專利名稱：：含有對(duì)白細(xì)胞介素－6的產(chǎn)生具有刺激活性的化合物的化妝組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有能夠在體內(nèi)刺激人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(IL-6)的活性化合物的化妝組合物。在由細(xì)胞產(chǎn)生的各種廣譜細(xì)胞因子中，特定的刺激合成IL-6對(duì)于在化妝學(xué)中的應(yīng)用具有特殊的意義。除了其對(duì)細(xì)胞和體液免疫的活化作用以外，IL-6積極地參與到皮膚再生的機(jī)制中。在體外，IL-6刺激膠原的合成以及角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生。在體內(nèi)，在皮膚中過(guò)表達(dá)IL-6的轉(zhuǎn)基因小白鼠皮膚中，觀察到角質(zhì)層增厚。出現(xiàn)皮膚表層的這種增加而沒(méi)有前炎癥表現(xiàn)，并且被認(rèn)為反映了皮膚在防護(hù)局部損害方面的改善。由文獻(xiàn)得到的這組數(shù)據(jù)表明，IL-6促進(jìn)修復(fù)在表皮出現(xiàn)的損傷和延緩皮膚老化。可以參考K.Yoshisaki等細(xì)胞因子，1990,2,381～387；R.M.Grossman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6367～6371；Kirbauer等免疫學(xué)雜志，1989,142,1922～1928；K.Turken等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,5068～5072；J.Taylor-Papadimetriou等細(xì)胞分化，1982,11,169～180；L.Aarden等淋巴因子，1985,10,175～182。眾所周知，在皮膚老化過(guò)程中，一方面，在表皮中角質(zhì)層增厚，但表皮生成減少，而且在基底膜附近的細(xì)胞內(nèi)聚力改變。因此，重要的是要給皮膚提供一種活性劑，以便有助于抗皮膚老化，其中該活性劑能夠刺激角質(zhì)細(xì)胞的增生，以造成表皮增厚。另一方面，在真皮中，負(fù)責(zé)構(gòu)筑皮膚結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞具有顯著降低的活性，其結(jié)果減少膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖的合成。與此同時(shí)，曝露在光線下的結(jié)果導(dǎo)致現(xiàn)有真皮纖維的加速降解(光化老化)。所有這些效果導(dǎo)致真皮結(jié)構(gòu)破壞，這樣使皮膚失去其彈性、密實(shí)性和緊張性等機(jī)械性能，促使皺紋出現(xiàn)。因此，為了克服老化作用，重要的是給予皮膚一種活性劑，它將刺激成纖維細(xì)胞并有助于重新構(gòu)筑其環(huán)境。為了使其有用，此效果不應(yīng)同時(shí)伴隨著纖維降解的酶活性，特別是膠原酶活性的增大。也不應(yīng)該改變皮膚的天然功能?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，能夠在體內(nèi)刺激由人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的組分或提取物構(gòu)成可以用于制備化妝組合物的“活性劑”，更具體地說(shuō)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以將含有能夠在體內(nèi)刺激人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的化合物的化妝組合物用于重建皮膚組織，而不會(huì)干擾皮膚的天然功能。對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6具有刺激活性的化合物在后面也被稱作“活性劑”，它們顯示出能夠誘導(dǎo)出尤其是對(duì)刺激角質(zhì)細(xì)胞增生的作用(在文獻(xiàn)中敘述的IL-6對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的自分泌作用)。另外，對(duì)人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6具有刺激活性的化合物顯示出能夠通過(guò)其對(duì)成纖維細(xì)胞的作用，誘發(fā)此細(xì)胞真皮環(huán)境緊張性的增加。這些化合物甚至誘導(dǎo)膠原纖維數(shù)量的輕微增加，但不增加膠原酶的活性。所以，本發(fā)明的第一個(gè)目的涉及一種化妝組合物，它含有能夠在活體內(nèi)刺激人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的化合物，并混合有化妝賦形劑。在此化妝組合物中所含有的對(duì)IL-6產(chǎn)生具有刺激活性的化合物，或活性劑可以是非肽化合物、肽、細(xì)胞提取物或植物來(lái)源的組織，或者是微生物比如細(xì)菌或蕈類(lèi)，更具體是酵母發(fā)酵獲得的產(chǎn)物。下面將敘述SEBR2002菌株特性，以及對(duì)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生白介素-6具有刺激活性的提取物的制備方法。菌株發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明這個(gè)特定的方面，產(chǎn)生對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6具有刺激活性的提取物的生物是一個(gè)酵母菌株，它分離自在Loiret(法國(guó))的石油鉆孔地點(diǎn)提取的油田水樣，賦予其內(nèi)部序號(hào)SEBR2002。此微生物樣品于1997年2月11日保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M.，登記號(hào)是Ⅰ1844。使用由BioMérieux銷(xiāo)售的API50CH平臺(tái)(對(duì)糖特異性的)，以及通過(guò)YT生物學(xué)測(cè)試(對(duì)美國(guó)Biolog公司銷(xiāo)售的酵母特異性的)測(cè)定此微生物的生化特性。鑒定出此微生物屬于擔(dān)子菌綱紅酵母屬(Basidiomycetes,Rhodotorula)。它為多形、嗜常溫酵母。在28℃下的YPG(瓊脂酵母胨葡萄糖)培養(yǎng)基中發(fā)育良好，菌落的顏色是帶橙色的桃紅色。此微生物顯示使其可能與種相關(guān)的特性。以序號(hào)Ⅰ1844保藏于Pasteur研究所C.N.C.M.的紅酵母屬菌株及其生產(chǎn)突變體也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)目的。