用于皮膚護理的組合物及其醫(yī)藥組合與其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明關于一種用于皮膚護理的組合物的制備方法，尤指一種由廝帶組織培養(yǎng)而 獲得含有特定組份的組合物的制備方法；本發(fā)明亦關于一種用于皮膚護理的組合物，其具 有刺激皮膚膠原蛋白增生的效果。
【背景技術】
[0002] 現(xiàn)有技術中，是藉由培養(yǎng)上皮細胞和間質干細胞等方式W獲得干細胞因子（stem cell factor, SCF)、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)、表 皮生長因子（epidermal growth facto;r，EGF)及類膜島素生長因子（insulin-l;Lke growth factor, IG巧等生長因子，其缺點在于一般冷凍需漸進降溫，相當耗時，且在后續(xù)培養(yǎng)過程 中，培養(yǎng)基所含的鹽類會造成對皮膚毛發(fā)的刺激性。

【發(fā)明內容】

[0003] 鑒于現(xiàn)有技術未使用凍融循環(huán)方式而導致產量較低、且無同時進行濃縮與去鹽類 的步驟W及整體步驟較為繁復耗時等缺點，本發(fā)明提供一種用于皮膚護理的組合物的制備 方法，該方法是通過液態(tài)氮冷凍解凍循環(huán)方式破壞細胞并收集細胞裂解液（cell lysate)， W獲得更多的多膚混合物（polyp巧tide or protein cocktail),并經由濃縮去鹽W獲得 特定分子量的組合物。
[0004] 為達上述目的，本發(fā)明提供一種用于皮膚護理的組合物的制備方法，其包含：提供 豬廝帶（umbilical cord)組織；W沖洗液沖洗該豬廝帶組織，使血球細胞和體液從該豬廝 帶組織中移除；由該豬廝帶組織分離細胞并進行繼代培養(yǎng)W獲得細胞激素；將該細胞及該 細胞激素進行凍融循環(huán)至少2次，W獲得多膚混合物；將該多膚混合物濃縮去鹽，W獲得組 合物，其中該組合物的分子量大于3000道爾頓（dalton，化）。 陽0化]依據(jù)本發(fā)明，"沖洗液"如此處所述是指對于豬廝帶組織為等張的溶液；優(yōu)選的所 述沖洗液是90%氯化鋼溶液或憐酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution, PB巧。
[0006] 依據(jù)本發(fā)明，"分離細胞"如此處所述是指將豬廝帶切成非常小的碎片W形成廝帶 碎片，并將4塊至6塊廝帶碎片放置培養(yǎng)皿中，其培養(yǎng)皿中包括10毫升（ml)的生長培養(yǎng)基 (含有a -MEM W及10 %胎牛血清（fetal bovine serum, FB巧），置于恒溫容器培養(yǎng)10天 后去除廝帶碎片，且每周加兩次3ml培養(yǎng)基，其中恒溫容器是指二氧化碳（C〇2)培養(yǎng)箱（含 有5% C〇2)，從而獲得細胞。
[0007] 依據(jù)本發(fā)明，"繼代培養(yǎng)"如此處所述是指當細胞生長至高密度時，即進行收集細 胞，并經稀釋后分殖至新的培養(yǎng)皿中，W降低細胞密度并維持細胞生長，其稀釋比例依細胞 種類而異。
[0008] 依據(jù)本發(fā)明，"凍融循環(huán)"如此處所述是指將細胞及其細胞激素放置于液態(tài)氮中冷 凍，然后再將細胞取出至室溫中融化，反復多次而達到破壞細胞膜的效果。如本案所例示， 將含有細胞的冷凍管直接浸置于液態(tài)氮中，再將含有細胞的冷凍管由液態(tài)氮中取出并置于 37°C水浴解凍，重復W上步驟循環(huán)至少2次，并將破裂的細胞于1000 G離屯、15分鐘至20分 鐘。
[0009] 依據(jù)本發(fā)明，"濃縮去鹽"如此處所述是指將多膚混合物放置于過濾裝置中，并經 由離屯、及去除上清液，使多膚混合物達到濃縮并去除鹽類的效果。如本案所例示，將多膚混 合物置于超濾裝置或離屯、設備，W減少多膚混合物的體積、增加濃度W及去除雜質（如鹽 類），W獲得一組合物，該組合物的分子量大于3000道爾頓（dalton，化）。
[0010] 優(yōu)選的，所述組合物包含一種或多種選自由堿性成纖維細胞生長因子化asic fibroblast growth factor, bFGF)、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子 0-1 (transforming growth factor beta-l，TGF-0 I)及其 組合所組成的組。
[0011] 優(yōu)選的，在所述的由豬廝帶組織分離細胞W進行繼代培養(yǎng)并獲得細胞激素的步驟 中，是將分離所得的細胞置于不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天至18天，W獲得細胞激素。
