專利名稱：：被孢霉的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及被孢霉。被孢霉(Mortierella)，一種纖維狀霉菌，具有工業(yè)價值，因為其至少有一部分成員產(chǎn)生含有多聚不飽和脂肪酸(尤其是花生四烯酸)和其它可以被人體代謝成為多聚不飽和脂肪酸(如γ-亞麻酸)殘基的脂類。當作為營養(yǎng)的補充物使用時，認為這些脂類和(或)從此衍生出來的這些酸對人體的健康有利。已經(jīng)有人提議在嬰兒乳粉(用于人類幼兒的合成奶粉)中加入這些脂類和(或)酸，目的是使其更接近于人類的母乳。這些酸、脂類或其有機體本身可以被食用，然后其多聚不飽和脂肪酸通過正常的消化過程變得可以被利用。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中被孢霉傾向于黏附在設備的表面。因此，攪拌器可能會被真菌的生物體中纏繞以致變得相對無效，而且管道可能會被阻塞。目前我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種形式的被孢霉(“理想的有機體”)，其基本上不受這一問題的干擾。顯微鏡檢顯示該被孢霉的纖維通常傾向于高度纏繞，以至通常不可能為了量化形態(tài)學上的特性，而將一個個體與另一個個體區(qū)別開來。然而，非纏繞的末端從纏繞的團塊中伸展出來，對它們的觀察顯示該理想的有機體比相應已知的有機體具有更高度的分支。在以下的步驟中可以顯示出相應于更高程度的分支，理想的有機體比已知的變體具有更緊密的形態(tài)。未知的是該理想的有機體為什么或如何更不傾向于黏附到固體表面上。為了鑒定被孢霉中理想的株系，可以在可比較的條件下、在液體培養(yǎng)和平板培養(yǎng)物中培養(yǎng)多個株系。表面皿中的營養(yǎng)培養(yǎng)基可以與液體培養(yǎng)中所使用的不同。就理想的有機體而言，在這種平板培養(yǎng)的一段時間后，被覆蓋的面積極大地小于其它具有類似的液體培養(yǎng)生長速度的有機體。被理想的有機體覆蓋的面積相比于被一種已知的在液體培養(yǎng)物中以類似的速度生長的被孢霉株系所覆蓋的面積，代表性的是小于一半，優(yōu)選的是小于四分之一。形態(tài)學可以更普遍地作為一種形態(tài)學指標進行量化，其中M=Krμmax]]>其中Kr是在培養(yǎng)皿中的平均徑向擴張，以μm表示，μmax是logθ2除以以小時計的倍增時間(即，在無約束的生長條件下(即其以最大速度生長)干細胞重量倍增所需要的時間)，在液體培養(yǎng)物中以及在相同的溫度下使用適合組合物的液體培養(yǎng)物的培養(yǎng)基濃度(gl-1)(NH4)2SO43.0MgSO4.7H2O1.0K2SO41.3H3PO40.75ml酵母自溶產(chǎn)物(BioSpringer)3.0葡萄糖45.0微量元素溶液1.0(組合物MnSO4.4H2O40gl-1ZnSO4.7H2O50gl-1CuSO4.5H2O5gl-1Biotin50mgl-1H2SO45mll-1)最初pH值為6.8，通過作為必需的NaOH的加入而阻止其下降，Kr的平均值是以以24小時間隔進行的、持續(xù)四天的一段時間的測量為基礎，其在相等數(shù)目的含有以下組合物的培養(yǎng)皿中進行(a)1.9(克/升)K2HPO41.6(克/升)NaH2PO41.8(克/升)(NH4)2SO40.2(克/升)MgSO4.7H2O(在高壓滅菌鍋滅菌之后經(jīng)過濾滅菌加入)0.9(毫克/升)FeCl31.0(ml/l)微量元素，包括720毫克/升Ca，5毫克/升Cu，23毫克/升Zn，用2MHCl滴定到pH7.2加入葡萄糖的終濃度達45克/升，加入酵母提取物的終濃度達到5克/升，以及加入瓊脂的終濃度達到15克/升。