專利名稱：甲狀旁腺素相關(guān)蛋白人源化抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人源化基因工程抗體領(lǐng)域甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein,PTHrP)具有與甲狀旁腺素蛋白(Parathyroid Hormone PTH)相似的生物活性，它最早發(fā)現(xiàn)于惡性腫瘤所致的體液性高鈣血癥(HumoralHypercalcemia of Malignancy,HHM)患者的血液中，鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、泌尿系統(tǒng)癌、卵巢癌等腫瘤組織都能產(chǎn)生PTHrP，是引起HHM的因素之一。HHM在臨床上表現(xiàn)為無食欲、惡心、多尿、精神異常甚至昏迷，一般多出現(xiàn)在癌癥末期，嚴(yán)重影響其預(yù)后，而幾乎在所有伴有HHM的腫瘤患者的血液中都能檢測(cè)到PTHrP，因此對(duì)PTHrP的研究引起醫(yī)學(xué)界極大的重視。目前得到醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可的降低與腫瘤相關(guān)的高鈣血癥HHM的手段之一就是利用PTHrP的中和抗體對(duì)PTHrP進(jìn)行免疫中和，在降低血鈣的同時(shí)也抑制了分泌PTHrP的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而起到治療腫瘤的目的。到目前為止人們已利用多克隆抗血清和鼠源性單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌的PTHrP進(jìn)行免疫中和，從而降低了高鈣血癥，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
目前，有關(guān)研究人員已利用雜交瘤技術(shù)得到抗PTHrP的單克隆抗體(專利號(hào)US5217896)，這種抗體能成功地檢測(cè)、診斷和治療由惡性腫瘤引起的高鈣血癥。建立鼠源性雜交瘤細(xì)胞系得到單克隆抗體的方法是抗體發(fā)展史上的一大革命，得到的抗體特異性強(qiáng)，已大量應(yīng)用于臨床。但是，單克隆抗體制作周期長(zhǎng)，建株不穩(wěn)定，重復(fù)性差。最主要的是雜交瘤所制單克隆抗體是鼠源性抗體，在人體上多次應(yīng)用后會(huì)引起免疫反應(yīng)，因而限制了其在臨床上的普及應(yīng)用。
自1989年首次報(bào)道利用抗體庫技術(shù)制備人源化單克隆抗體以來，該技術(shù)已有了長(zhǎng)足的發(fā)展(Ninnsim A,Hoogenboon HR,Tomlinson IM et al.,Antibody fragments from a single pot phage display as immunochemicalreagents.EMBO J,1991；13:692)。目前已能從經(jīng)過免疫或未經(jīng)免疫的天然抗體庫中篩選出多種抗半抗原、蛋白質(zhì)、病毒粒子等人源化抗體或抗體片段。
在人體內(nèi)，完整的抗體由四條鏈組成，即兩條輕鏈L(VL+CL)和兩條重鏈H(VH+CH1+CH2+CH3)。經(jīng)修飾和改造后的人源化抗體片段可由VL+VH組成，也可由VL+CL和VH+CH1組成。如果抗體片段是單鏈形式，輕鏈和重鏈片段之間可由一個(gè)連接肽(Linker)相連，如果抗體片段VL+CL和VH+CH1由羧基端形成二硫鍵連接，即形成了體內(nèi)抗體片段Fab。這種人源化抗體或抗體片段除了能達(dá)到和雜交瘤所制的單克隆抗體類似的效用，還有鼠源單克隆抗體無法比擬的優(yōu)越性。
但到目前為止，還沒有甲狀旁腺素相關(guān)蛋白人源化基因工程抗體及其制備方法的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供甲狀旁腺素相關(guān)蛋白人源化基因工程抗體及其制備方法，其技術(shù)路線如下從腫瘤病人外周血中收集淋巴細(xì)胞，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出重鏈H的VH+CH1基因和輕鏈L的VL+CL基因。根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的人抗體基因家族性保守序列設(shè)計(jì)引物，引物兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)與噬菌體遞呈載體上相應(yīng)的克隆位點(diǎn)一致。用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增VH+CH1基因和VL+CL基因。
將重鏈VH+CH1基因和輕鏈VL+CL基因先后連接到載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在輔助噬菌體的幫助下，有結(jié)合功能的免疫球蛋白分子片段Fab在絲狀噬菌體的表面表達(dá)出來，構(gòu)成抗體片段基因組合文庫。噬菌體遞呈載體pComb3上有相應(yīng)的克隆位點(diǎn)，見