按照常用的方法進(jìn)行此新菌株的分離，這包括將少量水樣稀釋到不同的濃度，將少量體積的稀釋液鋪至裝有瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的平皿上。在28℃下培養(yǎng)幾天以后，這使得這種微生物能夠繁殖，分別取樣各個(gè)菌落，并傳代培養(yǎng)到營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，如以獲得更大量的培養(yǎng)物。在瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)和多次連續(xù)傳代培養(yǎng)以后，這使得有可能得到大量而純的感興趣菌株的培養(yǎng)物，將貯存菌株保存為第0批，然后制備第一和第二種子批。為此，由在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的平皿培養(yǎng)物并使用恢復(fù)培養(yǎng)基制備酵母的懸浮液，此培養(yǎng)基含有低溫保護(hù)劑，其能夠在通過(guò)冷凍進(jìn)行保存時(shí)保證微生物良好的成活力。將得到的酵母懸浮液分配至保存于-80℃的冷凍試管中這些試管組成第0批。按照同樣的操作程序，但是是由第0批試管開(kāi)始，制備第一級(jí)種子批。然后，仍按照同樣的操作程序，由第一級(jí)種子批的冷凍試管制備第二級(jí)種子批。制備出0、1和2批保證了對(duì)菌株和由此的所需活性的長(zhǎng)期獲得。方法具有刺激人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的提取物的制備方法包括在培養(yǎng)基中和在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)此新菌株Ⅰ1844，或者其生產(chǎn)突變體，然后提取活性組分?；钚越M分可在生物質(zhì)中或在上清液中。發(fā)酵可以用各種需氧培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株Ⅰ1844的培養(yǎng)。為此目的，使用在發(fā)酵工業(yè)常用的各種類(lèi)型的設(shè)備。下面的方法尤其可用于進(jìn)行此操作。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)由第二批種子批，平皿接種，在培養(yǎng)2～3天后產(chǎn)生酵母懸浮液，其被用其來(lái)為裝有適當(dāng)培養(yǎng)基并帶攪拌的錐形瓶接種。在帶攪拌的錐形瓶中的培養(yǎng)可以持續(xù)1～3天。通過(guò)用有機(jī)溶劑進(jìn)行過(guò)濾或離心提取對(duì)得到的生物質(zhì)進(jìn)行提取來(lái)觀察活性的產(chǎn)生。從在錐形瓶中的第一步培養(yǎng)步驟起，進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的培養(yǎng)步驟可能是有利的第一步用于增殖細(xì)胞和繁殖生物質(zhì)，第二步用于生產(chǎn)。在后一種情況下，對(duì)于第一步，1～2天的時(shí)間足夠了。在培養(yǎng)生物質(zhì)提取物中所含的刺激人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性用稱為ISIL-6(IS)的刺激指數(shù)或因子來(lái)表示，其計(jì)算方法是用提取物誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6的量與測(cè)量的基礎(chǔ)水平(未誘導(dǎo))的比值即當(dāng)在角質(zhì)細(xì)胞SVK14中相對(duì)于干提取物最終濃度為1‰所測(cè)定的IS為值1.2～6，優(yōu)選為1.5～4.5時(shí)，則生物質(zhì)提取物被看作是有活性的。1L培養(yǎng)物可能得到大約10～15mL刺激指數(shù)為1.5～4.5的提取物，用于稀釋到1/100。通過(guò)提取在瓶中的培養(yǎng)物的生物質(zhì)可以得到所需活性，但為了得到更大量所需活性，很明顯最好先在發(fā)酵器中進(jìn)行培養(yǎng)，然后從發(fā)酵生物質(zhì)中進(jìn)行提取。在發(fā)酵器中培養(yǎng)用在攪拌的錐形瓶中培養(yǎng)1～2天的培養(yǎng)物給發(fā)酵器接種，優(yōu)選培養(yǎng)物仍處于指數(shù)期。在發(fā)酵器中，根據(jù)使用的培養(yǎng)條件，在培養(yǎng)開(kāi)始數(shù)小時(shí)就可以觀察到活性，但優(yōu)選等到達(dá)到穩(wěn)定增長(zhǎng)期然后再進(jìn)行提取。在發(fā)酵器培養(yǎng)Ⅰ1844使得能更好地控制將在下面說(shuō)明的培養(yǎng)條件，如pH值和通風(fēng)情況。根據(jù)所應(yīng)用的培養(yǎng)條件不同，在發(fā)酵器中得到的刺激角質(zhì)細(xì)胞活性可以不同。1L培養(yǎng)物在提取生物質(zhì)之后可以得到大約50mL具有IS值為1.5～4.5的提取物，用于稀釋100倍(1/100)。培養(yǎng)條件在發(fā)酵方法中使用的培養(yǎng)基應(yīng)該含有至少一種可同化的碳源、一種可同化的氮源和無(wú)機(jī)元素。作為可同化的碳源，可以使用比如碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、糊精、甘油、氨基酸和蛋白質(zhì)。作為可同化的碳源，還可以使用乙酸、環(huán)庚酸、檸檬酸、丙酸、琥珀酸和2-酮戊二酸或動(dòng)物油或植物油。最好的可同化氮源在蛋白質(zhì)、胨和氨基酸中找到。這些氮源包括比如，酪蛋白、乳清蛋白、谷蛋白及其水解物、魚(yú)粉、酵母提取物或胨。在培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)添加這兩種主要物質(zhì)中的一種和/或另一種，可以增加生物質(zhì)的生產(chǎn)。為保證微生物生長(zhǎng)，以及使微生物細(xì)胞的碳源和氮源同化最優(yōu)化而在培養(yǎng)基中添加的無(wú)機(jī)元素中，可以舉出鉀、鈉、鐵、鎂、鈣或錳的鹽，以及磷化合物，如磷酸鹽和痕量元素。在10～60小時(shí)的時(shí)間內(nèi)攪拌和向培養(yǎng)物通風(fēng)，這樣可得到優(yōu)化的結(jié)果。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選保持微酸性值，最佳培養(yǎng)溫度為23～38℃，優(yōu)選的范圍是25～33℃。各種培養(yǎng)條件，比如培養(yǎng)基的組成和pH值、培養(yǎng)溫度、攪拌速度以及發(fā)酵的通風(fēng)情況等都可以在很寬的范圍內(nèi)變化，并被選擇以獲得最好的可能結(jié)果。提取得到具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的活性提取物需要許多提取步驟。