(b)馬鈴薯提取物4.0克/升葡萄糖20.0克/升瓊脂15.0克/升pH5.6±0.2(c)麥芽汁30.0克/升真菌蛋白胨5.0克/升瓊脂15.0克/升pH5.4±0.2(d)1.9克/升K2HPO41.6克/升NaH2PO40.1克/升(NH4)2SO40.2克/升0.9毫克/升FeCl31.0毫升/升含有720毫克/升Ca、5毫克/升Cu、23毫克/升Zn的微量元素，用2MHCl滴定到pH7.20.1克/升酵母提取物45克/升葡萄糖15克/升瓊脂值M≤4×103μm及優(yōu)選的M≤3.5×103μm是優(yōu)選的。如果表面皿中的菌落近似圓形，可能對徑向膨脹的兩個垂直的測量就足夠，但如果其不合圓形，則可能需要更多的測量。本發(fā)明包含被孢霉的新菌株，其具有如以上所定義的形態(tài)指標M至多為4×103μm，以及優(yōu)選的是至多為3.5×103μm。合適的被孢霉菌株的例子為高山被孢霉(alpina)、貝勒被孢霉(M.bainied)、長形被孢霉(M.elongata)、微小被孢霉(M.exigua)、喜濕被孢霉(M.hygrophila)、M.globalpina、細密被孢霉(M.minutissima)、M.verficillata，多頭被孢霉(Mpolycepuala)和M.zyzchae。它們可能產(chǎn)生二十碳五烯酸、γ-亞麻酸(GLA)或優(yōu)選的是花生四烯酸和/或它們的衍生物，尤其是含有它們的殘基的脂類，依實驗方法的條件而定。本發(fā)明進一步提供了選擇新的被孢霉菌株的方法。一種這樣的方法包括在類似的條件下，在瓊脂平板中培養(yǎng)菌株，并選擇那些具有小菌落面積的菌株。顯示出低增長(在菌落面積中觀察到低密度)的菌株應該被忽略。這樣選擇的菌株最有可能具有理想的形態(tài)學指標。合適菌株的生產(chǎn)可以通過在營養(yǎng)限制(尤其是氮限制)的條件下延長培養(yǎng)被孢霉菌株，然后通過選擇具有菌落面積和(或)形態(tài)學的合適的值的個別菌株。然后可以將這些個別菌株在營養(yǎng)限制的條件下適當?shù)嘏囵B(yǎng)，如果需要可以進行重復篩選。本發(fā)明包括在一種發(fā)酵罐中培養(yǎng)被孢霉的方法，其包括從培養(yǎng)物中選擇具有緊密形態(tài)的有機體(優(yōu)選的是在連續(xù)培養(yǎng)之后直至被孢霉已經(jīng)基本上在發(fā)酵罐的表面發(fā)生黏附)，并隨后對上述更緊密的有機體進行的發(fā)酵。該過程可以如所需要的反復進行，直至獲得一種對表面具有低黏附的有機體。通過“對表面的低黏附”表示在發(fā)酵中遇到的湍流的正常條件下，從表面移去有機體的速度足以阻止在該表面建立沉著物。本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生一種脂類的方法，其包括如以上所描述的一步培養(yǎng)被孢霉。在批量培養(yǎng)中，開始用有機體接種培養(yǎng)基，其生長到含有理想量的有機體，優(yōu)選的是在一種或多種營養(yǎng)物耗盡之后進一步培養(yǎng)，然后收集生物體。在培養(yǎng)過程中，一種或多種營養(yǎng)物的供給需要重新補足(“供養(yǎng)批量”)。在連續(xù)培養(yǎng)中，加入新鮮的營養(yǎng)物并在不中止培養(yǎng)的情況下移去產(chǎn)物。這種加入和移去可以是連續(xù)的或間歇的。被孢霉新的變體有利于批量或供養(yǎng)批量操作，但尤其適合的是連續(xù)培養(yǎng)。在每種模式中，新的被孢霉形成了一種更均質的混合物以及因此提供了更好的混合，以及因此大體上更快和(或)更大的生物體信息。