圖1。
重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重鏈VH+CH1和輕鏈VL+CL在導(dǎo)肽的帶領(lǐng)下在大腸桿菌質(zhì)周腔內(nèi)裝配成有結(jié)合功能的免疫球蛋白分子片段Fab，即二者在羧基端形成二硫鍵連在一起，和體內(nèi)抗體裝配的模式一樣。Fab片段和噬菌體外膜蛋白gⅢ蛋白(由輔助噬菌體提供)融合表達(dá)，遞呈在噬菌體表面，構(gòu)成了抗體片段基因的組合文庫，在此簡(jiǎn)稱文庫。
用PTHrP抗原對(duì)文庫進(jìn)行擴(kuò)增、淘洗和篩選，得到陽性株。將文庫進(jìn)行擴(kuò)增，加入已包被了抗原PTHrP的反應(yīng)孔中進(jìn)行孵育，遞呈在噬菌體表面的Fab抗體與抗原牢固結(jié)合，其它非特異性噬菌體被沖洗掉，再擴(kuò)增和抗原結(jié)合的噬菌體，如此反復(fù)，即可篩選到抗PTHrP的抗體片段Fab，序列分析已篩選到的抗體基因重鏈VH+CH1和輕鏈VL+CL，與人抗體基因序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以確保其正確性。
將陽性株的抗體基因片段克隆到原核表達(dá)載體上組裝成高效表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組菌，在可使所述抗體基因片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌。表達(dá)載體pIG110含有二價(jià)多順反子操縱子、SD序列、轉(zhuǎn)錄終止子和相應(yīng)的克隆酶切位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，誘導(dǎo)其融合蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE電泳表明融合蛋白分子量為52KD，以包涵體形式存在于大腸桿菌內(nèi)，占菌體蛋白的30％左右。
分離表達(dá)的抗體。收集包涵體，變性后復(fù)性，過分子篩得到純化的抗體蛋白。在細(xì)胞水平上檢測(cè)其生物活性。Fab抗體蛋白能中和PTHrP的生物活性。
通過這一方法得到了對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有特異性的人源化抗體。具體地說，本發(fā)明得到甲狀旁腺素相關(guān)蛋白，本發(fā)明也得到了編碼甲狀旁腺素相關(guān)蛋白的基因。氨基酸序列，核苷酸序列如下VH+CH1鏈CCC CAG CTC ATA GTG GAA GTG TCT TTC AAC GGT ACA TTC GCT CAC AAA 48P Q L I V E V S F N G T F A H KTTC GTG AGA TGC TGG GAT AAA TCG GTC TTC CCC AAG CTG CAC CCG GTC 96F V R C W D K S V F P K L H P VAGC TGG GTT GGG TAT GAG TCT TCG GAT AGA GAC TCT AAC TTT TGG GGC 144S L V G Y E S S D R D S N F W GAAT ATG GAC TCT CCC CAC CAG AGA TCG AAC ACA GAC GAT AAG ATG TCG 192N M D S P H Q R S N T D D K M STCT AAG TAC TAT GAC GGT AAA ACC ACT GTG TTC AGA CTG AAC CAC TGG 240S K Y Y D G K T T V F R L N H WTCT GAA ATA CAG CCC ATG GTC GCT TTC GCT ATG AAG GTC GAG TGG AGA 288S E I Q P M V A F A M K V E W RGAC ATA GGT CTG AAC CAC TCT CAG CCG ATG CAC CAG AAG TTC ACA TAC 336D I G L N H S Q P M H Q K F T YGGG ACA TGG TTC GCT AGA TTT TCT CTG GAC ATG GAG CAC CAG AAG AGA 384G T W F A R F S L D M E H Q K RCCC TTC GTC ATA TAT ACT TTC AGA CTG GCT GGT TCT GTC GGT GCT CAC 432P F V I Y T F R L A G S V G A HTGG CAG TCT TGG TTC AAG GTC GAG ATG ACA TAC AGA ATA GCT GGT CTG 480W Q S W F K V E M T Y R I A G LCCG GAC AAT ATC CAG TGG TCG GCC TAT CCC TTC TAT GTC ACA TAC CCC 528P D N I Q W S A Y P