專利名稱：一種固定化酶載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種固定化酶載體。
目前，固定化酶載體主要有無機材料載體和有機材料載體兩大類，前者有硅膠、活性氧化鋁等，后者多數(shù)是人工合成的聚合物。
無機材料載體具有機械性能好、來源豐富和成本低等優(yōu)點，但酶是靠吸附作用固定在載體上的，由于這種分子間作用力較弱，酶容易流失，縮短了固定化酶的使用時間。于是，日本專利昭63-252544和歐洲專利0109300文獻以及劉立建等刊登在《離子交換與吸附》[11(6):541,1995]期刊上的“多孔硅球的活化和硅烷化”文章中，公開了一種將3-氨基丙基硅膠或玻璃微球通過雙功能團交聯(lián)劑或縮合劑來固定酶，使酶與載體之間形成共價鍵的技術。這雖然能提高固定化酶的穩(wěn)定性，但因在固定化反應中使用交聯(lián)劑或縮合劑，會使酶的高級結構發(fā)生變化，降低了酶的活性或使酶失活，致使固定化反應中，反應液中剩余的酶活力小，因而難以再利用，這不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
有機材料載體的缺點在于其機械性能較差，比重小，有可壓縮性。因而，用在某些反應器上時對液體的流動產(chǎn)生較大的阻力，并且成本比無機材料高。但是，由于此載體能使酶保持較高的活性，固定化酶的使用壽命長，所以，現(xiàn)在用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶大都采用聚合物作載體。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供集無機材料載體和有機材料載體的優(yōu)點于一身的一種固定化酶載體，以利于固定化酶用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的其由無機和有機材料載體構成復合型載體，包括聚丁二酰亞胺和3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共價鍵相連。
制備上述復合型載體的方法是將聚丁二酰亞胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，加入3-氨基丙基硅膠或3-氨基內基玻璃微球，按其氨基的摩爾數(shù)與聚丁二酰亞胺中的丁二酰亞胺結構單元的摩爾數(shù)之比1∶5～8投料，然后從反應混合物中收集生成物，此生成物即為復合型載體。
本發(fā)明所述的固定化酶載體(以下簡稱新載體)與現(xiàn)有的載體相比有以下主要優(yōu)點其一用新載體制得的固定化酶，能保持較高的活力。
其二用新載體固定酶的過程中，酶損耗小。因為，在固定化反應中，酶直接與新載體上的活性結構單元反應，反應液中剩余的酶能循環(huán)使用，同時避免了載體的預活化這一繁瑣的步驟。
其三聚丁二酰亞胺能回收循環(huán)使用。因為，它在N,N′-二甲基甲酰胺中(以下簡稱DMF)很穩(wěn)定，在水中的溶解度很小，將它的DMF溶液倒入水中便能進行回收，操作簡便。
其四新載體制備方便，成本低且機械性能好。
總之，新載體實用性強，利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種集無機和有機材料載體的優(yōu)點于一身的載體。
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。


圖1是制備本發(fā)明所述的新載體的示意圖。
圖2是用圖1新載體固定酶的示意圖。
圖3是反應溫度與脂肪酶及固定化脂肪酶相對活力的關系示意圖。
圖4是緩沖溶液的pH值與脂肪酶及固定化脂肪酶的相對活力的關系示意圖。
