專利名稱：新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白和編碼序列、及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白OB-RGRP2及其核酸編碼序列，生產(chǎn)該核酸序列和蛋白多肽的方法，以及該多肽和核酸序列的用途。
肥胖癥是西方發(fā)達國家中最常見的營養(yǎng)性疾病。30％以上的成年人體重超過標準體重的20％。因此，肥胖癥成為了重要的公共健康問題。此外，肥胖常與糖尿病，高血壓病，高脂血癥，心腦血管病甚至癌癥密切相關(guān)。因而，人們對肥胖癥的研究一直投入了大量的人力和物力。然而，肥胖的分子機制一直不清。
多年以來人們認為肥胖與遺傳和基因有關(guān)。近年從一種患肥胖癥的小鼠中克隆到一個與肥胖密切相關(guān)的基因-ob基因，該基因編碼一個調(diào)節(jié)人體能量平衡的激素類因子，稱為肥胖抑素(leptin，也有人譯為消瘦素)，后來，在人類中也克隆到同源的OB基因[Zhang Y，et al.Nature 1994；372425]。人類的OB基因被定位于7q31.3。OB基因編碼由167個氨基酸殘基組成的肥胖抑素原蛋白，在去除了N-端的21個氨基酸長的信號肽之后，形成的成熟肥胖抑素含有146個氨基酸。研究表明，肥胖抑素主要由白色的脂肪組織細胞所分泌。
研究還表明，肥胖抑素有多方面的生物學作用[Halaas JL，et al.Science1995；269543](1)調(diào)節(jié)能量代謝的平衡。這是肥胖抑素的最重要的功能之一，主要調(diào)節(jié)食物的攝入和刺激能量的消耗(包括生成熱量)。其作用部位和途徑有兩個A.作用于中樞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要的靶位點是下丘腦。肥胖抑素經(jīng)滲透轉(zhuǎn)運方式通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。肥胖抑素下游作用分子可能是下丘腦神經(jīng)肽Y(NPY)。NPY能刺激食物的攝入，而肥胖抑素可抑制NPY合成。另外，其他一些因子或激素如促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、糖原樣多肽等也可能與肥胖抑素的活性有關(guān)。
B.作用于外周組織肥胖抑素通過調(diào)控脂質(zhì)代謝而發(fā)揮調(diào)節(jié)能量平衡的作用。肥胖抑素可直接抑制細胞內(nèi)脂肪酸和甘油三酯的合成，同時增加脂質(zhì)的氧化，從而導致細胞中脂肪酸和甘油三酯的含量下降。進一步的研究表明，線粒體中氧化作用的增加并不伴有ATP合成的增加，也就是說，氧化作用所增加的能量大多被轉(zhuǎn)換成了熱量。
(2)肥胖抑素對其他系統(tǒng)也有重要的調(diào)節(jié)作用。例如A.對生殖系統(tǒng)，肥胖抑素對胚胎的發(fā)育和成熟有重要作用。B.對造血系統(tǒng)，肥胖抑素可直接作用于早期造血過程及刺激紅系和粒系祖細胞的發(fā)育和分化。這提示，肥胖抑素對血液病有治療價值，比如可用于分離OB-R陽性的早期造血祖細胞，這對造血干細胞移植有重要意義。另外也可用于治療貧血及增強巨噬細胞功能和免疫力。
肥胖抑素是通過位于細胞表面的肥胖抑素受體(簡稱“OB-R”)的介導而起作用的。OB-R是一種跨膜蛋白，它與白介素-6的受體gp130亞單位有相當高的同源性，屬于細胞因子I類家族[Tartaglia LA，et a1.Cell 1995；831263]。
已發(fā)現(xiàn)主要有二種類型的受體OB-RL和OB-RS。OB-RL由3000多個氨基酸殘基組成，其胞內(nèi)部分長約303個氨基酸，含有與胞內(nèi)信號傳導有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，如與Jak結(jié)合的基序(Motif)和激活STAT的基序。OB-RS缺少了STAT基序，但其胞外部分與OB-RL完全相同。目前至少有四種長度不等的OB-RS。
另一種更短的肥胖抑素受體還缺失了跨膜部分，它是一種存在于血液中的可溶性成分，有可能是一種肥胖抑素的結(jié)合蛋白。其來源可能是由OB-RS經(jīng)蛋白酶作用后胞外部分進入血液所形成的。
OB-RL主要在下丘腦中表達，在其他組織中表達量少。而OB-RS在各種組織中均有不同程度的表達，以肺和腎等組織中表達最高。兩種OB-R的結(jié)構(gòu)和表達譜的差異決定了兩者功能上有所不同。目前認為，肥胖抑素的作用主要由OB-RL介導。
肥胖癥的一種病因是由于肥胖抑素基因缺陷而導致肥胖抑素合成受阻或活力喪失，但這種肥胖抑素基因缺陷所致的肥胖癥發(fā)病率是極低的。大多數(shù)肥胖癥可能對肥胖抑素抵抗(leptin resistance)所致?，F(xiàn)在認為肥胖抑素抵抗主要有兩種原因A.肥胖抑素由血液通過血腦屏障進入下丘腦的過程受阻，從而使脂肪組織分泌的肥胖抑素不能有效地通過血腦屏障，然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對肥胖抑素仍是敏感的。由此可推測，能夠自由通過血腦屏障的OB-R激活劑可能對治療這種肥胖癥有重要價值。B.肥胖抑素受體或受體后的因子發(fā)生功能下降或喪失，從而導致抵抗現(xiàn)象。與肥胖抑素受體及下游信號傳導途徑中任一環(huán)節(jié)的功能下降或喪失都可能與肥胖癥發(fā)病有關(guān)?？梢?，OB-R是肥胖癥發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，同時也是治療和預防肥胖癥的重要靶位點[Tartaglia LA.J Bio Chem 1997；2726093]。
最近，有學者克隆到一個與OB-R基因相關(guān)的基因。該基因含有一個396bp的開放閱讀框(ORF)，編碼131個氨基酸的蛋白質(zhì)，命名為OB-RGRP(OB-R Gene relatedprotein，譯為“肥胖抑素受體基因相關(guān)蛋白”)。OB-RGRP的前2個外顯子的序列(164bp)與OB-R的5′-非翻譯區(qū)序列同源性為100％，但165bp以后的序列與OB-R完全不同[Bailleul B，et al.Nucleic Acids Res 1997；252752]。因此作者提出，OB-RGRP與OB-R屬于同一個基因座位，由同一個啟動子所控制，經(jīng)不同的外顯子剪接過程而形成不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