F Y V T Y PTTC TGG GGT GCT CAC ATG GAG TAC CAC ATG AAG CAG TGC AGA TCT GTC 576F W G A H M E Y H M K Q C R S VGCT AAA TGG CCC TCT CAG CAC TCT AGA CTG GTC CCC CAG GAC CAG AAG 624A K W P S Q H S R L V P Q D Q KCTG GCT CAG TGG ATG AGA AAC ACA CCC TGT TCT TTC CCG ATC AAT 669L A Q W M R N T P C S F P I NL鏈TAC ATG AAA TTC TCT AGA CTG GTC AAT ATC AGA GCT CAG TGG ATG TCT 48Y M K F S R L V N I R A Q W M SCCG ATC AAT CTG GTC GAC GCT TGG CCG AAT GCT TAT TGG TGG GTC ACT 96P I N L V D A W P N A Y W W V TCTG TTC CCG CCC TCC TCT GAG GAG GCA TGG GAT GAT AGC CTG AGT GGC 144L F P P S S E E A W D D S L S GCCT AAT CAG CTC CCA GGA ACG GCC AAA TAT AAT TCT TGT CTC ATA AGT 192P N Q L P G T A K Y N S C L I SGAC TTC TAC CCG GGA GCC CTG TTC CCG CCC TCT CTT CAA AAC AAG GCC 240D F Y P G A L F P P S L Q N K ATAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA ACC GTG GCA TGG GAT GAT AGC TGG 288Y S C Q V T H E T V A W D D S WCAG GCG CAG ACT ATG CTC AAC ATA TGT ATA TTC GGA TCT AAT GTC ACT 336Q A Q T M L N I C I F G S N V TCTG TTC AAA CCC CAC TAT TGG GAG TTC GCT ATG AGA AGA TTC GTC ATA 384L F K P H Y W E F A M R R F V ITAT ACA AAC CAC TGG CAG AAG GGT TTC TTT AAG GCT CCC ATA TTC GGT 432Y T N H W Q K G F F K A P I F GGAT TCT GCG ACT AAT TCT GCA ACT CTG CAC TAC ACG GGG AGC GAG TTC 480D S A T N S A T L H Y T G S E FTCT CTG TGT CAG TGG AAG ACT TCC TAC TCG ACG CCC AAC GTG ACA GTG 528S L C Q W K T S Y S T P N V T VGCC GTG TTC GGA CTG GGA CAG TGG TTC AAG ACC GCT GTC ACT TGC CTG 576A V F G L G Q W F K T A V T C LTTC CAG CTG ACC AGG TCT AAC ATC GGC TCA CAG TGG CTG ATC CCT TCC 624F Q L T R S N I G S Q W L I P SCTG CTC TGT TAC ACT CTC CAG GTG TTC 651L L C Y T L Q V F通過本發(fā)明的方法得到的抗體和PTHrP有高度的親和性，能中和PTHrP的生物活性，當(dāng)標(biāo)記上一個(gè)生物記號(hào)(marker)，如酶、生物素、熒光素、生色化學(xué)基團(tuán)或放射性同位素，能用于檢測(cè)和分析PTHrP在人正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)水平，達(dá)到檢測(cè)正常情況下和病理情況下血鈣代謝和調(diào)節(jié)情況(如骨質(zhì)疏松癥Osteoporosis和HHM)，也起到診斷惡性腫瘤所致的高鈣血癥的目的。
本發(fā)明的抗體基因還可以和人白細(xì)胞介素-2，腫瘤壞死因子等殺傷腫瘤因子連接在一起，共同表達(dá)成融合蛋白?？贵w部分既起到免疫中和作用，又起到體內(nèi)導(dǎo)向作用，從而更準(zhǔn)確地殺傷腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)施用，也可以和藥物可接受的載體一起施用。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于(1)工藝流程簡(jiǎn)單，成本較低，能在短期內(nèi)得到大量產(chǎn)品，為大規(guī)模臨床應(yīng)用創(chuàng)造了條件；(2)特異性高，是血清多克隆抗體所無法比擬的；(3)消除了鼠源單克隆抗體對(duì)人體的免疫原性，保證了應(yīng)用于人體的安全性；(4)整個(gè)工藝流程技術(shù)含量高，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，這是基因工程藥物能應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)條件。
