質(zhì)量體積比在3%^6%范圍內(nèi)的具有不同濃度的一組溶液，其中 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液中的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的摩爾比為 29: 1，然后分別加入光引發(fā)劑。排出空氣，灌入模具中，在不同濃度的光子晶 體凝膠聚合前體溶液的模具上加蓋不同形狀的掩模，靜置20 30min，以上所有 的操作都在醫(yī)用凈化工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，然后經(jīng)紫外光照射聚合4(K60min，即得不 同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜，將所得到的光子晶體水凝膠薄膜從模具 上剝落，洗滌后置于4。C的純水中保存；可以使用不同的掩模如三角形，圓形， 正方形，星形等將水凝膠薄膜制成不同的形狀。這樣將光子晶體反射光譜中特征 反射峰波長的數(shù)值與水凝膠薄膜的不同形狀結(jié)合可以大大提高編碼量。
第二步，如圖2所示，制備多元免疫檢測(cè)用復(fù)合編碼光子晶體水凝膠薄膜-將一種顏色或一種形狀作為一種編碼，選取由第一步制得的具有不同顏色或者不 同形狀的光子晶體水凝膠薄膜，在具有同種編碼的水凝膠薄膜表面包被同種特異 性抗原或者抗體制成一種免疫水凝膠薄膜，抗原或者抗體通過化學(xué)鍵共價(jià)連接到 光子晶體水凝膠薄膜上，將分別制備好的免疫水凝膠薄膜用磷酸鹽緩沖液洗滌， 吸去作為載體的水凝膠薄膜表面未結(jié)合的抗原或者抗體并對(duì)空位點(diǎn)進(jìn)行封閉之 后，將制備的各種形狀的水凝膠薄膜進(jìn)行混合，即得到多元免疫檢測(cè)用復(fù)合編碼 光子晶體水凝膠薄膜；
第三步，如圖3所示，檢測(cè)將第二步制備的多元免疫檢測(cè)用復(fù)合編碼光子 晶體水凝膠薄膜與待測(cè)樣品混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后 用磷酸鹽緩沖液洗去未反應(yīng)的物質(zhì)，再加入標(biāo)記二抗4進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束 磷酸鹽緩沖液洗去未反應(yīng)物質(zhì)，此時(shí)得到的水凝膠薄膜的結(jié)構(gòu)就是光子晶體編碼 水凝膠薄膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)1中包裹著二氧化硅粒子2，在光子晶體編碼水凝膠薄膜網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)1上共價(jià)鍵連接有抗原3或者抗體，抗原3或抗體又和標(biāo)記二抗4結(jié)合。 檢測(cè)復(fù)合編碼光子晶體水凝膠薄膜表面的標(biāo)記二抗的信號(hào)，根據(jù)水凝膠薄膜的編 碼將水凝膠薄膜分開檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)。信號(hào)的強(qiáng)弱與樣品中待測(cè)成分的含量成一定 正相關(guān)，這樣就能夠得到待測(cè)樣品中的信息了。待測(cè)樣品可以是體液、組織液、細(xì)胞裂解液、血液、血清中的病原微生物抗 原或其抗體、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、自身抗體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、毒品、興奮 劑、各種細(xì)胞表面的可溶性標(biāo)記或者各種可溶性受體分子。
上述的第一步中的光引發(fā)劑可以為質(zhì)量體積比為1%的偶氮異二丁腈，用量 為引發(fā)劑量。上述二抗的標(biāo)記物可以是酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光標(biāo)記和量子 點(diǎn)標(biāo)記。按照水凝膠薄膜的顏色將水凝膠薄膜分開，對(duì)于酶標(biāo)記物，加入標(biāo)記酶 的底物進(jìn)行酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。對(duì)于熒光標(biāo)記物，熒光 信號(hào)可以通過熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光光譜或者時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀 測(cè)定，由于光子晶體水凝膠薄膜熒光本底低，利于提高熒光的強(qiáng)度和檢測(cè)反應(yīng)的 靈敏度。