連續(xù)培養(yǎng)可以用已知的方式進行，例如在氣升式發(fā)酵罐(其沒有移動的部分，但在其中導管可能會被已知的變體阻塞)或在攪拌容器中。依據(jù)本發(fā)明，有機體的生長代表性的是在pH4到10，優(yōu)選的是在pH6到8。對于液體培養(yǎng)，pH值優(yōu)選的是控制在從最初值5到6上升至最終值6.5到7.5。溫度可以為5-40℃，優(yōu)選的是20-30℃。這些有機體可以在一種固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但優(yōu)選的是使用一種液體培養(yǎng)基。液體中的碳源可以包括可溶的(如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖或可溶性淀粉)，或者低溶解度的碳水化合物、脂肪酸或脂類和(或)(在有機體代謝碳氫化合物以供生長的情況下)碳氫化合物。氮源可以是復合物，如蛋白質、肽和(或)氨基酸，如酵母提取物、肉膏、玉米漿，或簡單的如硝酸鉀和(或)氨離子，氨離子的供應如以硫酸鹽或氣態(tài)氨的形式，或者其可以是化合物和一種單一來源的混合物。磷酸鹽的來源適當?shù)氖菬o機物的形式?？梢园ㄎ⒘吭睾途S生素。碳源的濃度(在總體培養(yǎng)基中的質量/質量)優(yōu)選的是至少為0.1％，可能達到30％或更多，但優(yōu)選的是在1-15％的范圍內(nèi)，如2-10％。氮源的濃度(在總體培養(yǎng)基中的質量/質量)如0.01到1，優(yōu)選的是0.1到0.4％，作為等價氮計算。當營養(yǎng)物衰竭時可以加入附加的營養(yǎng)物?？梢圆捎枚喾N碳源。為了產(chǎn)生產(chǎn)量提高的脂類，在除了碳源原料以外的營養(yǎng)物(尤其是氮或磷酸鹽)衰竭之后，優(yōu)選的是進行一段時間的培養(yǎng)操作培養(yǎng)是好氧的，合適的是在有作為空氣供應的溶解氧(可能達到富足)存在的情況下。培養(yǎng)被適當?shù)卣袷?，如通過攪拌或通過氣體的流通。合適的是使用一種氣升式發(fā)酵罐(其中液體的循環(huán)通過氣體的注入來維持，如氧氣或空氣)。對所培養(yǎng)的細胞進行適當?shù)某樘?，如用一種有機溶液，如己烷、一種酯或乙醇，可能結合使用或連續(xù)使用。如果需要，抽提可以使用一種鹵代烴，如氯仿，但為了避免環(huán)境問題，優(yōu)選的是使用碳氫化合物或乙醇或酯作為抽提劑。實施例MortierellaAlpinaATCC32222在pH6.8、26℃、好氧條件下的連續(xù)培養(yǎng)中生長，其中的溶解氧壓力(dissolvedoxygentension,DOT)維持在空氣飽和度高于20％的水平上。培養(yǎng)物在SD4培養(yǎng)基中生長，(見以下表格)過量葡萄糖作為初始碳源加入，以至在發(fā)酵的全過程中，葡萄糖在培養(yǎng)物中的濃度維持在標準值5到20克/升，硫酸氨為限制性底物。培養(yǎng)基以平衡速度加入，達到稀釋毒速度為0.05小時-1。每天將培養(yǎng)物從發(fā)酵罐中移去，在S2GYE瓊脂平板中生長(見附錄2)并仔細檢查所得到的菌株以確定菌株變體。從接種開始的620個小時的連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵之后，觀察到菌株變體。觀察到這些菌株變體的菌株比原始的母本有機體所覆蓋的面積較小。而且，菌株變體更高度分支。在進一步持續(xù)培養(yǎng)165小時后，觀察到這些菌株變體目前構成現(xiàn)有菌株的88％。