專利名稱：護(hù)理皮膚的化妝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改善皮膚健康狀況和皮膚外觀的化妝方法，本發(fā)明還涉及巖芹酸在制備用于改善皮膚健康狀況和皮膚外觀的局部施用組合物中的應(yīng)用。
皮膚容易受下列多種因素影響而變壞皮膚學(xué)疾病、環(huán)境濫用(風(fēng)、空調(diào)、集中采暖)或正常老化進(jìn)程(即時間老化，其可因皮膚受陽光照射(光老化)而加速)。近來，非常需要開發(fā)化妝品組合物和化妝方法用于改善皮膚健康狀況和皮膚外觀。
消費者逐漸尋求能治療或延遲皮膚時間老化和光老化的可見跡象、例如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過度和老年斑的“抗老化”化妝產(chǎn)品。
消費者還經(jīng)常從化妝品中尋求除抗老化之外的其它好處。“敏感性皮膚”的概念也使消費者需要化妝品用于改善干燥和／或薄而易剝落的敏感性皮膚的外觀和健康狀況以及用于緩和皮膚發(fā)紅和／或炎癥。消費者還需要能夠處理皮膚斑點、丘疹和瑕疵等的化妝產(chǎn)品。
許多人關(guān)心皮膚的色素沉著程度。例如，具有老年斑或雀斑的人們希望這些色素斑能夠變淺些。還有一些人希望降低由陽光照射引起的皮膚發(fā)黑或減輕他們的自然皮膚顏色。為了滿足這些需要，已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來開發(fā)能夠降低黑素細(xì)胞色素產(chǎn)生的產(chǎn)品。然而，迄今為止，已經(jīng)鑒定的物質(zhì)具有不需要的副作用例如皮膚發(fā)炎。
因此，這些物質(zhì)不適合用于化妝，或者他們只能以使皮膚增白效果不能令人滿意的濃度應(yīng)用?？梢钥紤]把不同的增白皮膚物質(zhì)組合來用于降低不利副作用，但這樣可能導(dǎo)致由于相容性作用而引起皮膚增白效果減弱。因此，需要改進(jìn)化妝性增白皮膚產(chǎn)品的效果，特別是這些物質(zhì)不刺激皮膚。
已知脂肪酸例如巖芹酸能夠用于處理頭發(fā)的化妝品制劑。EP116439記載了生發(fā)油含有脂肪酸(例如巖芹酸)來減輕頭皮屑和發(fā)癢以及用于刺激頭發(fā)生長。
EP-A 709084中描述了在化妝組合物中應(yīng)用芫荽子油(富含巖芹酸甘油三酯)來濕潤干燥的皮膚。
我們已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)巖芹酸還有一些未公開的特性，這些特性能在局部應(yīng)用的皮膚化妝組合物中提供以前未公開的皮膚護(hù)理效果。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過把含有巖芹酸或其衍生物的化妝組合物施用于皮膚，可以有效地處理和預(yù)防由時間老化或光老化引起的正常皮膚狀態(tài)例如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過重和老年斑。我們還發(fā)現(xiàn)在化妝組合物中應(yīng)用巖芹酸能夠有利地提供除抗老化之外的其它皮膚效應(yīng)例如降低皮膚敏感性和／或發(fā)炎以及增白皮膚。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是提供化妝方法用于提供至少一種下列皮膚護(hù)理作用處理／預(yù)防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚的膠原沉積；增加皮膚核心蛋白聚糖的產(chǎn)生；增強(qiáng)組織修復(fù)；增白皮膚；緩解皮膚炎癥、發(fā)紅和／或過敏；改進(jìn)皮膚紋理、光滑性和／或結(jié)實性；該方法包括把含有巖芹酸和／或其衍生物的局部用組合物施用于皮膚。
本發(fā)明還涉及巖芹酸和／或其衍生物在用于提供至少一種選自下列的皮膚護(hù)理效果的局部施用組合物中的應(yīng)用處理／預(yù)防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚膠原沉積、增加皮膚中核心蛋白聚糖的產(chǎn)生、增強(qiáng)組織修復(fù)；增白皮膚；增白皮膚；緩解皮膚炎癥、發(fā)紅和／或過敏；改進(jìn)皮膚紋理、光滑性和／或結(jié)實性。
本發(fā)明的方法和巖芹酸的應(yīng)用提供抗老化效果，該效果使皮膚更光滑和更柔軟，彈性更好，皮膚起皺和皮膚老化減少或延遲，并改善皮膚顏色。在皮膚外觀、紋理和健康狀況特別是光亮性、清晰性和通常的年輕外觀方面，均可以達(dá)到通常的改進(jìn)效果。本發(fā)明的方法和用途還有益于緩解和減輕皮膚的致敏和／或發(fā)炎。巖芹酸還可以局部用于人皮膚來降低黑色素產(chǎn)生從而增白其應(yīng)用部位的皮膚。因此，本發(fā)明的方法有利地提供廣泛的皮膚護(hù)理作用。
