專利名稱：：重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵的生產(chǎn)方法，具體的講是涉及一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法。技術背景近年來，長鏈多不飽和脂肪酸在人體中的生理和治療功能得到了越來越多的重視和認同。已經(jīng)有大量的資料及文獻在介紹利用生物工程的方法生產(chǎn)，同時很多產(chǎn)品己經(jīng)走向市場。花生四烯酸的發(fā)酵主要是利用高山被孢霉進行生產(chǎn)，高山被孢霉發(fā)酵獲得霉菌生物體，將富集的霉菌生物體濾干并千燥、浸提獲得花生四烯酸(ARA)后的微生物殘體，將此微生物殘體稱為高山被孢霉菌粕(同大豆提油后的豆粕)。從目前相關的資料可以看到，高山被孢霉的含油率在50%左右，因此可以說每生產(chǎn)一噸的ARA(花生四烯酸)油脂，就會有一噸的菌粕廢棄，霉菌生物體在浸提油脂的過程中，基本上只將脂質(zhì)成分浸提出，其它成分幾乎全部殘留在生物體中，含有高山被孢霉生長的所有營養(yǎng)物質(zhì)，通過對高山被孢霉菌粕的檢測分析，該物質(zhì)的含氮量高達5%以上，含氮量豐富，屬于優(yōu)質(zhì)的氮源。目前在ARA發(fā)酵過程中所使用的原料主要包括葡萄糖為碳源，不同的公司使用了不同的氮源，例如，專利申請公開CN1786178利用氣升式生物反應器高效生產(chǎn)高純度花生四烯酸的方法中所使用的氮源為氨基酸和酵母浸出物；專利申請公開CN1539982花生四烯酸油脂及其微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法中，所使用的氮源包括豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、魚粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸鈉；專利申請公開CN1696300花生四烯酸及其生產(chǎn)和使用方法中所使用的氮源為酵母浸出物。目前，高山被孢霉菌粕一般作為廢棄物進行填埋處理，或者作為肥料用于蔬菜生產(chǎn)，或者作為飼料用于水產(chǎn)品的生產(chǎn)。現(xiàn)有的公開文獻都沒有提及到關于花生四烯酸生產(chǎn)中的廢棄物菌粕的重復利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題是針對上述現(xiàn)有技術而提供一種重復利用高山被孢霉粕作為生長培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的部分氮源進行花生四烯酸的生產(chǎn)方法。本發(fā)明為解決上述提出的問題所采用解決方案為重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于包括有下述步驟首先在恒溫搖床中將裝有生長培養(yǎng)基的器皿進行高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再將培養(yǎng)好的高山被孢霉轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計為10%~90%;獲得的發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進行浸提或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進一步處理獲得目標產(chǎn)品花生四烯酸油脂，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌粕。按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前進行粉碎，再采用復合酶法對高山被孢霉菌粕進行水解處理，復合酶法中所使用的蛋白酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶或酸性蛋白酶。按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前可采用膨化法對高山被孢霉菌粕進行膨化處理，再將膨化后的高山被孢霉菌粕進行粉碎。按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前可采用膨化法對高山被孢霉菌粕進行膨化處理，進行粉碎后，再采用復合酶法對高山被孢霉菌粕進行水解處理，復合酶法中所使用的蛋白酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶或酸性蛋白酶。按上述方案，優(yōu)選的高山被孢霉菌粕的替代比以質(zhì)量百分比計為30%60%。按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕應粉碎至過20100目的篩分。按上述方案，優(yōu)選的高山被孢霉菌粕應粉碎至過60-80目的篩分。按上述方案，所述的常用氮源為酵母提取物、玉米漿及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物中的一種或多種。按上述方案，所述的非極性溶劑為丁烷、己烷、乙醚、石油醚中的一種或多種。本發(fā)明所涉及的高山被孢霉菌粕是利用高山被孢霉發(fā)酵獲得霉菌生物體，霉菌生物體經(jīng)沸騰干燥、浸提獲得花生四烯酸(ARA)后的微生物殘體。在浸提收獲花生四烯酸后的微生物殘體中，含有高山被孢霉生長的所有營養(yǎng)物質(zhì)，還含有8~10%的殘油，殘油主要成分是飽和或者不飽和的甘油三酯，而殘油中至少含有40%以上的花生四烯酸。高山被孢霉菌粕一般作為廢棄物進行填埋處理，或者作為肥料用于蔬菜生產(chǎn)，或者作為飼料用于水產(chǎn)品的生產(chǎn)。本發(fā)明的方法中，高山被孢霉菌粕作為氮源重復利用，部分替代常用氮源，在適合于生產(chǎn)ARA油的條件下培養(yǎng)霉菌生物體。例如，在搖瓶中進行高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)。