在第一步的開始質(zhì)量體積比為10%的非緊密堆積型二氧化硅的質(zhì)量體積比 檢測(cè)方法如下取lOOpl的二氧化硅溶液，將其在烘箱中烘干，稱量其質(zhì)量m， 質(zhì)量體積比濃度-m/100，將其換算成mg/ml即為實(shí)驗(yàn)中所提到的質(zhì)量體積比濃 度。在這個(gè)基礎(chǔ)上再用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合溶液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的濃 度。
第一步中稀釋后的二氧化硅膠體晶體在丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液 中的質(zhì)量體積比可以是3%~6%范圍內(nèi)的任意數(shù)值，比如3%、 4.2%或者6%; 光子晶體凝膠聚合前體溶液的模具加蓋掩模后靜置20 30min，可以是20min、 25min或者30min，為了非緊密堆積型交替晶體的形成。然后經(jīng)過紫外光照射可 以是用高壓汞燈在4"C下照射反應(yīng)40 60min，如40min、 51min或者60min。
實(shí)施例l
一種以顏色及形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)步驟為
第一步，制備各種不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜將質(zhì)量體積比 為10%的非緊密堆積型二氧化硅膠體晶體用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液 稀釋至質(zhì)量體積比為3%、 4%的具有不同濃度的一組溶液，分別加入光引發(fā)劑， 排出空氣，灌入模具中，在不同濃度的光子晶體凝膠聚合前體溶液的模具上依次
加蓋三角形、圓形、正方形的掩模，靜置20min，然后經(jīng)紫外光照射聚合60min，即得不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜，將所得到的光子晶體水凝膠薄膜 從模具上剝落，洗滌后置于純水中保存；
第二步，制備多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的光子晶體水凝膠薄膜在質(zhì)量 體積比為3%的圓形水凝膠薄膜的表面包被一種毒素，質(zhì)量百分比為3%的三角 形水凝膠薄膜的表面再包被一種激素，在質(zhì)量百分比為3%的正方形水凝膠薄膜 的表面包被一種腫瘤標(biāo)志物，在質(zhì)量百分比為4%的圓形水凝膠薄膜的表面包被
一種神經(jīng)遞質(zhì)，在質(zhì)量百分比為4%的三角形水凝膠薄膜的表面包被一種興奮劑， 在質(zhì)量百分比為4%的正方形水凝膠薄膜的表面包被一神細(xì)胞因子，將分別制備 好的免疫水凝膠薄膜用磷酸鹽緩沖液洗滌，封閉緩沖液之后，將制備的各種不同 形狀和不同顏色的水凝膠薄膜進(jìn)行混合，即得到多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的 光子晶體水凝膠薄膜；
第三步，檢測(cè)將第二步得到的多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的光子晶體水
凝膠薄膜與FITC，量子點(diǎn)或化學(xué)方法物質(zhì)標(biāo)記的待測(cè)樣品(比如說為細(xì)胞裂解
液、血液、體液等)混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢，用洗滌 緩沖液洗滌，分別測(cè)定每個(gè)光子晶體水凝膠薄膜的熒光強(qiáng)度或發(fā)光物質(zhì)強(qiáng)度，結(jié) 合形狀以確定其編碼，并用光纖光譜儀測(cè)定水凝膠薄膜的反射光譜即可分析得出 待測(cè)血清中含有的待測(cè)物質(zhì)表面抗原抗體的含量。
實(shí)施例2
使用光子晶體水凝膠薄膜進(jìn)行血液中艾滋病病毒(HIV)和乙型肝炎病毒 (HBV)的檢測(cè)
(1)在相同顏色的三角形和圓形的光子晶體水凝膠薄膜上分別包被艾滋病 病毒合成肽抗原和乙型肝炎表面抗原，在與前兩種水凝膠薄膜具有不同顏色的三 角形的光子晶體水凝膠薄膜上包被牛血清白蛋白做為對(duì)照。三種包被過的編碼水 凝膠薄膜分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入質(zhì)量體積比為1%的牛血清 白蛋白(BSA)封閉。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將三種包被過的編碼 水凝膠薄膜混合，得到不同特異性的多元免疫水凝膠薄膜。
