專利名稱：D－泛解酸和d－泛酸的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的D-泛解酸和/或D-泛酸(或其鹽)的生產(chǎn)方法和純化方法，一種能夠生產(chǎn)它的微生物，和一種具有包括在泛解酸或其鹽或其部分區(qū)域的生物合成中的一種基因區(qū)的質(zhì)粒DNA。泛酸是一種有用的維生素物質(zhì)。D-泛解酸是用作合成泛酸和CoA的重要中間體物質(zhì)。
通常D-泛酸(或其鹽)即一種重要的維生素物質(zhì)的生產(chǎn)方法包括(1)通過DL-泛酸內(nèi)酯(pantolactone)的光分解獲得D-泛酸內(nèi)酯和β-丙氨酸(或其鹽)在甲醇中化學(xué)縮合的方法，(2)D-泛酸酯水解成D-泛酸的方法，D-構(gòu)型的DL-泛酸酯選擇性水解成D-泛酸的方法，這兩種方法均使用微生物或一種酶(未審公開的日本專利Nos.228487/1989和228488/1989),(3)使泛解酸鉀、β-丙氨酸和ATP與在Tris緩沖液中的休眠細(xì)胞或微生物酶接觸得到泛酸的方法(描述于Journal of Biological Chemistry，第198卷，第23頁(1952)，發(fā)表于第176屆American Chemical Society National Meeting的Abstractsof Papers,Divi sion of Microbial and BioehemicalTechnology,No.48(1978)和其它公開出版物)。
通常D-泛解酸和/或D-泛酸內(nèi)酯的生產(chǎn)方法包括(4)將一種分解劑例如奎寧或番木鱉堿用于光分解的方法，(5)用一種特定的微生物使DL-泛酸內(nèi)酯中的L-泛酸內(nèi)酯分解，得到單一的D-泛酸內(nèi)酯的一種方法(審定公開的日本專利No.19745/1972),(6)用一種特定的微生物使DL-泛酸內(nèi)酯中單一的L-泛酸內(nèi)酯氧化得到酮泛酸內(nèi)酯(ketopantol actone)，然后使它不對稱地還原成D-泛酸內(nèi)酯的方法(審定公開的日本專利No.293386/1986),(7)將化學(xué)合成酮泛酸內(nèi)酯用一種特定的微生物不對稱地還原成D-泛酸內(nèi)酯的方法(審定公開的日本專利No.14797/1986)，(8)用一種特定的微生物使DL-泛酸內(nèi)酯中的L-構(gòu)型不對稱的水解成L-泛解酸的方法(未審查公開的日本專利Nos.152895/1982和294092/1987)以及(9)用一種特定的微生物使DL-泛酸內(nèi)酯中的D-構(gòu)型選擇性不對稱水解成D-泛解酸的方法(審定公開的日本專利No.65198/1991)。
人們關(guān)心怎樣收集泛酸的鹽，一種公知方法是在結(jié)晶前加入氯化鈣，以得到高產(chǎn)率和高純度的泛酸鈣和氯化鈣的絡(luò)合鹽結(jié)晶(如Jonathan O.Brooks 1960年10月18日申請的US2957025，審定公開的日本專利No.49571/1972等所述)。然而，沒有一種方法能從這樣獲得的絡(luò)合鹽中去除氯化鈣以高產(chǎn)率獲得泛酸鈣，該絡(luò)合鹽是通常所述的成品。
在工業(yè)化生產(chǎn)D-泛酸(包括其鹽；以下應(yīng)用相同)中，方法(1)不僅需要復(fù)雜的工藝以合成原料DL-泛酸內(nèi)酯，而且需要一種麻煩且困難的方法進(jìn)行其光分解。方法(2)缺點是需要由DL-泛酸內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛酸酯或DL-泛酸酯的方法。方法(3)的缺點在于需要使用昂貴的ATP和Tris緩沖液；泛酸的產(chǎn)率僅為痕量，且當(dāng)使用昂貴的D-泛解酸(或其鹽)作為原料時是不實用的。
還有，D-泛解酸和/或D-泛酸內(nèi)酯的大部分生產(chǎn)方法的失敗在于它們使用DL-泛酸內(nèi)酯作為原料，它需用麻煩的合成工藝。然而，方法(4)的缺點為，例如使用一種昂貴的分解劑和D-泛酸內(nèi)酯回收困難，以及方法(5)具有所生產(chǎn)的DL-泛酸內(nèi)酯丟失一半的缺陷。在方法(6)、(7)、(8)和(9)中，由于所用微生物的性質(zhì)，或由于泛酸內(nèi)酯(或泛解酸)的性質(zhì)，在培養(yǎng)肉湯中生產(chǎn)100％光學(xué)純的單一的D-構(gòu)型是非常困難的。方法(4)、(8)、和(9)也涉及更多麻煩的工藝因為要回收、消旋和重新利用殘余的L-構(gòu)型。
通過對于D-泛酸的有利于工業(yè)化和更有效的生產(chǎn)方法的廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在添加β-丙氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一種微生物會導(dǎo)致D-泛酸的形成。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)D-泛解酸能通過培養(yǎng)耐水楊酸的菌株進(jìn)行積累，通過在添加β-丙氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)耐水楊酸的菌株可生產(chǎn)高濃度的D-泛酸，并且使用能耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和/或O-甲基蘇氨酸的菌株會增加D-泛解酸和D-泛酸的產(chǎn)量。同時，本發(fā)明人通過研究應(yīng)用基因重組技術(shù)進(jìn)行菌株繁殖，發(fā)現(xiàn)用包括泛酸或其鹽生物合成運載基因的一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株在培養(yǎng)液中以甚至更高的濃度積累D-泛酸或D-泛解酸(和/或D-泛酸內(nèi)酯)。