對OB-RGRP進行同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)與線蟲的C30B5.2蛋白較高的同源性。有兩個結(jié)構(gòu)域(domain)高度同源(1)從+9至+27位的結(jié)構(gòu)域1，該結(jié)構(gòu)域由高度疏水和非極性氨基酸組成；(2)從+65至+88位的結(jié)構(gòu)域2。這些結(jié)構(gòu)域可能是跨膜結(jié)構(gòu)。在許多細胞因子受體(包括OB-R)家族中，在跨膜結(jié)構(gòu)的近端有一個Pro-X-Pro序列(式中，X表示任一氨基酸殘基)位于一組疏水性殘基之后，這一序列稱為box1。如果兩個Pro被Ser替代，則受體介導的JAK2酪氨酸磷酸化消失。在OB-RGRP中也存在一個類似的box1(Pro46-Ile-Pro48)。目前已知，OB-RL能夠引導JAK/STAT信號傳導途徑，但OB-RS則不能引導此傳導途徑。而且兩種OB-R都含有box1序列，因此這說明box1尚不足以激活JAK/STAT系統(tǒng)。但是兩種OB-R在肥胖抑素的刺激下都能誘導下游信號分子基因的表達，這提示OB-RGRP可能是肥胖抑素信號傳導過程中一個重要的協(xié)同蛋白，尤其是對OB-RS介導的信號傳導。
由于OB-R屬于I類細胞因子受體家族，與OB-R結(jié)構(gòu)和功能相似和信號傳導途徑類同的其他I類細胞因子如干擾素、白細胞介素6受體等可能也有類似的協(xié)同蛋白。
但是，在本申請之前，沒有發(fā)表或公開過本發(fā)明所涉及的新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白及編碼序列。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的核酸編碼序列，該核酸序列編碼肥胖抑素受體相關(guān)蛋白家族的一個新成員，本發(fā)明新的人基因被命名為OB-RGRP2。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白，該蛋白被命名為OB-RGRP2蛋白。
本發(fā)明的第三個目的是提供利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述新的人OB-RGRP2核酸序列和多肽的方法。
本發(fā)明的第四個目的是提供人OB-RGRP2核酸序列和多肽的應用。
本發(fā)明的第五個目的是提供針對OB-RGRP2的抗體。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離的核酸分子，它包括編碼具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列至少有70％的同源性；或者該核苷酸序列能夠在高度嚴緊條件下與SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列雜交。較佳地，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該核苷酸序列具有SEQ ID No.1中85-480位的序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的OB-RGRP2多肽，它包括具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽具有SEQ ID No.2氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有上述核酸分子的載體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的制備方法，該方法包括(a)將編碼具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成OB-RGRP2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成OB-RGRP2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達OB-RGRP2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了能上述的OB-RGRP2多肽特異性結(jié)合的抗體本發(fā)明所提供的新的與肥胖抑素受體相關(guān)的蛋白，被命名為OB-RGRP2。一方面，OB-RGRP2作為肥胖抑素(OB-R)的協(xié)同蛋白，能促進肥胖抑素的信號傳導；另一方面OB-RGRP2具有協(xié)同其它I類細胞因子受體的作用，在細胞的發(fā)育和分化、代謝、調(diào)節(jié)免疫功能等方面都有重要功能。OB-RGRP2的功能異常可引起肥胖癥、造血系統(tǒng)的疾病、糖尿病、免疫功能的紊亂、惡性腫瘤等?？筄B-RGRP2的抗體可用于診斷或治療與OB-RGRP2相關(guān)的疾病。
本發(fā)明的特征之一是一種分離的或純化的核酸(多聚核苷酸)序列，這種核酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨其酸序列的OB-RGRP2多肽。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中85-480位序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。較佳地，該核酸序列與SEQ ID NO1所示的序列基本上相同。本發(fā)明所說的“基本上相同”是指同源性至少80％，較佳地至少90％，更好地至少95％，最好至少99％。
本發(fā)明的多聚核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA，基因組DNA，或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或雙鏈。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列(85-480bp)相同或者是簡并變異體。在本發(fā)明中，“簡并變異體”是指編碼具有SEQ ID NO2序列的蛋白質(zhì)或肽但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明還包括了分離或純化的、在嚴緊條件下能與SEQ ID NO1序列(尤其是開放閱讀框序列)雜交的核酸片段。在本發(fā)明中，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較佳地至少20個核苷酸，更佳地至少40個核苷酸，最佳地至少60個核苷酸?！半s交”是指與一段特異的核酸序列結(jié)合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的那樣，“嚴緊條件”通常是指(1)低離子強度和高溫度下的雜交和洗脫，比如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，比如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/O.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少95％，更好地至少97％時才發(fā)生雜交。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)，以便確定和/或分離出編碼OB-RGRP2的多聚核苷酸。