(2)將混合后的三種編碼水凝膠薄膜，加入到100ul待測(cè)血清中，37。C孵育30分鐘，吸去反應(yīng)液，PBS洗滌兩次后加入熒光FITC標(biāo)記的羊抗人IgG， 37°C 孵育30分鐘，PBS洗滌兩次。
(3)在熒光顯微鏡下觀察水凝膠薄膜表面的熒光強(qiáng)度，并用光纖光譜儀測(cè)定 水凝膠薄膜的反射光譜即可分析得出待測(cè)血清中含有的艾滋病抗體和乙型肝炎 表面抗原抗體的含量。
實(shí)施例3
使用多元免疫水凝膠薄膜進(jìn)行TORCH (TORCH是指可導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感 染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的病原體，它是一組病原微生物的英文名稱縮 寫，其中T ( Toxopasma)是弓形蟲，R(RubeUa.Virus)是風(fēng)疹病毒， C(Cytomegalo.Virus)是巨細(xì)胞，H(Herpes.Virus)即是單純皰疹I(lǐng)/II型。)診斷
(1) 分別在5種不同顏色的三角形或正方形的光子晶體水凝膠薄膜上包 T.gondii， Rubella virus, CMV， HSV Type II抗原和對(duì)照牛血清白蛋白，用磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入質(zhì)量體枳比為1%的牛血清白蛋白(BSA)封閉， 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將5種包被過的編碼水凝膠薄膜混合得到不 同特異性的多元免疫水凝膠薄膜。
(2) 將混合后的5種編碼水凝膠薄膜，加入到100ul待測(cè)血清中，37。C孵育 30分鐘，吸去反應(yīng)液，PBS洗滌兩次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM， 37'C孵育30分鐘，PBS洗滌兩次后把五種編碼水凝膠薄膜分別放入微孔板的五 個(gè)微孔中，加入辣根過氧化物酶顯色底物TMB溶液，37'C催化反應(yīng)20分鐘， 加入2M'的硫酸終止反應(yīng)。用光纖光譜儀測(cè)定水凝膠薄膜的反射光譜即可得到待 測(cè)血清中5種病原體的含量了。
實(shí)施例4
使用光子晶體水凝膠薄膜進(jìn)行四種腫瘤標(biāo)記物(AFP， CEA， CA125， CA199) 的檢測(cè)
1.分別在不同顏色的三角形、圓形、正方形、星形和正五邊形的光子晶體水 凝膠薄膜上包AFP， CEA， CA125, CA199抗原和對(duì)照牛血清白蛋白，用磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入質(zhì)量體積比為1%的牛血清白蛋白(BSA)封閉，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將5種包被過的編碼水凝膠薄膜混合得到不 同特異性的多元免疫水凝膠薄膜。
2. 將混合后的五種編碼水凝膠薄膜，加入到100ul待測(cè)血清中，37t:孵育30 分鐘，吸去反應(yīng)液，PBS洗滌兩次后加入熒光FITC標(biāo)記的羊抗人標(biāo)記物抗體， 37'C孵育30分鐘，PBS洗滌兩次。
3. 在熒光顯微鏡下觀察水凝膠薄膜表面的熒光強(qiáng)度，并用光纖光譜儀測(cè)定水 凝膠薄膜的反射光譜即可分析得出待測(cè)血清中含有的表面抗原抗體的含量。
實(shí)施例5
使用光子晶體水凝膠薄膜進(jìn)行冠心病的檢測(cè)
1. 分別在紅色三角形、藍(lán)色圓形、綠色正方形的光子晶體水凝膠薄膜上包
C，reactive protein (CRP) and interleukin-6 (IL，6)抗原和對(duì)照牛血清白蛋白，用磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入質(zhì)量體積比為1%的牛血清白蛋白(BSA)封閉， 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將3種包被過的編碼水凝膠薄膜混合得到不 同特異性的多元免疫水凝膠薄膜。
2. 將混合后的3種編碼水凝膠薄膜，加入到100ul待測(cè)血清中，37。C孵育30 分鐘，吸去反應(yīng)液，PBS洗滌兩次后加入量子點(diǎn)標(biāo)記的羊抗人標(biāo)記物抗體，37°C 孵育30分鐘，PBS洗滌兩次。
3. 在熒光顯微鏡下觀察水凝膠薄膜表面的熒光強(qiáng)度，并用光纖光譜儀測(cè)定水 凝膠薄膜的反射光譜即可分析得出待測(cè)血清中含有的表面抗原抗體的含量。
權(quán)利要求
