專利名稱:由在GP130結(jié)合介面突變的白細(xì)胞介素-6(IL-6)受體α的可溶形式組成的IL-6拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地說,本發(fā)明的主題是白細(xì)胞介素-6受體α的可溶形式的突變體,這種突變體負(fù)向影響單體受體復(fù)合物IL-6/sIL-6Rα和gp130之間的二聚體受體復(fù)合物的形成。本發(fā)明的另一個(gè)主題是這些突變物作為白細(xì)胞介素-6的拮抗劑在控制、預(yù)防及治療由異常IL-6活性引起的疾病上的用途。
本
發(fā)明內(nèi)容
中的“白細(xì)胞介素6”或“IL-6”指IL-6和其保持野生型IL-6生物特征的片段、缺失體、插入體、取代體、突變體及修飾體。除非有特別說明,該術(shù)語是指人IL-6。
IL-6作用于不同的靶細(xì)胞引起一系列生物學(xué)反應(yīng)。然而,生理產(chǎn)生的IL-6調(diào)控B細(xì)胞的增殖和成熟、T細(xì)胞的激活及炎癥反應(yīng)情況下肝臟中急相蛋白的產(chǎn)生。該細(xì)胞因子的失調(diào)生產(chǎn)在許多炎癥、自體免疫和瘤形成疾病的病理中起關(guān)鍵作用。
如現(xiàn)有技術(shù)中所知,人們進(jìn)行了大量嘗試來尋找IL-6生物活性抑制劑,一方面想弄清在單一疾病發(fā)生中這一細(xì)胞因子的作用,另一方面也尋求治療疾病的藥物。
已經(jīng)知道成熟的人IL-6蛋白(hIL-6)是一個(gè)185個(gè)氨基酸組成的多肽,其中包括兩個(gè)二硫鍵(Cys45-Cys51,Cys74-Cys84)。IL-6通過兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(稱為位點(diǎn)I和位點(diǎn)II)和靶細(xì)胞表面的至少兩種特異受體(IL-Rα和gp130)相互作用形成一個(gè)三聚體復(fù)合物IL-6(受體)2起作用。這一復(fù)合物按以下順序形成第一個(gè)受體(IL-6Rα)以低親合力結(jié)合到IL-6的位點(diǎn)I上(不傳遞信號(hào));然后第二受體(gp130)以高親合力與IL-6位點(diǎn)II結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。
基于上述機(jī)制,已設(shè)計(jì)了人IL-6突變體,該突變體可通過位點(diǎn)I與第一受體結(jié)合,但不能二聚化第二受體,因?yàn)橥蛔冊(cè)诳臻g上抑制第二受體結(jié)合到位點(diǎn)II上。這種類型的突變體已經(jīng)在WO 94/09138(Cetus Onclogy Corporation)及WO 94/011402和PCT/IT94/00095(Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare p.Angeletti S.P.A.)中有描述。
現(xiàn)在已驚奇地發(fā)現(xiàn)在gp130的界面區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)突變的IL-6受體α的可溶形式是IL-6的拮抗劑,這一發(fā)現(xiàn)形成了本發(fā)明的基礎(chǔ)。
在一個(gè)實(shí)施方案中,sIL-6Rα包含至少一個(gè)在選自Ala228、Asn230、His280和Asp281位置上的突變。所述的突變可以是選自例如Asn230Asp(SEQ ID NO1);Ala 228 Asp/Asn230Asp(SEQ IDNO2),His 280Ser/Asp281 Val(SEQ ID NO3)的突變。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,sIL-6Rα含有在位置Ala228、Ans230、His280和Asp281上的多突變。給出好的效果的多突變是Ala228 Asp/Asn230 Asp/His280 Ser/Asp281 Val(SEQ ID NO4)。
本發(fā)明的由IL-6α受體的可溶形式構(gòu)成的、在與gp130結(jié)合的界面上發(fā)生突變的IL-6拮抗劑,可以以治療和預(yù)防與異常IL-6活性有關(guān)的疾病有效的濃度被施用。為此目的,按照本發(fā)明的拮抗劑最好經(jīng)靜脈或皮下注射施用,本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)這些施用方法是熟知的。
到此為止,已給出了本發(fā)明的一般性描述。以下將借助下列實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行更詳細(xì)的描述,以便更清楚地了解本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和其操作方法。
圖1A表示本發(fā)明的突變體與35S標(biāo)記sgp130(gP130可溶形式)的體外免疫共沉淀在SDS/PAGE(12%)上的分離。圖1B顯示了在對(duì)應(yīng)于遷移125I-IL-6的凝膠上的位置。
圖2以矩形圖的形式表示了野生型sIL-6Rα受體和突變型sIL-6Rα受體在A375細(xì)胞膜上與gp130作用的不同能力。