第一步包括將生物質(zhì)與發(fā)酵汁的其余部分分開(kāi)；為此可以使用離心、切向微過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)滾筒過(guò)濾或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員常用分離生物質(zhì)和發(fā)酵汁的方法。然后將生物質(zhì)和可提取疏水性分子的溶劑混合物接觸幾個(gè)小時(shí)。接觸時(shí)間優(yōu)選是過(guò)夜，即大約15小時(shí)。然后通過(guò)正面過(guò)濾分離生物質(zhì)和加入的有機(jī)相，除去生物質(zhì)。然后在環(huán)境溫度～50℃的溫度下真空蒸發(fā)有機(jī)相，直至得到干提取物。制備活性提取物可以將如此得到的干提取物溶解于在化妝品學(xué)中經(jīng)常使用的各種溶劑中。選擇的溶解濃度使得提取物要完全溶解，并且要與最終的使用相容。具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性的提取物，以根據(jù)活性是干提取物的5-10％的比例，將其加入到乙醇/水混合物(50/50,v/v)中，它組成了本發(fā)明優(yōu)選的溶劑。如果希望得到粉末，而不是溶液，可以簡(jiǎn)單地將干提取物冷凍干燥。對(duì)所得到的每種提取物的等份試樣中進(jìn)行的刺激角質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)IL-6的活性的分析使得有可能可以估量其活性，并驗(yàn)證本方法的可重復(fù)性。為了除去所有痕跡量的殘留生物質(zhì)并保證其微生物穩(wěn)定性，在排阻閾為0.2μm的膜上過(guò)濾提取液，并用無(wú)菌操作裝在滅菌瓶中。此溶液的無(wú)菌制備能夠避免加入防腐劑。進(jìn)行了不同的生化實(shí)驗(yàn)，有可能證實(shí)了由此新微生物Ⅰ1844得到的提取物具有極有價(jià)值的刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性。在不同的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了其很強(qiáng)的活性，這表明可以修復(fù)對(duì)表皮引起的損傷，并延緩皮膚的老化。Ⅰ1844提取物在體內(nèi)對(duì)人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞合成IL-6的刺激作用的鑒定如下面進(jìn)行。Ⅰ1844提取物和使用的產(chǎn)物在使用的類(lèi)似條件下制備來(lái)自不同發(fā)酵培養(yǎng)物的不同Ⅰ1844提取物試樣。樣品在4℃下保存在乙醇/水(50/50,v/v)混合物中，濃度是0.1g/g干提取物，然后在使用時(shí)稀釋到所希望的濃度。誘導(dǎo)IL-6合成的參考產(chǎn)物是脂多糖LPS(E.Coli055B5)Sigma，保存在-20℃，濃度為10mg/mLPBS。LPS的抑制劑多粘菌素B由Sigma公司提供。產(chǎn)物的稀釋在角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋產(chǎn)物(參見(jiàn)下文)。除非另有說(shuō)明，將如上面所述的方法制備的Ⅰ1844提取物在最終濃度相對(duì)于干提取物為1‰時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在10μg/mL的濃度下測(cè)試LPS。評(píng)估模型細(xì)胞使用的人角質(zhì)細(xì)胞系是在含有4.5g/L葡萄糖、100mmol丙酮酸鈉、50U/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素和10％的胎牛血清(SAV)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SVK14系(J.Taylor-Papadimetriou等，1982,11,169～180)。作為比較，在與上面的敘述相同但還含有10mg/mL的EGF和50μg牛垂體提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Ficoll梯度上提純并來(lái)自健康志愿者的正常人淋巴細(xì)胞，以及來(lái)自A431系(ATCCCRL1555)的角質(zhì)細(xì)胞和來(lái)自乳房成形手術(shù)的正常人角質(zhì)細(xì)胞(Biopredic,Rennes)。用產(chǎn)物培養(yǎng)為了誘導(dǎo)IL-6，以最終體積200μL將細(xì)胞接種三份，在96孔培養(yǎng)微平板上的密度為5×104細(xì)胞/孔。在95％的空氣和5％的二氧化碳的氣氛下，在37℃培養(yǎng)24小時(shí)以后，去除培養(yǎng)基并用相同體積含有如上所述濃度的產(chǎn)物的含1％FCS的培養(yǎng)基更換。再培養(yǎng)18～24hr之后，除去每組三份的培養(yǎng)物的上清液，收集，在-20℃下冷凍，直至測(cè)定其細(xì)胞因子含量。細(xì)胞因子的檢測(cè)借助于ELISA分析試劑盒(英國(guó)，Abington的R&amp;D公司)定量IL-6、IL-1β、TNFα和IL-8。按照制造者的說(shuō)明書(shū)對(duì)每種上清液進(jìn)行兩次測(cè)定。這些檢測(cè)的檢出限是3pg/mL。除了通過(guò)ELISA技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的免疫分析以外，通過(guò)對(duì)鼠雜交瘤細(xì)胞B9的生物分析也檢測(cè)了活性形式的IL-6(見(jiàn)L.Aarden等L淋巴因子，1985,10,175～182)。結(jié)果的表示結(jié)果表示為分泌的細(xì)胞因子的量的絕對(duì)值(對(duì)于ELISA分析為pg/mL蛋白質(zhì)，或者對(duì)于IL-6的B9的生物分析為U/mL一個(gè)單位被確定為誘導(dǎo)50％的B9細(xì)胞的最大增殖效果的細(xì)胞因子的量)，或者表示為如前面所定義的刺激指數(shù)IS，其被計(jì)算是誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生與基礎(chǔ)產(chǎn)生的比值結(jié)果在下面將把具有刺激產(chǎn)生IL-6活性的提取物簡(jiǎn)單稱為Ⅰ1844提取物。指出了每次實(shí)驗(yàn)使用的提取物的序號(hào)及其濃度。Ⅰ1844提取物對(duì)刺激角質(zhì)化細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的影響Ⅰ1844提取物以濃度依賴的方式刺激角質(zhì)化細(xì)胞SVK14合成IL-6?？紤]將產(chǎn)生的基礎(chǔ)IL-6的平均量+3SD(11.8+[3×0.8]=13.6pg/mL)為正極限，在0.12％區(qū)域(SI1.23)和以上的濃度時(shí)，Ⅰ1844提取物顯著刺激IL-6的合成，EC50等于0.25％，在濃度等于2％時(shí)得到最大的效果，對(duì)此IL-6合成的刺激因子為2.3。