術(shù)語“處理”在此包括減輕、延遲和／或防止上面描述的皮膚健康狀況例如起皺、老化、光損害和／或炎癥，并通過防止或降低起皺和增強(qiáng)柔韌性、結(jié)實性、光滑性、柔軟性和彈性來通常增進(jìn)皮膚質(zhì)量和改善皮膚外觀。本發(fā)明化妝方法和，巖芹酸和／或其衍生物的用途可能用于處理起皺、老化、光損害和發(fā)炎的皮膚，或者用于治療年輕的皮膚以預(yù)防或降低前面提到的由于正常老化／光老化引起的皮膚惡化。
發(fā)明詳述巖芹酸(下文稱“PA”)是單不飽和長鏈(C18)脂肪酸，化學(xué)式為CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH。
本發(fā)明還涉及含有巖芹酸部分的該游離酸衍生物。優(yōu)選的衍生物包括那些羧基部分被取代的衍生物例如酯(如視黃基酯、甘油三酯、單甘油酯、甘油二酯、磷酸酯)、酰胺(例如神經(jīng)酰胺衍生物)、鹽(例如堿金屬和堿土金屬鹽、銨鹽)；和／或那些來自于C18碳鏈部分被取代的衍生物例如α-羥基和／或β-羥基衍生物。
在甘油三酯衍生物中，包括所有在甘油骨架上PA取代的各種位置異構(gòu)體。該甘油三酯必須含有至少一個PA部分。例如，在甘油骨架可酯化的三個位置中，位置1和2可以被PA酯化，在位置3被另一個脂類酯化；或者，該甘油骨架可以在位置1和3被PA酯化，在位置2被另一個脂類酯化。
因此，富含巖芹酸甘油三酯的油也適合用于本發(fā)明。這樣的油可以市售得到，包括洋芫荽子油、胡蘿卜子油、小茴香油、歐洲蘿卜子油、芫荽子油、雪維菜子油、藏茴香油和芹菜籽油。
當(dāng)術(shù)語“巖芹酸”或“PA”用于本申請說明書時，應(yīng)該明白還包括含有PA部分的衍生物?！癙A”部分指PA衍生物的PA脂肪酰基部分。
根據(jù)本發(fā)明，在局部施用組合物中存在有效量的活性巖芹酸。通常地，為了以最小的代價取得最好的效果，按組合物的重量計，在組合物中活性成分的總含量為0．0001-50％重量、更優(yōu)選0．01-10％重量和最優(yōu)選0．1-5％重量。
皮膚學(xué)可接受載體本發(fā)明所用的組合物還含有皮膚學(xué)／化妝學(xué)上可接受的賦形劑作為活性成分PA的稀釋劑、分散劑或載體。這些賦形劑可以含有皮膚護(hù)理產(chǎn)品通常所用的物質(zhì)例如水、液體或固體潤膚劑、硅油、乳化劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑、粉末和推進(jìn)劑等。
按組合物重量計，所述賦形劑在組合物中的含量通常為5-99．9％、優(yōu)選25-80％，并可在缺乏其它化妝輔料的情況下用于平衡組合物。
任選的皮膚有益物質(zhì)和化妝輔料除含有活性成分PA外，還可以含有其它特別對皮膚有益的活性物質(zhì)例如防曬劑、其它皮膚增白劑和皮膚變褐劑。所述載體還進(jìn)一步包括輔料例如香料、遮光劑、防腐劑、著色劑和緩沖劑。
產(chǎn)品的制備、劑型、用途和包裝為了制備本發(fā)明方法所用的局部施用組合物，可以采取制備皮膚護(hù)理產(chǎn)品的通常方式。通常是按常規(guī)方式將活性組分加到可皮膚用載體中。首先可以把活性成分在一部分水或加入到組合物中的其它溶劑或液體中溶解或分散。優(yōu)選的組合物是水包油或油包水乳劑。
本組合物可以是常規(guī)皮膚護(hù)理產(chǎn)品劑型例如膏霜、凝膠或洗劑等。該組合物還可以是所謂的“洗去”產(chǎn)品例如沐浴膠或淋浴膠，可能含有用于在沖洗時促進(jìn)皮膚粘附的活性成分釋放系統(tǒng)。最優(yōu)選地，產(chǎn)品為“保留(leave-on)”產(chǎn)品在敷用于皮膚后無需故意的沖洗就能用于皮膚的產(chǎn)品。
該組合物可通過任意的合適方式包裝，例如以傳統(tǒng)的方式如廣口瓶、瓶子、管子或滾動條等。
可以每天1次或多次對需要處理的皮膚實施本發(fā)明的方法。通常在3-6個月后可以看出皮膚外觀的改進(jìn)，具體時間取決于皮膚狀況、本發(fā)明方法所用活性成分的濃度、應(yīng)用組合物的量及應(yīng)用頻率。通常地，從合適的容器或涂藥器中把小量組合物例如0．1-5ml敷用于皮膚，然后用手或手指或合適的設(shè)備將其擴(kuò)散和／或摩擦至皮膚。根據(jù)組合物是“保留”或“洗去”產(chǎn)品，可以選擇是否需要沖洗步驟。
為了使本發(fā)明可以更容易地被理解，列出下列實施例，它們僅僅用于舉例說明本發(fā)明。
實施例該實施例顯示巖芹酸的抗老化作用。
實施例1用于對比目的的局部巖芹酸處理后，體內(nèi)皮膚中前膠原-I和核心蛋白聚糖增量調(diào)節(jié)的鑒定已知膠原(主要的基質(zhì)皮膚蛋白)能賦予皮膚拉伸強(qiáng)度。核心蛋白聚糖是一種蛋白多糖，已知其對于控制和校正膠原在皮膚細(xì)胞外基質(zhì)中沉積是非常重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道隨著皮膚的老化和／或光損害，皮膚中膠原和核心蛋白聚糖的含量顯著降低。許多研究顯示隨著老化和／或光損害的增加，皮膚中I型膠原減少(例如Lavker，R．J．Inv．Derm．，(1979)，73，79-66；Griffiths等．N．Eng．J．Med．(1993)329，530-535)。對于核心蛋白聚糖，已經(jīng)顯示在體外的光損害皮膚中，該蛋白多糖的mRNA表達(dá)和表達(dá)太太降低(Bernstein等．Lab．Invest．(1995)72，662-669)。因此，這些皮膚蛋白含量的降低同引起起皺和松馳的皮膚拉伸強(qiáng)度下降是相關(guān)的。