附圖簡(jiǎn)要說明圖1是pComb3載體構(gòu)建圖。圖2是本發(fā)明方法的流程圖。
實(shí)施例1．設(shè)計(jì)一組引物克隆出全套免疫球蛋白的可變區(qū)基因。構(gòu)建噬菌體文庫。
根據(jù)已知的人免疫球蛋白可變區(qū)基因庫數(shù)據(jù)可知抗體基因具有家族性保守序列，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出六條引物，利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆出全套免疫球蛋白可變區(qū)基因，這六條引物是5’(CG)AG GTG CAG CTC GAG (CG)AG TCT GGG 3’5’GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG 3’5’GA(AC) AT(CT) GAG CTC AC(CG) CAG TCT CCA 3’5’GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC 3’5’(GC)AG GTG CAG CTG CTC GAC TCT GGG 3’5’GAC ATC GAC CTG ACC CAG TCT CCA 3’用DNA合成儀合成這六條引物，純化后用于PCR，模板DNA的制備材料源于腫瘤病人血液中的淋巴細(xì)胞，從淋巴細(xì)胞中提取總的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)由Promega公司提供，第一條cDNA鏈的反應(yīng)體系如下4ulMgCl2,25mM2ul5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2ul10mM dNTP混合物0.5ul rRNasin核糖核酸酶抑制劑1ul(15u) AMV反轉(zhuǎn)錄酶5ulRNA(2ug)加無RNase水至20ul混勻，42℃反應(yīng)30分鐘，得到第一條cDNA鏈。
PCR分別擴(kuò)增H鏈和L鏈基因5ulcDNA1ulTaq聚合酶(1-2u)1ul5’引物(50pmol)
1u1 3’引物(50pmol)10ul10×Taq酶緩沖液(含氯化鎂)1.5ul dNTPPCR反應(yīng)條件為94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，35個(gè)循環(huán)后，取10ul反應(yīng)混合物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別得到660bp左右的H鏈帶和660bp左右的L鏈帶，分別與人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)相近。
L鏈用SacⅠ和XbaⅠ酶切，H鏈用XhoⅠ和SpeⅠ酶切，將Pcomb3同樣酶切后先后與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，用電穿孔法將轉(zhuǎn)入大腸桿菌XLl-Blue，正確插有H鏈和L鏈的質(zhì)粒定名為P24，篩選陽性克隆，確定連接正確，至此已構(gòu)建成基因工程組合抗體的噬菌體文庫。
2．文庫的擴(kuò)增淘洗和篩選將上述文庫擴(kuò)大培養(yǎng)，加入輔助噬菌體M13，抗體的H鏈和L鏈蛋白即與M13外殼蛋白pⅢ融合表達(dá)在絲狀噬菌體的表面，擴(kuò)增過程如下1ml XL1-Blue(OD600≈1.0)+100ul文庫+LB至10ml37℃搖床震蕩1小時(shí)。
擴(kuò)大加入100ml培養(yǎng)基(LB),37℃搖床震蕩1小時(shí)加入輔助噬菌體M13 1ml(效價(jià)＞107),37℃搖床震蕩2小時(shí)加入卡那霉素至終濃度70ug/ml 37℃搖床震蕩過夜。第二天提取噬菌體進(jìn)行文庫的淘洗富集。
離心收集培養(yǎng)物上清加PEG8000至終濃度4％，加NaCl至終濃度3％充分溶解后冰浴30分鐘離心收集沉淀物，將沉淀物充分溶于3ml磷酸緩沖液中加入包被有PTHrP抗原(2ug/孔)的反應(yīng)孔中，孵育2小時(shí)倒出噬菌體，注滿水清洗一次用TBS/Tween洗10-20次，在此過程中上下吹打數(shù)次TBS/Tween洗10-20次，在此過程中上下吹打數(shù)次TBS/Tween緩沖液體系為50mM Tris-HCl,pH7.5150mM NaCl
0.05％ Tween 20最后注滿水清洗一次，去掉TBS/Tween注入50ul洗脫液EB，室溫放置10分鐘EB洗脫液體系為0.4M甘氨酸，0.39M鹽酸，0.1％牛血清白蛋白上下吹打幾次，吸取出，每50ul洗脫液加入3ul中和液，充分中和至pH7.0左右，中和液為2M Tris.