圖5是固定化脂肪酶在磷酸緩沖溶液中貯存的時間與其活力的關系示意圖。
本發(fā)明所述載體是復合型載體，由有機和無機材料載體構成，包括聚丁二酰亞胺和3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共價鍵相連。其制備方法是先將聚丁二酰亞胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，再加入3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球，按3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球中氨基的摩爾數(shù)與聚丁二酰亞胺中的丁二酰亞胺結構單元的摩爾數(shù)之比(以下簡稱摩爾數(shù)之比)1∶5～8投料，然后從反應混合物中收集生成物，此生成物是本發(fā)明所述的固定化酶載體，本申請人命名其為聚丁二酰亞胺-硅膠或聚丁二酰亞胺-玻璃微球(見圖1)，簡稱新載體。圖1中序號1、2、3分別是3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球、聚丁二酰亞胺、新載體。
一、新載體制備實施例實施例一10.8克聚丁二酰亞胺溶于55mL DMF中，加入15克3-氨基丙基硅膠，摩爾數(shù)之比1∶5。在室溫下將其攪拌約8小時，使之充分反應后，再經(jīng)抽濾和用DMF浸泡，通過洗滌工序除去未反應的聚丁二酰亞胺。然后，用乙醚洗三次，除去DMF。最后經(jīng)干燥(自然晾干)，得新載體即聚丁二酰亞胺-硅膠固體產(chǎn)品16.69克，增重1.69克，每克載體上含聚丁二酰亞胺0.101克。
實施例二12.4克聚丁二酰亞胺溶于65mL DMF中，加入15克3-氨基丙基玻璃微球，摩爾數(shù)之比1∶6。其余操作同例一。得聚丁二酰亞胺-玻璃微球16.98克，增重1.98克，每克載體上含聚丁二酰亞胺0.117克。
實施例三14.0克聚丁二酰亞胺溶于65mL DMF中，再加入15克3-氨基丙基硅膠，摩爾數(shù)之比1∶6.5。其余操作同例一。得聚丁二酰亞胺-硅膠固體產(chǎn)品17.27克，增重2.27克，每克載體上含聚丁二酰亞胺0.131克。
實施例四17.2克聚丁二酰亞胺溶于75mL DMF中，再加入15克3-氨基丙基硅膠，摩爾數(shù)之比1∶8。其余操作同例一。得聚丁二酰亞胺-硅膠17.41克，增重2.41克，每克載體上含聚丁二酰亞胺0.138克。
上述實施例中的濾液可循環(huán)使用。例如，向實施例三中的濾液補加2克聚丁二酰亞胺，再加入15克3-氨基丙基硅膠，其余操作同例一。得17.09克聚丁二酰亞胺-硅膠，增重2.09克，每克載體上含聚丁二酰亞胺0.122克。
二、新載體應用效果新載體應用效果可用圖3、圖4、圖5曲線圖說明。其中符號■為用新載體制備的固定化脂肪酶，符號▲為用3-氨基丙基硅膠為載體制備的固定化脂肪酶，符號●為脂肪酶。
如圖3所示，用新載體制備的固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性最高，這是通過將上述三種物質置于不同溫度下催化橄欖油水解，測定其活力和計算其相對活力得出的。圖中相對活力，其定義是某個溫度下的活力值與其中最高活力值之比得到的百分數(shù)，即為該溫度下的相對活力。
如圖4所示，在pH≤7.0的緩沖溶液中，用新載體制備的固定化脂肪酶的相對活力，要比用3-氨基丙基硅膠為載體制備的固定化脂肪酶的相對活力大得多。此圖中的相對活力，其定義是某個pH值下的活力值與其中最高活力值之比得到的百分數(shù)，即為該pH值下的相對活力。圖中pH≤8.0的緩沖溶液，由KH2PO4和NaOH配制，pH≥9.0的緩沖溶液由K2HPO4和NaOH配制，濃度均為0.1mol/L。