研究擴(kuò)展到其它人角質(zhì)細(xì)胞系(細(xì)胞系A(chǔ)431)，以及正常人角質(zhì)細(xì)胞。不象對(duì)SVK14所觀察的一樣，無(wú)論是對(duì)另外的角質(zhì)細(xì)胞系(A431)，還是對(duì)正常角質(zhì)細(xì)胞的初次培養(yǎng)物，Ⅰ1844提取物都能夠以大于2的因子刺激產(chǎn)生IL-6。因此，Ⅰ1844提取物的作用不被限制在這些譜系，也適用于正常細(xì)胞。Ⅰ1844提取物作用的特異性通過(guò)下面證實(shí)了在不同水平Ⅰ1844提取物作用的特異性-作用不是由于細(xì)菌LPS的污染，其刺激產(chǎn)生IL-6的能力是已知的，也能夠產(chǎn)生IL-6的淋巴源的細(xì)胞，對(duì)Ⅰ1844提取物是不敏感的。-在能夠由角質(zhì)化細(xì)胞合成的細(xì)胞因子當(dāng)中，僅IL-6的產(chǎn)生是受Ⅰ1844提取物的影響。當(dāng)LPS所誘導(dǎo)的刺激被多粘菌素合理地抑制時(shí)，LPS抑制劑多粘菌素的存在不改變Ⅰ1844提取物對(duì)角質(zhì)細(xì)胞SVK14產(chǎn)生IL-6的誘導(dǎo)效果。這個(gè)結(jié)果表明，觀察到的Ⅰ1844提取物的效果，并不因?yàn)榧?xì)菌內(nèi)毒素的污染而導(dǎo)致的。另外，對(duì)B9進(jìn)行的評(píng)估表明，Ⅰ1844提取物刺激產(chǎn)生的IL-6是有生物活性的。對(duì)不同的細(xì)胞靶進(jìn)行的對(duì)比研究表明，與角質(zhì)化細(xì)胞相反，血淋巴細(xì)胞(PBMNC)對(duì)Ⅰ1844提取物刺激產(chǎn)生IL-6的活性作用不敏感。相反，能夠刺激兩類(lèi)細(xì)胞的LPS在兩種情況下都是有效的。所以此項(xiàng)研究表明，Ⅰ1844提取物刺激角質(zhì)細(xì)胞而對(duì)淋巴源細(xì)胞沒(méi)有影響。最后，Ⅰ1844提取物刺激IL-6的合成而同時(shí)具有增加水平的IL-1、IL-8和TNF-α。在細(xì)胞素當(dāng)中，IL-8具有特殊的性質(zhì)，因?yàn)榫推溱吇詠?lái)說(shuō)它能夠在局部水平上吸收多核中性白細(xì)胞。因此在炎癥當(dāng)中它起著重要的作用。Ⅰ1844提取物刺激產(chǎn)生IL-6而不增加其它所研究的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。所有這些數(shù)據(jù)不存在LPS效果、僅僅以角質(zhì)細(xì)胞為靶細(xì)胞和限于刺激IL-6，都讓我們可以得出Ⅰ1844提取物作用是特異性的和不存在促炎癥作用的結(jié)論。因此，Ⅰ1844提取物可以重復(fù)刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。此作用在已建立細(xì)胞系的人類(lèi)角質(zhì)化細(xì)胞和來(lái)自初次培養(yǎng)的人正常角質(zhì)細(xì)胞中被觀察。Ⅰ1844刺激角質(zhì)細(xì)胞合成IL-6的性質(zhì)是特異性的。這是由于Ⅰ1844提取物固有的特性決定的，不是由于細(xì)菌性內(nèi)毒素類(lèi)的外源污染，它不影響淋巴源細(xì)胞，并且在被試驗(yàn)的細(xì)胞因子中只對(duì)IL-6進(jìn)行了觀察Ⅰ1844提取物的特異性是雙重的，同時(shí)有細(xì)胞特異性和分子特異性。Ⅰ1844提取物的刺激角質(zhì)化細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性效果的鑒定使得能夠定義1.5至4.5之間的IL-6刺激指數(shù)作為對(duì)于所有基于SKV14試樣進(jìn)行評(píng)估的樣品的活性標(biāo)準(zhǔn)。如下進(jìn)行了Ⅰ1844提取物對(duì)膠原纖維收縮的作用的鑒定。此項(xiàng)研究的目標(biāo)是測(cè)試Ⅰ1844提取物對(duì)膠原纖維收縮的影響。使用通過(guò)將成纖維細(xì)胞和膠原混合制成的膠原凝膠。在由細(xì)胞所產(chǎn)生的張力作用下，膠原形成纖維。此現(xiàn)象由凝膠的收縮量化。使用的細(xì)胞系是細(xì)胞系MRC5，它是源于人胚胎肺的成纖維細(xì)胞的一個(gè)菌株。在含有包含10％SVF、1％的青霉素-鏈霉素、1％的兩性霉素B和1％的NEAA(非必需氨基酸)Gibco的GlutamaxⅠ的BME培養(yǎng)基(基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)上進(jìn)行培養(yǎng)。使用的膠原是源于大鼠尾腱的Ⅰ型膠原，為2mg/mL的醋酸溶液。獲得凝膠的方法制備細(xì)胞懸浮液在75cm2的平皿中得到的MRC5培養(yǎng)物用胰蛋白酶處理后，以1×106細(xì)胞/ml的比例，在含有10％SVF和抗菌素的DMEM中制備細(xì)胞懸浮液，以獲得500,000細(xì)胞/凝膠。在冰上制備混合物以使凝膠化延遲。在攪拌下按照下面的順序和比例加入各種組分將勻漿良好的此混合物分配在直徑5cm的平皿中(細(xì)菌學(xué)類(lèi)型，NUNC)并在37℃下培養(yǎng)。在10分鐘內(nèi)形成凝膠。在大約2小時(shí)以后，借助于解剖刀片將凝膠從平皿壁上取下。借助于mm刻度尺，在形成以后24、48和72小時(shí)測(cè)量凝膠的直徑。處理在凝膠產(chǎn)生期間，在1.76XDMEM培養(yǎng)基中稀釋Ⅰ1844提取物，以得到最終濃度為0.1％、0.2％和0.5％。使用最終濃度為6.4g/L的苯酚溶液作為收縮抑制對(duì)照。定量分析在濃度為0.1％或之上時(shí)，Ⅰ1844提取物誘發(fā)收縮明顯增加。被用作收縮抑制對(duì)照的苯酚產(chǎn)生0％收縮。在有Ⅰ1844提取物存在和沒(méi)有其存在下，72小時(shí)以后，對(duì)收縮的凝膠進(jìn)行電子顯微鏡觀察所進(jìn)行的定量分析顯示出活性細(xì)胞，它們看來(lái)處于蛋白質(zhì)合成期。用Ⅰ1844提取物進(jìn)行的處理似乎基本不改變纖維的數(shù)量或尺寸。劑量為0.1％或之上時(shí)，Ⅰ1844提取物是有效的。它增加成纖維細(xì)胞的活性，這表現(xiàn)為僅在最高濃度時(shí)膠原凝膠的收縮增強(qiáng)和纖維數(shù)增多。如下進(jìn)行Ⅰ1844提取物對(duì)膠原酶活化的影響的鑒定。此項(xiàng)研究的目標(biāo)是測(cè)試Ⅰ1844提取物對(duì)膠原酶活化的影響。為此使用通過(guò)將成纖維細(xì)胞和氚化膠原混合而制備的膠原凝膠。在此環(huán)境下，成纖維細(xì)胞將膠原重組、改型并使之收縮，以產(chǎn)生真皮型結(jié)構(gòu)。為此，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶，其以潛在的形式釋放至培養(yǎng)基中，在蛋白酶作用下此潛在的形式可以被活化。以將氚化膠原底物消化為可溶的放射性肽的能力來(lái)測(cè)定膠原酶的活性。用被1,1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基-氯甲基酮(TPCK)處理的胰蛋白來(lái)活化潛在的膠原酶。