每50ul中和后的洗脫產(chǎn)物感染2ml新鮮的大腸桿菌XLl-Blue，室溫放置15min加入10ml培養(yǎng)基(SB)37℃搖床震蕩1小時(shí)倒入100ml培養(yǎng)基(SB),37℃擴(kuò)大培養(yǎng)，1小時(shí)加輔助噬菌體M13(1012PFU)37℃搖2小時(shí)加入卡那霉素至終濃度為70ug/ml 37℃搖過夜第三天，重復(fù)第一天和第二天的過程，如此重復(fù)三次。
將淘洗富集得到的產(chǎn)物鋪于LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，37℃過夜。
挑取陽性克隆100個(gè)接種于2ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。
收集噬菌體加入100個(gè)已包被有PTHrP抗原0.5ug/孔中孵育2小時(shí)。
用常規(guī)ELISA方法篩選，得到強(qiáng)陽性克隆。
3．甲狀旁腺素相關(guān)蛋白人源基因工程抗體序列測(cè)定和分析對(duì)所篩選的抗體進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定選用Amersham Life Science公司提供的United States Biochemical系統(tǒng)，重鏈VH+CHl的DNA序列和氨基酸序列如圖1所示，輕鏈VL+CL的DNA序列和氨基酸序列如圖1所示。
4．抗體基因在大腸桿菌中的表達(dá)從質(zhì)粒P24上分別切下抗體基因H鏈和L鏈，連接到原核表達(dá)型質(zhì)粒pIG110的相同位點(diǎn)，pIG110含二價(jià)多順反子，重組后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株系，經(jīng)酶切簽定H鏈和L鏈基因正確插入后，該質(zhì)粒命名為pHLB1，含pHLB1的工程菌定名為PHLB1。
挑PHLB1單菌落到3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜，按10％接種量轉(zhuǎn)種于20ml LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至0D600值達(dá)0.5，升溫至42℃，誘導(dǎo)6小時(shí)。取1ml培養(yǎng)液離心，收集菌體，溶于100ul蛋白上樣緩沖液中。
50mmol/L Tris-HCl pH6.8100mmol/L DTT2％ SDS0.1％溴酚藍(lán)10％ 甘油取10ul作10％SDS-PAGE電泳，鑒定表達(dá)產(chǎn)物，挑選表達(dá)量最大的菌株，做為菌種存于甘油管中。
5．工程菌的發(fā)酵和發(fā)酵后的純化LKB-Bromma發(fā)酵罐PHLB1單菌落在6ul LB-Amp培養(yǎng)液中，30℃過夜培養(yǎng)，做為一級(jí)種子液，供發(fā)酵用。
按1∶50比例，將一級(jí)種子液接種于300ml M9CA-Amp培養(yǎng)液中，30℃搖16小時(shí)，做為二級(jí)種子液，供發(fā)酵用。
將發(fā)酵罐最壓蒸汽滅菌(15P,30分鐘)，冷卻后安放在操作臺(tái)上，設(shè)定溫度為30℃,pH7.0，溶氧85％，攪拌速度450次/分。各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定后，1∶10接種二級(jí)種子液，維持上述參數(shù)條件不變，5小時(shí)后將溫度升至42℃繼續(xù)誘導(dǎo)10小時(shí)，自動(dòng)調(diào)節(jié)pH7.0左右，溶氧此時(shí)大于100％。
收集菌體，超聲破碎，收集包涵體，反復(fù)洗滌后，加含8M尿素的變性液。
8M 尿素50mmol/L Tris-HCl(pH8.5)1ul/mlβ-ME溶解沉淀，將溶解后的包涵體過Sephrose CL600分子篩柱，上樣的包涵體濃度調(diào)至10mg/ml，收集峰值樣品，用12％SDS-PAGE檢測(cè)，合并含有目的蛋白的各管溶液，加含1M尿素的復(fù)性液。
50mmol/L Tris-HCl(pH9.0)1mol/L尿素最后用無尿素的復(fù)性液透析后，回收樣品，將樣品再過一次分子篩柱，洗脫和平衡條件相同，收集各個(gè)洗脫峰值，鑒定目的蛋白后合并到一起超濾濃縮。
純化后的成品在Solo細(xì)胞系上檢測(cè)其生物活性，Solo細(xì)胞系為分泌PTHrP的細(xì)胞系，由澳大利亞墨爾本大學(xué)提供，經(jīng)檢測(cè)，該產(chǎn)品能抑制Solo細(xì)胞的生長(zhǎng)。該檢測(cè)方法請(qǐng)參閱美國專利No.5127896。