基于這些發(fā)現(xiàn)本發(fā)明人作進(jìn)一步研究，并發(fā)展成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(Ⅰ)一種生產(chǎn)D-泛解酸或其鹽的方法，該方法包括培養(yǎng)屬于腸桿菌科的一種微生物，該微生物耐水楊酸且能夠生產(chǎn)D-泛解酸，積累D-泛解酸或其鹽，并隨后收獲它；(Ⅱ)用微生物生產(chǎn)(Ⅰ)的方法，所用的微生物至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種；(Ⅲ)一種生產(chǎn)D-泛酸或其鹽的方法，其特征在于使屬于腸桿菌科的耐水楊酸和能生產(chǎn)D-泛酸的一種微生物與β-丙氨酸相接觸；(Ⅳ)用微生物生產(chǎn)(Ⅲ)的方法，所用的微生物至少耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸之一種；和(Ⅴ)用微生物生產(chǎn)(Ⅰ)-(Ⅳ)的方法，所用微生物是用包括泛酸或其鹽或其一部分區(qū)域生物合成運載基因區(qū)的一種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的一種微生物。
本發(fā)明也提供一種轉(zhuǎn)化的微生物和一種用于這些生產(chǎn)方法中所得至該微生物的質(zhì)粒，以及純化和分離所要化合物的方法。
本發(fā)明具有許多優(yōu)點，它不需要使用DL-泛解酸、泛酸內(nèi)酯等作原料，它能獲得100％光學(xué)純的D-構(gòu)型化合物，而且不需要回收L-構(gòu)型合物和使所獲得消旋化合物重新利用而進(jìn)行消旋的工序。


圖1表示實例3中獲得的質(zhì)粒pFv31的限制性圖。
在圖1中，E代表EcoRⅠ；EV代表EcoRⅤ；P代表PvuⅡ；B代表BglⅡ。
下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
在本發(fā)明中，D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸可以是它們的鹽。當(dāng)本說明書提及D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸時，不僅包括的游離形式，而且也包括其鹽。D-泛解酸、D-泛酸和β-丙氨酸的鹽包括堿金屬和堿土金屬鹽。在任何情況下，優(yōu)選的是鈣鹽、鈉鹽和鉀鹽。本發(fā)明合成D-泛酸和D-泛解酸的方法，其特征在于培養(yǎng)能夠生產(chǎn)泛酸和D-泛解酸的微生物，使其從各種碳源如葡萄糖中微生物地生產(chǎn)D-泛解酸，該D-泛解酸在培養(yǎng)液中進(jìn)行積累，或通過將β-丙氨酸與該微生物接觸，如將β-丙氨酸加入到培養(yǎng)液中，用β-丙氨酸進(jìn)行縮合，從而生產(chǎn)D-泛酸。在β-丙氨酸存在的條件下，能夠生產(chǎn)D-泛酸或D-泛解酸的微生物能用于本發(fā)明。特別是，優(yōu)選屬于腸桿菌科的微生物，如屬于檸檬酸細(xì)菌屬、志賀菌屬(Shigella)、克雷白桿菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙門菌屬、(Salmonella)和埃希桿菌屬(Escherichia)的微生物。更優(yōu)選地將屬于埃希桿菌屬和它的那些衍生形式的微生物用于本發(fā)明，其中包括已知的大腸桿菌菌株列于List of Cultures，第8版，由Institute forFermentation,Osaka出版，例如大腸桿菌K-12(IFO3301)和大腸桿菌IFO3547。
在力圖發(fā)展用埃希桿菌屬和其它屬微生物電碳源如糖重新合成D-泛解酸的更有效、更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法時，本發(fā)明人進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)人為地使菌株耐水楊酸時它就能生產(chǎn)大量的D-泛解酸。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在含有碳源的培養(yǎng)液中使該微生物與β-丙氨酸相接觸能積累大量的D-泛酸。
另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使這些菌株耐水楊酸以及耐α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸可生產(chǎn)更高濃度的D-泛酸。
用于本發(fā)明方法的突變體包括屬于腸桿菌科的微生物，其它微生物中屬于埃希桿菌屬的能生產(chǎn)D-泛解酸或D-泛酸。確切地說，這些突變體的實例為大腸桿菌FV5714(IFO15368)，它耐水楊酸，大腸桿菌FV525(IFO 15369)，它耐水楊酸和α-酮異戊酸，大腸桿菌FV814(IFO 15370)，它耐水楊酸、α-酮異戊酸和α-氧代丁酸，大腸桿菌FV521，它耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸和α-氨基丁酸，大腸桿菌FV 221，它耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、和β-羥基天冬氨酸，大腸桿菌FV 6051和大腸桿菌FV 5069，它們耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸。