使用的細(xì)胞系是MRC5系，它為源于人胎肺的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞株。在帶有含10％FCS、1％的青霉素-鏈霉素、1％的兩性霉素B和1％的NEAA(非必需氨基酸)Gibco的GlutamaxⅠ的BME培養(yǎng)基(基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基)上培養(yǎng)它們。使用的膠原是源于鼠尾腱的Ⅰ型膠原，為2mg/mL醋酸溶液。用氚標(biāo)記的膠原為0.3mg/ml的醋酸溶液，其放射性是0.06mCi/Ml(DuPontNet-660)。凝膠的制備方法制備細(xì)胞懸浮液在用胰蛋白酶處理在75cm2的平皿上得到的MRC5培養(yǎng)物后，以1×106細(xì)胞/mL的比例在含有10％的FCS和抗菌素的DMEM中制備細(xì)胞懸浮液。在冰上制備混合物以延遲凝膠化。在攪拌下按下面的順序和比例加入各組分<tablesid="table2"num="002"><table>DMEM2X400μL氚化Ⅰ型膠原300μL0.1NNaOH100μLFCS100μL細(xì)胞懸浮液100μL</table></tables>在24孔平板上分配200μL良好勻漿的此混合物，并在37℃下培養(yǎng)。放射性是0.4μCi/孔。1小時(shí)以后，在每個(gè)孔中放入500μlDMEM+3％FCS培養(yǎng)基。在7天內(nèi)，每24小時(shí)測(cè)量活化和潛在膠原酶的活性。為此，在每個(gè)孔中取出500μL培養(yǎng)基，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)。在每孔放入300μL的25mg/mL胰蛋白酶-TPCK的DMEM溶液，在37℃下培養(yǎng)15分鐘。加入200μL的100mg/ml胰蛋白酶的蒸餾水溶液抑制劑在蒸餾水中的100mg/mL溶液終止胰蛋白酶的作用。取出500μL的培養(yǎng)基，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)。在每孔中再加入500μL的DMEM培養(yǎng)基+3％FCS，將該板再培養(yǎng)24hr。在凝膠產(chǎn)生期間，將Ⅰ1844提取物用2×DMEM培養(yǎng)基稀釋，以得到最終濃度為0.1％和0.5％。Ⅰ1844提取物沒(méi)有改變膠原酶的總活性。在給定的時(shí)間內(nèi)，潛在和活化膠原酶各自的比例與對(duì)照組沒(méi)有變化，盡管隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在對(duì)照組和處理樣品觀察到潛在的膠原酶的增加。該產(chǎn)物沒(méi)有導(dǎo)致任何膠原酶的活化。在制備本發(fā)明的化妝組合物時(shí)，將如此構(gòu)成的Ⅰ1844提取物與和局部使用以及實(shí)際組合物活性成分相適應(yīng)的常規(guī)稀釋劑以及含水或不含水溶劑相混合。適當(dāng)?shù)娜軇┖?或稀釋劑將按照其運(yùn)載本發(fā)明提取物活性組分至皮膚表皮和真皮中的能力進(jìn)行選擇。本發(fā)明的Ⅰ1844提取物在Ames和DNA修補(bǔ)檢測(cè)方面也顯示出完全不存在基因毒性。其穩(wěn)定性與在化妝組合物中的應(yīng)用是相容的。本發(fā)明的化妝組合物含有為組合物總重量的0.00001％至5％(重量計(jì))的Ⅰ1844提取物，其與制備皮膚用化妝配方常用的賦形劑混合。作為在組合物中包含的Ⅰ1844提取物的固有活性的函數(shù)，所述百分比可以在上述范圍內(nèi)變化。相對(duì)于組合物的總重量，所述Ⅰ1844提取物的百分比優(yōu)選為0.0001％至2％(重量計(jì))。在制備本發(fā)明的組合物時(shí)，將Ⅰ1844提取物與適合于皮膚應(yīng)用以及組合物本身其它成分的常規(guī)稀釋劑和含水或不含水溶劑混合。適當(dāng)?shù)娜軇┖?或稀釋劑根據(jù)其將本發(fā)明的活性Ⅰ1844提取物沉積至皮膚上的能力來(lái)選擇。此組合物一般含有賦形劑或添加劑，它們選自根據(jù)所設(shè)想的特定配方的必要性，用于局部施用的組合物中常用的成分。它們可以含有例如增稠劑、軟化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、消泡劑、表面活性劑、抗氧劑、著色劑和/或顏料和/或其它類(lèi)型的填料、香精、聚硅氧烷和各種脂肪物質(zhì)。相對(duì)于組合物的總重量，Ⅰ1844提取物總是占0.00001％至5％(重量計(jì))，優(yōu)選0.0001％至2％(重量計(jì))，所述量是以干提取物重量計(jì)。本發(fā)明組合物優(yōu)選含有新菌株Ⅰ1844的發(fā)酵液提取物，其基于重量/重量百分比的比例取決于所用提取物的活性程度，因此就取決于干物質(zhì)的濃度和此物質(zhì)的比活。為了得到本發(fā)明的化妝組合物，通?？梢允褂脧陌l(fā)酵直接得到的粗提取物，用不著任何的提純步驟，其比例為相對(duì)于組合物的總重量為0.00001％至5％，優(yōu)選0.0001％至2％，更優(yōu)選0.01％至2％(重量計(jì))。此重量百分比自然是在制備的干提取物重量的基礎(chǔ)上計(jì)算的。更具體說(shuō)，本發(fā)明的組合物含有或多或少提純的提取物，它們被溶解并可通過(guò)發(fā)酵來(lái)自紅酵母屬的菌株獲得，該菌株以號(hào)Ⅰ1844保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M，或者其生產(chǎn)突變體，同時(shí)含有通常用于此種制劑的賦形劑，如在上面敘述的那些。本發(fā)明組合物的形式可以是乳液，其中的一種或幾種組分的混合物，與任選的穩(wěn)定劑一起，被與在化妝組合物中經(jīng)常使用并與所述組分相容的賦形劑混合，這些賦形劑如羊毛脂、植物油、礦物油或合成油。本發(fā)明組合物還可以以在適當(dāng)?shù)馁x形劑中的凝膠形式提供，這些賦形劑如纖維素酯或其它凝膠化劑，如丙烯酸類(lèi)衍生物，并可含有呈溶解形式或懸浮于微粒中的活性成分。本發(fā)明的組合物也可以采取洗劑或溶液的形式，其中各組分的混合物是溶解或微分散的。因此，本發(fā)明組合物的形式可以是一種在液體中的微分散液，其中該液體中含有水以及一種或幾種相容的表面活性劑。這些分散液顯示微乳液的特性，尤其是透明、低粘度，并實(shí)際上具有真溶液的外觀。它們還可以即時(shí)配制。本發(fā)明組合物一個(gè)有利的形式是借助于粘性載體局部施用的流體，在后面稱之為“貼片”，此貼片使任選活化的活性組分受物理現(xiàn)象如微電流控制地?cái)U(kuò)散。本發(fā)明的化妝組合物還可以含有其它活性組分，這些活性組分具有與合成膠原刺激劑、膠原酶抑制劑或彈性蛋白酶抑制劑、血管保護(hù)劑或有助于刺激角質(zhì)化細(xì)胞增生、刺激超細(xì)胞基質(zhì)組分(膠原、彈性蛋白、糖胺聚糖)的產(chǎn)品或可用于此類(lèi)局部施用組合物的產(chǎn)品，比如細(xì)胞增長(zhǎng)促進(jìn)劑、膠原酶或彈性蛋白酶抑制劑、血管保護(hù)劑、防輻射劑、修復(fù)皮膚屏障功能的活性劑(神經(jīng)酰胺、必須脂肪酸)或吸水劑等相同類(lèi)型的作用。