專利名稱：對蝦桿狀病毒新的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)物病毒的檢測方法，尤其是關(guān)于對蝦桿狀病毒新的PCR檢測方法。
隨著對蝦人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，蝦的病害日趨嚴(yán)重，每年由于病害而造成的損失約占總產(chǎn)量的8-10％，如1988年，臺灣發(fā)生嚴(yán)重蝦病，損失達(dá)80％左右，養(yǎng)蝦業(yè)至今未能完全恢復(fù)。泰國、印尼、日本、中國等國家也相繼發(fā)生蝦病病害，給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。由于蝦病的傳播和蔓延，不僅使蝦農(nóng)受到巨大經(jīng)濟損失，而且使與對蝦養(yǎng)殖相關(guān)的其它行業(yè)如飼料、加工、出口等也蒙受巨大損失。
對蝦的病毒病研究，雖在80年代初期就有報導(dǎo)(Couch J.A.,Nature,1974,247:229-231；Lightner D.V,Redman R.M.,J.Invertebr.Pathol.,1981,38:299-302)，至今發(fā)現(xiàn)了8至10種桿狀病毒,但絕大部分只停留在病毒的電鏡形態(tài)觀察研究水平(Sano T.,Nishimura Y.,Ogura K.,Momoyama K.,Yakeno N.,PenaeusJaponicus in Japan.Fish.Pathol.1981,15:185-191；Kasornchandra J.,Supamattaya K.,Boonyaratpalin S.,Abstractsof second symposium on disease in Asian aquaculture.Phuket,Thailand,1993,75.)。
為了搞清蝦病的流行原因、流行規(guī)律、病原傳播的可能中間寄主、親蝦及蝦苗的檢測以及養(yǎng)殖方法和模式間的關(guān)系，國內(nèi)外專家一致認(rèn)為，建立一個可靠的、靈敏的快速檢測方法是十分必要的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是80年代后期在分子生物學(xué)研究中發(fā)展出來的一種先進的檢測手段，這是一種生物基因(DNA)的擴增方法。目前國內(nèi)外應(yīng)用的PCR檢測手段有很多報道，曾經(jīng)有利用昆蟲桿狀病毒已知的保守序列作為合成引物的依據(jù)，進行檢測的報導(dǎo)(Chang,P.S.,Lo,C.F.,Kou G.H.,Lu C.C.,Chen S.N.,J.Invertebr.Pathol.1993,62:116-120；Lu C.C.,Tang K.F.J.,Kou G.H.,Chen S.N.,J.Fish Disease.1993,16:551-559)。但由于這樣的引物專一性差，因為對蝦病毒雖然屬于桿狀病毒，但對蝦本身并不屬于昆蟲，因此利用昆蟲桿狀病毒已知的保守序列作為合成引物進行PCR檢測往往會出現(xiàn)很多的假陽性結(jié)果，可能造成誤導(dǎo)。因此一個對蝦病毒快速微量檢測方法的建立，是國內(nèi)外迫切要求解決的問題。
本發(fā)明的目的是提供一種對蝦桿狀病毒新的PCR檢測方法，該方法應(yīng)用桿狀病毒本身基因組序列來合成引物，并在擴增反應(yīng)前先進行內(nèi)切酶水解模板的步驟，建立PCR方法，具有專一性強，靈敏度高的優(yōu)點，使檢出率提高，精確度增加。
本發(fā)明提供一種對蝦桿狀病毒的PCR檢測方法，包括用對蝦組織(鰓、肝、胰腺、腸皆可)制備PCR模板，再進行PCR體外擴增，在PCR擴增緩沖液體系中先加入EcoRⅠ內(nèi)切酶水解，水解后再加入應(yīng)用對蝦桿狀病毒本身基因組的DNA核苷酸序列來合成的兩段引物，在PCR擴增緩沖液體系中進行循環(huán)擴增，擴增結(jié)束后進行電泳檢測，如果出現(xiàn)條帶，則就檢出PCR陽性的樣品。下面分三部分詳述本發(fā)明的內(nèi)容。
一．對蝦桿狀病毒基因組DNA的分離及引物的合成1．病毒的分離提純病蝦的鰓、肝、胰腺或中腸組織中加入抽提緩沖液，經(jīng)勻漿或搗碎、有機溶劑抽提、差速離心及10％～50％的蔗糖密度梯度超速離心后，取中間部分，可以得到較純的病毒制劑，圖5是電鏡下觀測到的分離的病毒圖。