根據(jù)本文公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以得到本文所述的對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有特異性的人源化抗體。眾所周知，抗體的可變區(qū)是高度變化的，且無法預(yù)知，因此重復(fù)本實(shí)驗(yàn)所得到的抗體在氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)上不會(huì)完全相同。因而本發(fā)明公開的，并且根據(jù)本發(fā)明的方法也是可以得到的是一類人源化抗體，其共同特征是對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有特異性。
權(quán)利要求
1.一類對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有特異性的人源化抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其特征在于它主要是由VH+CH1和L鏈組成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化抗體，其特征在于該VH+CH1和L鏈?zhǔn)峭ㄟ^羧基端的二硫鍵相連的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其特征在于它具有如下所示的VH+CH1和L鏈的氨基酸序列VH+CH1鏈P Q L I V E V S F N G T F A H KF V R C W D K S V F P K L H P VS L V G Y E S S D R D S N F W GN M D S P H Q R S N T D D K M SS K Y Y D G K T T V F R L N H WS E I Q P M V A F A M K V E W RD I G L N H S Q P M H Q K F T YG T W F A R F S L D M E H Q K RP F V I Y T F R L A G S V G A HW Q S W F K V E M T Y R I A G LP D N I Q W S A Y P F Y V T Y PF W G A H M E Y H M K Q F R S VA K W P S Q H S R L V P Q D Q KL A Q W M R N T P S S F P I NL鏈Y M K F S R L V N I R A Q W M SP I N L V D A W P N A Y W W V TL F P P S S E E A W D D S L S GP N Q L P G T A K Y N S C L I SD F Y P G A L F P P S L Q N K AY S C Q V T H E T V A W D D S WQ A Q T M L N I C I F G S N V TL F K P H Y W E F A M R R F V IY T N H W Q K G F F K A P I F GD S A T N S A T L H Y T G S E FS L C Q W K T S Y S T P N V T VA V F G L G Q W F K T A V T S LF Q L T R S N I G S Q W L I P SL L F Y T L Q V F
5.一種制備甲狀旁腺素相關(guān)蛋白人源化抗體的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)從腫瘤病人外周血中收集淋巴細(xì)胞，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出重鏈H的VH+CH1基因和輕鏈L的基因，(2)將重鏈VH+CH1基因和輕鏈L基因先后連接到載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在輔助噬菌體的幫助下，有結(jié)合功能的免疫球蛋白分子片段Fab在絲狀噬菌體的表面表達(dá)出來，構(gòu)成抗體片段基因組合文庫。(3)用PTHrP抗原對(duì)文庫進(jìn)行PTHrP抗體的擴(kuò)增、淘洗和篩選，得到陽性株，(4)將陽性株的抗體基因片段克隆到原核表達(dá)載體上組裝成高效表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得重組菌，在可使所述抗體基因片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)該工程菌。(5)分離表達(dá)的抗體。
6.一種編碼權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的人源化抗體的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源化抗體基因，其特征在于它具有如下所示的VH+CH1和L鏈核苷酸序列VH+CH1鏈CCC CAG CTC ATA GTG GAA GTG TCT TTC AAC GGT ACA TTC GCT CAC AAA 48TTC GTG AGA TGC TGG GAT AAA TCG GTC TTC CCC AAG CTG CAC CCG GTC 96AGC TGG GTT GGG TAT GAG TCT TCG GAT AGA GAC TCT AAC TTT TGG GGC 144AAT ATG GAC TCT CCC CAC