一種新的菌株變體的純化培養(yǎng)物在28℃下、在S2GYE平板中生長。生長7天以后，通過將菌絲中的孢子無菌轉移到無菌的鹽溶液中以制備孢子懸浮液。然后將10μl的微量孢子溶液轉移到含有理想培養(yǎng)基的瓊脂平板的中央。然后將平板在28℃孵育，并每天測定徑向膨脹的速度，通過在兩個垂直位置上測定菌落的直徑。這在4種不同類型的培養(yǎng)基上進行(A)=S2GYE瓊脂(B)=馬鈴薯葡萄糖瓊脂(C)=麥芽汁(D)=S2LowN(見附錄2)用初始菌株重復相同的方法。每天測定徑向生長的速度并確定在生長期全過程中的平均速度(見附錄3)。從數(shù)據(jù)中可以看到新菌株的徑向膨脹速度明顯低于原始菌株的速度。在26℃、好氧條件下，在液體培養(yǎng)基(見附錄4)中培養(yǎng)新的有機體。使用批量發(fā)酵，起始pH值為6.8，其中通過加入無菌的2摩爾NaOH來阻止培養(yǎng)物的pH值下降。沒有采取控制來阻止pH值的升高。有機體的最大生長速度是通過對CO2釋放速度(CER)的測量來確定的。類似地，原始有機體的培養(yǎng)是在相同的條件下，其最大生長速度通過相同的方法確定。結果證明生長速度相似(原始菌株為0.06小時-1，新菌株為0.07小時-1)以及新菌株的粘性較低。在生長6天之后對所培養(yǎng)的樣品進行分析。生物體的油含量的確定是通過使用二氯甲和甲醇的體積比為2∶1的混合物的溶劑抽提，所抽提的油中花生四烯酸含量的確定是通過甲基酯的形成，并通過氣體的液相色譜進行分析。結果如以下表格所示。表<tablesid="table1"num="001"><table>油含量(％w/w)花生四烯酸含量(％w/w)初始菌株32.531.8新菌株34.521.9</table></tables>使用以上數(shù)據(jù)有可能計算出每種菌株的形態(tài)學指標值。初始菌株新菌株附錄ⅠSD4培養(yǎng)基成分濃度(gl-1)(NH4)2SO43.2MgSO4.7H2O0.5K2SO41.0H3PO41.0酵母自溶產(chǎn)物(BioSpringer)0.5微量元素溶液1.0**微量元素溶液成分濃度(gl-1)MnSO4.4H2O40ZnSO4.7H2O50CuSO4.5H2O5生物素50mgH2SO45ml附錄2Seed2制劑Seed2培養(yǎng)基1.9(克/升)K2HPO41.6(克/升)NaH2PO41.8(克/升)(NH4)2SO40.2(克/升)MgSO4.7H2O(在高壓滅菌之后以過濾滅菌的形式加入)0.9(毫克/升)FeCl31.0(毫升/升)Fisons微量元素，含有720毫克/升Ca、5毫克/升Cu、23毫克/升Zn，用2MHCl滴定到pH7.2培養(yǎng)基(A)S2GYE為seed2培養(yǎng)基，并加入葡萄糖到達終濃度為45克/升。加入酵母提取物(OxoidL21)到達終濃度為5克/升，以及加入瓊脂(OxoidBacteriologicalL11)到達終濃度為15克/升。培養(yǎng)基(B)馬鈴薯葡萄糖瓊脂從Oxoid(CM139)獲得。其由以下組成制劑gm/升馬鈴薯提取物4.0葡萄糖20.0瓊脂15.0pH5.6±0.2培養(yǎng)基(C)麥芽汁瓊脂從Oxoid(CM59)獲得。其由以下組成制劑gm/升麥芽汁30.0真菌蛋白胨5.0瓊脂15.0pH5.4±0.2培養(yǎng)基DS2LowN為seed2，其硫酸氨的水平變?yōu)?.1gl-1。加入酵母提取物(OxoidL21)到達終濃度為0.1克/升，并加入蔗糖到達終濃度為45克/升，然后到邊緣濃度為15克/升。附錄3被孢霉的新菌株和初始菌株在不同培養(yǎng)基A-D中的徑向膨脹速度(Kr)的比較。