本發(fā)明的多聚核苷酸的編碼區(qū)序列可以是如SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列的等位基因變異體。已有技術(shù)已經(jīng)表明，等位基因變異體是多聚核苷酸中一個或多個(通常為1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的替代、缺失或插入所形成的替換形式，還包括在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸所形成的替換形式。這些替換形式基本上不改變所編碼的蛋白或多肽的功能。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了具有SEQ ID No.1所示序列的核酸分子，其中，開放閱讀框位于85-480位核苷酸。
本發(fā)明還提供了分離或純化的OB-RGRP2多肽，比如具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明中，術(shù)語“OB-RGRP2蛋白和/或多肽”指有OB-RGRP2蛋白活性的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人OB-RGRP2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那樣，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括OB-RGRP2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與OB-RGRP2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗OB-RGRP2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含OB-RGRP2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了OB-RGRP2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有OB-RGRP2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約30個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供了OB-RGRP2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然OB-RGRP2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。
在本發(fā)明中，“OB-RGRP2的保守性變異多肽”指與SEQ ID No.2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1<
在本發(fā)明中，“分離的或純化的”是指物質(zhì)已從其原始環(huán)境中被分離出來(如果是天然物質(zhì)，原始環(huán)境就是天然環(huán)境)。例如，在活體細胞中處于天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是未分離和純化的，但如果同樣的多聚核苷酸或多肽與天然狀態(tài)中同時存在的其他物質(zhì)中分開，就是分離或純化的。
本發(fā)明還包括含有SEQ ID NO1中開放閱讀框序列的核酸分子或其變異體或其片段的載體，還包括用該載體進行遺傳工程改造的宿主細胞，以及用DNA重組技術(shù)獲得的本發(fā)明的蛋白或多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了診斷與OB-RGRP2功能異常相關(guān)的疾病的方法，其中包括(但不限于)檢測組織或細胞中OB-RGRP2的表達或OB-RGRP2基因的突變。通過測定組織或細胞中OB-RGRP2的mRNA水平或蛋白水平可以判斷OB-RGRP2的表達。
本發(fā)明還提供了治療與OB-RGRP2功能異常相關(guān)的疾病的方法，其中包括(但不限于)給細胞施用有效量的復合物，以激活或抑制OB-RGRP2的產(chǎn)生或活性。該復合物的種類包括化合物；與OB-RGRP2結(jié)合的配體、多肽或抗體；反義寡核苷酸；核酶(Ribozyme)；以及它們的混合物。
克隆本發(fā)明的OB-RGRP2基因的方法是本領(lǐng)域中熟練人員所常用的。一種可行的途徑是利用來源于哺乳動物組織(如胚胎腦或肝或肺等)細胞的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄方式合成cDNA，并構(gòu)建相應的cDNA文庫，再從文庫中獲得含OB-RGRP2基因的克隆。
提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，有關(guān)的試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。構(gòu)建cDNA文庫的方法也是常規(guī)的方法(Sambrook，et al，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。另外還可直接從商業(yè)途徑(如Clontech)獲得多種組織的cDNA文庫。
從cDNA文庫中獲得OB-RGRP2基因，包括(但不限于)以下兩種技術(shù)路線一是先篩選文庫含有OB-RGRP2 cDNA克隆，再對這些陽性克隆進行DNA序列分析；二是先測定文庫中所有克隆的插入DNA片段的5′和3′序列，然后再找出含有OB-RGRP2 cDNA的克隆，并進行全長cDNA的序列分析。