圖3表示用35S標(biāo)記的sgp1 30與2.0μg野生型受體或與2.0μg突變型受體(SEQ ID NO4)的體外免疫共沉淀在SDS/PAGE凝膠(12%)上的分離。
圖4表示了與野生型shIL-6Rα的激動(dòng)性質(zhì)比較,突變體(SEQID NO4)在HepG2細(xì)胞上的拮抗活性。
圖5表示了由APRF和DNA結(jié)合位點(diǎn)(SIE,Serum InducibleElement)形成的復(fù)合物在凝膠上的分離。(突變SEQ ID NO4不抑制OM依賴性APRF在HepG2細(xì)胞上的激活)。
本發(fā)明的IL-6拮抗劑可通過合成或重組技術(shù)產(chǎn)生。在后一種情況下,編碼sIL-6-Rα的cDNA可整合到質(zhì)粒中去,然后在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)。一般來說,細(xì)菌是較好的原核微生物。
此外,編碼本發(fā)明的sIL-6Rα突變體的cDNA亦可被引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以選自CHO,COS,C127,HepG2,SK Hep。而且,這些蛋白亦可用公知的重組桿狀病毒技術(shù)(AcNPV菌株)在昆蟲細(xì)胞(Sf9或HighFive)中表達(dá)。
實(shí)施例1sIL-6Rα突變體的制備sIL-6RαcDNA作為5′EcoRI-3′XbaI片段可用完整的IL-6RαcDNA作為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到(Sporeno E.,Paonessa G.,Salvati A.L.,Graziani R.,Delmastro P.,Ciliberto G.and Toniatti C.(1994)J.Biol.Chem.269,10991-10995)。設(shè)計(jì)3′引物以便在位于6個(gè)組氨酸編碼序列之后的324氨基酸位點(diǎn)引入一個(gè)人工TAG終止密碼子。進(jìn)行這一工作以保證sIL-6Rα和我們產(chǎn)生的突變體在分子的羧基端具有一個(gè)6個(gè)組氨酸的尾部,它在以后使用金屬親和層析進(jìn)行所述分子的提純中是有用的。然后,產(chǎn)生的片段可被導(dǎo)入到COS-7細(xì)胞表達(dá)載體pcDNAI(Invitrogen)中,并整體測(cè)序,由此得到pC6FRH質(zhì)粒。
再用pC6FRH質(zhì)粒作為模板進(jìn)行現(xiàn)有技術(shù)中描述的兩步法PCR擴(kuò)增(Landt O.,Grunert H.P.and Hahn U.(1990)Gene 96,125-128)來構(gòu)建下列四種突變體Asn230Asp(SEQ ID NO1);Asn 230 Asp/Ala228 Asp(SEQ ID NO2);His 280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO3)和Ala228 Asp/Asn 230 Asp/His 280 Ser/Asp281Val(SEQ ID NO4)。
然后在COS-7細(xì)胞中表達(dá)所述突變體,將COS-7細(xì)胞在5%CO2下保持在補(bǔ)加有10%FCS及谷氨酸和抗生素的DME培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)中。為了表達(dá)蛋白,將2.5×106個(gè)COS-7細(xì)胞接種到100-mm組織培養(yǎng)皿中,第二天用2μg不同的shIL-6Rα表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這一過程采用DEAE-葡聚糖技術(shù)(在Seed B.,Aruffto A.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84,3365—3369中描述)。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后,把細(xì)胞分割并重新接種于100—mm培養(yǎng)皿中并于37℃下在完整培養(yǎng)基中培養(yǎng)。72—96小時(shí)后收集培養(yǎng)基,離心并用于進(jìn)行共免疫沉淀和結(jié)合分析。為了監(jiān)測(cè)每個(gè)突變體的表達(dá)水平,重新接種2.5×105個(gè)轉(zhuǎn)染COS—7細(xì)胞于35—mm培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,用[35S]甲硫氨酸代謝標(biāo)記4小時(shí)。離心獲得的上清液用抗人IL-6Rα的單克隆抗體I6R1/9.G11免疫沉淀,然后用含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)免疫沉淀物進(jìn)行分析。
突變體的IL-6結(jié)合分析為了檢測(cè)包含在COS細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的sIL-6Rα對(duì)IL-6的親和力,使用我們產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中的6個(gè)組氨酸尾端。