[0012] 優(yōu)選的，所述的由豬廝帶組織分離細胞W進行繼代培養(yǎng)并獲得細胞激素的步驟 中，是將分離所得的細胞置于不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12天，W獲得細胞激素。
[0013] 依據(jù)本發(fā)明，"豬廝帶組織"如此處所述是指來自無特定病原（specific pathogen free, SP巧豬。
[0014] 本發(fā)明又提供一種W前述制備方法所獲得的的組合物，該組合物具有刺激皮膚膠 原蛋白增生的效果。
[0015] 依據(jù)本發(fā)明，"刺激皮膚膠原蛋白增生"如此處所述是指如本發(fā)明實施例所例示， 該組合物使膠原蛋白相較于控制組增生0. 5倍至3. 5倍。
[0016] 本發(fā)明再提供一種醫(yī)藥組合物，其包含有效劑量的前述組合物W及其醫(yī)藥可接受 的溶劑及/或賦形劑。
[0017] 優(yōu)選的，所述的有效劑量的組合物是每毫升0. 05納克（ng/ml)至20ng/ml。
[0018] 依據(jù)本發(fā)明，"醫(yī)藥可接受的溶劑及/或賦形劑"如此處所述是指任意可做為人類 或動物內服或外用的溶劑，例如酒精-水共溶劑、水、生理食鹽水；更佳的，所述的醫(yī)藥可接 受的溶劑及/或賦形劑是水或生理食鹽水；其中溶劑加入的量，W能維持組合物的有效劑 量為原則。
[0019] 本發(fā)明所述的制備方法是藉由不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞特定天數(shù)W獲得細胞 激素，并經由液態(tài)氮重復凍融W破壞細胞，W獲得更多的多膚混合物，再經由濃縮去鹽W獲 得特定分子量的組合物，其中該組合物具有刺激皮膚膠原蛋白增生的效果。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明的組合物用于細胞增殖實驗的柱狀圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明的組合物用于MTS實驗的柱狀圖。
[0022] 圖3為本發(fā)明的組合物用于傷口愈合實驗的細胞圖，其中圖3 (a)中的DO表示實 驗的第0天，即于含有細胞的培養(yǎng)盤中劃一條線；圖3化）中的D3表示實驗的第3天，SFM 為不含血清的培養(yǎng)基（serum化ee medium);圖3(c)及圖3(d)分別表示W(wǎng)本發(fā)明的組合 物（濃度分別為0. 55ng/ml及0. llng/ml)加入培養(yǎng)基后培養(yǎng)3天。
[0023] 圖4為本發(fā)明的組合物用于促進膠原蛋白生成實驗的柱狀圖，其中W bFGF作為橫 坐標并作為稀釋測試的依據(jù)。
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明將由下列的實施例做為進一步說明，運些實施例并不限制本發(fā)明前面所掲 示的內容。本領域技術人員可W做些許的改良與修飾，但不脫離本發(fā)明的范疇。
[0025] 制備例1由豬廝帶分離細胞
[00%] 提供豬廝帶，并將豬廝帶W 75 %乙醇清洗20秒至30秒，然后W憐酸鹽緩沖溶液 (phosphate buffered saline, PB巧清洗，再將廝帶切成3至4等份置于已滅菌的培養(yǎng)盤 中。W手術刀或綴子沿廝帶靜脈將廝帶打開，并將廝帶W兩綴子將廝帶拉開，小屯、將動脈移 除W避免任何血液潑瓣至華通氏膠（Wharton's jelly,即廝帶內的膠狀結締組織），同時將 靜脈一并移除。將華通氏膠塊從線羊膜（cord amnion)移除并置于新鮮且含有a-MEM的 培養(yǎng)皿中W保持其潤濕。接著W外科剪刀將廝帶切成非常小的碎片W形成廝帶碎片，并將 4-6塊廝帶碎片放置培養(yǎng)盤中，其培養(yǎng)盤中包括10毫升（ml)的生長培養(yǎng)基（含有Q-MEM W及10 %胎牛血清（fetal bovine serum, FB巧），并置于C〇2培養(yǎng)箱（含有5 % CO 2)。每周 加兩次3ml培養(yǎng)基。10天后將廝帶碎片移除，并W PBS洗涂后加入新鮮的培養(yǎng)基，使細胞培 養(yǎng)至80 %至90 %滿，并進行繼代培養(yǎng)W增殖細胞。
[0027] 制備例2繼代培養(yǎng)細胞
[0028] 藉由真空抽吸器吸除培養(yǎng)基，并W 5ml PBS清洗培養(yǎng)盤中的細胞。再次移除PBS， 并將3ml且濃度為0. 25%的膜蛋白酶（trypsin)-EDTA加到各培養(yǎng)盤中；將培養(yǎng)盤放置在 37°C、5分鐘后。將分離的細胞收集于15ml離屯、管中，W 400G離屯、5分鐘后，去除上清液并 加入2ml培養(yǎng)基。藉由移液管將細胞重新懸浮，并吸取10微升（y 1)細胞與10 y 1剛果藍 (trypan blue)混合，且W自動細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。
[00巧]制備例3制備細胞激素（巧tokines)
[0030] 為產生細胞激素，首先將制備例2所得的細胞接種