用于本發(fā)明的突變體是通過對大腸桿菌IFO 3547(作為一種母菌株)進(jìn)行通常的致突變處理，例如紫外輻射，或用化學(xué)試劑例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍處理，然后在含有水楊酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。同樣，F(xiàn)V525是通過在含有α-酮異戊酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV5714(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV814是通過在含有α-氧代丁酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV525(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物獲得的。FV521是通過在含有α-氨基丁酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV814(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV221是通過在含有β-羥基天冬氨酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV814(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV6051是通過在含有O-甲基蘇氨酸(其濃度不能使母菌株生長)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV221(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。FV5069是通過在含有α-氧代丁酸(其濃度不能使母菌株生)的瓊脂板培養(yǎng)液中培養(yǎng)FV6051(作為母菌株)，然后分離該板培養(yǎng)液中的克隆生長物而獲得的。
在最終獲得的滿足本發(fā)明目的的一種菌株中，對藥物例如水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸的耐受力可以任何順序傳給菌株。α-酮異戊酸、α-氨基丁酸和O-甲基蘇氨酸也可用已知的支鏈氨基酸類似物來代替，例如4-氮雜亮氨酸、4-硫雜異亮氨酸和正纈氨酸。
上述菌株耐水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸和O-甲基蘇氨酸的程度在下列試驗實驗實例中加以說明。
試驗實例表1(下文“％”是指“重量/體積％”，除另有說明外)所示的組合物培養(yǎng)液在121℃進(jìn)行10分鐘的熱消毒之后，加入預(yù)先消毒過濾的水楊酸、α-酮異戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羥基天冬氨酸或O-甲基蘇氨酸以達(dá)到表2所示濃度。然后將該培養(yǎng)液分配到9厘米直徑的陪替氏培養(yǎng)皿。在每一個該瓊脂培養(yǎng)液中加入0.1毫升的菌株培養(yǎng)肉湯，該菌株選自大腸桿菌IFO3547、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069(如表2示)，在最少量培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時，接著再培養(yǎng)30小時。生長程度列于表2。
表1瓊脂組合物培養(yǎng)液(pH7.0)成分 濃度Na2HPO40.6％KH2PO40.3％NaCl 0.05％NH4Cl0.1％葡萄糖0.5％MgSO41mMCaCl20.1mM維生素B1 5μg/ml瓊脂 1.5％表2①在水楊酸板上生長程度相似濃度菌株名稱(mg/ml)IFO3547FV5714 FV525FV8140.125 - ++ ++ ++0.25 - ±++0.5- - ± ±1 - - --2 - - --②在α-酮異戊酸板上生長程度IFO3547 FV5714 FV525 FV8140.625 ++ ++ ++++1.25 + ++ ++++2.5 ± + + +5 - ±+ +10- - - -③在α-氧代丁酸板上生長程度IFO3547 FV5714 FV525 FV814 FV221 FV6051 FV50690.125++ ++ ++ ++ + +++0.25 ++ ++ ++ ++ + ++0.5 ±++ ++ ± ±+1-±± + ± ± ±2 - - - ± - - ±④在α-氨基丁酸板上生長程度IFO3547FV571FV525FV814FV5210.125++++ ++ ++ ++0.25 + +++ ++ ++0.5 - ++++1- -± ++2- ---+⑤在β-羥基天冬氨酸板上生長程度IFO3547FV814FV221FV6051FV50690.125+ +++ ++++0.25 + +++ ++++0.5 - -+± +1- -±± ±2- --- -⑥在O-甲基蘇氨酸板上生長程度IFO3547FV814FV221FV6051FV50690.0125 ++++ ++ ++++0.025++++ ++ ++++0.05++ + ++ ++0.1 ±± - ++ ++0.2 -- - ++ ++在表2中符號具有如下含義++生長很好+生長良好±生長較差-不生長同時，基于上述D-泛酸的生產(chǎn)方法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有包括泛酸或其鹽或其部分生物合成的基因區(qū)運載的載體科微生物(由特定科微生物的染色體衍生)可高濃度積累D-泛酸和/或D-泛解酸。
本文所涉及的泛酸生物合成中所包括的基因是panB、panC或panD基因，它們分別與酶酮泛酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶、泛酸合成酶和天冬氨酸-α-脫羧酶相對應(yīng)。
這樣的DNA供體微生物包括上述的微生物，優(yōu)選能生產(chǎn)泛酸的埃希桿菌屬微生物。確切地說，如List of Cultures，第8版，1988中，由Institute for Fermentation,Osaks出版中所列的已知菌株，例如大腸桿菌K-12(IFO 3301)和大腸桿菌IFO 3547。更有效的是使用上述突變體如大腸桿菌FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069。