本領(lǐng)域熟知的事實是視黃酸是強(qiáng)效的抗老化活性成分，能夠引起光損害的皮膚修復(fù)。已經(jīng)顯示用視黃酸局部處理皮膚后，通過在皮膚中新的膠原沉積和合成，會引起皺紋的消除和皮膚的修復(fù)(例如，Griffiths等，N．Eng．J．med．(1993)329，530-535)。已經(jīng)廣泛接受的事實是通過應(yīng)用視黃酸增加膠原的含量從而加強(qiáng)皮膚基質(zhì)來提供抗老化／皮膚修復(fù)效果。前膠原I是膠原的前體。由測試化合物引起前膠原I的升高是增加膠原含量的標(biāo)志。
選擇兩組女人進(jìn)行試驗，她們在外側(cè)前臂表面均有相同程度或幾乎相同程度的輕度至中度光損害。用在濕潤基質(zhì)中的0．5％視黃酸(Retinava)提供給她們，同時還提供感覺相似、顏色相同、不含有活性成分的濕潤膏霜(Dermacare)作為安慰劑對照組。對于兩組中的每個參加者，在其一個外側(cè)前臂上敷用Retinova，另一個外側(cè)前臂敷用Dermacare。對于第一組，在其外側(cè)前臂上每天應(yīng)用產(chǎn)品共14周，第二組的外側(cè)前臂上應(yīng)用產(chǎn)品28周。在研究結(jié)束時，從各個前臂的處理區(qū)域取出2個總厚度為4mm的鉆取活組織。對從參加者中取出的活組織進(jìn)行免疫組化分析，鑒定視黃酸處理對皮膚細(xì)胞外基質(zhì)成分核心蛋白聚糖和前膠原-I表達(dá)的作用，將其同安慰劑處理前臂進(jìn)行比較。應(yīng)用下列程序物質(zhì)用于蠟切片的抗體稀釋緩沖液組成為Tris緩沖鹽水(TBS)、3％牛血清白蛋白(BSA)、0．05％TritonX-100和0．05％疊氮化鈉。前膠原-I(氨基末端)的初級抗體來自Chemicon International Inc．(cat# MAB1912，鼠IgG1)，當(dāng)該部分被胰蛋白酶(0．5mg／ml，25分鐘，37℃)預(yù)處理后，把上述前膠原-I以1∶800的稀釋比例應(yīng)用于蠟切片，在4℃的溫度下放置過夜。核心蛋白聚糖來自Biogensis(鼠多克隆)，將其以1∶800的稀釋比例應(yīng)用于蠟切片，在4℃的溫度下放置過夜。把抗大鼠生物素基化次級抗體[來自DAKO(cat#E0468，兔多克隆)]以1∶400的稀釋比例應(yīng)用于蠟切片。把抗兔生物素化次級抗體[來自Amersham(cat#RPN 1004，驢子多克隆)]以1∶400的稀釋比例應(yīng)用于蠟切片。把鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合的堿磷酸酶[來自Zymed(cat#43-4322)]以1∶2500的濃度應(yīng)用。固紅色原來自DAKO(cat#K597)。Gills #3蘇木清核復(fù)染劑[來自Sigma(cat#GHS-3)]過濾，在不稀釋的條件下應(yīng)用。胰蛋白酶來自Sigma(cat#T-7186)，載玻片用來自DAKO的Glycergel(cat#C563)固定。
方法在涂有硅烷的載玻片上固定生物活組織的蠟切片在55℃燒烤18小時。用二甲苯和乙醇脫蠟，移至水中，然后轉(zhuǎn)移至TBS。應(yīng)用DAKA鋼筆劃沿著這些切片劃圈。必要時，按照各個抗體的說明用胰蛋白酶處理該切片用于抗原提取。當(dāng)需要抗原提取時，用0．5mg／ml的胰蛋白酶(Sigma Cat#T-7186)在35℃下培養(yǎng)載玻片25分鐘。然后用TBS洗掉蛋白酶(2×2分鐘)。抗原提取后，如果必要，或者直接在洗掉后，應(yīng)用次級抗體宿主血清在TBS／0．5％BSA／0．1％疊氮化鈉中的5％溶液作為阻斷溶液來阻斷非特異性抗體結(jié)合，使該過程在濕潤的腔室中至少進(jìn)行20分鐘。引出剩余的阻斷溶液，但不讓這些切片干燥。然后在濕潤腔室中，在4℃下用初級抗體(如上所述適當(dāng)稀釋的)培養(yǎng)該切片過夜。然后從這些切片中倒掉抗體，不讓這些部分干燥。然后用TBS洗滌載玻片以除去未結(jié)合的初級抗體(經(jīng)1分鐘洗滌后再進(jìn)行3次5分鐘洗滌)，然后在濕潤腔室中室溫下用合適的次級抗體(如上所述適當(dāng)稀釋的)培養(yǎng)1小時。然后，不讓這些切片干燥的情況下從載玻片上引出抗體溶液。為了除去未結(jié)合的次級抗體，在TBS中洗滌載玻片，經(jīng)1分鐘洗滌后再進(jìn)行4×5分鐘洗滌。對于生物素化的次級抗體，用鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合物在37℃下培養(yǎng)這些切片45分鐘，然后在TBS中洗滌，以除掉未結(jié)合的鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合物。加入色原，觀測顏色變化以避免過度著色。然后對這些切片進(jìn)行復(fù)染色，再封固。
