專利名稱：新的人鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基、其編碼序列及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸。更具體地，本發(fā)明涉及人的鈣調(diào)磷酸化酶(Calcineurin，簡稱“CN”)調(diào)節(jié)亞基(Calcineurin B，簡稱“CNB”)家族中的一個(gè)新成員CNBII的編碼序列，該序列編碼的多肽被鑒定為人CNB基因的同系物。本發(fā)明還涉及由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。
已知CNB基因與生物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。CNB家族中最早的成員是在牛腦中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白。而該家族中最早被克隆的基因則是Guerini.D等人于1989年從小鼠精母細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到的一個(gè)CNB基因。同時(shí)被克隆的還有人的CNB基因(DNA，1989，8(9)，675-682)，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)它們的同源度很高。隨后，Cyert.M.S.等人于1991年克隆了酵母的CNB基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7376-7380)；Guerini.D等人于1992年克隆得到了果蠅的CNB基因(J.Biol.Chem.267，22542-22549)。所有這些CNB基因都有著高度的同源性(Biochem Biophys Res Commun 1997，235，271-275)。
在本發(fā)明之前，沒有發(fā)現(xiàn)或發(fā)表過本發(fā)明的人鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)基因。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸是編碼人CNB基因的一個(gè)同源基因，本發(fā)明的人CNB的同系物命名為CNBII。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人CNB同源蛋白，命名為CNBII蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的CNBII蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及該CNBII核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-513位的序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的CNBII蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有CNBII蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成CNBII蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成CNBII蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)CNBII蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有CNBII蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為517個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于1-513位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“CNBII蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中1-513位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框1-513位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中1-513位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。更佳地，還包括在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人CNBII相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“CNBII蛋白多肽”指具有CNBII蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基相同功能的、SEQ IDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括CNBII蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與CNBII DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗CNBII多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含CNBII多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括CNBII多肽的可溶性片段。通常，該片段具有CNBII多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供CNBII蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然CNBII多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括CNBII多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)CNBII的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有CNBII多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼CNBII的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測CNBII核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于CNBII多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)CNBII cDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于CNBII基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與CNBII基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制CNBII蛋白的分子，也包括那些并不影響CNBII蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的CNBII基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的CNBII基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)CNBII或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷CNBII功能的抗體以及不影響CNBII功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用CNBII基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與CNBII基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人CNBII核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的CNBII多核苷酸全長為517核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于1-513位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15＇-ATGGGAAACGAGGCCAGTTACC-3＇，反向引物A25＇-AGGCTCATACGATGAGGACCAG-3＇，進(jìn)行PCR獲得520bp(A1/A2)的目的片段。測序后得到SEQ ID NO3的全長cDNA序列。