2．病毒基因組DNA的分離初步純化的病毒懸浮液經(jīng)兩次苯酚/氯仿抽提，一次氯仿/異戊醇抽提，用乙醇沉淀，沉淀的核酸經(jīng)低熔點瓊脂糖電泳可分離出病毒的基因組DNA帶，圖6顯示了病毒基因組DNA的電泳圖。
3．病毒基因組DNA的內(nèi)切酶(EcoRⅠ)水解片段的克隆、測序及引物合成分離的病毒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ水解后，水解混合液經(jīng)純化后再溶解；載體puc19也以同樣條件用EcoRⅠ酶切，再純化。
EcoRⅠ水解后的病毒DNA和puc19片段混合，在連接酶作用下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌落(克隆)經(jīng)LB過夜培養(yǎng)后，離心收集菌體，用“堿變性法”將破菌后的核酸蛋白溶液中的蛋白質(zhì)變性去除，用乙醇將核酸沉淀下來，抽提的核酸用EcoRⅠ水解，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，挑選出含病毒基因片段(約600bp)的克隆。
用標(biāo)準(zhǔn)的“雙脫氧法”測定該病毒基因片段的順序(參見分子克隆實驗指南，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1989)，圖1顯示了該片段的DNA核苷酸序列，共有623個堿基對。根據(jù)這一順序，用DNA自動合成儀合成兩段分別與該序列5′和3′端相應(yīng)的各長20bp的引物，見圖2。
二．對蝦桿狀病毒的PCR檢測方法1．PCR模板的制備蝦組織(鰓、肝、胰腺、腸皆可)，加入TE緩沖液，搗碎后離心除去碎片雜質(zhì)，上清再離心，沉淀用TE懸浮，加蛋白酶K在50℃保溫以使病毒的外膜破裂，再用等體積苯酚、苯酚/氯仿、氯仿/異戊醇各抽提一次使所有的蛋白變性，上清加用無水乙醇可沉淀其中的核酸，即為PCR模板。
2．PCR體外擴增及電泳檢測由于對蝦桿狀病毒基因組分子量極大，因此直接作為模板使PCR檢測造成困難，本發(fā)明在擴增前引入內(nèi)切酶水解一步，發(fā)展了一套富有特色的從模板制備到有效擴增檢測的方法。具體如下取上述樣品(即PCR模板)，在PCR擴增緩沖液體系中先加入EcoRⅠ內(nèi)切酶水解，混合液中加入合成的兩段引物，在PCR擴增緩沖液體系中進行循環(huán)擴增。
擴增結(jié)束后，吸出小部分反應(yīng)液經(jīng)1.5％瓊脂糖或3.5％聚丙烯酰胺電泳檢查結(jié)果，圖3便是PCR擴增后的結(jié)果，從中可見PCR陽性的樣品，在擴增后出現(xiàn)623bp的條帶。
三．PCR擴增的靈敏度測定取蝦組織，按上述方法提取模板DNA，溶解后作梯度稀釋，依次從1×,10-1,10-2，……稀釋到10-8倍，分別進行PCR擴增，擴增的結(jié)果如圖4。結(jié)果顯示，從5克病蝦組織中抽提的DNA溶液，取其總量的1/40，進行至10-8的稀釋，結(jié)果證明，直至10-6的稀釋度還能檢出，也即從每0.125微克的蝦組織內(nèi)含有的病毒亦可檢出，說明用極少量的蝦苗或取親蝦極少量的鰓組織進行檢測是可能的，同時使貴重親蝦保持不死。因而，此方法適用于對親蝦、蝦苗是否帶毒，對蝦病毒病的發(fā)生及發(fā)病過程進行追蹤；對環(huán)境因子是否帶毒(如飼料、水質(zhì)、對蝦排泄物)等均可檢測，還可追蹤該病的傳播途徑。
本發(fā)明優(yōu)點與效果
本發(fā)明根據(jù)對蝦病毒本身的基因結(jié)構(gòu)，建立了一種新型的檢測對蝦病毒的快速、微量PCR方法，具有專一性強，靈敏度高的優(yōu)點。本方法極大地提高了對蝦病毒DNA的檢出率，與電鏡檢查方法對比，電鏡檢查觀察到病毒的陽性樣品，PCR均為陽性，符合率為100％，而PCR檢查為陽性的樣品，電鏡檢查卻未發(fā)現(xiàn)病毒，兩者的對照如表1顯示，這是由于電鏡的漏檢性較大所致。檢測所有樣品至今尚未發(fā)現(xiàn)有電鏡為陽性，而PCR為陰性的樣品，因此證明我們建立的PCR方法結(jié)果是可靠的。在本發(fā)明建立的PCR檢測方法中，由于對蝦桿狀病毒基因組分子量極大，因此直接作為模板使PCR檢測造成困難，我們在擴增前引入內(nèi)切酶水解一步，發(fā)展了一套富有特色的從模板制備到有效擴增檢測的方法，使得檢測獲得成功。