1.一種以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)方法包括以下步驟第一步，制備各種不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜將質(zhì)量體積比為10％的非緊密堆積型二氧化硅膠體晶體用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液稀釋至質(zhì)量體積比在3％～6％范圍內(nèi)的具有不同濃度的一組溶液，分別加入光引發(fā)劑，排出空氣，灌入模具中，在不同濃度的光子晶體凝膠聚合前體溶液的模具上加蓋不同形狀的掩模，靜置20～30min，然后經(jīng)紫外光照射聚合40～60min，即得不同形狀不同顏色的光子晶體水凝膠薄膜，將所得到的光子晶體水凝膠薄膜從模具上剝落，洗滌后置于純水中保存；第二步，制備多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的光子晶體水凝膠薄膜將一種顏色或一種形狀作為一種編碼，選取由第一步制得的具有不同顏色或者不同形狀的光子晶體水凝膠薄膜，在具有同種編碼的水凝膠薄膜表面包被同種特異性抗原或者抗體制成一種免疫水凝膠薄膜，將分別制備好的免疫水凝膠薄膜用磷酸鹽緩沖液洗滌，封閉緩沖液之后，將制備的各種不同形狀不同顏色的水凝膠薄膜進(jìn)行混合，即得到多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的光子晶體水凝膠薄膜；第三步，檢測(cè)將第二步制備的多元免疫檢測(cè)用具有復(fù)合編碼的光子晶體水凝膠薄膜與待測(cè)樣品混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后用磷酸鹽緩沖液洗滌，再加入標(biāo)記二抗進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束磷酸鹽緩沖液洗滌，檢測(cè)具有復(fù)合編碼的光子晶體水凝膠薄膜的標(biāo)記二抗的信號(hào)即可得出待測(cè)樣品中待測(cè)分子的有無及多少。
2. 如權(quán)利要求1所述的以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法， 其特征在于所述的光子晶體水凝膠薄膜的形狀為星形、三角形、圓形、正方形、 正五邊形中任意一種或幾種。
3. 如權(quán)利要求1所述的以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法， 其特征在于第三步中所述的標(biāo)記二抗的標(biāo)記物為酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光標(biāo) 記或者量子點(diǎn)標(biāo)記中的任意一種或幾種。
4. 如權(quán)利要求1所述的以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，其特征在于第三步中所述的待測(cè)樣品為病原微生物抗原或其抗體、細(xì)胞因子、腫 瘤標(biāo)志物、自身抗體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、毒品、興奮劑、各種細(xì)胞表面的可溶性 標(biāo)記或者各種可溶性受體分子中的任意一種或幾種。
5.如權(quán)利要求1所述的以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法， 其特征在于第一步中的光引發(fā)劑為偶氮異二丁腈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以顏色和形狀復(fù)合編碼的水凝膠多元免疫檢測(cè)方法，該方法中該方法采用具有編碼的光子晶體水凝膠薄膜，使抗體或者抗原與光子晶體水凝膠薄膜結(jié)合，抗體或者抗原的種類用光子晶體水凝膠薄膜的編碼來標(biāo)識(shí)，通過多種利用光子晶體水凝膠薄膜標(biāo)識(shí)的抗體或者抗原，同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)待測(cè)樣品中相應(yīng)的抗原或者抗體，水凝膠薄膜利用光子晶體特異的光反射峰和其不同形狀來編碼，不同編碼的水凝膠薄膜表面分別固定不同的抗原或者抗體，將多個(gè)不同編碼的水凝膠薄膜與同一個(gè)待測(cè)樣品混合，可以同時(shí)檢測(cè)樣品中多個(gè)待分析物。這種基于光子晶體水凝膠薄膜的多元免疫分析方法具有靈敏度高，檢測(cè)通量大，載體解碼簡單，檢測(cè)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101315369SQ200810124478
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者靖 扈, 娟 李, 趙文舉, 趙祥偉, 趙遠(yuǎn)錦, 顧忠澤 申請(qǐng)人:東南大學(xué)