篩選文庫的方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因的功能顯現(xiàn)或喪失；(3)測定OB-RGRP2的轉(zhuǎn)錄物的水平；(4)應用免疫學技術(shù)或測定生物學活性檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單獨使用，也可多種方法組合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與OB-RGRP2 DNA片段(如SEQ ID No.1所示序列的片段)的任何一部分相同，探針的長度至少10個連續(xù)核苷酸，較好是至少約20-30個連續(xù)核苷酸，更好是至少約50-60個連續(xù)核苷酸，最好是至少約100個核苷酸。探針的長度通常為5kb以內(nèi)，較佳地2kb以內(nèi)，更佳地1kb以內(nèi)，最佳地500bp以內(nèi)。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測OB-RGRP2基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學技術(shù)如Western印跡法、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等進行。
DNA序列的測定可用常規(guī)的雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)，而測序所用的引物可已知的cDNA序列(如SEQ ID No.1的序列)設計。
為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
如果未能獲得完整的5′端編碼序列(這在cDNA克隆中是經(jīng)常遇到的問題)，則需要進行RACE(cDNA末端快速擴增技術(shù))。
一旦獲得全長的cDNA序列，則可用計算機對序列進行分析，如開放閱讀框的位置、可能的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及其基因或蛋白結(jié)構(gòu)的同源性比較等。
此外，在獲得了全長cDNA序列，就可以用常規(guī)方法設計和合成有關(guān)引物，通過PCR擴增法而獲得本發(fā)明蛋白的編碼序列。
本發(fā)明的OB-RGRP2多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的OB-RGRP2蛋白或多肽。一般來說有以下步驟(a)將編碼具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成OB-RGRP2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成OB-RGRP2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達OB-RGRP2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。
在步驟(a)中，所用的編碼具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可以是具有SEQ ID No.1編碼區(qū)的DNA片段或其變異體。
“表達調(diào)控序列”包括至少一個啟動子、至少一個終止密碼子和其他任何對于載體核酸序列的合適轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯所必需或優(yōu)選的DNA序列，例如前導序列、增強子等。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
表達載體的一個重要特征是含有適當?shù)膯幼雍头g控制元件。多種表達載體可從商業(yè)途徑得到。常用的載體包括(但不限于)質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母表達載體、病毒、Ti質(zhì)粒等，但最常用的載體首選質(zhì)粒。常用的宿主細胞包括(但不限于)細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞等，但最常用的宿主細胞為細菌，尤其是大腸桿菌。另一個較常用的表達系統(tǒng)是哺乳動物細胞系，如Hela細胞系、COS細胞系或CHO細胞系等。
可用本領(lǐng)域中熟練人員已知的方法構(gòu)建含OB-RGRP2編碼序列的重組表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(參見Sambrook，et al，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。
重組的OB-RGRP2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療OB-RGRP2功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或拮抗OB-RGRP2功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制OB-RGRP2的功能。此外，用表達的重組OB-RGRP2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的、能抑制或刺激OB-RGRP2功能的多肽分子。
本發(fā)明還提供了能特異地與OB-RGRP2結(jié)合的抗體或抗體片段?？贵w片段有Fab、Fab′、F(ab′)2或Fr片段?？贵w可以是單鏈的、人源化的或嵌合的抗體。
有多種方法可用于生產(chǎn)針對OB-RGRP2抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
抗OB-RGRP2的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)，以檢測活檢樣本中的OB-RGRP2的存在與否。與OB-RGRP2結(jié)合的單克隆抗體還可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤OB-RGRP2的位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于相關(guān)細胞的定位，如判斷腫瘤細胞是否有轉(zhuǎn)移等。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與OB-RGRP2相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷OB-RGRP2的產(chǎn)生或活性。