用光學(xué)顯微鏡觀察免疫組化著色切片，確定視黃酸(Retinova)和安慰劑(Dermacare)處理部位之間前膠原-I和核心蛋白聚糖表達(dá)上的區(qū)別。
分析顯示如下列表1所示，在光損害的皮膚中，局部應(yīng)用視黃酸(Retinova)后，前膠原-I和核心蛋白聚糖明顯增量調(diào)節(jié)。
表1體內(nèi)皮膚中用視黃酸處理對前膠原-I和核心蛋白聚糖表達(dá)的影響
因此，多余的細(xì)胞基質(zhì)組份前膠原1和核心蛋白聚糖是視黃酸誘導(dǎo)的皮膚修復(fù)的明顯識別標(biāo)志。
在人皮膚成纖維細(xì)胞中測定前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的步驟皮膚成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液的制備以1000細(xì)胞／cm2的密度把初級人包皮成纖維細(xì)胞第2代(P2)接種于12孔培養(yǎng)板中，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中并在5％二氧化碳和4％氧氣的氣氛下維持24小時。然后，用不含血清的DMEM洗滌細(xì)胞，再在不含血清的新鮮DMEM中培養(yǎng)60小時。再用不含血清的DMEM洗滌該成纖維單層細(xì)胞。在最終體積為0．4毫升／孔不含血清的新鮮DMEM中，以一式三份把試劑和載體對照加入到細(xì)胞中，再培養(yǎng)24小時。立即分析該成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基或者將其在液氮中突然冷凍，在-70℃下儲存以便進(jìn)一步分析。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后把根據(jù)斑點印跡分析得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞數(shù)目。
在皮膚成纖維條件培養(yǎng)基中對前膠原-I和核心蛋白聚糖的斑點印跡分析對于用載體(作為對照)或測試試劑處理的皮膚成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基樣品，由用20mM二硫蘇糖醇(200mM儲存液的1∶10的稀釋液)和0．1％十二烷基硫酸鈉(10％儲存液的1∶100稀釋液)進(jìn)行補(bǔ)充，充分混合，在75℃下培養(yǎng)2分鐘。分析標(biāo)準(zhǔn)是這樣生成的在175cm2燒瓶中以1000細(xì)胞／cm2的密度接種成纖維細(xì)胞，如上所述，將其在不含血清的DMEM中培養(yǎng)，將從中得到的純成纖維條件培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋。然后應(yīng)用來自Bio-Rad的96孔Bio-Dot儀器，按照制造商的說明，一式三份地把分析樣品應(yīng)用于Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜的預(yù)濕潤片中。在每個孔中大約應(yīng)用200μl培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基在重力作用下透過膜(30分鐘)過濾，然后用PBS(200μl)洗滌膜兩次。把這些PBS洗滌物在重力作用下通過膜過濾(2×15分鐘)。再把Bio-Dot儀器連接到真空多支管中，在抽吸下用PBS進(jìn)行第三次(最后一次)洗滌。拆開儀器，在4℃下，按照需要移開膜，并快速切開，置于封閉緩沖液中靜置過夜。對于用于核心蛋白聚糖分析制備的膜，用3％(w／v)BSA／0．1％(v／v)吐溫20的PBS液封閉該膜；而對于用于前膠原-I分析所用的膜，則用脫脂干奶粉／0．05％吐溫20的PBS液封閉膜。次日，應(yīng)用人前膠原-I(MAB1912；鼠單克隆；Chemicon Int．Inc．，Temecula，CA)的或者人核心蛋白聚糖的(鼠單克??；Biogensis)的初級抗體的1∶1000稀釋液在室溫對該膜探測2小時。然后用TBS／0．05％吐溫20(3×5分鐘)對膜進(jìn)行洗滌，然后在室溫下，將其置于125I-結(jié)合的抗大鼠或抗兔F(ab＇)2片斷(Amersham)的1∶1000稀釋液中培養(yǎng)1小時。然后，再次用TBS／吐溫20洗滌(3×5分鐘)該Immbilon條，再讓其在室溫下的空氣中干燥。把干燥膜包裹于玻璃紙中，將其置于分子動態(tài)儲存磷屏上16-18小時。最后，通過phosphorimager(Molecular DynamicsPhosphorimager SF)用ImagequantTM軟件掃描。通過電腦輔助成象分析應(yīng)用ImageQuantTM的定量工具評價點強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)化至細(xì)胞數(shù)，把載體處理的對照值定為100任意單位，相對于該值來確定不同測試試劑對核心蛋白聚糖和前膠原-I合成的作用。