如圖5所示，用新載體制備的固定化脂肪酶在緩沖溶液中，其活力保持的時間要比用3-氨基丙基硅膠為載體制備的固定化脂肪酶在同樣的條件下長得多，而且它在30～35℃下的緩沖溶液中的活力比保存在4℃下的活力還要高，放置到90天時其活力仍比保存在4℃下的活力約高55％。所謂同樣條件，是指將這兩種物質置于5mL緩沖溶液和30～35℃的環(huán)境中，并且每隔一段時間測一次活力。
上述酶活力的測定過程是12克橄欖油加入40mL 25％聚乙烯醇溶液，在超聲波的作用下乳化5分鐘，得到白色乳狀液。將脂肪酶溶于緩沖溶液中，配成1mg/mL的溶液。5mL橄欖油乳狀液加入4mL緩沖溶液中，再加入1mL脂肪酶溶液，于37℃下反應30分鐘。以20mL乙醇-丙酮(1∶1,V/V)終止反應，加5滴酚酞溶液(當測酶在pH≥9緩沖溶液中的活力時，終止反應后，先向混合物中加入1mL 0.1mol/L KH2PO4溶液)，用0.04N NaOH溶液滴定至紅色，這個滴定值為V1。
在上述測定中，將1mL脂肪酶溶液在終止反應后加入混合物中，其余操作不變，同樣用0.04N NaOH溶液滴定至紅色，這個滴定值為空白值V2。由V1和V2的差值來計算酶的活力。
測固定化脂肪酶活力時，將5mL橄欖油乳狀液和0.15g用聚丁二酰亞胺-硅膠制備的固定化脂肪酶或0.7g用3-氨基丙基硅膠為載體制備的固定化脂肪酶加入5mL緩沖溶液中，其余操作同脂肪酶活力的測定。
用上述新載體制備固定化脂肪酶，如圖2所示，序號3是新載體，NH2-En是脂肪酶，序號4是用新載體制備的固定化脂肪酶。其方法是將0.6g脂肪酶和6g用實施例三制備的聚丁二酰亞胺-硅膠加入16mL緩沖溶液中，在4℃下攪拌6小時。抽濾，固定化脂肪酶用緩沖溶液洗四次，然后真空干燥。固定化反應的活力回收達90％，活力回收的定義為固定化酶與濾液中剩余酶的活力之和占用于固定化反應的脂肪酶總活力的百分數(shù)。該固定化反應液可以再利用，例如24mg脂肪酶和0.2g新載體加入緩沖溶液中，在4℃下攪拌6小時。離心分離，離心液加入另一份0.2g載體中，用0.4mL緩沖溶液洗固定化脂肪酶，洗滌液也加入另一份0.2g載體中，這一份混合物再在4℃下攪拌6小時，如此重復四次。每一次固定化脂肪酶都用緩沖溶液洗四次，然后真空干燥。測各次固定化脂肪酶的活力分別為13.5、11.7、8.9、6.5、5.9個單位。一個活力單位定義為每克固定化脂肪酶在一分鐘內催化橄欖油乳狀液水解所生成的脂肪酸的微摩爾數(shù)。
用上述3-氨基丙基硅膠為載體制備固定化脂肪酶，可參照文獻(Shi-Jun Ge etal.Biotechnol.Appl.Biochem.24,1,1996)制備，即10g 3-氨基丙基硅膠加入30mL2％甲醛的磷酸緩沖溶液(pH8.0,0.1mol/L)中，在4℃下攪拌12小時，抽濾，用蒸餾水洗，除去過量的甲醛。再將與甲醛反應過的3-氨基丙基硅膠加入含0.33g脂肪酶的30mL緩沖溶液中，在4℃下攪拌過夜。抽濾，固定化脂肪酶用緩沖溶液洗四次，然后在真空下干燥。濾液中酶的活力較低，活力回收為34％?；盍厥盏亩x為固定化酶與濾液中剩余酶的活力之和占用于固定化反應的脂肪酶總活力的百分數(shù)。
三、實施例中的原料及有關試驗中所用的儀器、試劑說明
1、原料聚丁二酰亞胺和3-氨基丙基硅膠、3-氨基丙基玻璃微球可由國外進口，也可以按下述方法制備。