搖瓶中裝有生長培養(yǎng)基，接種高山被孢霉菌種，在恒溫搖床中培養(yǎng)約2至3天，轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在恒溫搖床進行連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)7至10天。本發(fā)明的生長和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可以不相同，但都含有碳源和氮源。一般使用的碳源是葡萄糖，也可以是果糖或者糖蜜、水解淀粉以及其它用于發(fā)酵的低成本常規(guī)碳源。一般情況下，在培養(yǎng)過程中需要補充加入碳源。這是因為，碳源在菌絲體培養(yǎng)過程中消耗量較大，一次添加過多碳源往往會對菌絲體的生長產(chǎn)生明顯不利影響。生長和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源一般是酵母提取物、玉米漿以及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物等。本發(fā)明所述的高山被孢霉菌粕代替部分氮源，可以成批加入，即培養(yǎng)前一次性全部加入，也可以分批加入。本發(fā)明培養(yǎng)過程一般在25"C至3(TC培養(yǎng)2至3天，生長的生物體可以滿足發(fā)酵搖瓶的接種要求。采用多極連續(xù)發(fā)酵罐的生物體培養(yǎng)物培養(yǎng)時間可以根據(jù)實際需要延長1天至2天。培養(yǎng)的溫度工藝與菌種有很大的不同，也與生產(chǎn)的工藝有關。這是發(fā)酵領域技術人員容易控制的。例如，一級種子罐培養(yǎng)2天至3天，二級種子培養(yǎng)1天至2天，轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)周期為5至12天。本發(fā)明在一般情況下，高山被孢霉接種量可以不相同，接種量可以使用1%至30%,較好的接種量為5%至25%，例如，搖瓶種子接種發(fā)酵搖瓶采用10%的接種量，搖瓶種子接種一級種子罐采用1%接種量，一級種子罐接種二級種子罐采用8%的接種量，二級種子罐接種發(fā)酵罐采用25%的接種量。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中必須對營養(yǎng)物質(zhì)水平進行監(jiān)測。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)過程中不需要補充碳源和氮源。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中當葡萄糖水平降低至5g/l時，應流加補充葡萄糖。在一個完整的培養(yǎng)周期使用每升超過80克葡萄糖和超過10克的酵母提取物。在培養(yǎng)過程中氮源將提前耗盡，有利于促使高山被孢霉產(chǎn)生油脂。對上述發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)的霉菌生物體進行后續(xù)處理，對產(chǎn)品的后續(xù)處理我們主要采取對霉菌生物體進行千燥提油的工藝，主要包括霉菌生物體的收集、干燥及油脂提取。在適宜的培養(yǎng)條件下，進行發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)花生四烯酸含量確定收獲霉菌生物體。當高山被孢霉中的花生四烯酸含量不低于40%,可以收獲霉菌生物體。其中霉菌生物體的收集前，首先需要對其進行滅活，滅活的方式主要是采用高溫瞬時滅菌的方法，也可以采用80度及以上低溫滅活的方法，目的在于防止微生物在后處理中異常的生化反應。對于滅活的產(chǎn)品可以采用各種合適的方法收集，例如過濾、離心等。優(yōu)先采用成本較低的過濾方法。發(fā)酵醪液經(jīng)高壓板框過濾，霉菌生物體形成濾餅，經(jīng)洗滌、粉碎干燥。千燥的工藝有很多，例如滾筒干燥、流化床干燥、粉碎干燥等。干燥脫水后的霉菌生物體，可以采用非極性溶劑進行浸提或壓榨法，收獲油脂。收獲的油脂經(jīng)進一步處理獲得目標產(chǎn)品花生四烯酸油脂。霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余固體物質(zhì)，即高山被孢霉菌粕。本發(fā)明涉及重復利用高山被孢霉菌粕生產(chǎn)花生四烯酸。所謂重復利用是指利用上述經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余的固體物質(zhì)部分替代高山被孢霉培養(yǎng)基中的氮源。部分替代是指降低原培養(yǎng)基配方中的氮源使用量，添加高山被孢霉菌粕作為補充。高山被孢霉菌粕替代的比例可以為原氮源的10%~90%，優(yōu)先采用的比例為30%60%。用于替代氮源的高山被孢霉菌粕可以進行必要的處理，如進行膨化處理，然后再采用碾壓、高速粉碎機粉碎、高壓均質(zhì)等方法，粉碎后的高山被孢霉菌粕進行篩分，可以選用過20100目的篩分，優(yōu)先選用60~80目的篩分用于培養(yǎng)基中，還可以通過復合酶法對粉碎后的高山被孢霉菌粕進行水解處理。本發(fā)明的高山被孢霉菌粕用于培養(yǎng)基代替部分常用氮源，其培養(yǎng)基的配制處理、滅菌、培養(yǎng)等方法是本領域熟練技術人員所熟知的，相關處理方法均可用于本發(fā)明。例如培養(yǎng)基滅菌時間可以采用12rC，保溫30分鐘。通過上述技術方案的實施可以達到以下效果1、利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放；2、高山被孢霉菌粕通過膨化處理，使得高山被孢霉菌粕變得松散，易于粉碎，便于有效營養(yǎng)物質(zhì)的釋放從而得到應用；3、高山被孢霉菌粕通過復合酶處理，使得高山被孢霉菌粕中高分子物質(zhì)(例如蛋白)得到降解，降解的小分子物質(zhì)，能更有效地被高山被孢霉吸收利用；4、高山被孢霉菌粕通過一系列前處理用于花生四烯酸的發(fā)酵生產(chǎn)，可以顯著提高花生四烯酸的產(chǎn)量；5、釆用高山被孢霉菌粕循環(huán)利用于花生四烯酸的發(fā)酵生產(chǎn)，可以顯著降低花生四烯酸的生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。