含有包括泛酸或其鹽生物合成基因的DNA片斷的制備方法包括用已知方法從一種供體微生物中先萃取染色體DNA的方法(如H.Saito和K.Miura在Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)中所述)，或用抑制酶EcoRⅠ分裂后的其類似方法。然后，將上述獲得的含有包括泛酸或其鹽的生物合成的基因的染色體DNA片斷插入載體DNA。
用于本發(fā)明的載體DNA可適當(dāng)選自能在受體微生物中增殖的那些。能在受體微生物中增殖的質(zhì)粒包括(但不限于)pSC101[Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA,70,3240(1973)]和pBR322[Gene,4,121(1978)]；甚至能用最新分離或合成的載體DNA，只要能實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
將含有包括泛酸或其鹽的生物合成的基因的DNA片斷插入這些質(zhì)粒中能用公知方法或基于此的一種方法來實現(xiàn)，該公知方法如T.Maniatis等人在Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,University ofTokyo Press,1982中所述。
能用一種已知的轉(zhuǎn)化方法或基于此的一種方法將載有包括泛酸或其鹽生物合成基因的質(zhì)粒載體引入受體微生物中，該已知方法如Journal of Molecular Biology,53,159(1979)中所述。受體桿菌的實例包括已知的菌株例如大腸桿菌C600菌株[Bacteriology Review,36,525(1972)]。
含有包括泛酸或其鹽生物合成基因運載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體可選自通過轉(zhuǎn)化泛酸營養(yǎng)缺陷體作DNA受體和選擇一種菌株，轉(zhuǎn)化結(jié)果使其變成能在泛酸游離培養(yǎng)液中生長的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)所用培養(yǎng)液使選擇的菌株作為質(zhì)粒DNA標(biāo)記時這種選擇是容易的。如此獲得的含有包括泛酸或其鹽生物合成基因運載的載體DNA能用于從含有它的菌株中提取重組DNA，并且將它引入另一個受體微生物，或從提取的重組DNA中制備含有包括泛酸或其鹽生物合成基因的DNA片斷，并將它接到另一個載體質(zhì)粒上。如此獲得的轉(zhuǎn)化體的實例包括如下大腸桿菌3547/pFV31菌株(IFO 15371)大腸桿菌5714/pFV31菌株(IFO 15372)大腸桿菌525/pFV31菌株(IFO 15373)大腸桿菌814/pFV31菌株(IFO 15374)(FERMBP 4401)大腸桿菌521/pFV31菌株，大腸桿菌221/pFV31菌株(IFO 15524)，大腸桿菌6051/pFV31菌株(IFO 15525)，和大腸桿菌5069/pFV31菌株(IFO 15526)(FERM BP 4395)上述大腸桿菌3547/pFV31菌株是通過將從大腸桿菌FV525衍生出的含有包括泛酸或其鹽的生物合成運載基因質(zhì)粒pFV31引入IFO 3547而獲得的，大腸桿菌5714/pFV31是將pFV31引入FV5714菌株而得到的，大腸桿菌525/pFV31是將pFV31引入FV525菌株而得到的，大腸桿菌814/pFV31是將pFV31引入FV814菌株而得到的，大腸桿菌521/pFV31是將pFV31引入FV521菌株而得到的，大腸桿菌221/pFV31是將pFV31引入FV221菌株而得到的，大腸桿菌6051/pFV31是將pFV31引入FV6051菌株而得到的，和大腸桿菌5069/pFV31是將pFV31引入FV5069菌株而得到的。
在本說明書中，IFO的數(shù)值表示在Institute forFermintation,Osaka(2-17-85,Jyuso Honmaehi,Yodogawa-ku,Osaka_shi)處的登記號，F(xiàn)ERM BP的數(shù)值表示在Budapest Treaty Fermentation Research Institute,Agency of Incustrial Science and Technology(1-1-3,Higashi,Tsukuba-shi,Ibaraki)處的登記號。
如此獲得的菌株能用普通培養(yǎng)方法〖如靜置培養(yǎng)、振動培養(yǎng)(旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)等)和通氣旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)〗進(jìn)行連續(xù)或間斷的培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為可使所用微生物生長的普通組合物。該微生物能消化的碳源可適當(dāng)選自單一使用或在組合物中的烴、油和脂肪、脂肪酸、有機(jī)酸、和醇。氮源的實例包括有機(jī)氮源如胨、大豆粉、棉籽粉、玉米漿、酵母抽提物、肉羹、麥精和尿素，以及無機(jī)氮源如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、和磷酸銨按需要單獨或混合使用。用磷酸二氫鉀或磷酸二鉀作磷源也是有利的。該培養(yǎng)液通?？商砑由L所需的金屬鹽(例如硫酸鎂)、基本生長因子如氨基酸和維生素、生長促進(jìn)因子、以及碳源、氮源、和磷源。為控制培養(yǎng)液pH值和泡沫，可適當(dāng)加入堿性物質(zhì)如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸銨和碳酸鈣，加入消泡劑是有效的。這些物質(zhì)可以在培養(yǎng)過程中適當(dāng)?shù)丶尤搿娙胙鯕鈱Ρ３中柩鯒l件的環(huán)境也是有效的。通常將培養(yǎng)溫度保持在15至45℃、優(yōu)選25至40℃范圍內(nèi)是有利的。培養(yǎng)連續(xù)進(jìn)行直到泛酸和/或泛解酸的含量已基本達(dá)到最高值；一般能在6至120小時內(nèi)實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