取適量的轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞上清液(事先用滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)定,并在其中加入咪唑至終濃度5mM),與20—40pM的125I-IL-6和增加的濃度的未標(biāo)記的細(xì)胞因子混合。在平衡狀態(tài)下,加入40μl Ni2+-NTA-瓊脂糖(一種能選擇性結(jié)合包含組氨酸尾端之蛋白的樹脂),溫育額外的1小時(shí)。被受體結(jié)合因而不直接與樹脂結(jié)合的配體,經(jīng)離心通過PBS中30%蔗糖墊層與游離配體(上清液)分離。所有的步驟均在4℃進(jìn)行。由游離和結(jié)合cpm(每分鐘放射活性計(jì)數(shù))值,可給出競(jìng)爭(zhēng)替代曲線。所得結(jié)果經(jīng)Scatchard轉(zhuǎn)化后確定各種可溶性IL-6受體的表現(xiàn)Kd值(參見Sporeno,Paonessa,Salviati,Graziani,Delmastro,Ciliberto and Toniatti(1994),J.Biol.Chem.269,10991—10995)。用UltraFit軟件(Biosoft)在Macintosh計(jì)算機(jī)上進(jìn)行結(jié)合數(shù)據(jù)分析及曲線匹配。
從表1可以看出,結(jié)合親合力如下a)突變體Asn 230Asp(SEQID NO1)、Asn230Asp/Ala 228 Asp(SEQ ID NO2)基本上沒有改變;b)突變體His280Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO3)稍有降低而且結(jié)果是可重復(fù)的(在25nM和6nM之間);c)突變體Ala228 Asp/Asn230 Asp/His 280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO4)完全保持了野生型蛋白的活性。
表1COS細(xì)胞中表達(dá)的用組氨酸標(biāo)記的可溶性IL-6受體(野生型和突變型)的IL-6結(jié)合親和力突變體 IL-6結(jié)合親和力(nM)Asn230Asp (SEQ ID NO1)1.5±1Ala228Asp/Asn230Asp(SEQ ID NO2)2.0±1His280Ser/Asp281Val(SEQ ID NO3)4.3±2Ala228Asp/Asn230Asp/His280Ser/Asp281Val(SEQ ID NO4)2.5±1野生型sIL-6Rα2.0±1突變體與gp130的結(jié)合sIL-6Rα/sgp130異源二聚體的IL-6-依賴性形成,用合適的單克隆抗體經(jīng)體外共免疫沉淀容易檢測(cè)。由此進(jìn)行表現(xiàn)出與野生型有相同數(shù)量級(jí)的IL-6結(jié)合親合力的突變體的選擇,在有IL-6存在下,用共免疫沉淀法估價(jià)它們與sgp130的結(jié)合。
將35S標(biāo)記的sgp130、125I-IL-6以及轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞培養(yǎng)基(既有野生型又有突變型受件)一起溫育。體外結(jié)合后,向混合物中加入抗IL-6RαI6/R19.G11.,將免疫沉淀物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離。結(jié)果如圖1所示??梢钥闯?,突變體His280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO3)大大降低了IL-6/sIL-6Rα復(fù)合物與gp130分子的結(jié)合。單點(diǎn)取代突變體Asn 230 Asp(SEQ ID NO1)也降低與gp130的相互作用(第2道),這一突變體與sgp130作用的效果與突變體Ala228 Asp/Asn 230Asp(SEQ ID NO2)的該效果有相同的數(shù)量級(jí)。最后,四位點(diǎn)突變體Ala 228 Asp/Asn230Asp/His280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO4)表現(xiàn)出共免疫沉淀35S-gp130的最差的能力。