CAG AGA TCG AAC ACA GAC GAT AAG ATG TCG 192TCT AAG TAC TAT GAC GGT AAA ACC ACT GTG TTC AGA CTG AAC CAC TGG 240TCT GAA ATA CAG CCC ATG GTC GCT TTC GCT ATG AAG GTC GAG TGG AGA 288GAC ATA GGT CTG AAC CAC TCT CAG CCG ATG CAC CAG AAG TTC ACA TAC 336GGG ACA TGG TTC GCT AGA TTT TCT CTG GAC ATG GAG CAC CAG AAG AGA 384CCC TTC GTC ATA TAT ACT TTC AGA CTG GCT GGT TCT GTC GGT GCT CAC 432TGG CAG TCT TGG TTC AAG GTC GAG ATG ACA TAC AGA ATA GCT GGT CTG 480CCG GAC AAT ATC CAG TGG TCG GCC TAT CCC TTC TAT GTC ACA TAC CCC 528TTC TGG GGT GCT CAC ATG GAG TAC CAC ATG AAG CAG TTC AGA TCT GTC 576GCT AAA TGG CCC TCT CAG CAC TCT AGA CTG GTC CCC CAG GAC CAG AAG 624CTG GCT CAG TGG ATG AGA AAC ACA CCC TCG TCT TTC CCG ATC AAT 669輕鏈LTAC ATG AAA TTC TCT AGA CTG GTC AAT ATC AGA GCT CAG TGG ATG TCT 48CCG ATC AAT CTG GTC GAC GCT TGG CCG AAT GCT TAT TGG TGG GTC ACT 96CTG TTC CCG CCC TCC TCT GAG GAG GCA TGG GAT GAT AGC CTG AGT GGC 144CCT AAT CAG GTC CCA GGA ACG GCC AAA TAT AAT TCT TGT CTC ATA AGT 192GAC TTC TAC CCG GGA GCC CTG TTC CCG CCC TCT CTT CAA AAC AAG GCC 240TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT GAA ACC GTG GCA TGG GAT GAT AGC TGG 288CAG GCG CAG ACT ATG CTC AAC ATA TGT ATA TTC GGA TCT AAT GTC ACT 336CTG TTC AAA CCC CAC TAT TGG GAG TTC GCT ATG AGA AGA TTC GTC ATA 384TAT ACA AAC CAC TGG CAG AAG GGT TTC TTT AAG GCT CCC ATA TTC GGT 432GAT TCT GCG ACT AAT TGT GCA ACT CTG CAC TAC ACG GGG AGC GAG TTC 480TCT CTG TGT CAG TGG AAG ACT TCC TAC TCG ACG CCC AAC GTG ACA GTG 528GCC GTG TTC GGA CTG GGA CAG TGG TTC AAG ACC GCT GTC ACT TCA CTG 576TTC CAG CTG ACC AGG TCT AAC ATC GGC TCA CAG TGG CTG ATC CCT TCC 624CTG CTC TTC TAC ACT CTC CAG GTG TTC651
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的人源化抗體，其特征在于它可以作為用于診斷、治療或預(yù)防腫瘤的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的人源化抗體，其特征在于它在用于診斷、治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7中任意一項(xiàng)所述的人源化抗體基因，其特征在于它在制備與人白細(xì)胞介素-2，腫瘤壞死因子等殺傷腫瘤了因子組成的融合蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明首次提供了一種對(duì)甲狀旁腺素相關(guān)蛋白具有特異性的人源化抗體及其制備方法。該抗體主要由重鏈(VH+CH1)和輕鏈(L鏈)組成。其制備方法是使用基因工程的方法。該抗體作為藥物可用于診斷、治療和預(yù)防腫瘤。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1212967SQ97118928
公開日1999年4月7日 申請(qǐng)日期1997年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者王學(xué), 周瑩, 田波 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所