在D-泛酸的生產(chǎn)中，能通過在菌株開始培養(yǎng)之前、或菌株培養(yǎng)過程中的適當(dāng)時間加入原料，或通過在適當(dāng)時間將原料加到加工過的細(xì)胞中以使原料β-丙氨酸與細(xì)胞相接觸。本文所述的已加工過的細(xì)胞包括洗滌過的細(xì)胞培養(yǎng)液、及包含和固定在丙酮粉、聚丙烯酰胺凝膠或K-角叉菜膠中的細(xì)胞。將該原料以溶液形式、或在合適溶劑中(如水)的懸浮液、或以粉末形式，在一定時間或連續(xù)地、或在給定時間內(nèi)間斷地加入。
加入的β-丙氨酸濃度最好與加到培養(yǎng)液中該微生物的產(chǎn)率相適應(yīng)、以經(jīng)濟(jì)為原則，所加β-丙氨酸的優(yōu)選濃度為0.1至5％(重量/體積比)，最好是0.5至3％(重量/體積比)。
當(dāng)從上述培養(yǎng)液或反應(yīng)產(chǎn)物中分離D-泛酸或其鹽時，它能以常規(guī)的方法進(jìn)行收獲。例如，D-泛酸或其鹽可通過從培養(yǎng)肉湯中去除細(xì)胞，隨后進(jìn)行一個或多個公知工序如離子交換樹脂處理、用活性碳吸收處理等、結(jié)晶、去鹽、以及電透析以來進(jìn)行分離。
通過上述反應(yīng)獲得的游離形式D-泛酸能用普通方法轉(zhuǎn)化成鹽；通過該反應(yīng)獲得的D-泛酸鹽能用普通方法轉(zhuǎn)化成游離形式。
例如，泛酸鈣的分離方法如下從含有泛酸或其鹽的培養(yǎng)肉湯中去除細(xì)胞。使該液體流經(jīng)陽離子交換樹脂柱(例如，DIAION PK-216(H型)或pk-228(H型)，二者均由Mitsubishi Chemical Industries生產(chǎn))以去除陽離子，然后經(jīng)過陰離子交換樹脂柱(例如，DIAION PA-412(OH型)或WA-30(OH型)，二者均由Mitsubishi Chemical Industries生產(chǎn))以去除比無機(jī)陰離子和泛酸酸性更大的有機(jī)酸。在加入活性碳(如，Shirasagi A，由Takeda Chemical Industries生產(chǎn))，隨之進(jìn)行過濾之后，通過加入氫氧化鈣將流出物(pH3±1)調(diào)節(jié)到近于中性pH值(pH7±2)。濃縮所得濾液，且加入適量低級醇(如，甲醇、乙醇、異丙醇)，加入晶種以使D-泛酸鈣結(jié)晶，然后將所得D-泛酸鈣晶體分離并干燥。若這種D-泛酸鈣結(jié)晶產(chǎn)率不夠的話，可在結(jié)晶前適當(dāng)加入氯化鈣以得到高產(chǎn)率和高純度結(jié)晶D-泛酸鈣和氯化鈣的絡(luò)合鹽，按US2957025(由Jonathan O.Brooks，于1960年10月18日申請)和審定公開的日本專利No.49571/1972所述方法進(jìn)行。雖然為此目的加入的氯化鈣可以是無水、二水、六水鹽結(jié)晶，但最好是無水或二水鹽。氯化鈣的加入量一般是泛酸鈣摩爾比的0.5至5倍，優(yōu)選為1至3倍。US2957025(由Jonathan O.Brooks，于1960年10月18日提出申請)指出，該泛酸鈣和氯化鈣的絡(luò)合鹽是不吸濕的，且是有效的動物飼料添加物；英國專利No.933669指出它在片劑中比泛酸鈣更穩(wěn)定。
有關(guān)從這樣獲得的D-泛酸鈣和氯化鈣絡(luò)合鹽中去除氯化鈣以高產(chǎn)率獲得D-泛酸鈣的方法尚未見報道。本發(fā)明人為實現(xiàn)本發(fā)明目的進(jìn)行各種方法的廣泛研究之后，設(shè)計出了一種非常有效的電滲析方法。確切地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用一種陰離子可滲透膜〖該膜可使氯離子通過但泛酸不行(例如，一價離子可選擇性滲透的膜Neocepter ACS，由Tokuyama soda生產(chǎn))〗并用硝酸鈣水溶液作電極液進(jìn)行電滲析，可有效地從D-泛酸鈣和氯化鈣絡(luò)合鹽的水溶液中去除氧化鈣。雖然，在水溶液中該絡(luò)合鹽的濃度是可選擇的，但通常在1至60％(重量/體積比)，優(yōu)選4至40％(重量/體積比)的正常濃度范圍內(nèi)是可溶的。通過這種電滲析處理所獲得的D-泛酸鈣水溶液可用普通方法如噴霧干燥得到D-泛酸鈣粉末。
因此，D-泛酸鈣能有效地從培養(yǎng)肉湯中分離。
D-泛解酸能通過從培養(yǎng)肉湯中去除細(xì)胞、用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)該液體的pH為1-2、衍生出泛酸內(nèi)酯(泛解酸的環(huán)化衍生物)、用溶劑(例如，異丙酸乙酯、乙酸乙酯)進(jìn)行萃取、然后進(jìn)行濃縮和結(jié)晶，以進(jìn)行分離，從而得到晶體。通過加入氫氧化鈉等很容易使這樣獲得的泛酸內(nèi)酯還原成泛解酸。
實例在下文中通過以下實例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述，這些實例僅是本發(fā)明的實施方案，它們不能以任何方式限制本發(fā)明范圍。