抗體也可被設計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如OB-RGRP2高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素、蓖麻蛋白、紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯)攻擊抗體上的氨基基團，通過二硫鍵的交換作用而將毒素結(jié)合于抗體上。這種雜交抗體可用于殺滅OB-RGRP2陽性細胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用OB-RGRP2蛋白或多肽免疫動物，如家兔、小鼠和大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，其中包括(但不限于)弗氏佐劑等。
OB-RGRP2單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975.256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。此外，已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No.4946778)，也可用于生產(chǎn)抗OB-RGRP2的單鏈抗體。
能與OB-RGRP2結(jié)合的多肽分子，可通過對由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫進行篩選而獲得。
OB-RGRP2多聚核苷酸還可用于OB-RGRP2相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，OB-RGRP2多聚核苷酸可用于檢測OB-RGRP2的是否表達或OB-RGRP2的表達是否異常(如在疾病狀態(tài)下)。如OB-RGRP2 DNA序列可用于對活檢樣本的雜交以判斷OB-RGRP2的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法、Northern印跡法和原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。另外，用OB-RGRP2特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(PCR)體外擴增也可檢測OB-RGRP2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。其中特異性的引物可以根據(jù)SEQ ID No.1序列進行設計，其長度通常為15-60個核苷酸，較佳地為20-50個核苷酸，更佳地為25-40個核苷酸。
另外，檢測OB-RGRP2基因的突變也可用于診斷OB-RGRP2相關(guān)的疾病。OB-RGRP2突變的形式包括點突變、易位、缺失、重組以及與正常野生型OB-RGRP2 DNA序列相比的其他任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有時會影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法和Western印跡法可間接地判斷基因有無突變。
OB-RGRP2多聚核苷酸還可用于多種治療用途?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于OB-RGRP2的無表達或異常的/無活性的OB-RGRP2的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的OB-RGRP2，用于抑制內(nèi)源性的OB-RGRP2活性。例如，一種變異的OB-RGRP2可以是截短的、缺失了信號傳導功能域的OB-RGRP2。因此，這種變異的OB-RGRP2雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導活性。這樣，重組的基因治療載體就用于治療OB-RGRP2表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將OB-RGRP2基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶OB-RGRP2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。另外，重組OB-RGRP2基因可被包裝在脂質(zhì)體中而轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
抑制OB-RGRP2mRNA翻譯的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)和核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何常規(guī)合成RNA或DNA的技術(shù)獲得，如已廣泛應用的固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)。反義RNA分子也可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得，其中該DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，例如增加兩側(cè)的序列長度，使寡核苷酸應用磷酸硫酯鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法是本領(lǐng)域中已知的各種常規(guī)技術(shù)，其中包括(但并不限于)將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人OB-RGRP2與OB-RGRP的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。
圖2為本發(fā)明的人OB-RGRP2與線蟲的C30b5的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，(比如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件)，或按照制造廠商所建議的條件進行。