表1 PCR及電鏡檢測結(jié)果
本發(fā)明PCR檢測方法在對蝦養(yǎng)殖地區(qū)包括對對蝦育苗、養(yǎng)殖過程中的病毒感染與否進行了檢測和監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)了對蝦苗種帶有病原體的問題，及時切斷了病毒感染的第一步，也對對蝦孵化苗的早期進行了快速診斷和監(jiān)測，取得很好的效果，并對病毒的傳播途徑進行了研究，初步確定不存在垂直傳播途徑，病毒帶在蝦卵的表面，因而確定了可用卵表面消毒的方法予以解決，用本發(fā)明檢測方法也檢測到蝦的開口餌料(一種鹵蟲)中帶有病毒及時予以解決。同時，該方法已連續(xù)兩年在上海郊區(qū)對蝦育苗、養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中用以定期監(jiān)測，為生產(chǎn)部門及時提供養(yǎng)殖過程中是否帶有桿狀病毒的信息，以便生產(chǎn)單位及時采取預(yù)防措施，取得明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。


圖1．對蝦桿狀病毒基因組中623bp片段的DNA核苷酸序列。
圖2．用于PCR體外擴增的兩個引物的序列。
圖3．檢測樣品經(jīng)PCR檢測后的電泳圖。
1:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量2、5、6、7、8:PCR檢測陰性結(jié)果的樣品3、4、9、10:PCR檢測陽性結(jié)果的樣品(右側(cè)箭頭所指為PCR擴增帶)圖4．PCR檢測的靈敏度試驗。
1:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量2～10模板依次從1×,10-1,10-2，……稀釋到10-8倍后的PCR檢測結(jié)果(右側(cè)箭頭所指為PCR擴增帶)圖5．從對蝦組織分離提純后對蝦桿狀病毒的電鏡觀察圖。
圖6．對蝦桿狀病毒基因組DNA電泳圖。
1:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量2病毒的基因組DNA(右側(cè)箭頭所指為基因組DNA帶)本發(fā)明通過以下的實施例作進一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。
實施例1對蝦桿狀病毒基因組DNA的分離及引物的合成1．病毒的分離提純?nèi)〔∥r的鰓(肝、胰腺或中腸皆可)組織30克，加入100ml緩沖液(0.3M甘氨酸，0.1M MgCl2,pH8.0)后，經(jīng)勻漿或搗碎、有機溶劑(CCl4)抽提、差速離心(3000rpm)及密度梯度(10％-50％蔗糖)超速離心(20000rpm,4小時，4℃)后，取中間部分，可以得到較純的病毒制劑，見圖5所示分離提純后對蝦桿狀病毒的電鏡觀察圖。
2．病毒基因組DNA的分離初步純化的病毒懸浮液5ml(自30克組織)，經(jīng)兩次苯酚/氯仿(1/1，每次5ml)抽提，一次氯仿/異戊醇(24/1,5ml)抽提，上清用2倍體積乙醇沉淀(含1/10體積3M NaAC,pH4.8)，沉淀經(jīng)75％乙醇洗滌，抽干，溶于50ul TE(10mM Tris,1mM EDTA)，經(jīng)0.7％低熔點瓊脂糖電泳，分離出核酸帶，再經(jīng)等體積苯酚/氯仿(1/1)抽提，70％乙醇沉淀，洗滌后抽干溶解于20ul TE,4℃保存(分離的對蝦桿狀病毒基因組DNA電泳圖見圖6)。
3．病毒基因組DNA EcoRⅠ酶切片段的克隆、測序及引物合成a．病毒DNA和載體puc19(華美公司)的內(nèi)切酶EcoRⅠ水解分離的病毒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(Promega公司)水解(20ul病毒DNA中加入5ul 10×EcoRⅠ緩沖液、2ul EcoRⅠ(12單位/ul)和23ulH2O,37℃，保溫2小時)，水解混合液經(jīng)等體積苯酚/氯仿(1/1)抽提，70％乙醇沉淀，洗滌后抽干溶解于20ul TE,4℃保存。載體puc19(lug)以同樣條件用EcoRⅠ酶切、苯酚/氯仿(1/1)抽提、70％乙醇沉淀、洗滌后抽干溶解于20ul TE,4℃保存。