生物的免疫功能主要由鈣調(diào)磷酸化酶來催化完成，而鈣調(diào)磷酸化酶的催化活性則是由其調(diào)節(jié)亞基(CNB)與催化亞基(CNA)共同完成。其中，調(diào)節(jié)亞基起著更為重要的作用。本發(fā)明的cDNA序列被確認(rèn)為人的CNBII基因，屬于鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基CNB基因家族。其在調(diào)節(jié)鈣調(diào)磷酸化酶的催化活性中起著重要的作用。CNB在淋巴系統(tǒng)中高表達(dá)(Guerini.D 1997 Biochem.Biophys.Res.Commun 235，271-275)，是生物抵抗外來毒素侵入并保護(hù)自身的一種重要的蛋白。尤其在高等生物中，其起著更為重要的作用。CNB可能與催化亞基CNA的穩(wěn)定性有關(guān)；CNB結(jié)合于Ca2+，可有效地提高鈣調(diào)磷酸化酶另一調(diào)節(jié)蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)的調(diào)節(jié)活性；該同源基因還被認(rèn)為可能是介導(dǎo)Ca2+，提高免疫系統(tǒng)活性方面的重要因子(Merat.D.L 1985，J.Biolog.Chem，260(20)Sep.15，11053-11059)。進(jìn)一步的報(bào)道顯示了CNB不僅對(duì)免疫系統(tǒng)具調(diào)節(jié)功能，還可能與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(Aitken.A 1982，F(xiàn)EBSLett 150(2)314-318)。本發(fā)明的CNBII基因具有與CNB基因相似或相同的功能。
在本發(fā)明附圖中，

圖1本發(fā)明的人CNBII蛋白與人CNB蛋白(HCNB)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1CNBII的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A15＇-ATGGGAAACGAGGCCAGTTACC-3＇(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25＇-AGGCTCATACGATGAGGACCAG-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘；電泳檢測得到的PCR片段，A1/A2，為520bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1/A2與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共517bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于1-513位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出CNBII的氨基酸序列，共170個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實(shí)施例2同源比較用CNBII的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與人CNB基因及其編碼蛋白具有很高的同源性，尤其在蛋白水平上的同一性(identity，又稱相同性)達(dá)到了84％，相似性達(dá)到了88％(圖2)。
特別是在CNBII的氨基酸序列中存在3個(gè)由13個(gè)氨基酸組成的EF手型鈣結(jié)合位點(diǎn)的特征性序列-DX(D/N/S){ILVFYW}(D/E/N/S/T/G)(D/N/Q/G/H/R/K){GP}(L/I/V/M/C)(D/E/N/Q/S/T/A/G/C)X2(D/E)(L/I/V/M/F/Y/W)[注該序列中X為任意氨基酸，“2”等數(shù)字為氨基酸數(shù)目，“(L/I/V/F/Y/W)”表示從這6個(gè)氨基酸中任意選擇一個(gè)氨基酸，{GP}表示此處不可能為G或P]。
在本發(fā)明的蛋白中符合上述模式的序列片段是DTDGDGEVDFKEF(SEQ IDNO.4中63-75位)，DMDKDGYISNGEL(SEQ ID NO.4中100-112位)，DKDGDGKISFEEF(SEQ ID NO.4中141-153位)，這進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明的人CNBII屬于一種鈣調(diào)蛋白。綜上所述，可以斷定人的CNBII蛋白屬于鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基家族，并且具有鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基家族的相關(guān)功能。
CNB被認(rèn)為與淋巴系統(tǒng)免疫功能有關(guān)，是生物抵抗外來影響，保護(hù)自身的一種蛋白。生物的免疫功能主要由鈣調(diào)磷酸化酶來催化完成，而鈣調(diào)磷酸化酶的催化活性則是由其調(diào)節(jié)亞基(CNB)與催化亞基(CNA)共同完成。其中，調(diào)節(jié)亞基起著更為重要的作用(Guerini.D 1997 Biochem.Biophys.Res.Commun 235，271-275)。
鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基(CNB)主要通過協(xié)同鈣調(diào)蛋白(CaM)調(diào)節(jié)鈣調(diào)磷酸化酶催化亞基(CNA)的催化活性來調(diào)節(jié)人及動(dòng)物的免疫細(xì)胞發(fā)揮正常的免疫功能，抵抗外來物質(zhì)對(duì)人體的不良影響。首先，CNB被認(rèn)為可能與催化亞基的穩(wěn)定性有關(guān)，CNB與CNA結(jié)合后，CNA的穩(wěn)定性比正常狀態(tài)下高的多。其次，CNB結(jié)合于Ca2+，可有效地提高鈣調(diào)磷酸化酶另一調(diào)節(jié)蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)的調(diào)節(jié)活性。雖然，CNB與CaM的調(diào)節(jié)作用是相互獨(dú)立的，但它們之間又存在著協(xié)調(diào)作用的關(guān)系。缺了任何一方，CNA的催化活性都不能最高水平的發(fā)揮出來。CNB還被認(rèn)為可能是介導(dǎo)Ca2+，提高免疫系統(tǒng)活性方面的重要因子，Merat等人早已通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ca2+在調(diào)節(jié)鈣調(diào)磷酸化酶的活性方面起著必不可少的作用，而在CNB的存在下，Ca2+的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)的更加明顯(Merat.D.L1985，J.Biolog.Chem，260(20)，11053-11059)。
已表明，CNB不僅對(duì)免疫系統(tǒng)具調(diào)節(jié)功能，還可能與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在CNB的N末端有一段特殊的氨基酸序列，人們發(fā)現(xiàn)這一序列在環(huán)化AMP依賴的蛋白激酶催化亞基中也存在。本發(fā)明CNBII的N末端的多個(gè)氨基酸與CNB中的氨基酸的同一性大于85％，相似性更高達(dá)93％。并且CNBII中存在相應(yīng)的這一不尋常區(qū)域，這一事實(shí)表明，CNBII也參與了細(xì)胞膜的相互作用，并參與物質(zhì)的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。CNB的上述功能表明，CNBII可用于提高免疫水平或者用于治療因CNBII缺乏而導(dǎo)致的其他疾病。由于在蛋白激酶和磷酸激酶蛋白中均有這一不尋常的區(qū)域，因此這一區(qū)域可能與這些蛋白與其底物的相互作用有關(guān)。另外，這一區(qū)域的存在，使得這些蛋白能與細(xì)胞膜相互作用，并參與物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。更深入地對(duì)這一區(qū)域的研究認(rèn)為，這一神秘的區(qū)域可能在維持CNB與CNA兩個(gè)亞基的相互作用中起著重要的作用(FEBS Lett1982，150(2)，314-318)。
本發(fā)明的CNBII除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明CNBII還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，如將本發(fā)明CNBII的C端與人CNB的C端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明CNBII的抗體，可用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