D-泛酸可用高性能液體色譜法進(jìn)行定量(柱ShimadzuSCR101H(7.9mm直徑×30cm)；微生物相0.008N硫酸；流量0.8毫升/分鐘；檢測器差動式折射計)和/或微生物的生物試驗(指示菌株植物乳桿菌 IFO3070；培養(yǎng)液市售可得的泛酸試驗培養(yǎng)液(由DIFCO生產(chǎn)))。泛解酸的定量測定和光學(xué)純度測定是通過離心從培養(yǎng)肉湯中去除細(xì)胞后用高性能乙酸乙酯抽提物的液體色譜法進(jìn)行的(柱SUMICHIRAL OA-1200；微生物相n-己烷/1，2-二氯代乙烷/乙醇=90/8/2；流量1.0毫升/分鐘；檢測器UV)，將6N鹽酸加到該上清液中，接著在水浴中在80℃加熱15分鐘(該操作使平衡的泛解酸轉(zhuǎn)化成泛酸內(nèi)酯)。
實例1在含20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中接種得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌IFO3547菌株、FV5714(IFO15368)菌株、FV525(IFO15369)菌株、FV814(IFO15370)菌株、或FV521菌株，隨后以220rpm的轉(zhuǎn)速在30℃進(jìn)行20小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液1ml部分移至含有20ml表4所示組合物消毒培養(yǎng)液的200ml肋狀錐形瓶中，然后在38℃下培養(yǎng)20小時，在每個瓶中加入2.5ml、54％含水葡萄糖溶液之后，再培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后所產(chǎn)生的泛解酸量和光學(xué)純度以及積累的泛酸的量在表5中給出。
表3組物培養(yǎng)液(pH7.0)成分 濃度玉米浸液 0.5％(NH4)2SO40.5％MgSO4·7H2O 0.01％KH2PO40.01％K2HPO40.03％CaCO31.0％葡萄糖5.0％
表4培養(yǎng)液①(pH7.0) 培養(yǎng)液②(pH7.0)成分 濃度 成分濃度玉米浸液 0.2％ 玉米浸液0.2％(NH4)2SO41.5％ (NH4)2SO41.5％MgSO4·7H2O 0.02％ MgSO4·7H2O 0.02％KH2PO40.05％ KH2PO40.05％K2HPO40.1％ K2HPO40.1％CaCO32.0％ CaCO32.0％葡萄糖9.0％ 葡萄糖 9.0％β-丙氨酸2.0％表5培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株生成的泛解酸量 光學(xué)純度生成的泛解酸量(mg/ml) (％ee)(mg/ml)大腸桿菌IFO3547 未測出 0.1FV5714 1.5 100 7.0FV525 2.8 100 11.0FV814 3.0 100 13.0FV521 3.5 100 13.9實例2在含有20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中接種得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌FV221菌株、FV6051菌株，隨后以220rpm的轉(zhuǎn)速在30℃進(jìn)行20小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液1ml部分移至含有40ml如表6所示組合物的消毒培養(yǎng)液的200ml肋狀錐形瓶中，然后在38℃下培養(yǎng)20小時，在每個瓶中加入5ml、54％含水葡萄糖溶液之后，立刻再培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完成后所產(chǎn)生的泛解酸量和光學(xué)純度以及積累的泛酸量，在表5中給出。
表6培養(yǎng)液①(pH7.0) 培養(yǎng)液②(pH7.0)成分 濃度 成分 濃度玉米浸液 2.0％ 玉米浸液 2.0％(NH4)2SO41.5％ (NH4)2SO41.5％MgSO4·7H2O 0.02％MgSO4·7H2O 0.02％KH2PO40.05％ KH2PO40.05％K2HPO40.1％ K2HPO40.1％CaCO33.0％ CaCO33.0％葡萄糖 9.0％ 葡萄糖 9.0％β-丙氨酸 2.0％
表7培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學(xué)純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (％ee) (mg/ml)大腸桿菌FV221 3.2 100 15.8FV6051 3.9 100 16.3FV5069 4.5 100 17.9實例3ⅰ)DNA染色體的制備將能產(chǎn)生D-泛酸的大腸桿菌FV525菌株接種到1升的L培養(yǎng)液中(1.0％Bactotrypton、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉)，隨后在37℃下過夜培養(yǎng)。最后，用Saito等人的方法用苯酚[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)]從該細(xì)胞中獲得DNA染色體3.3mg。ⅱ)將DNA染色體插入載體質(zhì)粒pMW118除非另外說明以下實驗均按T.Maniatis等人在MolecularCloning中(由University of Tokyo Press,1982出版)所述方法進(jìn)行操作。