b．20ul EcoRⅠ水解后的病毒DNA和10ul puc19片段混合，加入4ul10×T4連接酶緩沖液、5ul H2O,1ul T4連接酶(10單位/ul)，16℃保溫14小時。
c．大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備2ml LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.5％氯化鈉)37℃培養(yǎng)過夜的JM109菌株轉(zhuǎn)入50ml LB中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6，離心5000rpm,5分鐘收集菌體，將菌體懸浮于25ml 50mM CaCl2半小時，再離心5000rpm,5分鐘收集菌體，并將菌體懸浮于2ml 50mM CaCl2,4℃保存。
d．連接產(chǎn)物對感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取200ul感受態(tài)細(xì)胞，加入16℃保溫的連接混合液，0℃,50’；42℃,2’加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃,1小時，取200ul涂布于LB(含50ug/mlAmp)板上，37℃培養(yǎng)過夜。
e．含外源插入片段的克隆篩選挑取24個轉(zhuǎn)化后的菌落(克隆)，轉(zhuǎn)入2ml LB(含50ug/ml Amp),37℃過夜培養(yǎng)，離心(5000rpm,5′)收集菌體，加入100ul溶液Ⅰ(25mMTris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM葡萄糖)，冰浴5′，再加入200ul溶液Ⅱ(0.2N氫氧化鈉，1％SDS)，室溫5′，再加入100ul溶液Ⅲ(3M醋酸納pH4.8)，冰浴5′，離心(14000rpm,5′)，將上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管，用等體積苯酚/氯仿(1/1)抽提，70％乙醇沉淀、洗滌后抽干溶解于50ul TE,4℃保存。按病毒DNA和載體puc19的EcoRⅠ水解條件將抽提的核酸用EcoRⅠ水解，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，挑選出含600bp左右片段插入的克隆。
f．600bp左右片段的序列測定用標(biāo)準(zhǔn)的“雙脫氧法”測定順序(參見分子克隆實驗指南，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1989)，其結(jié)果如圖1所示，共有623個堿基對。
g．PCR引物的合成根據(jù)順序，用DNA自動合成儀合成兩段各長20bp的引物，見圖2。
實施例2對蝦桿狀病毒的PCR檢測方法1．PCR模板的制備取5克蝦鰓組織(肝、腸、胰腺也可)，加15ml TE，搗碎后離心(1K,20分鐘)除去碎片雜質(zhì)，上清再離心(10K,20分鐘)，沉淀用10ml TE懸浮，加蛋白酶K(Promega)至100ug/ml,50℃保溫3小時后，用等體積苯酚、苯酚/氯仿(1/1)、氯仿/異戊醇(24/1)各抽提一次，上清加2倍體積無水乙醇、1/10體積3M NaAC(pH4.8)，置干冰0.5小時，離心(10K,20分鐘)，沉淀用70％乙醇洗一次，抽干后溶于500ul TE。
2．PCR體外擴增及電泳檢測取1ul上述樣品于0.5ml的塑料離心管中，加2ul 10×Tag DNA聚合酶緩沖液(500mM KCl,100mM Tris-HCl pH9.0,1％Triton X-100),16ul ddH2O,1ul(10單位)EcoRⅠ,37℃保溫1小時進行水解后，混合液中加入17ul ddH2O,3ul 10×Tag DNA聚合酶緩沖液，3ul MgCl2(25mM),4ul 4×dNTP(2.5mM),1ul引物1(40ug/ul),1ul引物2(40ug/ul),94℃5分鐘后，加1ul(2單位)Tag DNA聚合酶(Promega公司)，封以100ul液體石臘油，按下列循環(huán)擴增