本發(fā)明組合物具有良好的穩(wěn)定性，可以在-10～60℃的溫度下保存必需的時(shí)間以供使用，而沒(méi)有組分的沉淀或產(chǎn)生相分離，或可損害其使用的活性的活性的降低。這些組合物有很好的耐受性，它們不具有任何光毒性，將其長(zhǎng)時(shí)間施用于皮膚沒(méi)有任何副作用。為其不同存在形式的本發(fā)明組合物可以用作各種制劑，用來(lái)預(yù)防和/或?qū)箖?nèi)因性或外因性皮膚老化，在此情況下主要是光化老化。設(shè)計(jì)用于抗老化目的本發(fā)明的化妝組合物可以與表皮或毛發(fā)系統(tǒng)接觸，以改善其外觀及對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。眾所周知，為了使皮膚年輕，緊密是重要的品質(zhì)。實(shí)際上這構(gòu)成了細(xì)胞生命力的真實(shí)的標(biāo)志，其消亡就決定了其它老化跡象的演變，如起皺紋或缺乏光澤。只要真皮保持住其充實(shí)的密度和柔軟的彈性，表皮就仍然是光滑、柔軟和很強(qiáng)壯的。皮膚的老化是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，從很年輕時(shí)就開(kāi)始了。自由基、遺傳因素、太陽(yáng)是其中幾個(gè)原因，但它們又是多重和可變的。皮膚的整個(gè)結(jié)構(gòu)在所有層次上受影響，而且隨著時(shí)間細(xì)胞數(shù)量減少。這導(dǎo)致組織的品質(zhì)更差，失去了初始的結(jié)實(shí)和彈性性質(zhì)。已經(jīng)觀察到，表皮細(xì)胞的代謝變慢，其基層失去了曲折狀，變成了方形的。角質(zhì)細(xì)胞的總?cè)后w退化，因此角質(zhì)層失去了其效果。再有，它還控制水的不良蒸發(fā)。還觀察到構(gòu)成真皮關(guān)鍵細(xì)胞的成纖維細(xì)胞的活性逐年在減少。形成的膠原這時(shí)纖維化并變硬。彈性蛋白的合成甚至過(guò)早下降。真皮的性質(zhì)如此改變了組織并變薄塌縮，變得不那么耐肌肉的牽拉。這樣的松弛造成裂口，從而形成皺紋。本發(fā)明化妝組合物重建光滑的方法是在所有皮膚的水平上為使皮膚結(jié)實(shí)的進(jìn)程重新確立天然的基礎(chǔ)。這相當(dāng)于對(duì)失去緊固性、彈性和青春的皮膚進(jìn)行感覺(jué)不到的微觀重建。本發(fā)明的化妝組合物還用于成熟的皮膚，為其進(jìn)行抗老化治療。這時(shí)，Ⅰ1844提取物對(duì)皮膚重建的因素起作用，因此重建其結(jié)構(gòu)(緊固性和緊張性)與表面(舒適和光澤)，或深處(緊固性和緊張性)與表面(光澤和舒適)的物理平衡。賦予生命活力和重建的本發(fā)明化妝組合物可分別在白天和/或晚上使用。該化妝組合物還可以含有其它附加的活性劑。它可以為例如維生素或抗色斑劑。與比如海洋浮游生物提取物一起使用的協(xié)同特性也增強(qiáng)和擴(kuò)大其無(wú)與倫比的重建品質(zhì)。源于海洋浮游生物的提取物可以保證皮膚的吸水和緊固性的最佳推進(jìn)。也可以使用植物刺激素，如水果提取物，例如蘋(píng)果植物刺激素，由于其抗自由基特性而被選擇。富含黃酮、膽固醇、基本脂肪酸和維生素，特別是維生素E的物質(zhì)，它們構(gòu)成了新型的特別能抗自由基的活性物。這時(shí)，皮膚能夠最大限度地不受特別是由紫外線產(chǎn)生的自由基和應(yīng)激的損害的保護(hù)。在本發(fā)明化妝組合物中還可以使用全氟的油，此外這些全氟的油具有使皮膚的凹凸不平處和顆粒微突起部分變得光滑的性能。真實(shí)地“塑造”青春，這使我們重塑了容顏，在視覺(jué)上美化了皮膚表面。因此，本發(fā)明的化妝組合物刺激了表皮細(xì)胞的更新和膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生，保證了吸水天然進(jìn)程的最佳實(shí)現(xiàn)，更完全地保護(hù)了皮膚不受自由基的侵害，而這是導(dǎo)致皮膚老化的主要因素。由于重新賦予了活力，此時(shí)表皮重新獲得了更好的吸水性，皮膚顯得恢復(fù)了青春、更加光滑、更加結(jié)實(shí)。特別是面部的容顏更加整潔，皮膚仿佛被從內(nèi)部重新塑造過(guò)，看起來(lái)更加結(jié)實(shí)。在上述化妝組合物中所含有的Ⅰ1844提取物對(duì)皮膚的作用是作為聚集活性劑。對(duì)120名30至60歲的婦女進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。她們對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行了四個(gè)星期的試驗(yàn)。對(duì)于87％的人，觀察到該產(chǎn)品對(duì)她們的皮膚在緊固性、光滑性和吸水性上有可見(jiàn)的效果。對(duì)于82％的人對(duì)此化妝品的性能給予好評(píng)，比如容易涂敷、滲透迅速、完全沒(méi)有油脂的膜，感覺(jué)良好、舒適。其它的臨床研究包括證實(shí)本發(fā)明組合物對(duì)皮膚突起、微凹陷網(wǎng)狀物、皮膚的生物力學(xué)性能及其光澤的效果。專門(mén)用于成熟皮膚的品種讓我們觀察到，在白天護(hù)理敏感及干燥的皮膚，使微皺紋、微突起得到明顯穩(wěn)定的緩和，整潔度和微凹陷網(wǎng)狀物外觀得到改善，皮膚的緊張度也得到改善。夜間的抗皺紋/重建結(jié)實(shí)的護(hù)理對(duì)深皺紋、微皺紋和微突起都得到明顯穩(wěn)定的緩和，整潔度和微凹陷網(wǎng)狀物的改善，對(duì)皮膚緊固性和結(jié)實(shí)度的改善。強(qiáng)化再生護(hù)理對(duì)微皺紋和微突起顯示出明顯穩(wěn)定的緩和，對(duì)整潔度和微凹陷網(wǎng)狀物顯示出改善?；瘖y領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的各種方法都確認(rèn)了這些不同的臨床結(jié)果，比如磁共振圖象(IRM)的微量探針技術(shù)能夠測(cè)量吸水性；透射顯微鏡可以評(píng)價(jià)皮膚的重建；高分辨率超聲回波描記術(shù)可以測(cè)量皮膚厚度，而磷31的分光光度計(jì)可以測(cè)定細(xì)胞活性。本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是化妝護(hù)理方法，其特征在于，在表皮和/或毛發(fā)系統(tǒng)上涂敷含在化妝品用載體中的具有化妝效果量的Ⅰ1844提取物。下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但不對(duì)其構(gòu)成限制。實(shí)施例1制備源于紅酵母Ⅰ1844菌株的提取物。1.1發(fā)酵在傳代培養(yǎng)基上進(jìn)行紅酵母Ⅰ1844菌株的發(fā)酵。1.1.1a)將在平皿上的譜系移植到接種介質(zhì)上。在30℃下培養(yǎng)此培養(yǎng)物48hr。