測試下表2顯示巖芹酸對人皮膚成纖維細(xì)胞的前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的作用及其應(yīng)用的數(shù)量。為了將這些結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，以載體處理的對照值100任意單位作為基準(zhǔn)來確定測試物質(zhì)的作用。為了對比，還用視黃酸進(jìn)行了試驗以確定其對人皮膚成纖維細(xì)胞中核心蛋白聚糖合成的作用。在試驗中所用試劑的濃度對細(xì)胞存活率沒有影響。
表2巖芹酸對前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的作用處理 前膠原-I 核心蛋白聚糖對照組(載體) 100 100巖芹酸(10μM) 118．4±48．6 153．0±19．1(n=3)(p=0．01，n=4)表2的結(jié)果顯示同對照組相比，巖芹酸明顯增加人皮膚成纖維細(xì)胞中的前膠原-I和核心蛋白聚糖的合成。
在皮膚中，核心蛋白聚糖的含量同皮膚的健康狀況和外觀改善有關(guān)。增加皮膚中核心蛋白聚糖的含量對于控制和糾正皮膚膠原(皮膚膠原同許多皮膚效應(yīng)例如皺紋消失和光損害皮膚的皮膚損傷有關(guān))的沉積是非常重要的。
用視黃酸(1μm)的對比試驗顯示相對于100任意單位的載體處理的對照值相比，核心蛋白聚糖增量調(diào)節(jié)，其值為138±14．0(p=0．035，n=4)。令人驚奇地，這些數(shù)據(jù)還進(jìn)一步表明在人皮膚成纖維細(xì)胞中，巖芹酸對核心蛋白聚糖合成增量調(diào)節(jié)的幅度超過了標(biāo)準(zhǔn)抗老化皮膚修復(fù)活性視黃酸的影響值。
實施例2本實施例測量巖芹酸的抗刺激功能。
角質(zhì)形成細(xì)胞SDS生存能力測試方法學(xué)在96孔培養(yǎng)皿中用角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，培養(yǎng)至大約80％融合時，培養(yǎng)液用不含氫化可的松的KGM替換，培養(yǎng)24-28小時。然后，在巖芹酸的存在下或不存在下，應(yīng)用能夠產(chǎn)生大約50％細(xì)胞存活能力濃度(2μ／ml)的十二烷基硫酸鈉(SDS)處理細(xì)胞。然后應(yīng)用巖芹酸(濃度如表3所示)對細(xì)胞用藥。對照組不含有任何SDS或測試化合物。經(jīng)培養(yǎng)24小時后，除去培養(yǎng)基，用中性紅方法確定存活能力。應(yīng)用該方法，在含有25μg／ml的中性紅的KGM中培養(yǎng)該細(xì)胞3小時，然后除掉培養(yǎng)基，再用1ml 1％(v／v)乙酸、50％(v／v)乙醇提取細(xì)胞30分鐘。測定提取物在562nm處的吸收度，參照不含SDS并且不含測試化合物的對照孔評價生存能力。得到的結(jié)果如下表3所示表3處理組角質(zhì)形成細(xì)胞的％存活性SDS(μg／ml) PA(μM)平均 SD n0 0 100 11．982 0 55．8 18．382 0．1 94．5 16．582 1． 0 84．1 16．882 1085．8 11．98通過1way ANOVA，應(yīng)用Student-Neumann-Kuels多次對比檢驗，同單獨的2μg／ml SDS值相比，所有巖芹酸(PA)值顯示明顯增加的生存能力，p＜0．05。
該方法顯示刺激劑的角質(zhì)形成細(xì)胞毒性同試劑在體內(nèi)的刺激作用有關(guān)(Lawrence，JN，Starkey，S．，Dickson，F(xiàn)M ＆ Benford，DJ．)，應(yīng)用人和大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物以評價皮膚刺激能力。Toxitol． Invitro．10，331-340(1996)．)。因此，我們在此證明應(yīng)用巖芹酸處理能夠顯著降低SDS對角質(zhì)形成細(xì)胞的毒性作用，因此其具有抗刺激功能。
實施例3本實施例顯示巖芹酸能夠有效地降低由體外角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的PGE2(前列腺素E2)。