實施例1OB-RGRP2基因的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2微克poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA.用UniZAPxR載體試劑盒(購自Stratagene)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5細菌形成cDNA文庫。共獲得3028個克隆。用雙脫氧法測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個克隆(018e11)的DNA序列與人OB-RGRP的同源性達70.2％。通過合成一系列引物對018e11克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，018e11克隆所含的全長cDNA是一個新的DNA序列(如SEQ ID No.1所示)，從第85bp至480bp有一個396bp的ORF，編碼一個新的由131氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。該蛋白質(zhì)被命名為OB-RGRP2蛋白。
OB-RGRP2含有131個氨基酸，與OB-RGRP的長度完全相同。蛋白質(zhì)水平的同源性分析表明，OB-RGRP2與OB-RGRP相同性為67％，相似性為80％(圖1)。與線蟲的C30b5蛋白相同性為48％，相似性為78％(圖2)。結(jié)構(gòu)分析表明，OB-RGRP2存在兩個主要由疏水性氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域(9-27位和65-88位)，它們被推定為跨膜結(jié)構(gòu)，因而OB-RGRP2為跨膜蛋白。在結(jié)構(gòu)域1區(qū)存在一個LRRs基序，該基序富含亮氨酸，其功能主要參與蛋白-蛋白之間的相互作用。在結(jié)構(gòu)域1的下游，還存在一個Pro-X-Pro的基序(SEQ ID No.2中第46-48位氨基酸Pro Ile Pro)，該基序與Jak2的功能有關(guān)。上述結(jié)果表明，OB-RGRP2與OB-RGRP同屬于一個基因家族，具有OB-RGRP相似的功能，即作為OB-R的協(xié)同蛋白促進肥胖抑素的信號傳導；另外，還可能具有協(xié)同其它細胞因子受體的作用，因而其功能比OB-RGRP更為廣泛。在細胞的發(fā)育和分化、代謝、調(diào)節(jié)免疫功能等方面都有重要作用。
本發(fā)明的人OB-RGRP2除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人OB-RGRP2還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人OB-RGRP2的N端與人OB-RGRP的N端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人OB-RGRP2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
例如，本發(fā)明人OB-RGRP2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人OB-RGRP2的表達水平或者抑制人OB-RGRP2的過度表達。本發(fā)明的人OB-RGRP2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人OB-RGRP2缺失、無功能或異常而導致的有關(guān)病癥，尤其是一些與肥胖有關(guān)的病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預后判斷。
實施例2用RT-PCR方法克隆OB-RGRP2用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用Qiagen的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增正向引物F15’-CCGCCGTAGCGCGTCTTG-3’位于SEQ ID No.1的起始處；反向引物R15’-GCATAGCAATTATTTTCCAG-3’位于SEQ ID No.1的1532-1551bp。擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/LMgCl2，200μmol/L dNTP，25pmol引物，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀上按下列條件反應25個周期94℃ 30秒；55℃，30秒；72℃ 2分鐘。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物QLAGEN試劑盒純化后，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen)，并測定DNA序列。結(jié)果PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1的1-1551bp完全相同。
實施例3重組OB-RGRP2的體外表達，分離和純化分別在OB-RGRP2基因的起始密碼子處及終止密碼子處設計了一對引物，其5’端分別帶有BamHI和EcoRI酶切位點。以質(zhì)粒018e11或市售的cDNA文庫為模板進行PCR擴增獲得OB-RGRP2基因編碼區(qū)。經(jīng)過酶切將擴增片段插入表達載體pGEX-2T(購自Pharmacia Biotech)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，在含氨芐青霉素和IPTG的LB平板上，篩選白色的5個重組轉(zhuǎn)化子進行DNA序列分析，結(jié)果與018e11中的基因編碼區(qū)序列完全相同。該重組克隆能表達GST-OBRGRP2融合蛋白，克隆記為pOBRGRP2。