用限制性酶EcoRⅠ(由Nippon Gene生產(chǎn))分別使在上述第ⅰ)項中獲得的DNA染色體10μg和pMW118(由Nippon Gene生產(chǎn))分裂，隨后在存在T4噬菌體-衍生的DNA連接酶(由Nippon Gene生產(chǎn))的條件下進(jìn)行混合和連接。ⅲ)泛酸生物合成系統(tǒng)基因的克隆用合適的細(xì)胞方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。確切地說，合適的細(xì)胞是用得自大腸桿菌C600菌株的亞硝基胍誘變衍生的D-泛酸營養(yǎng)缺陷體A4C菌株(IFO 15251,FERM BP-3677)制備的。在該上清液中加入在上述第ⅱ)項中制備的質(zhì)粒DNA，從而使它用于轉(zhuǎn)化。然后將含該轉(zhuǎn)化體的懸浮液涂于含M-9瓊脂培養(yǎng)液(0.6％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、1mM硫酸鎂、0.1mM氯化鈣、0.5％葡萄糖、10μg/ml維生素B1、50μg/ml蘇氨酸、50μg/ml亮氨酸、1.5％瓊脂、pH7.2)的培養(yǎng)板上，添加50μg/ml氨芐青霉素的鈉鹽，隨后在37℃下培養(yǎng)2天。從該板培養(yǎng)液中的克隆生長物中獲得耐氨芐青霉素和能生產(chǎn)D-泛酸的轉(zhuǎn)化體。將用從大腸桿菌FV525菌株的DNA染色體插入衍生出的運載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的A4C菌株命名為A4C/pFV31菌株(IFO 15367)。ⅳ)從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒最后，從1升的該轉(zhuǎn)化體大腸桿菌A4C/pFV31菌株的培養(yǎng)肉湯中獲得600μg的質(zhì)粒，且命名為pFV31。ⅴ)質(zhì)粒pFV31的分析用各種抑制性酶使pFV31分裂，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從該電泳圖中，以λ形噬菌體DNA(由Nippon Gene生產(chǎn))HindⅢ消化產(chǎn)物的分子量為基礎(chǔ)制備圖1所示的限制性酶分裂圖。發(fā)現(xiàn)pFV31是在pMW118的EcoRⅠ位點載帶約2.5kb的DNA片斷的重組質(zhì)粒。ⅵ)重新轉(zhuǎn)化為了證實在pFV31中存在包括泛酸或其鹽的生物合成的基因，用上述質(zhì)粒DNA使α-酮泛解酸營養(yǎng)缺陷體A1B菌株、β-丙氨酸營養(yǎng)缺陷體A17C菌株和泛酸營養(yǎng)缺陷體A4C菌株，(均通過大腸桿菌C600菌株的亞硝基胍誘變衍生的)重新轉(zhuǎn)化。所得到的轉(zhuǎn)化體能在上述M-9瓊脂培養(yǎng)液中生長，從而證實在pFV31中存在酮泛酸羥基甲基轉(zhuǎn)化酶、天冬氨酸-α-脫羧酸以及泛酸合成酶基因。
此外，為證實該轉(zhuǎn)化體能生產(chǎn)泛酸，用pFV31使大腸桿菌IFO 3547菌株、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如此獲得的轉(zhuǎn)化體分別命名為大腸桿菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、521/pFV31菌株、21/pFV31菌株、6051/pFV31菌株和5069/pFV31菌株。
實例4使如表3所示組合物液體培養(yǎng)液在高壓滅菌器中在121℃加熱消毒15分鐘，并且以每瓶20ml分配到200ml的錐形瓶中。每瓶中接種實例3第ⅳ)項中得自斜面培養(yǎng)液的大腸桿菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、或521/pFV31菌株的白金圈，然后以220rpm轉(zhuǎn)速，在30℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)20小時。將該種培養(yǎng)液(1ml部分)移至20ml如表4所示的組合物培養(yǎng)液中，隨后，在38℃在200ml肋狀錐形瓶中培養(yǎng)20小時，每瓶中加入2.5ml、54％葡萄糖含水溶液，立刻再培養(yǎng)24小時以上。在培養(yǎng)完成之后所產(chǎn)生的泛解酸量和光學(xué)純度以及積累的泛酸量，在表8中給出。
表8培養(yǎng)液①培養(yǎng)液②菌株生成的泛解酸量 光學(xué)純度 生成的泛解酸量(mg/ml)(％ee)(mg/ml)大腸桿菌3547/pFV312.210013.05714/pFV313.410014.4525/pFV31 7.410025.0814/pFV31 8.510031.5521/pFV31 9.610034.9實例5將表3所示組合物的一種液體培養(yǎng)液在高壓滅菌器中在121℃加熱消毒15分鐘，并且以每瓶20ml分配到200ml的錐形瓶中。每瓶中接種實例3第ⅳ)項中得自斜面培養(yǎng)液的大腸桿菌221/pFV31菌株、6051/pFV31菌株、或5069/pFV31菌株的白金圈，然后以220rpm轉(zhuǎn)速，在30℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)20小時。將該種培養(yǎng)液(2ml部分)移至40ml如表6所示的組合物培養(yǎng)液中，隨后，在38℃在200ml肋狀錐形瓶中培養(yǎng)24小時，每瓶中加入5ml、54％葡萄糖含水溶液后，立刻再培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成之后所產(chǎn)生的泛解酸量和光學(xué)純度以及積累的泛酸量，在表9中給出。