變性 退火 合成94℃ 60℃ 72℃循環(huán)1 2′ 30″ 1′循環(huán)2-25 30″ 30″ 1′循環(huán)2630″ 30″ 3′PCR儀為美國ERICOMP公司生產(chǎn)的儀器，擴增結(jié)束后，吸去石臘油，取15ul反應(yīng)物，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳(或3.5％聚丙烯酰胺電泳)檢查結(jié)果。圖3中顯示9個不同樣品的檢測結(jié)果，每個樣品的檢測方法如上所述，其中，3、4、9、10為PCR陽性結(jié)果，2、5、6、7、8為PCR陰性結(jié)果。
實施例3:PCR擴增的靈敏度測定取5克蝦組織，按實施例2.1中所述方法提取模板DNA，溶于40ulTE，取1ul，作梯度稀釋，依次從1×,10-1,10-2，……稀釋到10-8倍，按實施例2.2中所述用量、方法和條件進行PCR擴增。
結(jié)果如圖4所示，圖中2-8都顯示有PCR擴增帶，結(jié)果證明直至10-6稀釋度還能檢出，也即從每0.125微克的蝦組織內(nèi)含有的病毒也可檢出。
權(quán)利要求
1.一種對蝦桿狀病毒的PCR檢測方法，包括PCR模板的制備，PCR體外擴增及電泳檢測，其特征在于在PCR體外擴增中，在PCR擴增緩沖液體系中先加入EcoRⅠ內(nèi)切酶水解，水解后再加入合成的兩段引物，引物序列如下引物1:5′ACAATGTTCCGGTGGATACC 3′引物2:5′TTCACCACTACTTTGAAGCG 3′在PCR擴增緩沖液體系中進行循環(huán)擴增。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于所述兩段引物是應(yīng)用對蝦桿狀病毒本身基因組的DNA核苷酸序列來合成的，即分別與對蝦桿狀病毒基因組中623bp片段的DNA核苷酸序列5′和3′端相應(yīng)的各長20bp的引物。
3.如權(quán)利要求1和2所述的PCR檢測方法，其特征在于所述對蝦桿狀病毒基因組中623bp片段的DNA核苷酸序列如下5′CACAGGCATGGAGCGGCCCTCCCGGCTTCACCACTACTTTGAAGCGACGGCCTTGGCTTA 60TGCCGATCGTGCAAGTTTGTGGGCGACCCCCGCATTTGTGGATGTTTCCACCGCAACCCT 120GACCGACAAGCTGTTCGGCGTCGACTGCAGGCCACAGTATGGTGGCCCCTACTTAAGCTG 180CGAGCGCCCAGGAAGCTCCCCAGGAAGCTCCCCCGCTTTGGCACCCACCAGGGGATCCTT 240ATTAGCGTACGCTGCGGATCCTTGTCAAGCCGCTCCTGCTTGGCGAGCAAGACTCGTATC 300GTGGGTGCGCGCGCACATCAAGCGTGCGGTTGACTGGCCCCAACCCGGGATCCATCGGAT 360CGAGCATTTCGGACTGAAAAATCCAGCCTGAGACCGCCAGAAGTGACGGCTGGCGAGTCT 420GCAGTACCTGTGTTCGCGGTGTACGGGAACCCCTGTTCCGCTACTGAAGCTGCGGGTACG 480TGCCGTAACCGAAGATCGCAGGTTGCTTTAGTGCGGCCCGACCAATTCCGGCTTGCACCG 540CCATGAGTACCAGCTGAAGATTGCGGCTCCGCCTCGGTGGGATCTTCGGGCATGAAGGTA 600TCCACCGGAACATTGTGGAATTC 6233’
全文摘要
一種對蝦桿狀病毒新的PCR檢測方法,是根據(jù)對蝦病毒本身的基因結(jié)構(gòu),建立的一種新型的檢測對蝦病毒的快速、微量PCR方法,具有專一性強,靈敏度高的優(yōu)點。此方法適用于對親蝦、蝦苗是否帶毒,對蝦病毒病的發(fā)生及發(fā)病過程進行追蹤;對環(huán)境因子是否帶毒(如飼料、水質(zhì)、對蝦排泄物)等均可檢測,還可追蹤該病的傳播途徑。
文檔編號C12Q1/70GK1219592SQ9811072
公開日1999年6月16日 申請日期1998年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月24日
發(fā)明者龔祖塤, 周國瑛, 沈菊英, 彭寶珍 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所