新菌株于1998年1月8日保存，保存編號為IMI378077，由CommonwealthAgriculturalBureau，InternationalMycologicalInstitute，F(xiàn)erryLane，Kew，SurreyTW93AF，UnitedKingdom保存，(目前為UKCentre(Egham)，BakehamLane，Egham，Surrey，TW209TY)附錄4濃度(gl-1)(NH4)2SO43.0MgSO4.7H2O1.0K2SO41.3H3PO40.75ml酵母自溶產(chǎn)物(BioSpringer)3.0葡萄糖45.0微量元素溶液1.0(組合物MnSO4.4H2O40gl-1ZnSO4.7H2O50gl-1CuSO4.5H2O5gl-1生物素50mgl-1H2SO45mll-1)權利要求1．一種在一個發(fā)酵罐中培養(yǎng)被孢霉的方法，其包括從培養(yǎng)物中選擇具有緊密形態(tài)學的有機體，優(yōu)選的是在連續(xù)培養(yǎng)之后，直至被孢霉已經(jīng)基本上在發(fā)酵罐的表面發(fā)生黏附，并且對上述更緊密的有機體進行后繼的發(fā)酵。2．如權利要求1中所述的方法，其包括重復上述過程直至獲得一種對表面具有低黏附的有機體。3．一種被孢霉的變體，其特征為形態(tài)學指標(M)最多為4×10-3μm。4．一種選擇對固體表面具有低黏附的被孢霉變體的方法，其包括在液體及平板培養(yǎng)物中生長許多被孢霉的菌株，并選擇與在液體培養(yǎng)物中具有類似的生長速度的被孢霉的菌株相比，覆蓋平板的面積小的菌株。5．一種產(chǎn)生一種被孢霉變體的方法，其包括在營養(yǎng)限制的條件下、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)被孢霉的一種菌株，借助平板培養(yǎng)獲得的菌株選擇至少一種有機體，其相對于其它相似的條件下重新培養(yǎng)該有機體平板培養(yǎng)物具有較小的菌落面積，以及選擇性地重復該方法直至獲得一種對表面黏附低的有機體。6．一種產(chǎn)生脂類或含有脂類的食品的方法，其包括被孢霉的一步液體培養(yǎng)，其中的被孢霉如權利要求3中所述，或依據(jù)權利要求4進行選擇，或者依據(jù)權利要求5進行生產(chǎn)。7．如權利要求1、2或6中所述的方法，其中被孢霉的培養(yǎng)是連續(xù)的。8．如權利要求1、2、5或6中所述的方法或如權利要求3中所述的，依據(jù)權利要求4進行選擇的，或依據(jù)權利要求5進行生產(chǎn)的被孢霉，其中的被孢霉是MortierellaAlpine。9．如權利要求1、2、6、7或8中所述的方法，其中的被孢霉在pH值為6至8、溫度為5至40℃下、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基在有溶解氧的情況下包括一種可溶的碳水化合物。10．一種方法，其中的脂類從如權利要求3中所述的，依據(jù)權利要求5進行選擇的，或者依據(jù)權利要求1、2、6、7、8或9中的任意一條中所述的方法產(chǎn)生的被孢霉中獲取，通過溶劑抽提進行生產(chǎn)，優(yōu)選的是采用有機溶劑。11．具有theInternationalMycologicalInstitute所保存的菌株(IMI378077)的特性的被孢霉及其變體、突變異種和衍生物。全文摘要在培養(yǎng)過程中通過使用形態(tài)學上緊密的變體,降低了被孢霉對表面的黏附。文檔編號C12N1/14GK1296527SQ9980485公開日2001年5月23日申請日期1999年1月21日優(yōu)先權日1998年2月7日發(fā)明者M·G·杜查斯申請人:艾夫西亞有限公司