同樣檢測(cè)了這些受體突變體與細(xì)胞膜表面的gp130相互作用的能力。為此,結(jié)合實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人黑瘤A375細(xì)胞,這種細(xì)胞具有超過IL-6Rα的過量gp130分子。實(shí)際上,125I-IL-6與A375單細(xì)胞單層的結(jié)合能力可由加入可溶性受體大大提高。這種現(xiàn)象歸因于sIL-IL-6Rα與125I-IL-6結(jié)合然后再與細(xì)胞表面的gp130分子相互作用的能力。這種作用的特異性由這樣一個(gè)事實(shí)證明在sIL-6Rα存在下的125I-IL-6結(jié)合的增加可經(jīng)加入過量的未標(biāo)記人腫瘤抑制素M(Oncostation OM)而受競(jìng)爭(zhēng)(圖2)。這種細(xì)胞因子可以直接與gp130結(jié)合而使其與IL-6/IL-6Rα復(fù)合物和gp130的結(jié)合形成一種競(jìng)爭(zhēng)。與野生型shIL-6Rα不同,當(dāng)用125I-IL-6加上可溶性突變受體(作為拮抗劑起作用)處理細(xì)胞時(shí)僅檢測(cè)到特異結(jié)合的微少增加(圖2)。以下突變體表現(xiàn)出與gP130作用的最大變化His280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO3)和Ala 228 Asp/Asn 230Asp/His 280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO4)。證明突奕體Ala 228 Asp/Asn 230 Asp/His 280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO4)是IL-6拮抗劑以上結(jié)果顯示這種突變(與IL-6的親合力沒有任何降低)對(duì)gp130結(jié)合具有最好效果。為了研究這種突變體的生物學(xué)活性,用NaxBac系統(tǒng)(Invitrogen′s Baculovirus Exprecsion System)大量產(chǎn)生這種突變型和野生型可溶性受體。將表達(dá)和提純的受體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。
采用Sf9細(xì)胞(培養(yǎng)基為Grace′s昆蟲培養(yǎng)基)用于轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移載體、分離重組病毒及制備高滴度病毒原種。用High Five細(xì)胞(In-vitrogen)替代產(chǎn)生蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單地說,將在完全Gracer′s昆蟲培養(yǎng)基培養(yǎng)中生長(zhǎng)的4×107High Five細(xì)胞接種到750ml培養(yǎng)瓶中,用合適的重組病毒在10MOI下感染。2小時(shí)后,沖洗細(xì)胞,加SF—900無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)收集培養(yǎng)物上清液,用PBS透析后直接上樣于Ni2+-NTA瓊脂糖柱上。用PBS/8mM咪唑洗滌后,野生型shIL-6Rα和突變型受體均在PBS/80mM中被洗脫。純化蛋白質(zhì)經(jīng)PBS透析,直接用于實(shí)驗(yàn)或4℃貯存(可達(dá)三周)。
純化蛋白的使用使定量分析受體量及比較野生型受體和突變型受體在大范圍IL-6濃度下與gp130作用的能力成為可能。結(jié)果(圖3)與以前用COS細(xì)胞來源的受體所獲得的結(jié)果是相當(dāng)吻合的。有趣的是,在曲線上的每一個(gè)點(diǎn),實(shí)變型受體與gp130的共免疫沉淀量都要低于野生型受體,即使在細(xì)胞因子的最高測(cè)試濃度(100nM)下也是這樣。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了IL-6與突變型sIL-6Rα間的相互作用產(chǎn)生與gp130有較低親合力的復(fù)合物。
為了試驗(yàn)這些突變體對(duì)IL-6活性的潛在的拮抗作用,我們選擇了人肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子APRF(急相應(yīng)答因子)/STAT3的IL-6依賴性激活。APRF的激活(依賴于酪氨酸磷酸化)是在IL-6家族的所有細(xì)胞因子刺激下在幾分鐘內(nèi)發(fā)生的快速胞質(zhì)反應(yīng)。
用遞增濃度的IL-6與固定量野生型和突變型受體(100nM)一起,對(duì)人HepG2細(xì)胞進(jìn)行刺激。如圖4所示,在shIL-6Rα加強(qiáng)的IL-6誘導(dǎo)激活A(yù)PRF過程中,可溶性突變受體不但缺乏任何激動(dòng)活性,而且下調(diào)該細(xì)胞因子的活性(圖4,第8-10道)。和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)示的一樣,當(dāng)用高達(dá)20pM的IL-6處理細(xì)胞時(shí),抑制作用是完全的(圖4,第8和9道),并且在IL-6濃度達(dá)到最高時(shí)(200pM,圖4第10道),只檢測(cè)到微弱的誘導(dǎo)作用。
為了試驗(yàn)拮抗作用是否是對(duì)IL-6特異的,將突變體加入到用經(jīng)IL-6相關(guān)的細(xì)胞因子OM誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中,已知OM有效誘導(dǎo)APRF磷酸化。如圖5所示,突變體不拮抗OM活性。
序列表一般信息(i)申請(qǐng)人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.