挑一環(huán)大腸桿菌DH5α(pOBRGRP2)菌株，接種于20ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100微克/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜作為種子液，取種子液按2％接種量轉(zhuǎn)接于4升LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至菌體A600＝0.7時(對數(shù)生長期)，加入IPTG至終濃度0..4mmol/L，再培養(yǎng)25℃培養(yǎng)12小時，離心收集菌體，用1×PBS洗用緩沖液A(16mMNa2HPO4，4mM NaH2PO4，pH6.5)按10ml/克菌體溶解，冰浴中超聲破碎，離心后收集上清，上清液過谷胱甘肽-Sepharose 4B層析柱，用緩沖液A淋洗后，用含5mM還原型谷胱苷肽的洗脫液進行洗脫。洗脫液經(jīng)SDS-PAGE顯示約44kDa處有GST-OBRGRP2融合蛋白產(chǎn)物。
實施例4抗OB-RGRP2抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE-ABI)合成下述OB-RGRP2特異性的多肽NH2-Leu-Pro-Ile-Val-Phe-Ala-Arg-Ala-His-Leu-COOH。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白偶合形成復合物，方法參見Avrameas.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與OB-RGRP2結(jié)合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海生元基因開發(fā)有限公司(ii)發(fā)明名稱新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白和編碼序列、及制法和用途(iii)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度2701bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA.(xi)序列描述SEQ ID NO.11CCGCCGTAGC GCGTCTTGGG TCTCCCGGCT GCCGCTGCTG CCGCCGCCGC51CTCGGGTCGT GGAGCCAGGA GCGACGTCAC CGCCATGGCA GGCATCAAAG101CTTTGATTAG TTTGTCCTTT GGAGGAGCAA TCGGACTGAT GTTTTTGATG151CTTGGATGTG CCCTTCCAAT ATACAACAAA TACTGGCCCC TCTTTGTTCT201ATTTTTTTAC ATCCTTTCAC CTATTCCATA CTGCATAGCA AGAAGATTAG251TGGATGATAC AGATGCTATG AGTAACGCTT GTAAGGAACT TGCCATCTTT301CTTACAACGG GCATTGTCGT GTCAGCTTTT GGACTCCCTA TTGTATTTGC351CAGAGCACAT CTGATTGAGT GGGGAGCTTG TGCACTTGTT CTCACAGGAA401ACACAGTCAT CTTTGCAACT ATACTAGGCT TTTTCTTGGT CTTTGGAAGC451AAGGACGACT TCAGCTGGCA GCAGTGGTGA AAAGAAATTA CTGAACTATT501GTCAAATGGA CTTCCTGTCA TTTGTTGGCC ATTCACGCAC ACAGGAGATG551GGGCAGTTAA TGCTGAATGG TATAGCAAGC CTCTTGGGGG TATTTTAGGT601GCTCCCTTCT CACTTTTATT GTAAGCATAC TATTTTCACA GAGACTTGCT651GAAGGATTAA AAGGATTTTC TCTTTTGGAA AAGCTTGACT GATTTCACAC701TTATCTATAG TATGCTTTTT GTGGTGTCCT GCTGAATTTA AATATTTATG751TGTTTTTCCT GTTAGGTTGA TTTTTTTTGG AATCAATATG CAATGTTAAA801CACTTTTTTA ATGTAATCAT TTGCATTGGT TAGGAATTCA GAATTCCGCC851GGCTCTATTA CTGGTCAAGT ACATCTTTTC TCTTAAAATT ATTTAGCCTC901CATTATTACA AAAAATTATA AAAATAAGTT TTCAGTCAGT CAGGATGACA951TCACTCCCAA TGTTATGCAG ACATACAGAC GGTTGGCATA CGTTATAGAC1001TGTATACTCA GTGCAAATAT AGCTGCATTT ATACCTCAGA GGGGCCAAGT1051GTTAATGCCC ATGCCCTCCG TTAAGGGTTG TTGGTTTTAC TGGTAGACAG1101ATGTTTTGTG GATTGAAAAT TATTTTATGG AATTGCTACA GAGGAGTGCT1151TTTCTTCTCA ATTGTTAGAA GAATTTATGT TAAACTTTAA GGTAAGGGTG1201TAAAAACATT TTTGAGATAA GGTTTTTATT TATGTTTATT ATTGTTAGAG1251TGAGTTGCAA TGTGGGAAGA AATGACATTG AAATTCCAGT TTTTGAATCC1301TGTTTCTATT TATAAGTGAA ATTTGTGATC TCCTATCAAC CTTTCATGTT1351TTACCCTGTT AAAATGGACA TACATGGAAC CACTACTGAT GAGGGACAGT1401TGTATGTTTG CATCATATAT GCCAGAAAAC CTTCCTCTGC TTCCTCCTTT1451TGACTTATTT GGTATGTTGT ATATATTACA TAAAATAACT TTTCAAATAT1501AGTTTAATAA CACTTAGAAG TGTTTACTTA CCTGGAAAAT AATTGCTATG1551CCGTACATTC AGAGTGCCCC CTCCCCTGCA AGGCCTTGCC ATGATTAACA1601AGTAACTTGT TAGTCTTACA GATAATTCAT GCATTAACAG TTTAAGATTT1651AGACCATGGT AATAGTAGTT CTTATTCTCT AAGGTTATAT CATATGTAAT1701TTAAAAGTAT TTTTAAGCCA AGTTTCCTGT ATACCTCTGA ACTGTTTTGA1751TTTTGAGTTC ATCATGATAG ATCTGCTGTT TCCTTATAAA AGGCATTTGT1801TGTGTGAGTT AATGCAAAGT AGCCAAGTCC