然后在每個(gè)平皿中加入10mL具有下列組成的適當(dāng)回收培養(yǎng)基，得到酵母的懸浮液b)用5mL此懸浮液接種2L錐形瓶，內(nèi)裝500mL具有如下組成的培養(yǎng)基這里，微量元素溶液由如下的化合物組成在以150rpm的攪拌下，在2L的錐形瓶中，在30℃下將培養(yǎng)物培養(yǎng)48hr。1.1.2a)使用0.2mL來(lái)自第二種子批的酵母懸浮液，給500mL裝有100mL具有如下成分的培養(yǎng)基的燒瓶接種微量元素溶液與實(shí)施例1.1.1中所述的相同。在200rpm的攪拌下，在30℃下將培養(yǎng)物培養(yǎng)24hr.。b)使用100mL如上面得到的培養(yǎng)物，給裝有12L組成與實(shí)施例1.1.1.b所述相同的再加入了1mL/L的Struktol的培養(yǎng)基的20L發(fā)酵器接種。在1vvm通風(fēng)速率下和變化的攪拌下，于30℃下培養(yǎng)培養(yǎng)物，以使得保持30％的溶解氧的壓力。用氨將pH值調(diào)節(jié)到5.0。在25hr后，加入葡萄糖濃溶液以使繼續(xù)增長(zhǎng)。在32hr時(shí)，增長(zhǎng)呈水平狀時(shí)終止培養(yǎng)。1.1.3.+以與實(shí)施例1.1.2.相同的方式，在攪拌的瓶中制備100mL培養(yǎng)物，并使用此培養(yǎng)物為裝有12L具有如下成分培養(yǎng)基的20L發(fā)酵器接種微量元素溶液如在實(shí)施例1.1.1中所述。在與實(shí)施例1.1.2.b相同的條件下培養(yǎng)此培養(yǎng)物。在31hr時(shí)，加入葡萄糖濃溶液使繼續(xù)增長(zhǎng)。在34hr時(shí)，增長(zhǎng)呈水平狀時(shí)終止培養(yǎng)。1.1.4制備含與實(shí)施例1.1.2.a相同組成的培養(yǎng)基的4種2L攪拌錐形瓶培養(yǎng)物。這4個(gè)錐形瓶每個(gè)都用0.75ml來(lái)自第二種子批酵母的懸浮液接種。在30℃和200rpm下培養(yǎng)此培養(yǎng)物24hr。然后將它們合并給裝有230L具有如下組成的培養(yǎng)基的450L發(fā)酵器接種微量元素溶液與實(shí)施例1.1.1中所述相同。在1vvm通風(fēng)速率和變化的攪拌下，于30℃下培養(yǎng)培養(yǎng)物，使得保持30％的溶解氧的壓力。用氨將pH值調(diào)節(jié)到5.5，在老化30hr時(shí)加入葡萄糖濃溶液，以維持生長(zhǎng)期。在37hr時(shí)，當(dāng)增長(zhǎng)達(dá)水平時(shí)終止培養(yǎng)。1.1.5使用0.75mL來(lái)自第二種子批酵母懸浮液給包含500mL具有如下組成的培養(yǎng)基的6個(gè)2L瓶子接種微量元素溶液與實(shí)施例1.1.1中所述相同。在220rpm的攪拌下，在30℃下將培養(yǎng)物培養(yǎng)24hr。然后合并6個(gè)瓶以對(duì)含有300L具有如下組成的培養(yǎng)基的450L發(fā)酵器接種微量元素溶液與實(shí)施例1.1.1中所述的相同。在1vvm通風(fēng)速率和變化的攪拌下，于30℃下培養(yǎng)培養(yǎng)物，使得保持約30％的溶解氧的壓力。用氨將pH值調(diào)節(jié)到5.5，在35hr時(shí)，加入葡萄糖濃溶液，以維持生長(zhǎng)期。在老化40hr時(shí)，當(dāng)增長(zhǎng)達(dá)水平時(shí)終止培養(yǎng)。1.2提取1.2.1用9L按實(shí)施例1.1.1(18個(gè)裝有500mL發(fā)酵汁的2L瓶子)得到的發(fā)酵汁進(jìn)行提取。以9000rpm(14,000g)離心10分鐘，得到154g濕的生物質(zhì)。在室溫和攪拌下將此生物質(zhì)與6L二氯甲烷/甲醇混合物(v/v)接觸過(guò)夜。然后過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下將有機(jī)相真空蒸發(fā)至干。蒸發(fā)的殘?jiān)?9.8g)就構(gòu)成了干提取物，將其溶解于112mL甲醇中。在0.2μ的過(guò)濾器上過(guò)濾如此得到的級(jí)分，進(jìn)行刺激角質(zhì)細(xì)胞的生物測(cè)試，當(dāng)其被稀釋200倍時(shí)(1/200)，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的刺激指數(shù)(IS)為1.9。1.2.2對(duì)12L實(shí)施例1.1.2的培養(yǎng)汁液進(jìn)行提取。按照與實(shí)施例1.2.1相同的操作程序，但是是在用80L的二氯甲烷/甲醇混合物(50/50)獲得的1,900g濕生物質(zhì)中進(jìn)行提取，即使用的溶劑混合物/濕生物質(zhì)混合物的比例接近每kg濕生物質(zhì)40L溶劑混合物。在接觸過(guò)夜后過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下真空蒸發(fā)有機(jī)相。得到93.8g干提取物，將其溶解于375g乙醇/水混合物(50/50,v/v)中。包含如此得到的0.2g/g干提取物在0.2μm的過(guò)濾器上過(guò)濾后的溶液顯示刺激指數(shù)(IS)是2.1，用于稀釋1/200。1.2.3用11L實(shí)施例1.1.3的培養(yǎng)物進(jìn)行提取。按照于實(shí)施例1.2.2相同的操作程序，用80L二氯甲烷/甲醇(50/50,v/v)提取2.2kg得到的濕生物質(zhì)。然后過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下真空蒸發(fā)有機(jī)相。得到98g干提取物，將其溶解于392g乙醇/水(50/50,v/v)混合物，以得到0.2g/g的溶液。在0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾后，評(píng)價(jià)此溶液的角質(zhì)細(xì)胞刺激生物學(xué)測(cè)試；其顯示刺激指數(shù)(IS)為2.8，供稀釋1/200。1.2.4用與實(shí)施例1.1.3相同方式制備的12L培養(yǎng)物進(jìn)行提取，但在此情況下，用連續(xù)離心進(jìn)行生物質(zhì)分離。得到1.6kg濕生物質(zhì)，用80L二氯甲烷/甲醇(50/50,v/v)混合物處理此生物質(zhì)。在接觸過(guò)夜后，過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下真空蒸發(fā)有機(jī)相。得到83g干提取物，將其溶解于747g乙醇/水混合物(50/50,v/v)中，以得到0.1g/g干提取物的溶液。用0.2μm的過(guò)濾器過(guò)濾獲得的溶液，如此得到的溶液的刺激指數(shù)(IS)是3.5，用于稀釋1/100。1.2.5將230L的實(shí)施例1.1.3培養(yǎng)物進(jìn)行提取，在連續(xù)離心分離生物質(zhì)后，得到29kg濕生物質(zhì)。用80L二氯甲烷/甲醇(50/50,v/v)混合物處理8kg此生物質(zhì)，即使用的混合溶劑/濕生物質(zhì)的比例接近于每kg濕生物質(zhì)10L混合溶劑。