具體實施方式下面結(jié)合實施例進一步介紹本發(fā)明，但是實施例不會構成對本發(fā)明技術方案的限制。實施例1高山被孢霉菌粕循環(huán)應用前處理1.1、高山被孢霉菌粕復合酶工藝處理。高山被孢霉菌粕經(jīng)粉碎，過60目篩，添加水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，pH保持自然，升溫至5(TC，添加占高山被孢霉菌粕質(zhì)量百分比0.5~3%的中性蛋白酶，在5(TC下保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌1~2小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，采用現(xiàn)有工藝將高山被孢霉蛋白酶水解物作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。1.2、高山被孢霉菌粕復合酶工藝處理。高山被孢霉菌粕經(jīng)粉碎，過80目篩，添加水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，調(diào)節(jié)pH至8.0-9.0，升溫至50°C~55°C，添加占高山被孢霉菌粕質(zhì)量百分比0.5~3%的堿性蛋白酶，5(TC保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌13小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。1.3、高山被孢霉菌粕膨化工藝處理。高山被孢霉菌粕經(jīng)膨化設備處理，膨化溫度控制在90100'C之間，然后粉碎，過70目篩，添加一定量的水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，pH保持自然，升溫至5(TC，添加占高山被孢霉菌粕質(zhì)量百分比0.53%的中性蛋白酶，5(TC保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌12小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。實施例2高山被孢霉發(fā)酵配方工藝優(yōu)化高山被孢霉菌粕經(jīng)粉碎，過60目篩，添加一定量的水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，pH保持自然，升溫至5(TC，添加0.53%高山被孢霉菌粕質(zhì)量百分比的中性蛋白酶，50'C保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌1~2小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。按不同替換比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用原始生長培養(yǎng)基配方，配制后的生長培養(yǎng)基，121'C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C,搖床轉(zhuǎn)速220rpm。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基按不同比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源，分別替換10%，20%,30%，40%，50%,60%，70%，80%，90%。配制后的培養(yǎng)基121°C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種前述培養(yǎng)好的霉菌種子，發(fā)酵搖瓶接種量為10%。發(fā)酵搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm。培養(yǎng)結(jié)束得到發(fā)酵醪液，進行相關檢測。發(fā)酵醪液經(jīng)過濾收集的霉菌生物體，經(jīng)洗絡、干燥、粉碎，采用非極性溶劑丁烷或者己烷進行浸提，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)堿煉、脫膠、脫色、脫溶、脫臭獲得目標產(chǎn)品花生四烯酸油脂。霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑丁烷或者己烷浸提后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌粕。編號替換比例結(jié)果(AA(g/1))10%5.52210%5.51320%5.57430%5.6540%5.83650%5.86760%5.54<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3高山被孢霉發(fā)酵配方工藝優(yōu)化高山被孢霉菌粕經(jīng)粉碎，過80目篩，添加一定量的水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，調(diào)節(jié)pH至8.0~9.0,升溫至5(TC55。C,添加高山被孢霉菌粕的質(zhì)量百分比0.5~3%的中性蛋白酶，5(TC保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌13小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。按不同替換比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用氮源替換50°/。