AGCTATATAG CAGCTTCAGA1851AACATACCTG ACCAAAAAAT TCCCAGTAAC CAGGCATGAT CAATTTATAG1901TGGTCGTTTA CATCTAATAA TTATCAGGAC TTTTTTCAGG AGTGGGTTAT1951AAAAACATTC AAGTTGGTCT GACAGTATTT TGTTAAGGAT ATTTGTTTGT2001ATGTTTATTC AGTATACTTA CATAAAAATT ATTTCGCCAT CAGCCAAAAC2051TCAGTAATCA TGACAGCTGT CTGTTGTTTT ATGAAGTTTA TTTCTCAAGA2101AAATGGGAAT AAATTTGGGA TTTGTTCAGC TTTTTTACTA AAGATGCCTA2151AAGCCACAGG TTTTATTGCC TAACTTAAGC CATGACTTTT AGATATGAGA2201TGACGGGAAG CAGGACGAAA TATCGGCGTG TGGCTGGAGC CTTCCCACTG2251GAGGCTGAAA GTGGCTTGTG GTATTATAAT GTTCAGATTT CAAGAGGAAG2301GTGCAGGTAC ACATGAGTTA GAGAGCTGGT GAGACAGTTG GGAACTCTTT2351GTGCTTGTGA TCTACTGGAC TTTTTTTTTG CAGGAAGTGC ATTCTCTGGT2401CCTTCCCTAT TTTCTGTTCT GGATGTCAGT GCAGTGCACT GCTACTGTTT2451TATCCACTTG GCCACAGACT TTTTCTAACA GCTGCGTATT ATTTCTATAT2501ACTAATTGCA TTGGCAGCAT TGTGTCTTTG ACCTTGTATA CTAGCTTGAC2551ATAGTGCTGT CTCTGATTTC TAGGCTAGTT ACTTGAGATA TGAATTTTCC2601ATAGAATATG CACTGATACA ACATTACCAT TCTTCTATGG AAAGAAAACT2651TTTGATGATG AAACAATAAA GATTTTAAAT ATCAAAAAAA AAAAAAAAAA2701A(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度131個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.21 Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe Gly Gly Ala16 Ile Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Pro Ile Tyr31 Asn Lys Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser46 Pro Ile Pro Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu Val Asp Asp Thr Asp61 Ala Met Ser Asn Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr76 Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Ile Val Phe Ala Arg91 Ala His Leu Ile Glu Trp Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly106 Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe121 Gly Ser Lys Asp Asp Phe Ser Trp Gln Gln Trp
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其特征在于，它包括編碼具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列至少有70％的同源性；或者該核苷酸序列能夠在高度嚴緊條件下與SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的分子，其特征在于，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的分子，其特征在于，該核苷酸序列具有SEQ ID No.1中85-480位的序列。
4.一種分離的OB-RGRP2多肽，它包括具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的核酸分子。
7.一種用權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.一種具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成OB-RGRP2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成OB-RGRP2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達OB-RGRP2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的OB-RGRP2多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種核酸分子，它含有權(quán)利要求1所述的核酸分子中連續(xù)的10-2000核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的肥胖抑素受體相關(guān)蛋白OB－RGRP2及其核酸編碼序列,該蛋白是與肥胖抑素受體相關(guān)的蛋白,并且與OB－RGRP高度同源。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)該核酸序列和蛋白多肽的方法,以及該多肽和核酸序列的用途。
文檔編號C12N15/12GK1253178SQ9812147
公開日2000年5月17日 申請日期1998年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月30日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 黃燕 申請人:上海生元基因開發(fā)有限公司