在接觸過(guò)夜后過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下真空蒸發(fā)有機(jī)相。在蒸發(fā)后得到314g干提取物的有機(jī)相，將其溶解于2,826g乙醇/水混合物(50/50,v/v)中。如此得到的溶液(0.1g/g干提取物)的刺激指數(shù)(IS)是2.8，用于稀釋1/100。1.2.6將330L的實(shí)施例1.1.5培養(yǎng)物進(jìn)行提取，借助于連續(xù)離心，得到54.4kg濕生物質(zhì)。用272L二氯甲烷/甲醇(50/50,v/v)混合物處理27.7kg此生物質(zhì)，使用的混合溶劑/濕生物質(zhì)的比例接近于每kg濕生物質(zhì)5L混合溶劑。在接觸過(guò)夜后過(guò)濾除去生物質(zhì)，在50℃下真空蒸發(fā)有機(jī)相。在蒸發(fā)后得到1447g干提取物的有機(jī)相，將其溶解于13,023g乙醇/水混合物(50/50,v/v)中，得到含0.1g干提取物的溶液。在過(guò)濾后，用0.2g這樣的溶液進(jìn)行評(píng)價(jià)其刺激角質(zhì)細(xì)胞的的生物學(xué)測(cè)試，其刺激指數(shù)(IS)是2.6，用于稀釋1/100。在下面的實(shí)施例中，給出的量是重量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例2日用面霜實(shí)施例3面用濃縮護(hù)理劑實(shí)施例4面用乳液實(shí)施例5洗劑實(shí)施例6凝膠實(shí)施例7防護(hù)乳實(shí)施例8漂洗面膜<tablesid="table18"num="018"><table>丙烯酸類(lèi)共聚物1三乙醇胺1甘油15C14-16烯烴磺酸鹽5聚乙二醇醚和椰子酸酯2海洋浮游生物提取物1蘋(píng)果提取物5大豆芽提取物0.5磷酸抗壞血酸酯3絲蛋白提取物2防腐劑0.8香精0.5Ⅰ1844提取物0．15軟化水至100</table></tables>權(quán)利要求1．一種化妝組合物，其含有至少一種具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的化合物，并混合有制備化妝品用的賦形劑。2．如權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，它含有具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性提取物，該提取物是一種源于微生物發(fā)酵的產(chǎn)物。3．如權(quán)利要求2的組合物，其特征在于，具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性提取物是一種源于選自酵母的微生物發(fā)酵的產(chǎn)物。4．如權(quán)利要求3的組合物，其特征在于，具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性提取物是一種由紅酵母屬菌株發(fā)酵得到的產(chǎn)物。5．如權(quán)利要求4的組合物，其特征在于，具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性提取物可以由一種紅酵母SEBR2002菌株或其生產(chǎn)突變體發(fā)酵而獲得，其中所述紅酵母菌株以Ⅰ1844的保藏號(hào)保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M。6．菌株紅酵母SEBR2002，其以Ⅰ1844保藏號(hào)保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M，以及其生產(chǎn)突變體。7．一種制備具有刺激角質(zhì)化細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性提取物產(chǎn)品的方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中和在常規(guī)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求6的菌株，直至在發(fā)酵汁液中得到刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性。8．按照權(quán)利要求7的方法得到的具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的組合物。9．如權(quán)利要求8的按照權(quán)利要求7方法得到的組合物，其中使用未加工或濃縮的生物質(zhì)。10．如權(quán)利要求8的組合物，其特征在于，它顯示刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的活性，刺激指數(shù)SI為1.2～6。11．如權(quán)利要求8～10任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，它是通過(guò)提取生物質(zhì)、蒸發(fā)溶劑和水，以及在與化妝應(yīng)用相容的溶劑中稀釋干提取物而得到的。12．具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的化合物在制備用于克服皮膚老化的化妝組合物中的應(yīng)用。13．如權(quán)利要求12的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)酵母的發(fā)酵得到該化合物。14．如權(quán)利要求13的應(yīng)用，其特征在于由紅酵母屬菌株，特別是紅酵母SEBR2002或其生產(chǎn)突變體得到該化合物，其中所述紅酵母SEBR2002以Ⅰ1844的保藏號(hào)保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M。15．紅酵母屬菌株，特別是紅酵母SEBR2002菌株或其生產(chǎn)突變體在制備具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6活性的化合物方面的應(yīng)用，其中所述紅酵母SEBR2002以Ⅰ1844的保藏號(hào)保藏于Pasteur研究所的C.N.C.M。16．化妝處理方法，其特征在于，在表皮上涂敷化妝有效量的含在化妝用載體中的能刺激產(chǎn)生IL-6活性的化合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種化妝組合物,其中含有混合了制備化妝品用的賦形劑的至少一種具有刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL－6活性的化合物。文檔編號(hào)C12N1/16GK1296405SQ99804968公開(kāi)日2001年5月23日申請(qǐng)日期1999年2月3日優(yōu)先權(quán)日1998年2月11日發(fā)明者P·卡塞拉斯,J·－M·德羅克,J·－M·佩雷洛申請(qǐng)人:圣諾菲-合成實(shí)驗(yàn)室公司