角質(zhì)形成細(xì)胞PGE2分析在96孔培養(yǎng)皿中用角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM)培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，培養(yǎng)至大約80％融合時，培養(yǎng)液用不含氫化可的松的KGM替換，培養(yǎng)24-28小時。然后，對細(xì)胞給予巖芹酸，其量如表下表4所示。在對照組細(xì)胞中不加入巖芹酸。用巖芹酸(或者，對于對照組，不用巖芹酸)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。在培養(yǎng)結(jié)束時，收集培養(yǎng)基，應(yīng)用市售PGE2試劑盒(Amersham，Buckinghamshire，英國)通過酶聯(lián)免疫檢測檢測培養(yǎng)基中促炎因子PGE2的基本釋放。
然后，按照上面實施例2描述的中性紅攝取方法，測試細(xì)胞的生存能力。通過應(yīng)用測試濃度的巖芹酸處理，沒有發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞存活能力有副作用。
通過測試化合物降低PEG2基本分泌的能力(同對照組相比)，確定測試化合物抗炎作用。應(yīng)用Student’s t-檢驗，確定統(tǒng)計學(xué)有效性。得到的結(jié)果總結(jié)于下列表4。
表4處理 角質(zhì)形成細(xì)胞PGE2含量(pg／孔)平均 SDn對照組 197．9 50．2 4PA 0．1μM 150．1 55．7 4PA 1μM117．8 22．6 4通過1way ANOVA，應(yīng)用Student-Neumann-Kuels多次對比檢驗，統(tǒng)計分析顯示0．1μM和1μM的巖芹酸(PA)明顯(p＜0．05)降低未刺激角質(zhì)形成細(xì)胞中PGE2的釋放。
PGE2是公知的皮膚炎癥介質(zhì)，參見Greaves等“Prostagludus，白三烯、磷酯酶、血小板活化因子和細(xì)胞因子人皮膚炎癥的綜合治療途徑”Arch．Dermatol．Res．(1988)[增刊]533-541。
該結(jié)果顯示巖芹酸(PA)處理的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生較少的促炎前列腺素PGE2，因此降低皮膚的發(fā)炎可能性。
實施例4本實施例測定巖芹酸對降低皮膚成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。
成纖維細(xì)胞PGE2和ICAM測試人皮膚成纖維細(xì)胞中細(xì)胞間粘附分子(ICAM)和PEG2的產(chǎn)生可以通過炎癥刺激劑PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯phorbal myristateacetate)來誘導(dǎo)。PMA代表外部應(yīng)激物，其誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。該模型通常用于體內(nèi)炎癥模型。
以1000細(xì)胞／孔的密度把初級人包皮成纖維細(xì)胞第2代(P2)接種于96孔培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中并在5％二氧化碳和4％氧氣的氣體下維持24小時。一式三份把巖芹酸加入到新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM)的二甲基亞砜(DMSO，終濃度1％)液中，再培養(yǎng)24小時。把佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)(Sigma)加入到培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。對照組不含有測試化合物并且不含有任意PMA。然后，立即按照下面描述分析成纖維細(xì)胞／培養(yǎng)基，或者在液氮中突然冷凍，并在-70℃下儲存，用于以后分析。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后把根據(jù)斑點印跡分析得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞數(shù)目。
前列腺素E2(PGE2)分析輕輕搖蕩培養(yǎng)皿后，取50μl培養(yǎng)基進(jìn)行PGE2分析。用Biotrak PGE2免疫分析試劑盒(Amersham，UK)測定培養(yǎng)基中PGE2含量。分析的基礎(chǔ)是對于限定量固定PGE2特異性抗體，樣品中未標(biāo)記PEG2和固定量辣根過氧化物酶標(biāo)記的PGE2之間的競爭。按照同一時間得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定未標(biāo)記樣品PGE2的濃度。