的配方，配制后的培養(yǎng)基，121'C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。高山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基按不同比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源，分別替換10%，20%,30%,40%，50%，60%,70%,80%，90%。配制后的培養(yǎng)基12rC,保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉種子，發(fā)酵搖瓶接種量為10%。發(fā)酵搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm。培養(yǎng)結(jié)束的搖瓶菌絲體，進行相關檢測。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>100%.12實施例4高山被孢霉發(fā)酵配方工藝優(yōu)化。高山被孢霉菌粕經(jīng)膨化設備處理，然后粉碎，過70目篩，添加一定量的水配制成質(zhì)量百分比濃度為20%的混濁液，pH保持自然，升溫至5(TC，添加高山被孢霉菌粕的質(zhì)量百分比0.5~3%的屮性蛋白酶，5(TC保溫，以每10分鐘攪拌2分鐘的方式間歇攪拌12小時。制備的高山被孢霉蛋白酶水解物，作為氮源添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)與其它原料滅菌后用于高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)。按不同替換比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用氮源替換50%的配方，配制后的生長培養(yǎng)基，121°C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。高山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基按不同比例替換搖瓶培養(yǎng)基中的氮源，分別替換10%,20%，30%,40%，50%，60%，70%，80%，90%。配制后的培養(yǎng)基121°C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉種子，發(fā)酵搖瓶接種量為10%。發(fā)酵搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm。培養(yǎng)結(jié)束的搖瓶菌絲體，進行相關檢測。編號替換比例結(jié)果(AA(g/1))10%5.252腦5.38320%5.52430%5.6440%5.82650%5.87760%5.69870%5.47980%5.361090%5.22111000/05.04實施例5高山被孢霉發(fā)酵中試工藝優(yōu)化。中試70升發(fā)酵罐培養(yǎng)。高山被孢霉菌粕經(jīng)后處理實施例1.1的處理后，按所需比例替換培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，121'C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。高山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。種子罐培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，116°C，保溫30分鐘。接入搖瓶高山被孢霉種子后通氣培養(yǎng)48小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，分別替換30%，40%，50%，60%，配制后的培養(yǎng)基116°C，保溫30分鐘。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為1.2VVM培養(yǎng)溫度為28'C，攪拌轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速250rpm。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至0.1%以下，最終結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例6高山被孢霉發(fā)酵中試工藝優(yōu)化。中試70升發(fā)酵罐培養(yǎng)。高山被孢霉菌粕經(jīng)后處理實施例1.2的處理后，按所需比例替換培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，12rC，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種髙山被孢霉菌種孢子。高山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。種子罐生長培養(yǎng)基采用50°/。氮源替代培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，116'C，保溫30分鐘，接入搖瓶高山被孢霉種子后通氣培養(yǎng)48小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，分別替換30%，40%，50%，60%。配制后的培養(yǎng)基116°C，保溫30分鐘，發(fā)酵罐接種量為20%，發(fā)酵罐接種后，通氣量為1.2VVM培養(yǎng)溫度為28'C，攪拌轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速250rpm。