表9培養(yǎng)液① 培養(yǎng)液②菌株 生成的泛解酸量 光學(xué)純度 生成的泛解酸量(mg/ml) (％ee) (mg/ml)大腸桿菌FV221/pFV31 9.810032.6FV6051/pFV31 10.5 10041.3FV5069/pFV31 11.2 10045.4實例6在含20ml表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中加入得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌814/pFV31菌株，隨后以220rpm的轉(zhuǎn)速，在30℃進(jìn)行24小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液(20ml部分)移至含有200ml相同組合物的第二消毒種培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，隨后以220rpm的轉(zhuǎn)速，在30℃進(jìn)行24小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第二種培養(yǎng)液(125ml部分)移至5升發(fā)酵罐中，其中含有2.3升消毒培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有250g葡萄糖、12.5g玉米漿、37.5g硫酸銨、1.25g磷酸二氫鉀、2.5g磷酸二鉀、0.5g硫酸鎂、75g碳酸鈣、和33gβ-丙氨酸(pH7.0)，然后在38℃下培養(yǎng)，同時通氣(0.8體積/體積/分鐘)并攪拌(800rpm)。16至62小時后開始，連續(xù)加入葡萄糖，以保持其濃度在2％至3％之間。培養(yǎng)68小時后，最終液體體積是2.5升，D-泛酸生成量是38.5g/l。
實例7將2.0升實例6中獲得的發(fā)酵肉湯(含有77.0gD-泛酸)在80℃加熱10分鐘，然后過濾以去除細(xì)胞和不溶物質(zhì)。該濾液與洗滌液合并，得到2.4升液體，使其通過填充600mlDIAION PK-216(H型)的柱，然后通過填充340mlDIAION PA-412(OH型)的柱，與水洗脫液相合并得到總共4.1升處理過的液體(pH3.2)，加入氫氧化鈣將該處理過的液體pH調(diào)節(jié)到6.8再加入5克活性碳，然后進(jìn)行過濾。將濾液和洗滌液合并，得到4.2升含有75.1克D-泛酸的液體，從該數(shù)值計算得到D-泛酸鈣的含量為82.0克。該液體可用作結(jié)晶的起始液。
使2.1升如此獲得的4.2升起始材料結(jié)晶液體(含有41.0克D-泛酸鈣)在減壓條件下濃縮，從而得到約43％(重量/重量)濃度的最終D-泛酸鈣。在該濃縮液中加入410ml甲醇并加入0.5克晶種，隨后在30℃緩慢攪拌5小時。然后，使該液體在5℃下靜置14小時接著通過過濾分離晶體并干燥，所得晶體重6.3克，純度為98.5％。
實例8使2.1升實例7中所得的4.2升起始材料結(jié)晶液體(含有41.0克D-泛酸鈣)在減壓條件下濃縮，從而得到約43％(重量/重量)濃度的最終D-泛酸鈣。在該濃縮液中加入100ml甲醇?；旌虾螅尤?10ml含有37.94克氯化鈣二水合物的甲醇溶液，并加入0.5克晶種，隨后在50℃下緩慢攪拌5小時。通過過濾收集晶體并干燥。所得晶體重41.95克，且含有74.3％(重量/重量)D-泛酸、13.6％(重量/重量)Ca和12.1％(重量/重量)Cl的組合物。這一發(fā)現(xiàn)證明這種晶體是1∶1摩爾比的一種D-泛酸和氯化鈣的絡(luò)合鹽。
將40克這樣的絡(luò)合鹽溶于約2升的水中，并用電滲析器進(jìn)行電泳〖TS-2-10型(Tokuyama Soda)；陽離子可滲透膜Neocepter CM-1；陰離子可滲透膜Neocepter ACS；電極液0.2N硝酸鈣水溶液；流量0.3升/分鐘；電壓10V)。結(jié)果，該氯化鈣去除出系統(tǒng)外面，且獲得含D-泛酸和鈣摩爾比為2∶1的D-泛酸鈣水溶液(pH7.0)。將該D-泛酸鈣水溶液在減壓下濃縮，使其濃度約為50％(重量/重量)，然后使用噴射干燥器進(jìn)行噴射干燥，從而得到34.0克D-泛酸鈣粉末。該粉末的D-泛酸鈣純度為99.8％(重量/重量)([α]D=+28.1(c=5,H2O)〗。
實例9在含有20ml如表3所示組合物的第一消毒種培養(yǎng)液的200ml錐形瓶中加入得自斜面培養(yǎng)液的白金圈大腸桿菌5069/pFV31菌株，隨后以220rpm的轉(zhuǎn)速，在30℃進(jìn)行24小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第一種培養(yǎng)液20ml移至含有200ml相同組合物的第二消毒種培養(yǎng)液的1000ml錐形瓶中，隨后在30℃下進(jìn)行24小時的旋轉(zhuǎn)振動培養(yǎng)。將該第二種培養(yǎng)液75ml移至3升的發(fā)酵罐中，其中含有1.35升一消毒培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液含有75g葡萄糖、30g玉米漿、22.5g硫酸銨、0.75g磷酸二氫鉀、1.5g磷酸二鉀、0.3g硫酸鎂、45g碳酸鈣、0.75mg維生素B1和15gβ-丙氨酸(pH7.0)，然后在38℃下培養(yǎng)，同時通氣(0.8體積/體積/分鐘)并攪拌(700rpm)。在培養(yǎng)開始之后15、27、和38.5小時間歇加入葡萄糖，以保持5％濃度。在培養(yǎng)開始之后27和46.5小時還加β-丙氨酸以保持1％濃度，和在培養(yǎng)開始之后30和50小時0.75mg維生素β1。在培養(yǎng)72小時后，該最終液體體積是1.58升，D-泛酸量是65.4g/l。
權(quán)利要求
1．一種質(zhì)粒DNA，它具有泛酸或其鹽的生物合成中所涉及的基因區(qū)或該區(qū)的一部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)D－泛酸或其鹽的方法和生產(chǎn)D－泛解酸或其鹽的方法。D－泛酸,D－泛解酸或其鹽能有效地直接用微生物方法獲得,而不需要使用DL－泛解酸、DL－泛酸內(nèi)酯等作起始材料。
文檔編號C12P7/42GK1225392SQ9812155
公開日1999年8月11日 申請日期1998年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月25日
發(fā)明者引地裕一, 守谷岳郎, 三木啟司, 山口高正, 野上昱雄 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社