例如，本發(fā)明人CNBII核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人CNBII的表達(dá)水平或者抑制人CNBII的過度表達(dá)。本發(fā)明的人CNBII蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人CNBII缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3CNBII在大腸桿菌中的表達(dá)編碼CNBII的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5＇寡核苷酸引物序列為5＇-TCTGGGATCCATGGGAAACGAGGCCAGTT-3＇(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的CNBII編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTAGGGATCCTCATACGATGAGGACCAGC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個(gè)翻譯終止子和CNBII的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用SalI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗(yàn)證結(jié)果表明CNBII的cDNA插入片段已正確裝入載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6，隨后加入IPTG(“異丙基硫代-B-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的CNBII。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫CNBII?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化了的蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對(duì)含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為20KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實(shí)施例4CNBII在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼CNBII的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物，以人腦λgt11eDNA文庫為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得合成的插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-TCTGAAGCTTATGGGAAACGAGGCCAGTT-3＇(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的CNBII編碼序列的19個(gè)核苷酸；3＇端引物序列為5’-GTAGGGATCCTCATACGATGAGGACCAGC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和CNBII的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100g/μml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用EcoRV酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗(yàn)證結(jié)果表明CNBII的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，采用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為20KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀CNBII基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱新的人鈣調(diào)磷酸化酶調(diào)節(jié)亞基、其編碼序列及制備方法(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGGAAACG AGGCCAGTTA CC22(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AGGCTCATAC GATGAGGACC AG 22(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度517bp
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 ATGGGAAACGAGGCCAGTTACCCGGCGGAGATGTGCTCCCACTTTAACAATGATGAAATT61 AAAAGGCTGGGCAGGAGGTTTAAGAAGTTGGACTTGGACAAATCAGGGTCTCTAAGCGTG121 GAGGAGTTCATGTCCCTGCCGGAGCTGCGCCACAACCCGTTGGTGCGGCGAGTGATCGAC181 GTCTTCGACACCGACGGTGATGGAGAAGTGGACTTCAAGGAATTCATCCTGGGGACCTCC241 CAGTTCAGCGTCAAGGGCGACGAGGAGCAGAAGTTGAGGTTTGCGTTCAGCATTTACGAC301 ATGGATAAAGATGGCTACATTTCCAACGGGGAGCTCTTCCAGGTGCTGAAGATGATGGTG361 GGCAACAACCTGACGGACTGGCAGCTCCAGCAGCTGGTCGACAAAACCATCATCATCCTG421 GACAAGGATGGCGATGGGAAGATATCCTTTGAGGAATTCAGTGCTGTGGTCAGAGACCTG481 GAGATCCACAAGAAGCTGGTCCTCATCGTATGAGCCT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度170個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Ala Glu Met Cys Ser His Phe16 Asn Asn Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Arg Arg Phe Lys Lys Leu31 Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser46 Leu Pro Glu Leu Arg His Asn Pro Leu Val Arg Arg Val Ile Asp61 Val Phe Asp Thr Asp Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe76 Ile Leu Gly Thr Ser Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Glu Glu Gln91 Lys Leu Arg Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly106 Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val121 Gly Asn Asn Leu Thr Asp Trp Gln Leu Gln Gln Leu Val Asp Lys136 Thr Ile Ile Ile Leu Asp Lys Asp Gly Asp Gly Lys Ile Ser Phe151 Glu Glu Phe Ser Ala Val Val Arg Asp Leu Glu Ile His Lys Lys166 Leu Val Leu Ile Val(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5TCTGGGATCC ATGGGAAACG AGGCCAGTT 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GTAGGGATCC TCATACGATG AGGACCAGC 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7TCTGAAGCTT ATGGGAAACG AGGCCAGTT 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GTAGGGATCC TCATACGATG AGGACCAGC29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-513位的序列。
4.一種分離的CNBII蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有CNBII蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成CNBII蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成CNBII蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)CNBII蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有CNBII蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸1-513位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的CNBII蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人的鈣調(diào)磷酸化酶(Calcineurin,簡稱“CN”)調(diào)節(jié)亞基(CalcineurinB,簡稱“CNB”)家族中的一個(gè)新成員CNBⅡ的編碼序列, 該序列編碼的多肽被鑒定為人CNB基因的同系物。本發(fā)明還涉及由該多核苷酸編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1249347SQ9812192
公開日2000年4月5日 申請(qǐng)日期1998年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者余龍, 張宏來, 趙勇, 傅強(qiáng), 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)