ICAM-1分析棄去培養(yǎng)基，用DulbeccoPBS洗滌細(xì)胞。對于洗滌的細(xì)胞，以3分鐘時間把150μl 0．1％Triton X-100(Sigma)加入到細(xì)胞膜中的提取物ICAM中。把提取物轉(zhuǎn)移至Eppendoff離心管中，在1000g下離心2分鐘以除掉細(xì)胞碎片。取100μl上清液用于ICAM分析。應(yīng)用市售免疫酶分析試劑盒(R&D系統(tǒng))分析可溶性ICAM-1。按照平行標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中ICAM-1的濃度。
從PGE2和ICAM分析得到的結(jié)果如下表5所示。
表5巖芹酸對人皮膚成纖維細(xì)胞中PMA-誘導(dǎo)的ICAM和PGE2產(chǎn)生的作用處理 N ICAM(ng／ml)PGE2(pg／ml)對照組 4 3．07+0．54 32±6PMA(10nM)-處理 4 14．42±1．86 2371±241PMA+PA(0．1μM) 4 8．64±0．89* 500±127*PMA+PA(1μM) 4 7．71±0．66* 486±93*PMA+PA(10μM)4 7．39±0．14* 233±139*PMA+PA(100μM) 4 6．68±1．35* 117±39**同PMA處理細(xì)胞得到的數(shù)值對比，p＜0．001。
上述結(jié)果顯示通過產(chǎn)生所測定的前列腺素E2(PGE2)，炎癥刺激劑例如PMA(Phorbol myristyl acetate)攻擊細(xì)胞使炎癥反應(yīng)增加。巖芹酸，即使?jié)舛仍?．1μm時，也明顯降低通過測定PGE2產(chǎn)生所測得的炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明巖芹酸具有良好的抗炎活性。
上述結(jié)果還顯示用PMA攻擊細(xì)胞引起ICAM產(chǎn)生增加。巖芹酸降低細(xì)胞間粘附分子(ICAM)(炎癥的另一個指標(biāo))的產(chǎn)生。因此，這些結(jié)果進(jìn)一步顯示巖芹酸具有良好的抗炎效應(yīng)。
實施例5皮膚增白測定方法*細(xì)胞培養(yǎng)在75cm2的培養(yǎng)瓶中，應(yīng)用補(bǔ)充L-谷氨酰胺(4mM)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基(ICN-Flow，cat．no．12-60-54)，在含5％CO2的空氣下，培養(yǎng)B16-F1小鼠黑素瘤細(xì)胞(美國典型物培養(yǎng)中心，Maryland，USA)。把細(xì)胞每周傳代兩次。
*色素沉著分析在96孔微量滴定培養(yǎng)皿中，以5000細(xì)胞／孔的密度接種subconfluent B16細(xì)胞，在含有10％胎牛血清和1％青霉素／鏈霉素但不含酚紅的DMEM中，在37℃和5％CO2的氣體下培養(yǎng)過夜。24小時后，培養(yǎng)基用含有測試物質(zhì)或賦形劑對照物的新鮮培養(yǎng)基替換。將細(xì)胞培養(yǎng)72小時，此時可在對照組孔中看見黑色素。然后，把從每個孔中得到的含黑色素的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到清潔的96孔培養(yǎng)皿中，通過應(yīng)用微量培養(yǎng)板分光光度計(Dynatech MR5000)讀取其在530nm處的吸收度來定量分析，并校正新鮮培養(yǎng)基的基準(zhǔn)吸收度。因為校正的吸收正比于黑色素濃度，因此皮膚增白試驗物質(zhì)的色素沉著百分比可以按照下式計算％色素沉著=(OD530檢測／OD503參比)×100％其中OD530檢測和OD503參比分別表示從含有測試物質(zhì)的孔中得到的培養(yǎng)基平均校正吸收度和從不含有測試物質(zhì)的孔中得到的平均培養(yǎng)基校正吸收度。然后，由測試物質(zhì)引起的百分比抑制值為100-％色素沉著*細(xì)胞存活測試抑制黑色素生成可以降低黑色素的產(chǎn)生，但黑色素的產(chǎn)生還受細(xì)胞毒性或細(xì)胞增生影響。為了測試其釋放出現(xiàn)，用中性紅染料吸附測試細(xì)胞存活能力。中性紅是水溶性染料，其能夠通過完整的血漿膜，并濃集于完整細(xì)胞的溶酶體中。中性紅染料的總攝取同培養(yǎng)物中生存細(xì)胞數(shù)成正比。
把用于黑色素分析的培養(yǎng)基從微量滴定孔中除去后，立即把200μl新鮮預(yù)熱的中性紅染料(ex．Sigma，UK，Cat．Nr 2889)的25μg/ml培養(yǎng)液應(yīng)用于細(xì)胞，并培養(yǎng)3小時。通過反轉(zhuǎn)培養(yǎng)板除掉沒有被細(xì)胞吸收的染料，輕叩吸水紙。用200μl PBS洗滌細(xì)胞，然后除去洗滌液。加入100μl溶劑(50％H2O、49％EtOH、1％乙酸)。20分鐘后，在室溫下，在微滴培養(yǎng)皿搖蕩器上把每個培養(yǎng)皿搖動5秒鐘。如上所述，測定吸收度。
測試下表6顯示所測定皮膚增白測試物質(zhì)及其用量。如上所述，由測試物質(zhì)引起的黑色素生產(chǎn)百分比抑制反映于表中。