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至0.1%以下，最終結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例7高山被孢霉發(fā)酵中試工藝優(yōu)化。中試70升發(fā)酵罐培養(yǎng)。高山被孢霉菌粕經(jīng)后處理方法1.3的處理后，按所需比例替換培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，12rc，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。高山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。種子罐生長培養(yǎng)基采用50%氮源替代培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，116'C，保溫30分鐘。接入搖瓶高山被孢霉種子后通氣培養(yǎng)48小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，分別替換10%，40%，60%,90%,。配制后的培養(yǎng)基116'C，保溫30分鐘。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為1.2VVM培養(yǎng)溫度為28'C,攪拌轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速250rpni。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至0.1%以下，最終結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例8發(fā)酵生產(chǎn)大罐培養(yǎng)。高山被孢霉菌粕經(jīng)后處理方法1.1的處理后，按所需比例替換培養(yǎng)基中的氮源。高山被孢霉種子搖瓶生長培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，121°C，保溫30分鐘。在潔凈工作臺接種高山被孢霉菌種孢子。髙山被孢霉種子搖瓶在恒溫搖床培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)溫度為28'C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm。一級種子罐生長培養(yǎng)基采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，116'C，保溫30分鐘。接入搖瓶高山被孢霉種子后通氣培養(yǎng)48小時。二級種子罐采用原始培養(yǎng)基配方，配制后的培養(yǎng)基，U6。C，保溫30分鐘。接入搖瓶高山被孢霉種子后通氣培養(yǎng)48小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，替換30%，配制后的培養(yǎng)基通過連消塔，滅菌后管道輸入已經(jīng)空消滅菌的發(fā)酵大罐中。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為0.7VVM培養(yǎng)溫度為28'C。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至O.1%以下。在發(fā)酵大罐中培養(yǎng)7天，花生四烯酸的含量達到48.9%，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中花生四烯酸的產(chǎn)量為7.86g。實施例9依照實例8方法，獲得發(fā)酵所需要的高山被孢霉種子。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，替換40%，配制后的培養(yǎng)基通過連消塔，滅菌后管道輸入已經(jīng)空消滅菌的發(fā)酵大罐中。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為0.7VVM培養(yǎng)溫度為28'C。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至0.W以下。在發(fā)酵大罐中培養(yǎng)7天，花生四烯酸的含量達到49.6%，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中花生四烯酸的產(chǎn)量為8.19g。實施例10依照實例8方法，獲得發(fā)酵所需要的高山被孢霉種子。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，替換50%，配制后的培養(yǎng)基通過連消塔，滅菌后管道輸入已經(jīng)空消滅菌的發(fā)酵大罐中。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為0.7VVM，培養(yǎng)溫度為變溫培養(yǎng)，過程的培養(yǎng)溫度為3(TC培養(yǎng)3天，然后以每12h降低rC的速度，進行降溫培養(yǎng)，當發(fā)酵溫度降至25t:，穩(wěn)定培養(yǎng)溫度在25'C繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至O.1%以下。在發(fā)酵大罐中培養(yǎng)7天，花生四烯酸的含量達到51.3%，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中花生四烯酸的產(chǎn)量為8.32g。實施例11依照實例8方法，獲得發(fā)酵所需要的高山被孢霉種子。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(即發(fā)酵培養(yǎng)基)按一定比例替換培養(yǎng)基中的氮源，替換60%，配制后的培養(yǎng)基通過連消塔，滅菌后管道輸入己經(jīng)空消滅菌的發(fā)酵大罐中。發(fā)酵罐接種量為20%。