按文獻[Pietro Tundo,et al.Journal of the American ChemistrySociety.101(22):6606,1979；]和劉立建等刊登在《離子交換與吸附》[11(6):541,1995]期刊上的“多孔硅球的活化和硅烷化”文章中公布的技術，制備3-氨基丙基硅膠(玻璃微球)50g硅膠加入150mL 7％的甲烷磺酸中，加熱使之回流5小時。冷卻，抽濾，用蒸餾水洗三次后，再用蒸餾水浸泡，再抽濾，用蒸餾水洗至中性，真空下干燥至恒重。然后，將43.2g經(jīng)酸處理后的硅膠加入40mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和120mL甲苯的混合物中，攪拌，緩慢升溫并使之回流10小時。冷卻，抽濾，用甲苯浸泡洗滌三次，再用無水乙醚洗三次，干燥至恒重，得3-氨基丙基硅膠49.27g，增重6.08g，每克硅膠上含1.48mmol氨基，其紅外光譜數(shù)據(jù)Y N-H(3228-3614cm-1,1100cm-1),δN-H(1639cm-1,801cm-1)。
以玻璃微球代替硅膠，制備3-氨基丙基玻璃微球，其操作同上，每克3-氨基丙基玻璃微球含1.42mmol氨基。
按文獻[Neri Paolo,et al.Journal of Medicinal Chemistry.16(8):893,1973l制備聚丁二酰亞胺50g研細的L-天冬氨酸和25g 85％的磷酸置于燒杯中混合均勻，然后將混合物均勻平攤在瓷盤中，在180℃下減壓反應4小時。冷卻，將粗產(chǎn)物加入200mLDMF中，攪拌使之溶解。將溶液緩慢倒入1L蒸餾水中，同時劇烈攪拌。靜置后抽濾，沉淀物用水洗至中性，真空于燥，得白色粉末狀固體32.5g，產(chǎn)率89％，特性粘度34.1mL·g-1(DMF,25℃)。
其紅外光譜數(shù)據(jù)YC=O(1788cm-1,1712cm-1)。
2、儀器和試劑Nicolet FT-IR紅外光譜儀烏氏粘度計。
硅膠為化學純，100-200目；多空玻璃微球為色譜固定相，120-160目；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(武漢大學化工廠產(chǎn)品)，用前減壓重蒸；L-天冬氨酸為生化試劑；橄欖油為化學純；甲苯、DMF、甲醛(40％)和無水乙醚為分析純；聚乙烯醇為實驗試劑，平均聚合度為1750±50；脂肪酶(porcine pancreas)為Sigma公司產(chǎn)品，蛋白質含量為25％，活力為55單位/毫克；緩沖溶液由分析純的KH2PO4NaOH(pH≤8.0)和K2HPO4、NaOH(pH≥9.0)配制，除特別注明外，緩沖溶液的pH值為7.5，濃度均為0.1mol/L。
權利要求
1.一種固定化酶載體，其特征在于所述的載體是由無機和有機材料載體構成的復合型載體，包括聚丁二酰亞胺和3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共價鍵相連。
2.一種制備權利要求1所述載體的方法，其特征是將聚丁二酰亞胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，加入3-氨基丙基硅膠或3-氨基丙基玻璃微球，按其氨基的摩爾數(shù)與聚丁二酰亞胺中的丁二酰亞胺結構單元的摩爾數(shù)之比1∶5～8投料，然后從反應混合物中收集生成物。
全文摘要
本發(fā)明是一種固定化酶載體,其由無機和有機材料載體構成,包括聚丁二酰亞胺和3－氨基丙基硅膠或3－氨基丙基玻璃微球,二者以共價鍵相連。其制備方法是:將聚丁二酰亞胺溶于N,N′,－二甲基甲酰胺中,加入3－氨基丙基硅膠或3－氨基丙基玻璃微球,按其氨基的摩爾數(shù)與聚丁二酰亞胺中的丁二酰亞胺結構單元的摩爾數(shù)之比1∶5～8投料,然后從反應混合物中收集生成物。本發(fā)明具有實用性強、利于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
文檔編號C12N11/00GK1216776SQ9812166
公開日1999年5月19日 申請日期1998年11月10日 優(yōu)先權日1998年11月10日
發(fā)明者柏正武, 周宜開, 任恕 申請人:同濟醫(yī)科大學