小于100％黑色素對照組的值顯示黑素生成的抑制。因此，下表3中的結(jié)果顯示PA抑制黑素的生成。
在試驗中，用DMEM稀釋測試物質(zhì)，其量如下表5所示。
表6培養(yǎng)基中的黑色素 中性紅細(xì)胞存活能力處理 ％對照 S．D． t-測試 ％對照S．D． t-測試相對于對照相對于對照對照組 100 8．5 100．0 4．60．1％巖芹酸 19．3 1．2**(0．000)1．0 0．4**(0．000)0．04％巖芹酸 3．9 0．7**(0．000)69．98．8**(0．000)0．02％巖芹酸 55．3 18．2 **(0．000)103．1 3．9**(0．082)0．013％巖芹酸 40．4 10．7 **(0．000)105．2 4．1(0．006)0．01％巖芹酸 79．5 8．6**(0．000)104．8 3．9*(0．009)Student’s t-測試**p＜0．01；*p＜0．05(n=4)實施例6下列配方描述適合于本發(fā)明方法和用途的水包油膏霜。顯示的百分比是按組合物重量而計的。
wt％礦物油 4巖芹酸(三甘油酯) 1．15Brij 56* 4Alfol 16RD 4三乙醇胺 0．75丁烷-1，3-二醇 3黃原膠 0．3香料 適量丁化羥基甲苯 0．01水 加至100*Brij 56為十六烷醇POE(10)Alfol 16RD為十六烷醇實施例7下列制劑描述本發(fā)明的乳膏化學(xué)全名或CTFA名稱商品名 重量百分比PA甘油三酯 2．0EDTA二鈉 Sequesterne Na2 0．05硅酸鋁鎂 Veegum Ultra 0．6對羥基苯甲酸甲酯 Methyl Paraben0．15二甲基硅油DC Antifoam Emulsion 0．011，3-丁二醇 1，3-丁二醇 3．0羥乙基纖維素 Natrosol 250HHR 0．5甘油，USP 甘油USP 2．0黃原膠Keltrol 1000 0．2三乙醇胺 三乙醇胺(99％)1．2硬脂酸Pristerene 4911 3．0對羥基苯甲酸丙酯NFPropylparaben NF 0．1氫化硬脂酸甘油酯 Naturechem GMHS 1．5
十八烷醇 Lanette 18 DEO1．5棕櫚酸異十八烷基酯Protachem ISP 6．0C12-15醇辛酸酯Hetester FAO 3．0二甲聚硅氧烷 Silicone Fluid 200(50cts) 1．0膽固醇NF Cholesterol NF0．5硬脂酸脫水山梨糖醇酯 硬脂酸脫水山梨糖醇酯 1．0丁化羥基甲苯 Embanox BHT 0．05乙酸生育酚酯 維生素E乙酸酯 0．1PEG-100硬脂酸酯 Myrj 59 2．0硬脂酰基乳酸鈉Pationic SSL 0．5羥基辛酸 羥基辛酸 0．1棕櫚酸視黃酯 維生素A棕櫚酸酯 0．06α-紅沒藥醇 α-紅沒藥醇 0．2水，DI適量至100當(dāng)用于經(jīng)老化或光老化損害的皮膚時，上面實施例6和實施例7的局部用組合物均通過有效的化妝處理用于增白皮膚和／或改善起皺、老化、光損害和／或刺激性皮膚的外觀，當(dāng)用于青年皮膚時，用于防止或延遲這種損害變化。這些組合物可以通過常規(guī)方式制備。
權(quán)利要求
1．提供至少一種選自下列皮膚護(hù)理效應(yīng)的化妝方法，所述皮膚護(hù)理效應(yīng)選自處理和／或預(yù)防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚中膠原的沉積，促進(jìn)皮膚中核心聚糖蛋白的生成，增強(qiáng)組織修復(fù)；增白皮膚；緩和皮膚的刺激、發(fā)紅和／或致敏，增強(qiáng)皮膚紋理、光滑性和／或結(jié)實性；該方法包括把含有巖芹酸和／或其衍生物的局部組合物應(yīng)用于皮膚。
2．巖芹酸和／或其衍生物在局部組合物中的應(yīng)用，所述的局部用組合物用于提供至少一種下列皮膚護(hù)理功能，選自處理和／或預(yù)防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚中膠原的沉積，促進(jìn)皮膚中核心聚糖蛋白的生成，增強(qiáng)組織修復(fù)；增白皮膚；緩和皮膚的刺激、發(fā)紅和／或致敏，增強(qiáng)皮膚紋理、光滑性和／或結(jié)實性。
全文摘要
通過把含有巖芹酸和/或其衍生物的組合物局部應(yīng)用來提供一種用于治療老化、起皺和/或光損害皮膚的化妝方法。所述方法還降低皮膚刺激并且增白皮膚。
文檔編號A23D7/015GK1293566SQ99804114
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月16日
發(fā)明者S·阿拉盧夫, K·E·巴雷特, A·M·布林克, F·W·凱恩, M·R·格林, H·L·胡, K·伊瓦塔, T·E·亞努爾里奧, K·A·奧特, L·R·帕蘭克爾, J·R·波維爾, A·V·羅林斯, J·S·羅杰斯, U·桑塔納姆, A·瓦特金森, R·L·溫考夫 申請人:尤尼利弗公司