發(fā)酵罐接種后，通氣量為0.7VVM，培養(yǎng)溫度為變溫培養(yǎng)，過程的培養(yǎng)溫度為30'C培養(yǎng)2天，然后以每12h降低rC的速度，進行降溫培養(yǎng)，當發(fā)酵溫度降至25'C，穩(wěn)定培養(yǎng)溫度在25'C繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行葡萄糖的流加，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度控制在一定濃度范圍內(nèi)，初始控制1.0%左右，逐步降低至0.1%以下。在發(fā)酵大罐中培養(yǎng)6天，花生四烯酸的含量達到50.1%，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中花生四烯酸的產(chǎn)量為7.96g。權利要求1、重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于包括有下述步驟首先在恒溫搖床中將裝有生長培養(yǎng)基的器皿進行高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再將培養(yǎng)好的高山被孢霉轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計為10％～90％；獲得的發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進行浸提或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進一步處理獲得目標產(chǎn)品花生四烯酸油脂，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌粕。2、按權利要求l所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前進行粉碎，再采用復合酶法對高山被孢霉菌粕進行水解處理，復合酶法中所使用的蛋白酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶或酸性蛋白酶。3、按權利要求l所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前可采用膨化法對高山被孢霉菌粕進行膨化處理，再將膨化后的高山被孢霉菌粕進行粉碎。4、按權利要求l所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在進行循環(huán)使用前可采用膨化法對高山被孢霉菌粕進行膨化處理，進行粉碎后，再采用復合酶法對高山被孢霉菌粕進行水解處理，復合酶法中所使用的蛋白酶為中性蛋白酶、堿性蛋白酶或酸性蛋白酶。5、按權利要求1至4任意一項所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于優(yōu)選的高山被孢霉菌粕的替代比以質(zhì)量百分比計為30%60%。6、按權利要求2至4任意一項所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕應粉碎至過20~100目的篩分。7、按權利要求6所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于優(yōu)選的高山被孢霉菌粕應粉碎至過6080目的篩分。8、按權利要求l所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉生長培養(yǎng)溫度為25-30度，生長培養(yǎng)時間2-5天。9、按權利要求8所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25-30度，發(fā)酵培養(yǎng)時間5-12天。10、按權利要求8所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)采取變溫培養(yǎng),發(fā)酵前期在30度下培養(yǎng)2-3天，發(fā)酵中期以每12h降溫1度培養(yǎng)，發(fā)酵后期在25度下培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)吋間5-12天。11、按權利要求1所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的常用氮源為酵母提取物、玉米漿及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物中的一種或多種。12、按權利要求1所述的重復利用高山被孢霉菌粕制備花生四烯酸的方法，其特征在于所述的非極性溶劑為丁垸、己烷、乙醚、石油醚中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法，包括有下述步驟首先在恒溫搖床中將高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計為10％～90％；發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進行浸提或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進一步處理獲得目標產(chǎn)品，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌粕，本發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放。文檔編號C12P7/64GK101613724SQ200910063369公開日2009年12月30日申請日期2009年7月28日優(yōu)先權日2009年7月28日發(fā)明者唐孝鵬,耘尚,張玉良,易華榮,汪志明,紀王,耿安峰,敏肖,肖子豪,馬凡提申請人:嘉吉烯王生物工程(湖北)有限公司;嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司