(ii)發(fā)明名稱由在GP130結(jié)合界面突變的白細(xì)胞介素6(IL-6)受體α可溶形式組成的IL-6拮抗劑
(iii)序列數(shù)目4(iv)通信地址(A)地址Società Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra,39(C)城市羅馬(D)國家意大利(E)郵政編碼I-00186(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5吋軟盤,1.44兆字節(jié)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS Rev.6.22(D)軟件Microsoft Word 6.0(viii)代理人信息(A)姓名DI CERBO,Mario(Dr.)(C)卷號(hào)RM/X88470/PC-DC(ix)電訊信息(A)電話06/6785941(B)電傳06/6794692(C)電傳612287 ROPAT(1)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的否(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成真核細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(ix)特征
(A)名稱Asn230Asp(C)鑒別方法變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(D)其他信息白細(xì)胞介素6受體突變體的222—236位氨基酸序列(xi)序列描述SEQ ID NO1Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asp Pro Arg Trp Leu Ser15 10Val15(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的否(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成真核細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(ix)特征(A)名稱Ala228Asp/Asn230Asp(C)鑒別方法變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(D)其他信息白細(xì)胞介素-6受體胺突變體的222—236位氨基酸序列(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Thr Val Thr Ala Val Asp Arg Asp Pro Arg Trp Leu Ser15 10Val15(3)SEQ ID NO3信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的否(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成真核細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(ix)特征(A)名稱His280Ser/Asp281Val(C)鑒別方法變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(D)其他信息白細(xì)胞介素6受體突變體的273-287位氨基酸序列(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Gln His His Cys Val Ile Ser Val Ala Trp Ser Gly Leu Arg1 5 10 15(4)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假定的否(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成真核細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(ix)特征(A)名稱Ala228Asp/Asn230Asp/His280Ser/Asp281Val(C)鑒別方法變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
(D)其他信息白細(xì)胞介素6受體突變體的222—287氨基酸序列(xi)序列描述SEQ ID NO4Ile Thr Val Thr Ala Val Asp Arg Asp Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr15 10 15Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe20 25 30Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met35 40 45Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile Ser Val Ala Trp Ser Gly50 55 60Leu Arg6權(quán)利要求
1.白細(xì)胞介素-6(IL-6)拮抗劑,其特征在于,它由IL-6α受體可溶形式(sIL-6Rα)組成,所述sIL-6Rα包含在與gp130結(jié)合的界面上的一個(gè)或多個(gè)突變。
2.按照權(quán)利要求1的白細(xì)胞介素-6拮抗劑,其中sIL-6Rα包含在選自Ala228、Asn230、His280和Asp281位置上的至少一個(gè)突變。
3.按照權(quán)利要求1或2的白細(xì)胞介素-6拮抗劑,其中sIL-6Rα包含突變Asn230 Asp(SEQ ID NO1)。
4.按照權(quán)利要求1或2的白細(xì)胞介素-6拮抗劑,其中sIL-6Rα包含突變Ala228Asp/Asn 230 Asp(SEQ ID NO2)。
5.按照權(quán)利要求1或2的白細(xì)胞介素-6拮抗劑,其中sIL-6Rα包含突變His 280 Ser/Asp 281 Val(SEQ ID NO3)。
6.按照權(quán)利要求1或2的白細(xì)胞介素-6拮抗劑,其中sIL-6Rα包含突變Ala 228 Asp/Asn 230 Asp/His 280 SeR/Asp 281 Val(SEQ ID NO4)。
7.按照權(quán)利要求1—6的白細(xì)胞介素-6拮抗劑在研究和制備能夠控制、預(yù)防和治療由異常IL-6活性引起的疾病的藥物中的用途。
8.以上描述、說明的和要求的作為IL-6拮抗劑起作用的可溶性受體及其用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素-6拮抗劑,該拮抗劑的特征在于它由人IL-6受體α的可溶形式(shIL-6Ra)組成,所述shIL-6Ra包含在gp130結(jié)合界面上的一個(gè)或多個(gè)突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述突變存在于選自Ala228、Asn230、His280和Asp281的位置上。這些拮抗劑可以用作能預(yù)防和治療由異常IL-6活性引起的疾病的藥物。圖4顯示與野生型shIL-6Ra的激動(dòng)性質(zhì)比較突變體Ala228Asp/Asn230Asp/His280Ser/Asp281Val的拮抗活性。該拮抗劑可以用于制備預(yù)防、控制和治療由異常IL-6生物活性引起的疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1139933SQ95191457
公開日1997年1月8日 申請(qǐng)日期1995年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月6日
發(fā)明者G·希利博托, C·托怪亞逖 申請(qǐng)人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所